CN111665301A - 超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗真菌药物的试剂盒 - Google Patents

超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗真菌药物的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗真菌药物的试剂盒，前处理过程简单，成本低，且灵敏度高、特异性强，5min之内完成抗真菌药物的分离和检测，准确度与精密度基本满足要求，可用于临床上抗真菌药物的定量分析，为临床上抗真菌药物的治疗浓度监测提供一种可靠的检测方法。

Description

超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗真菌药物的试 剂盒
技术领域
本发明属于血清检测技术领域，具体涉及一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗真菌药物的试剂盒，具体药物为：氟康唑(Fluconazole，FCZ)、伏立康唑(Voriconazole，VCZ)、伏立康唑N-氧化物(Voriconazole N-Oxide，OVCZ)、泊沙康唑(Posaconazole，PCZ)、伊曲康唑(Itraconazole，ICZ)、羟基伊曲康唑(Hydroxyitraconazole，HICZ)、卡泊芬净(Caspofungin，CPF)。
背景技术
真菌感染是临床上不可忽视的问题，院内感染中，真菌感染约占7.5％，甚至更高。特别是对于危重症、器官移植、免疫缺陷、免疫抑制疗法的病人。真菌感染造成这些病人的感染率和死亡率都非常高，现有的批准用于临床的抗真菌药物比较少，一些抗真菌药物出现了耐药性，导致抗真菌感染的治疗变得更加困难，因此需要更合理的使用现有药物。氟康唑(Fluconazole，FCZ)、伏立康唑(Voriconazole，VCZ)、泊沙康唑(Posacona zole，PCZ)、伊曲康唑(Itraconazole，ICZ)、卡泊芬净(Caspofungin，CPF)是常用的抗真菌药物。其中氟康唑、伏立康唑、泊沙康唑、伊曲康唑均属于***类抗真菌药物。氟康唑是是一种广谱的抗真菌药物，但治疗窗较窄，高的血药浓度具有较强的毒性。伏立康唑属于新一代的广谱***类抗真菌药物，抗菌谱和抗菌活性大于氟康唑，是目前临床上被广泛应用的抗真菌药物。伏立康唑的在患者体内药物代谢个体差异较大，药物动力学复杂，且可以与多种药物如环孢素A等产生相互作用，从而造成伏立康唑的血药浓度与临床治疗效果不佳，甚至引起不良反应和毒性，其代谢产物伏立康唑氮氧化物也具有较弱的抗菌活性，因此了解其代谢产物在体内的浓度有利于确定伏立康唑及其代谢产物对机体产生的作用，使药物治疗更加有效和安全。泊沙康唑是一种高效、低毒、广谱的治疗和预防侵袭性真菌感染的药物，对于对多烯类和其他***类抗真菌药物产生耐药性的真菌具有较好的疗效，由于其可以与CYP3A4产生相互作用，因此和其他药物联用时极易发生药物相互作用，在临床使用时非常有必要对其进行药物浓度监测。伊曲康唑也属于***类抗真菌药物，通过抑制酵母菌和真菌细胞膜的主要成分发挥作用，用于治疗严重或顽固性皮肤真菌感染，伊曲康唑在肝脏中被代谢为多种代谢产物，其中羟基伊曲康唑(Hydroxy itraconazole，HICZ)为主要代谢产物，且与伊曲康唑具有相似的抗菌效果。但是伊曲康唑的水溶性比较差，口服后吸收较差，从而导致体内有效血药浓度较低，且个体差异较大。伊曲康唑可以与多种药物发生相互作用，因此在临床使用时需要对伊曲康唑及其代谢产物其中羟基伊曲康唑进行体内血药浓度监测。卡泊芬净是一种一线的抗真菌药物，属于棘白菌素类药物，抗真菌作用良好，对人体较为安全，常被用于对唑类药物产生耐药性或危重症患者念珠菌感染的治疗和预防，由于重症患者药物吸收的特异性，需要对药物浓度及进行监测。
目前针对抗真菌药物体内浓度检测的方法主要有微生物法、高效液相色谱法、超高效液相-串联质谱法，文献报道的多为一次性针对1-4种药物进行检测，也有专利报道，比如中国专利申请(公布号：CN 109030672 A)公开了一种：“同时测定干血斑中四种抗真菌药物的试剂盒及其应用”，针对4种抗真菌药物进行检测，单个样本采集时间长，线性范围不适宜；中国专利申请(公布号：CN 110470775 A)公开了：“一种血液中氟康唑药物浓度监测试剂盒及其检测方法”，仅针对一种药物，需要配置特殊设备，适用性不强，样本量需求大，样品前处理复杂和存在基质效应干扰等不足。而抗真菌药物种类繁多，本发明采用LC-MS/MS法，可以一次性对7种常用的抗真菌药物进行检测，灵敏度高、准确性好，可很好应用于临床，可为抗真菌药联合用药研究提供可靠依据。
发明内容
本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗真菌药物的试剂盒。
本发明的另一个目的是提供上述试剂盒在利用超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗真菌药物中的应用。
本发明的技术方案如下：
一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗真菌药物的试剂盒，
所述抗真菌药物分别为：氟康唑(FCZ)、伏立康唑(VCZ)、伏立康唑N-氧化物(OVCZ)、泊沙康唑(PCZ)、伊曲康唑(Itraconazole，ICZ)、羟基伊曲康唑(HICZ)、卡泊芬净(CPF)
上述抗真菌药物对应的同位素内标物分别为：伏立康唑-d3(VCZ-d3)、伏立康唑N-氧化物-d3(OVCZ-d3)、氟康唑-d4(FCZ-d4)、伊曲康唑-d5(ICZ-d5)、羟基伊曲康唑-d5(HICZ-d5)、泊沙康唑-d4(PCZ-d4)、卡泊芬净-d4(CPF-d4)。
所述的试剂盒包含如下试剂：
(1)流动相：
流动相A：0.01％～0.2％甲酸水溶液；流动相B：乙腈；
(2)校准品样本：
七个不同浓度点的校准品样本S7～S1：
S7：含CPF 20000ng/mL，VCZ/OVCZ/ICZ/HICZ 10000ng/mL，FCZ 40000ng/mL，PCZ5000ng/mL；
S6：含CPF10000ng/mL，VCZ/OVCZ/ICZ/HICZ 5000，FCZ 20000ng/mL，PCZ 2500ng/mL；
S5：含CPF 5000ng/mL，VCZ/OVCZ/ICZ/HICZ 2500，FCZ 10000ng/mL，PCZ 1250ng/mL；
S4：含CPF 1000ng/mL，VCZ/OVCZ/ICZ/HICZ 500，FCZ 2000ng/mL，PCZ 250ng/mL；
S3：含CPF 500ng/mL，VCZ/OVCZ/ICZ/HICZ 250，FCZ 1000ng/mL，PCZ 125ng/mL；
S2：含CPF 200ng/mL，VCZ/OVCZ/ICZ/HICZ 100，FCZ 400ng/mL，PCZ 50ng/mL；
S1：含CPF 100ng/mL，VCZ/OVCZ/ICZ/HICZ 50，FCZ 200ng/mL，PCZ 25ng/mL；
(3)混合内标溶液：
包含有FCZ-d4 4000ng/mL、VCZ-d3 1000ng/mL、CPF-d4 2000ng/mL、OVCZ-d31000ng/mL、PCZ-d4 2000ng/mL、ICZ-d5 5000ng/mL、HICZ-d5 4000ng/mL的甲醇水溶液；
(4)蛋白质沉淀剂：
甲醇与乙腈混合溶液；
(5)质控品：
含有抗真菌药物的血清基质溶液，分为低、中、高三个浓度，分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)，其中，
QC(L)中包含：FCZ 400ng/mL、VCZ 100ng/mL、CPF 200ng/mL、OVCZ 100ng/mL、PCZ50ng/mL、ICZ 100ng/mL、HICZ 100ng/mL；
QC(M)中包含：FCZ 4000ng/mL、VCZ 1000ng/mL、CPF 2000ng/mL、OVCZ 1000ng/mL、PCZ 500ng/mL、ICZ 1000ng/mL、HICZ 1000ng/mL；
QC(H)中包含：FCZ 16000ng/mL、VCZ 4000ng/mL、CPF 8000ng/mL、OVCZ 4000ng/mL、PCZ 2000ng/mL、ICZ 4000ng/mL、HICZ 4000ng/mL。
一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗真菌药物的试剂盒，
所述抗真菌药物分别为：FCZ、VCZ、OVCZ、PCZ、ICZ、HICZ、CPF。
所述的试剂盒包含如下试剂：
(1)洗脱液：
流动相A：含0.01％～0.2％甲酸水溶液，流动相B：乙腈；
(2)校准品样本：
包含有FCZ 800000ng/mL、VCZ 200000ng/mL、CPF 400000ng/mL、OVCZ 200000ng/mL、PCZ 100000ng/mL、ICZ 200000ng/mL、HICZ 200000ng/mL的混合标准溶液和空白血清基质；检测前按照使用说明书中记载的以下配方稀释配制成七个不同浓度点的校准品样本S7～S1和低、中、高三个浓度的质控品溶液QC(L)、QC(M)、QC(H)：
S7：含CPF 20000ng/mL，VCZ/OVCZ/ICZ/HICZ 10000ng/mL，FCZ 40000ng/mL，PCZ5000ng/mL；
S6：含CPF10000ng/mL，VCZ/OVCZ/ICZ/HICZ 5000，FCZ 20000ng/mL，PCZ 2500ng/mL；
S5：含CPF 5000ng/mL，VCZ/OVCZ/ICZ/HICZ 2500，FCZ 10000ng/mL，PCZ 1250ng/mL；
S4：含CPF 1000ng/mL，VCZ/OVCZ/ICZ/HICZ 500，FCZ 2000ng/mL，PCZ 250ng/mL；
S3：含CPF 500ng/mL，VCZ/OVCZ/ICZ/HICZ 250，FCZ 1000ng/mL，PCZ 125ng/mL；
S2：含CPF 200ng/mL，VCZ/OVCZ/ICZ/HICZ 100，FCZ 400ng/mL，PCZ 50ng/mL；
S1：含CPF 100ng/mL，VCZ/OVCZ/ICZ/HICZ 50，FCZ 200ng/mL，PCZ 25ng/mL；
QC(L)中包含：FCZ 400ng/mL、VCZ 100ng/mL、CPF 200ng/mL、OVCZ 100ng/mL、PCZ50ng/mL、ICZ 100ng/mL、HICZ 100ng/mL；
QC(M)中包含：FCZ 4000ng/mL、VCZ 1000ng/mL、CPF 2000ng/mL、OVCZ 1000ng/mL、PCZ 500ng/mL、ICZ 1000ng/mL、HICZ 1000ng/mL；
QC(H)中包含：FCZ 16000ng/mL、VCZ 4000ng/mL、CPF 8000ng/mL、OVCZ 4000ng/mL、PCZ 2000ng/mL、ICZ 4000ng/mL、HICZ 4000ng/mL；
(3)混合内标溶液：
包含有FCZ-d4 4000ng/mL、VCZ-d3 1000ng/mL、CPF-d4 2000ng/mL、OVCZ-d31000ng/mL、PCZ-d4 2000ng/mL、ICZ-d5 5000ng/mL、HICZ-d5 4000ng/mL的甲醇水溶液；
(4)蛋白质沉淀剂：
甲醇与乙腈混合溶液；
(5)使用说明书：包含校准品样本S1～S7和低、中、高三个浓度的质控品溶液QC(L)、QC(M)、QC(H)的配制方法。
在一种优选方案中，上述流动相A为0.01％～0.2％甲酸水溶液，优选为0.1％甲酸水溶液。
在一种方案中，蛋白质沉淀剂中甲醇与乙腈的体积比1:1～5；优选地，蛋白质沉淀剂中甲醇与乙腈的体积比1:4。
本发明提及的混合标准溶液按照如下方法制备：
分别将抗真菌药物FCZ 50mg/mL、VCZ 20mg/mL、CPF 5mg/mL、OVCZ 1mg/mL、PCZ1mg/mL、ICZ 2mg/mL、HICZ 0.5mg/mL用甲醇配制成含FCZ 800000ng/mL、VCZ 200000ng/mL、CPF 400000ng/mL、OVCZ 200000ng/mL、PCZ 100000ng/mL、ICZ 200000ng/mL、HICZ200000ng/mL混合标准溶液。
在一种更优选方案中，混合标准溶液按照如下方法制备：
分别准确移取一定体积的抗真菌药物标准母液，加入80％甲醇水溶液94μL，充分混匀得到1mL混合标准溶液，浓度参下表1。
表1混合标准溶液
编号 组分 母液浓度(μg/mL) 移取体积(μL) 总体积(μL) 浓度(ng/mL)
1 FCZ 50 16 1000 800000
2 VCZ 20 10 1000 200000
3 CPF 5 80 1000 400000
4 OVCZ 1 200 1000 200000
5 PCZ 1 100 1000 100000
6 ICZ 2 100 1000 200000
7 HICZ 0.5 400 1000 200000
采用梯度稀释法进行标曲配制，从-20℃冰箱取出标准溶液后，涡旋10s，2min内使用标准溶液配制标曲最高浓度点，配制好后-80℃保存。具体过程如下表2(浓度单位：ng/mL)：
表2标曲配制
校准品 移取溶液(μL) 空白血清(μL) CPF VCZ/OVCZ/ICZ/HICZ FCZ PCZ
S7 混合标准溶液10 190 20000 10000 40000 5000
S6 S7 50 50 10000 5000 20000 2500
S5 S7 40 120 5000 2500 10000 1250
S4 S6 20 180 1000 500 2000 250
S3 S5 20 180 500 250 1000 125
S2 S4 50 200 200 100 400 50
S1 S350 200 100 50 200 25
本发明提及的混合内标工作液按照如下方法制备：将FCZ-d4 1mg/mL、VCZ-d30.1mg/mL、CPF-d4 0.5mg/mL、OVCZ-d3 1mg/mL、PCZ-d4 0.5mg/mL、ICZ-d5 0.5mg/mL、HICZ-d5 1mg/mL母液用甲醇水溶液配制成包含FCZ-d4 4000ng/mL、VCZ-d3 1000ng/mL、CPF-d42000ng/mL、OVCZ-d3 1000ng/mL、PCZ-d4 2000ng/mL、ICZ-d5 5000ng/mL、HICZ-d5 4000ng/mL的同位素内标溶液。
在一种更优选方案中，混合内标工作液按照如下方法制备：
分别准确移取一定体积的抗真菌药物同位素内标母液，加入80％甲醇水溶液963μLμL，混匀得到1mL同位素内标溶液，浓度参下表3。
表3混合内标工作溶液配制
Figure BDA0002515757390000061
在制备混合标准溶液和混合内标工作液时，采用的甲醇水溶液为50％～95％甲醇水溶液；优选为70％～90％甲醇水溶液；更优选为80％甲醇水溶液。
在制备混合标准溶液，无干扰血清基质为无抗真菌药物的空白血清。
本发明提及的甲醇水溶液浓度一般指体积浓度。
所述的使用说明书中记载的低、中、高三个浓度的质控品溶液QC(L)、QC(M)、QC(H)的配制方法如下：
QC(L)为QC(M)用无干扰血清基质稀释至10倍；
QC(M)为上述混合标准溶液用无干扰血清基质稀释至200倍；
QC(H)为上述混合标准溶液用无干扰血清基质稀释至50倍。
本发明提及的血清为人或动物的血清。
上述试剂盒在利用超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗真菌药物的应用也在本发明的保护范围之内。
具体检测方法如下：
超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗真菌药物的方法，
所述抗真菌药物分别为：氟康唑(FCZ)、伏立康唑(VCZ)、伏立康唑N-氧化物(OVCZ)、泊沙康唑(PCZ)、伊曲康唑(Itraconazole，ICZ)、羟基伊曲康唑(HICZ)、卡泊芬净(CPF)
上述抗真菌药物对应的同位素内标物分别为：伏立康唑-d3(VCZ-d3)、伏立康唑N-氧化物-d3(OVCZ-d3)、氟康唑-d4(FCZ-d4)、伊曲康唑-d5(ICZ-d5)、羟基伊曲康唑-d5(HICZ-d5)、泊沙康唑-d4(PCZ-d4)、卡泊芬净-d4(CPF-d4)。
采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血清中的上述抗真菌药物，先利用超高效液相色谱将目标待测物与血清基质中的干扰组分进行分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算血清中抗真菌药物的含量，具体色谱条件为：
(1)超高效液相色谱条件：
流动相A：0.01％～0.2％甲酸水溶液，优选为0.1％甲酸-水溶液；流动相B：乙腈；
色谱柱型号：Agilent Zorbax Eclipse XDB C18(3×100mm,1.8μm)；
采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱的方式，流动相A和流动相B的初始比例为95:5，在0-1.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由95:5匀速渐变至70:30；在1.0-3.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由70:30匀速渐变至2:98；在3.0-5.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98变至95:5；在一种方案中，流动相流速为0.1～0.4mL/min，优选为0.3mL/min。进一步地，柱温为35～50℃，优选为45℃。更进一步地，进样体积为1～5μL，优选为1μL。
表4流动相梯度洗脱参数
Figure BDA0002515757390000071
(2)质谱条件：
在电喷雾电离(ESI)模式下，采用多反应监测(MRM)进行正离子扫描；喷雾电压为3.0kV(ESI+)；源温度为120℃；雾化气温度为400℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测了各目标物及其对应同位素内标。
各目标待测物的质谱采集参数见表5。
表5抗真菌药物质谱参数
化合物 母离子 子离子 去簇电压(V) 碰撞电压(V)
FCZ 307.1 127 14 28
FCZ-d4 311.1 129 30 28
VCZ 350.1 154.8 28 24
VCZ-d3 353.1 224.1 48 14
OVCZ 366.2 224.1 2 10
OVCZ-d3 369.2 227.1 4 12
CPF 547.6 131 2 24
CPF-d4 551.6 135 5 28
PCZ 701.3 127 20 48
PCZ-d4 705.4 127.1 60 48
ICZ 705.3 392.3 76 32
ICZ-d5 710.5 397.4 78 34
HICZ 721.4 408.3 68 34
HICZ-d5 726.4 413.3 50 30
为了改善色谱分离选择性，可以考虑调节流动相的极性。本发明在流动相A中添加了甲酸，可有效提高某些目标化合物的离子化效率，在其他条件的配合下，较现有技术中采用LC-MS/MS方法检测血清中抗真菌药物的灵敏度更高，前处理过程简单，成本低，且灵敏度高、特异性强，5min之内完成抗真菌药物的分离和检测。在不影响本发明效果的情况下，在一种优选方案中，流动相A为0.01％～0.2％甲酸水溶液。在一种更优选方案中，流动相A为0.1％甲酸水溶液。
在色谱法中，色谱柱的选择十分重要，对色谱柱的要求：柱效高、选择性好，分析速度快等。本发明采用0.01％～0.2％甲酸水溶液和乙腈作为流动相，色谱柱型号：AgilentZorbax Eclipse XDB C18(3×100mm,1.8μm)，在其他条件的配合下，内源性物质不干扰样品的测定，灵敏度高、特异性强、成本低且前处理过程简单，5.0min之内可完成分离和检测，精密度及准确度均满足要求。
在采用内标法时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想的内标物应当能以准确、已知的量加到样品中去，和被分析的样品有基本相同或尽可能一致的物理化学性质、色谱行为和响应特征；在色谱分析条件下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。本发明分别采用伏立康唑-d3(VCZ-d3)、伏立康唑N-氧化物-d3(OVCZ-d3)、氟康唑-d4(FCZ-d4)、伊曲康唑-d5(ICZ-d5)、羟基伊曲康唑-d5(HICZ-d5)、泊沙康唑-d4(PCZ-d4)、卡泊芬净-d4(CPF-d4)作为内标，氘代内标和待测物具有相同的保留时间、化学性质和基质效应，测定血清中抗真菌药物时的重现性、准确度均较好。
本发明提及的血清为人或动物血清。
在一种方案中，经过预处理的血清按照如下方法制备：向血清中加入含内标的蛋白沉淀剂，振荡离心后取上清液；其中，蛋白质沉淀剂为甲醇与乙腈混合溶液。
优选地，蛋白质沉淀剂中甲醇与乙腈的体积比1:1～5，在不影响本发明效果的情况下，例如，蛋白质沉淀剂中甲醇与乙腈的体积比1:4。
在一种优选方案中，经过预处理的血清按照如下方法制备：取50μL血浆于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含有内标的蛋白沉淀剂(甲醇与乙腈的体积比1:1～5)，在12000～15000r/min，1～5℃离心4～10min后，取60μL上清液。其中含内标的蛋白沉淀剂是由混合内标溶液与蛋白沉淀剂混合配制而成，内标与蛋白沉淀剂比例为0.1-0.3:19.7-19.9。
在一种更优选方案中，经过预处理的血清按照如下方法制备：取50μL血浆于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含有内标的蛋白沉淀剂(甲醇与乙腈的体积比1:4),高速振荡(最大振速)5min；在14000r/min，4℃离心5min；转移EP管中的上清液60μL至塑料内衬管中，进样量1μL。其中含内标的蛋白沉淀剂是由混合内标溶液与蛋白沉淀剂混合配制而成，内标与蛋白沉淀剂比例为0.2:19.8，下同。
每个校准品样本取50μL于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含有内标的蛋白沉淀剂(甲醇与乙腈的体积比1:4),高速振荡(最大振速)5min；在14000r/min，4℃离心5min；转移EP管中的上清液60μL至塑料内衬管中，进样量1μL。
采用本发明的技术方案，优势如下:
采用本发明的试剂盒检测血清中抗真菌药物时，前处理过程简单，成本低，且灵敏度高、特异性强，5min之内完成抗真菌药物的分离和检测，准确度与精密度基本满足要求，可用于临床上抗真菌药物的定量分析，为临床上抗真菌药物的治疗浓度监测提供一种可靠的检测方法。
附图说明
图1为抗真菌药物标准品的提取离子流谱图；
图2为血清样本中抗真菌药物的提取离子流谱图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：
一、实验材料与仪器
1.材料
试剂盒学研究实验的样本来自于上海中山医院2019年9月份门诊收集的血清样本。
(1)仪器：Xevo TQ-S三重四级杆质谱仪(Waters Corporation)；UPLC I-Class超高效液相色谱***(配自动进样器，Waters Corporation)；SCILOGEX D2012高速台式离心机(美国)；超纯水仪(ELGA LabWater，英国)；多管涡旋混合仪(Vortex genie2，美国)；可调移液器(Eppendorf 0.5～10μL，10～100μL，100～1000μL)；玻璃仪器、量筒等。
(2)试剂耗材：MS级甲醇(Fisher，美国)；MS级乙腈(Fisher，美国)；HPLC级乙腈(Honeywell，美国)；HPLC级甲醇(Honeywell，美国)；MS级甲酸(Fisher，美国)；HPLC级甲醇(Honeywell，美国)；色谱柱Agilent Zorbax Eclipse XDB C18(3×100mm,1.8μm)。
(3)标准品：标准品及其对应的内标物，见下表6。
表6标准品和内标
序号 中文名称 厂家
1 伏立康唑 TRC
2 伏立康唑-d3 TRC
3 伏立康唑N-氧化物 TRC
4 伏立康唑N-氧化物-d3 深圳振强生物技术有限公司
5 氟康唑 TRC
6 氟康唑-d4 TRC
7 伊曲康唑 TRC
8 伊曲康唑-d5 TRC
9 羟基伊曲康唑 TRC
10 羟基伊曲康唑-d5 TRC
11 泊沙康唑 TRC
12 泊沙康唑-d4 TRC
13 卡泊芬净 TRC
14 卡泊芬净-d4 TRC
(4)质控品：含有抗真菌药物的无干扰血清基质，分为低、中、高三个浓度，分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)，如表1所示。
试剂盒上下四周加膜，防震保温，左上方放置流动相A和B，左下方分别放置11个安瓿瓶，分别为7瓶校准品样本、1瓶混合内标溶液和质控品(QC(L)、QC(M)、QC(H))；右边放置25mL蛋白沉淀剂。
二、液质条件
(1)色谱条件：流动相A：0.1％甲酸-水溶液；流动相B：乙腈。色谱柱型号：AgilentZorbax Eclipse XDB C18(3×100mm,1.8μm)，采用梯度洗脱的方式，详见表5。流速为0.3mL/min，柱温为45℃，进样体积为1μL。
(2)质谱条件：在电喷雾电离检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压为3.0kV(ESI+)；源温度为120℃；雾化气温度为400℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测各目标物以及同位素内标。各目标待测物的质谱采集参数见表6。
二、实验过程
(1)标准品配制：
分别将抗真菌药物母液，浓度分别为：FCZ 50mg/mL、VCZ 20mg/mL、CPF 5mg/mL、OVCZ 1mg/mL、PCZ 1mg/mL、ICZ 2mg/mL、HICZ 0.5mg/mL用80％甲醇水溶液配制成包含有配制成含FCZ 800000ng/mL、VCZ 200000ng/mL、CPF 400000ng/mL、OVCZ 200000ng/mL、PCZ100000ng/mL、ICZ 200000ng/mL、HICZ 200000ng/mL混合标准溶液(详见表3)。
将上述混合标准溶液以空白血清基质配制成七个不同浓度点的校准品样本(详见表4)，各标曲点的浓度如表4中所列，所述校准品样本的七个浓度点为：
CPF：100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、5000ng/mL、10000ng/mL、20000ng/mL
VCZ/OVCZ/ICZ/HICZ：50ng/mL、100ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、2500ng/mL、5000ng/mL、10000ng/mL
FCZ：200ng/mL、400ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL、10000ng/mL、20000ng/mL、40000ng/mL
PCZ：25ng/mL、50ng/mL、125ng/mL、250ng/mL、1250ng/mL、2500ng/mL、5000ng/mL
(2)混合内标溶液配制
将FCZ-d4 1mg/mL、VCZ-d3 0.1mg/mL、CPF-d4 0.5mg/mL、OVCZ-d3 1mg/mL、PCZ-d40.5mg/mL、ICZ-d5 0.5mg/mL、HICZ-d5 1mg/mL母液用80％甲醇水溶液配制成包含FCZ-d44000ng/mL、VCZ-d3 1000ng/mL、CPF-d4 2000ng/mL、OVCZ-d3 1000ng/mL、PCZ-d4 2000ng/mL、ICZ-d5 5000ng/mL、HICZ-d5 4000ng/mL的同位素内标溶液(详见表2)；
(3)质控品配制：
取上述混合标准溶液以无抗真菌药物的空白血清配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)，详见表7。
表7抗结核病类药物质控品对应浓度(单位：ng/mL)
序号 化合物 QC(L) QC(M) QC(H)
1 FCZ 400 4000 16000
2 VCZ 100 1000 4000
3 CPF 200 2000 8000
4 OVCZ 100 1000 4000
5 PCZ 50 500 2000
6 ICZ 100 1000 4000
7 HICZ 100 1000 4000
(4)样品处理
1)标准品前处理：每个校准品样品取50μL于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂(甲醇与乙腈的体积比为1:4)，高速振荡5min；在14000r/min，4℃离心5min后；转移EP管中的上清液60μL至塑料内衬管中，进样量1μL
2)血清样品前处理：取50μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂(甲醇与乙腈的体积比为1:4)，高速振荡5min；在14000r/min，4℃离心5min后；转移EP管中的上清液60μL至塑料内衬管中，进样量1μL。
3)质控品前处理：分别取质控品溶液QC(L)、QC(M)、QC(H)各50μL于1.5mL离心管中，然后与血清样品前处理一致，此处不再赘述。
分析试剂盒中各组分见表8。
表8抗结核病类药物分析试剂盒组分的制备(100人份)
Figure BDA0002515757390000121
Figure BDA0002515757390000131
备注：所述含内标的蛋白沉淀剂按照如下方法制备，取200μL上述混合内标溶液加入至19.8mL蛋白沉淀剂中，即得含内标的蛋白沉淀剂。含内标的蛋白沉淀剂最好现配现用.
四、方法验证
1.提取离子流色谱图：抗真菌药物的标准品和血清样品的峰形比较对称，且没有杂峰干扰，说明在此条件下能够得到良好的检测，图1为抗真菌药物标准品的提取离子流色谱图；图2为血清样本中抗真菌药物的提取离子流色谱图。
2.校准曲线：采用同位素内标定量法，利用TargetLynx软件以标准物与内标物的浓度比为X轴，标准物与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，并计算出血清中待测物的浓度。抗真菌药物在各自浓度范围内的线性拟合方程，线性良好，相关系数在0.99以上，满足定量要求，见表9。
表9抗真菌药物线性回归方程及线性相关系数
序号 化合物 保留时间(min) 线性范围(ng/mL) 线性方程 相关系数(r)
1 FCZ 2.16 200-40000 y＝0.000167598*x-0.00990376 0.9984
2 VCZ 2.87 50-10000 y＝0.00156148*x-0.00375731 0.9994
3 OVCZ 2.46 50-10000 y＝0.00065887*x-0.00224909 0.9985
4 PCZ 3.11 25-5000 y＝0.0115402*x+0.0336516 0.9997
5 ICZ 3.56 50-10000 y＝0.00340923*x-0.0565839 0.9965
6 HICZ 3.17 50-10000 y＝0.000804196*x-0.00657326 0.9999
7 CPF 2.37 100-20000 y＝0.000554567*x-0.00443162 0.9986
3.准确度考察：采用加标回收率试验评估方法的准确性。准备一混合空白血清样品，分别加入低、中、高3个浓度的标准品，以相同步骤重复处理并测定5次，结果显示，抗真菌药物的加标回收率在86.35％-112.10％之间，5次重复试验的RSD在1.34％-7.81％范围，统计结果见表10。
表10抗真菌药物加标回收率结果
Figure BDA0002515757390000141
Figure BDA0002515757390000151
4.精密度试验：取无干扰空白血清样本，加入不同浓度抗真菌药物标准品，得到低、中、高三个浓度血清样本，一天内重复处理6批，连续处理三天，以同位素内标法定量测定抗真菌药物的浓度，批内精密度为2.44～8.14％，三日内分3批处理，计算批间精密度为2.95～7.54％，结果见表11。
Figure BDA0002515757390000161
Figure BDA0002515757390000171
Figure BDA0002515757390000181
Figure BDA0002515757390000191
Figure BDA0002515757390000201
五、讨论
本发明建立了ID-UPLC-MS/MS一同测定人体血清中抗真菌药物的方法。血清用量少(仅需50μL)且前处理简单，且一针分析多种物质只需5min，简单快速。
采用同位素内标法定量不仅可以极大消除基质干扰，而且结果不受前处理过程、仪器响应波动等条件的影响，能够达到准确定量。以加标回收率试验评估方法的准确性，结果显示，抗真菌药物的加标回收率为86.35％-112.10％之间，5次重复试验的RSD为1.34％-7.81％，准确度良好。
方法的重现性结果表明，抗真菌药物批内精密度为2.44～8.14％，批间精密度为2.95～7.54％，方法的重现性良好。
总之，该方法灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程简单，5min之内完成化合物的分离和检测，准确度及精密度满足要求，可用于临床上血清抗真菌药物的定量分析，为相关的药物浓度监测提供一种可靠的检测方法。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可能对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (8)

1.一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗真菌药物的试剂盒，
所述抗真菌药物分别为：FCZ、VCZ、OVCZ、PCZ、ICZ、HICZ、CPF。
其特征在于，所述的试剂盒包含如下试剂：
(1)洗脱液：
流动相A：含0.01％～0.2％甲酸水溶液，流动相B：乙腈；
(2)校准品样本：
七个不同浓度点的校准品样本S7～S1：
S7：含CPF 20000ng/mL，VCZ/OVCZ/ICZ/HICZ 10000ng/mL，FCZ 40000ng/mL，PCZ5000ng/mL；
S6：含CPF10000 ng/mL，VCZ/OVCZ/ICZ/HICZ 5000，FCZ 20000ng/mL，PCZ 2500ng/mL；
S5：含CPF 5000ng/mL，VCZ/OVCZ/ICZ/HICZ 2500，FCZ 10000ng/mL，PCZ 1250ng/mL；
S4：含CPF 1000ng/mL，VCZ/OVCZ/ICZ/HICZ 500，FCZ 2000ng/mL，PCZ 250ng/mL；
S3：含CPF 500ng/mL，VCZ/OVCZ/ICZ/HICZ 250，FCZ 1000ng/mL，PCZ 125ng/mL；
S2：含CPF 200ng/mL，VCZ/OVCZ/ICZ/HICZ 100，FCZ 400ng/mL，PCZ 50ng/mL；
S1：含CPF 100ng/mL，VCZ/OVCZ/ICZ/HICZ 50，FCZ 200ng/mL，PCZ 25ng/mL；
(3)混合内标溶液：
包含有FCZ-d4 4000ng/mL、VCZ-d3 1000ng/mL、CPF-d4 2000ng/mL、OVCZ-d3 1000ng/mL、PCZ-d4 2000ng/mL、ICZ-d5 5000ng/mL、HICZ-d5 4000ng/mL的甲醇水溶液；
(4)蛋白质沉淀剂：
甲醇与乙腈混合溶液；
(5)质控品：
含有抗真菌药物的血清基质溶液，分为低、中、高三个浓度，分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)，其中，QC(L)中包含：FCZ 400ng/mL、VCZ 100ng/mL、CPF 200ng/mL、OVCZ 100ng/mL、PCZ50ng/mL、ICZ 100ng/mL、HICZ 100ng/mL；
QC(M)中包含：FCZ 4000ng/mL、VCZ 1000ng/mL、CPF 2000ng/mL、OVCZ 1000ng/mL、PCZ500ng/mL、ICZ 1000ng/mL、HICZ 1000ng/mL；
QC(H)中包含：FCZ 16000ng/mL、VCZ 4000ng/mL、CPF 8000ng/mL、OVCZ 4000ng/mL、PCZ2000ng/mL、ICZ 4000ng/mL、HICZ 4000ng/mL。
2.一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗真菌药物的试剂盒，
所述抗真菌药物分别为：FCZ、VCZ、OVCZ、PCZ、ICZ、HICZ、CPF。
其特征在于，所述的试剂盒包含如下试剂：
(1)洗脱液：
流动相A：含0.01％～0.2％甲酸水溶液，流动相B：乙腈；
(2)校准品样本：
包含有FCZ 800000ng/mL、VCZ 200000ng/mL、CPF 400000ng/mL、OVCZ 200000ng/mL、PCZ 100000ng/mL、ICZ 200000ng/mL、HICZ 200000ng/mL的混合标准溶液和空白血清基质；检测前按照使用说明书中记载的以下配方稀释配制成七个不同浓度点的校准品样本S7～S1和低、中、高三个浓度的质控品溶液QC(L)、QC(M)、QC(H)：
S7：含CPF 20000ng/mL，VCZ/OVCZ/ICZ/HICZ 10000ng/mL，FCZ 40000ng/mL，PCZ5000ng/mL；
S6：含CPF10000 ng/mL，VCZ/OVCZ/ICZ/HICZ 5000，FCZ 20000ng/mL，PCZ 2500ng/mL；
S5：含CPF 5000ng/mL，VCZ/OVCZ/ICZ/HICZ 2500，FCZ 10000ng/mL，PCZ 1250ng/mL；
S4：含CPF 1000ng/mL，VCZ/OVCZ/ICZ/HICZ 500，FCZ 2000ng/mL，PCZ 250ng/mL；
S3：含CPF 500ng/mL，VCZ/OVCZ/ICZ/HICZ 250，FCZ 1000ng/mL，PCZ 125ng/mL；
S2：含CPF 200ng/mL，VCZ/OVCZ/ICZ/HICZ 100，FCZ 400ng/mL，PCZ 50ng/mL；
S1：含CPF 100ng/mL，VCZ/OVCZ/ICZ/HICZ 50，FCZ 200ng/mL，PCZ 25ng/mL；
QC(L)中包含：FCZ 400ng/mL、VCZ 100ng/mL、CPF 200ng/mL、OVCZ 100ng/mL、PCZ50ng/mL、ICZ 100ng/mL、HICZ 100ng/mL；
QC(M)中包含：FCZ 4000ng/mL、VCZ 1000ng/mL、CPF 2000ng/mL、OVCZ 1000ng/mL、PCZ500ng/mL、ICZ 1000ng/mL、HICZ 1000ng/mL；
QC(H)中包含：FCZ 16000ng/mL、VCZ 4000ng/mL、CPF 8000ng/mL、OVCZ 4000ng/mL、PCZ2000ng/mL、ICZ 4000ng/mL、HICZ 4000ng/mL；
(3)混合内标溶液：
包含有FCZ-d4 4000ng/mL、VCZ-d3 1000ng/mL、CPF-d4 2000ng/mL、OVCZ-d3 1000ng/mL、PCZ-d4 2000ng/mL、ICZ-d5 5000ng/mL、HICZ-d5 4000ng/mL的甲醇水溶液；
(4)蛋白质沉淀剂：
甲醇与乙腈混合溶液；
(5)使用说明书：包含校准品样本S1～S7和低、中、高三个浓度的质控品溶液QC(L)、QC(M)、QC(H)的配制方法。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，
所述流动相A为0.01％～0.2％甲酸水溶液，优选为0.1％甲酸水溶液。
4.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，
所述蛋白质沉淀剂中甲醇与乙腈的体积比1:1～5；优选地，蛋白质沉淀剂中甲醇与乙腈的体积比1:4。
5.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述无干扰血清基质为无抗真菌药物的空白血清。
6.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，
所述试剂盒还包含色谱柱Agilent Zorbax Eclipse XDB C18，规格为3×100mm,1.8μm。
7.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，
所述的使用说明书中记载的低、中、高三个浓度的质控品溶液QC(L)、QC(M)、QC(H)的配制方法如下：
QC(L)为QC(M)用无干扰血清基质稀释至10倍；
QC(M)为上述混合标准溶液用无干扰血清基质稀释至200倍；
QC(H)为上述混合标准溶液用无干扰血清基质稀释至50倍。
8.权利要求1～2中任一项所述的试剂盒在利用超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗真菌药物中的应用。
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