CN108441460A - 一种高产羟基四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

一种高产羟基四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种高产羟基四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法与应用，所述菌株在大肠杆菌基因组上整合了由木糖启动子控制的来源于T7噬菌体的RNA聚合酶；敲除了编码高丝氨酸脱氢酶I的thrA基因；整合了来源于谷氨酸棒状杆菌的lysC基因、来源于伸长盐单胞菌Halomonas elongate的ectABC基因簇以及编码四氢嘧啶羟化酶的ectD基因，均由强启动子PT7启动，重构了羟基四氢嘧啶合成途径；在琥珀酰辅酶A合成酶sucCD位点整合了ectD基因，由强启动子PT7启动；是目前报道的发酵法生产羟基四氢嘧啶的最高水平。

Description

一种高产羟基四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其是一种高产羟基四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
羟基四氢嘧啶(1,4,5,6-四氢-2-甲基-5-羟基-4-嘧啶羧酸)是一种极性、易溶、生理pH范围内不带电荷的小分子有机物，最初是在Streptomyces parvulus中发现的。近年来，羟基四氢嘧啶在微生物细胞中作为相容性溶质已被广泛研究。研究发现，羟基四氢嘧啶不仅具有渗透调节功能，还可以在高温、干燥、高渗、冷冻等不良环境中保护和稳定核酸、细胞膜、蛋白质等物质的结构，并且羟基四氢嘧啶对蛋白的保护作用要优于四氢嘧啶和其他相容性溶质。目前羟基四氢嘧啶已经广泛应用于在医药、基因工程、化妆品等领域。
在医药领域的应用：羟基四氢嘧啶不仅可以加入药物中用于神经***疾病的治疗，还可以作为化疗过程中健康细胞的保护剂，另外羟基四氢嘧啶还有增强人工肺表面活性剂的作用；在基因工程技术领域的应用：羟基四氢嘧啶可以提高双链DNA的解链温度，因此可以作为聚合酶链式反应的增强剂；在化妆品中的应用：基于羟基四氢嘧啶的渗透保护功能，羟基四氢嘧啶可以作为保湿剂添加在化妆品中，既能防止皮肤干燥和衰老，又能减少紫外线对皮肤的伤害。
现阶段极少有关于微生物发酵法生产羟基四氢嘧啶的报道，由于嗜盐微生物中具有羟基四氢嘧啶的合成途径，因此仅有的报道中也大多是在中度嗜盐菌中发酵生产羟基四氢嘧啶。如Hisayo Ono等在NaCl浓度为2.56M时，在伸长盐单胞菌Halomonas elongate KS3中发酵生产羟基四氢嘧啶浓度达到45μg/mgBDM；也有将四氢嘧啶及羟基四氢嘧啶合成基因簇完整的拷贝到大肠杆菌中来发酵生产羟基四氢嘧啶，如Britta Seip等通过向大肠杆菌DH5α中导入来自于施氏假单胞菌的基因簇使其中羟基四氢嘧啶产量在低盐浓度下(2％NaCl)达到500μmol/(g DBM)。目前报道的羟基四氢嘧啶生产方法均产量低，达不到羟基四氢嘧啶的工业生产要求，另外，利用嗜盐菌发酵生产羟基四氢嘧啶需要高渗透压，因此对发酵设备要求高、损耗大。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种高产羟基四氢嘧啶的基因工程菌。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述高产羟基四氢嘧啶的基因工程菌的构建方法。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述高产羟基四氢嘧啶的基因工程菌的应用。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种高产羟基四氢嘧啶的基因工程菌，命名为E.coli HECT06，是以大肠杆菌为出发菌株，在其基因组上做如下改造而得到的：在大肠杆菌基因组上整合了由木糖启动子PxylF控制的来源于T7噬菌体的RNA聚合酶T7RNAP；敲除了编码高丝氨酸脱氢酶I的thrA基因，阻止L-天冬氨酸-β-半醛向分支代谢产物苏氨酸、赖氨酸、蛋氨酸的支路代谢；通过整合来源于谷氨酸棒状杆菌的lysC基因，由强启动子PT7启动，解除赖氨酸对四氢嘧啶合成途径中的关键酶天冬氨酸激酶Ask的反馈抑制；整合来源于伸长盐单胞菌Halomonas elongate的ectABC基因簇以及编码四氢嘧啶羟化酶的ectD基因，并由强启动子PT7启动，重构了羟基四氢嘧啶合成途径；在琥珀酰辅酶A合成酶sucCD位点整合了ectD基因，由强启动子PT7启动(由于四氢嘧啶羟化酶受α-酮戊二酸正调节，因此阻断TCA循环，增加α-酮戊二酸量，达到提高EctD酶活的目的)。
上述高产羟基四氢嘧啶的基因工程菌可通过所述方法重复制备得到，于实验室-80℃冰箱保存即可。
优选的，上述高产羟基四氢嘧啶的基因工程菌，所述大肠杆菌为E.coli W3110，保藏号ATCC 27325。
优选的，上述高产羟基四氢嘧啶的基因工程菌，所述木糖启动子PxylF具有序列表1所示核苷酸序列。
优选的，上述高产羟基四氢嘧啶的基因工程菌，所述RNA聚合酶T7RNAP具有序列表2所示核苷酸序列。
优选的，上述高产羟基四氢嘧啶的基因工程菌，所述thrA基因具有序列表3所示核苷酸序列。
优选的，上述高产羟基四氢嘧啶的基因工程菌，所述lysC基因具有序列表4所示核苷酸序列。
优选的，上述高产羟基四氢嘧啶的基因工程菌，所述强启动子PT7具有序列表5所示核苷酸序列。
优选的，上述高产羟基四氢嘧啶的基因工程菌，所述ectABC基因簇来源于H.elongata，保藏号CGMCC No.1.6329。
优选的，上述高产羟基四氢嘧啶的基因工程菌，所述ectABC基因簇具有序列表6所示核苷酸序列。
优选的，上述高产羟基四氢嘧啶的基因工程菌，所述编码四氢嘧啶羟化酶的ectD基因来源于H.elongata，保藏号CGMCC No.1.6329。
优选的，上述高产羟基四氢嘧啶的基因工程菌，所述ectD基因具有序列表7所示核苷酸序列。
上述高产羟基四氢嘧啶的基因工程菌的构建方法，采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术对E.coli W3110进行定向改造，具体步骤如下：
(1)在大肠杆菌(E.coli W3110，ATCC 27325)基因组上，将来源于T7噬菌体的RNA聚合酶(T7RNAP)基因整合在lacZ基因位点；
(2)为了减弱天冬氨酸支路代谢，将编码高丝氨酸脱氢酶I的thrA基因敲除；
(3)为增加前体物天冬氨酸半醛的供应，将来源于谷氨酸棒状杆菌的编码天冬氨酸激酶的lysC基因整合在yghX基因位点；
(4)将四氢嘧啶合成基因簇ectABC整合到ybeM基因位点，重构四氢嘧啶合成途径；
(5)将四氢嘧啶羟化酶基因ectD整合到trpR基因位点，重构羟基四氢嘧啶合成途径；
(6)为增加α-酮戊二酸量以提高EctD酶活，将ectD基因整合在编码琥珀酰辅酶A合成酶的sucCD基因位点。
上述基因工程菌在发酵生产羟基四氢嘧啶方面的应用。
优选的，上述基因工程菌的应用，具体方法为：
摇瓶发酵：
将菌种活化后制备种子液，按10-15％接种量接种到三角瓶中(终体积为30mL)，九层纱布封口，37℃，200r/min振荡培养，发酵过程中通过补加氨水维持pH在7.0-7.2；补加60％(m/v)葡萄糖溶液维持发酵进行(以苯酚红做指示剂)，发酵液颜色不再变化时即视为缺糖，缺糖时补加1-2mL 60％(m/v)葡萄糖溶液，发酵初始添加60％(m/v)木糖溶液(发酵液中木糖终浓度5-15g/L)诱导目的基因表达，发酵周期22-26h；或
发酵罐发酵：
将菌种活化后制备种子液，按照15-20％接种量接入新鲜的发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制pH稳定在7.0左右，温度维持在37℃，溶氧在30-40％；当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加80％(m/v)的葡萄糖溶液，维持发酵培养基中的葡萄糖浓度在0.1-5g/L；发酵周期36-40h。
优选的，上述基因工程菌的应用，所述摇瓶发酵中采用的发酵培养基组成为：葡萄糖20-40g/L，(NH4)2SO4 1-3g/L，KH2PO4 1-3g/L，MgSO4·7H2O 1-2g/L，酵母提取物0.1-0.3g/L，玉米浆1-2mL/L，FeSO4·7H2O 80-100mg/L，MnSO4·7H2O 80-100mg/L，α-酮戊二酸3-5g/L，其余为水，pH 7.0-7.2。
优选的，上述基因工程菌的应用，所述发酵罐发酵中采用的发酵培养基组成为：葡萄糖15-25g/L，酵母提取物1-5g/L，胰蛋白胨1-5g/L，柠檬酸钠0.1-1g/L，KH2PO4 1-5g/L，MgSO4·7H2O 0.1-1g/L，FeSO4·7H2O 80-100mg/L，MnSO4·H2O 80-100mg/L，VB1 0.5-1mg/L，VH 0.1-0.5mg/L，α-酮戊二酸3-5g/L，消泡剂2滴，其余为水，pH 7.0-7.2。
上述培养基均可采用标准方法制备获得。
本发明的有益效果是：
上述高产羟基四氢嘧啶的基因工程菌，具有良好的生长性状，羟基四氢嘧啶的生产效率高，且该菌遗传背景清晰，基因操作简单高效，方便对其进行进一步的性状改良；本发明所提供的产羟基四氢嘧啶菌种构建方法是一种定向的理性的菌种构建方法，相比传统诱变方法更为高效便捷，可操作性强，通过制定了相应的发酵过程控制方案，使重组的菌株在中度盐离子浓度或者是低的盐离子浓度的胁迫下就能以葡萄糖为原料催化合成羟基四氢嘧啶，可应用于羟基四氢嘧啶的高效工业化生产。
本发明提供的羟基四氢嘧啶的发酵工艺廉价高效，周期短，生产强度更高，并且发酵培养基成份简单，更有利于后续产品的分离纯化。采用本发明所提供的技术方案在5L发酵罐发酵36-40h可生产羟基四氢嘧啶17-24g/L，是目前报道的发酵法生产羟基四氢嘧啶的最高水平。
附图说明
图1(a)pREDCas9质粒图谱，(b)pGRB质粒图谱。
图2PxylF-T7RNAP重叠片段的构建及验证电泳图。其中，M：1kb DNA marker；1：重叠片段；2：阳性菌鉴定片段(鉴定引物)3：原菌对照(鉴定引物)。
图3thrA基因敲除片段构建及验证电泳图。其中，M：1kb DNA marker；1：上游同源臂；2：下游同源臂；3：重叠片段；4：阳性菌鉴定片段；5：原菌对照。
图4T7-lysC整合重叠片段的构建及验证电泳图。其中，M：1kb DNA marker；1：上游同源臂；2：lysC片段；3：下游同源臂；4：重叠片段；5：原菌对照；6：阳性菌鉴定片段。
图5T7-ectABC整合重叠片段的构建及验证电泳图。其中，M：1kb DNA marker；1：上游同源臂；2：ectABC片段；3：下游同源臂；4：重叠片段；5：原菌对照；6：阳性菌鉴定片段。
图6trpR::PT7-ectD基因整合片段构建及验证电泳图。其中：M：1kb DNA marker；1：上游同源臂；2：ectD片段；3：下游同源臂；4：重叠片段；5：原菌对照；6：阳性菌鉴定片段。
图7sucCD::PT7-ectD整合片段构建及验证电泳图。其中：M：1kb DNA marker；1：上游同源臂；2：ectD片段；3：下游同源臂；4：重叠片段；5：原菌对照(鉴定引物)；6：阳性菌鉴定片段(鉴定引物)。
图8菌株E.coli HECT06发酵过程曲线。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。
实施方案中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，指质量百分比，溶液的百分比指100mL中含有溶质的克数，液体之间的百分比，是指在25℃时溶液的体积比例。
所述菌株在大肠杆菌基因组上整合了由木糖启动子PxylF控制的来源于T7噬菌体的RNA聚合酶T7RNAP；敲除了编码高丝氨酸脱氢酶I的thrA基因；整合了来源于谷氨酸棒状杆菌的lysC基因、来源于伸长盐单胞菌Halomonas elongate的ectABC基因簇以及编码四氢嘧啶羟化酶的ectD基因，均由强启动子PT7启动，重构了羟基四氢嘧啶合成途径；在琥珀酰辅酶A合成酶sucCD位点整合了ectD基因，由强启动子PT7启动。从而达到摇瓶发酵22-26h后羟基四氢嘧啶的产量达到4.3-4.6g/L，5L发酵罐发酵36-40h后羟基四氢嘧啶的产量达到17-24g/L，是目前报道的发酵法生产羟基四氢嘧啶的最高水平。其中，
木糖启动子PxylF具有序列表1所示核苷酸序列；
RNA聚合酶T7RNAP具有序列表2所示核苷酸序列；
thrA基因具有序列表3所示核苷酸序列；
lysC基因具有序列表4所示核苷酸序列；
强启动子PT7具有序列表5所示核苷酸序列；
ectABC基因簇具有序列表6所示核苷酸序列；
ectD基因具有序列表7所示核苷酸序列。
实施例1
菌株E.coli HECT06的构建
1基因编辑的方法
本发明中采用的基因编辑方法参照文献(Li Y,Lin Z,Huang C,et al.Metabolicengineering of Escherichia coli using CRISPR–Cas9meditated genomeediting.Metabolic engineering,2015,31:13-21.)进行，该方法所用的两个质粒图谱见附图1。其中pREDCas9携带gRNA表达质粒pGRB的消除***，λ噬菌体的Red重组***及Cas9蛋白表达***，奇霉素抗性(工作浓度：100mg/L)，32℃培养；pGRB以pUC18为骨架，包括启动子J23100，gRNA-Cas9结合区域序列和终止子序列，氨苄青霉素抗性(工作浓度：100mg/L)，37℃培养。
该方法的具体步骤如下：
1.1.pGRB质粒构建
构建质粒pGRB的目的是为了转录相应的gRNA，从而与Cas9蛋白形成的复合体，并通过碱基配对和PAM识别目的基因靶位点，实现目的DNA双链断裂。采用包含靶序列的DNA片段与线性化的载体片段重组的方法构建pGRB质粒。
1.1.1靶序列设计
使用CRISPR RGEN Tools设计靶序列(PAM:5’-NGG-3’)
1.1.2包含靶序列的DNA片段的制备
设计引物：5’-线性化载体末端序列(15bp)-酶切位点-靶序列(不包括PAM序列)-线性化载体末端序列(15bp)-3’及其反向互补的引物，通过单链DNA的退火制备包含靶序列的DNA片段。反应条件：预变性95℃，5min；退火30-50℃，1min。退火体系如下表1：
表1退火体系
1.1.3线性载体的制备
载体的线性化采用反向PCR扩增的方法。
1.1.4重组反应
重组体系如下表2。所用重组酶均为IIOne Step Cloning Kit系列的酶，重组条件：37℃，30min。
表2重组体系
1.1.5质粒的转化
取10μL反应液，加入到100mL DH5α化转感受态细胞中，轻轻混匀后冰浴20min，42℃热激45-90s，立即冰浴2-3min，加入900μL SOC，于37℃复苏1h。8000rpm离心2min，弃部分上清，留200μL左右将菌体重悬后涂布到含有100mg/L氨苄青霉素的平板，将平板倒置，于37℃过夜培养。待平板长出单菌落后通过菌落PCR鉴定，挑选阳性重组子。
1.1.6克隆鉴定
将PCR阳性菌落接种至含有100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中过夜培养后保菌，提取质粒，酶切鉴定。
1.2重组DNA片段的制备
用于敲除的重组片段由需敲除基因的上下游同源臂组成(上游同源臂-下游同源臂)；用于整合的重组片段以整合位点的上下游同源臂及待整合的基因片段组成(上游同源臂-目的基因-下游同源臂)。利用引物设计软件primer5，以待敲除基因或待整合位点的上下游序列为模板，设计上下游同源臂引物(扩增长度约400-500bp)；以待整合基因为模板，设计整合基因的扩增引物。通过PCR的方法分别扩增上下游同源臂和目的基因片段后，再经过重叠PCR制备重组片段。PCR的体系和方法如下表3：
表3PCR扩增体系
重叠PCR的体系如下表4：
表4重叠PCR扩增体系
注：模板由上下游同源臂的扩增片段和目的基因等摩尔组成，且总量不超过10ng。
PCR反应条件(宝生物PrimeSTAR HS酶)：预变性(95℃)5min；然后进行30轮循环：变性(98℃)10s，退火((Tm-3/5)℃)15s，72℃延伸(此酶活力1min延伸约1kb)；72℃继续延伸10min；维持(4℃)。
1.3质粒和重组DNA片段的转化
1.3.1 pREDCas9的转化
利用电转的方法将pREDCas9质粒电转至W3110的电转感受态中，将菌体复苏培养后涂布于含奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养。抗性平板上生长单菌落用鉴定引物进行菌落PCR,筛选阳性重组子。
1.3.2含pREDCas9的目的菌株电转化感受态制备
32℃培养至OD600＝0.1～0.2时，添加0.1M的IPTG(使其终浓度为0.1mM)，继续培养至OD600＝0.6～0.7时进行感受态制备。添加IPTG的目的是使pREDCas9质粒上的重组酶诱导表达。感受态制备所需培养基及制备过程参照常规标准操作。
1.3.3pGRB和重组DNA片段的转化
将pGRB和供体DNA片段同时电转化至含有pREDCas9的电转感受态细胞中。将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养。用上游同源臂上游引物和下游同源臂的下游引物，或设计专门的鉴定引物，进行菌落PCR验证，筛选阳性重组子并保菌。
1.4质粒的消除
1.4.1 pGRB的消除
将阳性重组子置于含有0.2％***糖的LB培养基中过夜培养，适量稀释后涂布于含有奇霉素抗性的LB平板上，32℃过夜培养。对点含有氨苄青霉素和奇霉素抗性的LB平板，挑选氨苄青霉素平板不生长，奇霉素抗性平板生长的单菌落保菌。
1.4.2 pREDCas9质粒的消除
将阳性重组子转接到无抗性的LB液体培养基中，42℃过夜培养，适量稀释后涂布于无抗性的LB平板上，37℃过夜培养。对点含有奇霉素抗性和无抗性的LB平板，挑选奇霉素抗性平板不生长，无抗性平板生长的单菌落保菌。
2.菌株构建的具体过程
2.1将来源于T7噬菌体的T7RNA聚合酶基因T7RNAP整合在E.coli W3110基因组上的lacZ基因位点
本发明中将T7噬菌体的T7RNA聚合酶基因T7RNAP整合在E.coli W3110基因组上的lacZ基因位点处，并由启动子PxylF启动该外源基因的转录表达，构建了菌株E.coli W3110HECT01。以E.coli W3110(ATCC27325)基因组为模板，根据其lacZ基因的上下游序列设计上游同源臂引物(lacZ-1、lacZ-2)、下游同源臂引物(lacZ-3、lacZ-4)和启动子PxylF引物(xylF-F、xylF-R)，并PCR扩增其上下游同源臂片段及木糖启动子片段；以E.coli BL21(DE3)基因组为模板，根据T7RNAP基因序列设计引物(lacZ-T7RNAP-up、lacZ-T7RNAP-down)，PCR扩增获取T7RNAP片段。上述片段通过重叠PCR的方法获得T7RNAP基因的整合片段(上游同源臂-PxylF-T7RNAP-下游同源臂)，通过引物gRNA-lacZ-F和gRNA-lacZ-R退火后重组构建pGRB-lacZ-gRNA，以转录出用于结合在lacZ位点的gRNA。制备E.coli W3110的感受态细胞，按照1.3和1.4所示的方法操作，最终获得菌株E.coli HECT01。PxylF-T7RNAP片段整合过程中，整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图2。其中重叠片段的长度为5000bp，利用鉴定引物(J-lacZ-F、J-lacZ-R)通过PCR验证重组子时，阳性重组子所扩增的片段长度应为731bp，原菌无扩增片段。
2.2将编码高丝氨酸脱氢酶I的thrA基因敲除
本发明中将编码高丝氨酸脱氢酶I的thrA基因敲除，构建了菌株E.coli W3110HECT02。以E.coli W3110(ATCC27325)基因组为模板，根据thrA基因的上下游序列设计上游同源臂引物(thrA-1、thrA-2)和下游同源臂引物(thrA-3、thrA-4)，并PCR扩增其上下游同源臂片段；上述片段通过重叠PCR的方法获得thrA基因的敲除片段(上游同源臂-下游同源臂)，通过引物gRNA-thrA-F和gRNA-thrA-R退火后重组构建pGRB-thrA-，以转录出用于结合在thrA位点的gRNA。制备E.coli W3110 HECT01的感受态细胞，按照1.3和1.4所示的方法操作，最终获得菌株E.coli HECT02。thrA基因敲除过程中，敲除片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图3。其中上游同源臂长度约500bp，下游同源臂长度约700bp，重叠片段的长度约1200bp，PCR验证重组子时，阳性重组子所扩增的片段长度应约1200bp，原菌扩增出来的片段长度约2000bp。
2.3将来源于谷氨酸棒状杆菌的lysC基因整合在E.coli HECT03的yghX基因位点
本发明中将来源于谷氨酸棒状杆菌的lysC基因整合在E.coli HECT03的yghX基因位点处，并由启动子PT7启动该外源基因的转录表达，构建了菌株E.coli W3110 HECT03。以E.coli W3110(ATCC27325)基因组为模板，根据其yghX基因的上下游序列设计上游同源臂引物(yghX-1、yghX-2)和下游同源臂引物(yghX-3、yghX-4)，并PCR扩增其上下游同源臂片段；以谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032基因组为模板，根据其lysC基因序列设计引物(yghX-lysC-F、yghX-lysC-R)，并PCR扩增lysC片段；启动子PT7则设计在上游同源臂的下游引物和lysC基因的上游引物中。上述片段通过重叠PCR的方法获得lysC基因的整合片段(上游同源臂-PT7-lysC-下游同源臂)，通过引物gRNA-yghX-F和gRNA-yghX-R退火后重组构建pGRB-yghX-，以转录出用于结合在yghX位点的gRNA。制备E.coliW3110 HECT02的感受态细胞，按照1.3和1.4所示的方法操作，最终获得菌株E.coliHECT03。PT7-lysC片段整合过程中，整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图4。其中上游同源臂长度为418bp，lysC基因片段长度为1500bp，下游同源臂长度为480bp，重叠片段的长度约2400bp，PCR验证重组子时，阳性重组子所扩增的片段长度约2400bp，原菌扩增出来的片段长度应为1732bp。
2.4将来源于伸长盐单胞菌的四氢嘧啶合成基因簇整合在E.coli HECT03的ybeM基因位点
本发明中将H.elongata中的四氢嘧啶合成基因簇ectABC整合在E.coli W3110HECT03基因组上的ybeM基因位点处，并由启动子PT7启动该外源基因的转录表达，构建了菌株E.coli W3110 HECT04。以E.coli W3110(ATCC27325)基因组为模板，根据其ybeM基因的上下游序列设计上游同源臂引物(ybeM-1、ybeM-2)和下游同源臂引物(ybeM-3、ybeM-4)，并PCR扩增其上下游同源臂片段；以H.elongata(CGMCC No.1.6329)基因组为模板，根据其ectABC基因序列设计引物(ybeM-ectABC-F、ybeM-ectABC-R)，并PCR扩增ectABC片段；启动子PT7则设计在上游同源臂的下游引物和ectABC基因的上游引物中。上述片段通过重叠PCR的方法获得ectABC基因的整合片段(上游同源臂-PT7-ectABC-下游同源臂)，通过引物gRNA-ybeM-F和gRNA-ybeM-R退火后重组构建pGRB-ybeM-，以转录出用于结合在ybeM位点的gRNA。制备E.coli W3110 HECT03的感受态细胞，按照1.3和1.4所示的方法操作，最终获得菌株E.coli HECT04。PT7-ectABC片段整合过程中，整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图5。其中上游同源臂长度为488bp，ectABC基因片段长度为2500bp，下游同源臂长度为645bp，重叠片段的长度为3640bp，PCR验证重组子时，阳性重组子所扩增的片段长度应为3640bp，原菌扩增出来的片段长度应为2000bp。
2.5将来源于伸长盐单胞菌的四氢嘧啶羟化酶基因整合在E.coli HECT04的trpR基因位点
本发明中将H.elongata中的四氢嘧啶羟化酶基因ectD整合在E.coli W3110HECT04基因组上的trpR基因位点处，并由启动子PT7启动该外源基因的转录表达，构建了菌株E.coli W3110 HECT01b。以E.coli W3110(ATCC27325)基因组为模板，根据其trpR基因的上下游序列设计上游同源臂引物(trpR-1、trpR-2)和下游同源臂引物(trpR-3、trpR-4)，并PCR扩增其上下游同源臂片段；以H.elongata(CGMCC No.1.6329)基因组为模板，根据其ectD基因序列设计引物(trpR-ectD-F、trpR-ectD-R)，并PCR扩增ectD片段；启动子PT7则设计在上游同源臂的下游引物和ectD基因的上游引物中。上述片段通过重叠PCR的方法获得ectD基因的整合片段(上游同源臂-PT7-ectD-下游同源臂)，通过引物gRNA-trpR-F和gRNA-trpR-R退火后重组构建pGRB-trpR-，以转录出用于结合在trpR位点的gRNA。制备E.coliW3110 HECT04的感受态细胞，按照1.3和1.4所示的方法操作，最终获得菌株E.coliHECT05。PT7-ectD片段整合过程中，整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图6。其中上游同源臂长度为585bp，ectD基因片段长度为999bp，下游同源臂长度为532bp，重叠片段的长度为2252bp，PCR验证重组子时，阳性重组子所扩增的片段长度应为2252bp，原菌扩增出来的片段长度应为1523bp。
2.6将来源于伸长盐单胞菌的四氢嘧啶羟化酶基因整合在W3110 HECT05的sucCD基因位点
以E.coli W3110(ATCC27325)基因组为模板，根据其sucCD基因的上下游序列设计上游同源臂引物(sucCD-1、sucCD-2)和下游同源臂引物(sucCD-3、sucCD-4)，并PCR扩增其上下游同源臂片段；以H.elongata(CGMCC No.1.6329)基因组为模板，根据其ectD基因序列设计引物(sucCD-ectD-F、sucCD-ectD-R)，并PCR扩增ectD片段；启动子PT7则设计在上游同源臂的下游引物和ectD基因的上游引物中。上述片段通过重叠PCR的方法获得ectD基因的整合片段(上游同源臂-PT7-ectD-下游同源臂)，通过引物gRNA-sucCD-F和gRNA-sucCD-R退火后重组构建pGRB-sucCD-，以转录出用于结合在sucCD位点的gRNA。制备E.coli W3110HECT05的感受态细胞，按照1.3和1.4所示的方法操作，最终获得菌株E.coli HECT06。PT7-ectD片段整合过程中，整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图7。其中上游同源臂长度为616bp，ectD基因片段长度为999bp，下游同源臂长度为487bp，重叠片段的长度为2238bp，利用鉴定引物(J-sucCD-F、J-sucCD-R)通过PCR验证重组子时，阳性重组子所扩增的片段长度应为751bp，原菌无扩增片段。
3.菌株构建过程中用到的引物
菌株构建过程中所涉及的所有引物见下表5：
表5
实施例2
利用基因工程菌E.coli HECT06发酵生产羟基四氢嘧啶的方法如下：
(1)摇瓶发酵：
斜面培养：取-80℃保藏菌种划线接种于活化斜面，37℃培养12h，并传代一次；
摇瓶种子培养：用接种环刮取一环斜面种子接种于装有30mL种子培养基的500mL三角瓶中，九层纱布封口，37℃，200rpm培养7-10h；
摇瓶发酵培养：按10-15％接种量接种到装有发酵培养基的500mL三角瓶中(终体积为30mL)，九层纱布封口，37℃，200r/min振荡培养，发酵过程中通过补加氨水维持pH在7.0-7.2；补加60％(m/v)葡萄糖溶液维持发酵进行(以苯酚红做指示剂，发酵液颜色不再变化时即视为缺糖，缺糖时补加1-2mL 60％(m/v)葡萄糖溶液)，发酵初始添加60％(m/v)木糖溶液(发酵液中木糖终浓度5-15g/L)诱导目的基因表达，发酵周期24-30h；
斜面培养基组成为：葡萄糖1-5g/L，蛋白胨5-10g/L，牛肉膏5-10g/L，酵母粉1-5g/L，NaCl 1-2.5g/L，琼脂15-20g/L，其余为水，pH 7.0-7.2；
种子培养基组成为：葡萄糖20-30g/L，(NH4)2SO4 1-5g/L，KH2PO4 1-5g/L，MgSO4·7H2O 1-2g/L，酵母提取物5-10g/L，FeSO4·7H2O 1-3mg/L，MnSO4·H2O 1-3mg/L，其余为水，pH 7.0-7.2；
发酵培养基组成为：葡萄糖20-40g/L，(NH4)2SO4 1-3g/L，KH2PO4 1-3g/L，MgSO4·7H2O 1-2g/L，酵母提取物0.1-0.3g/L，玉米浆1-2mL/L，FeSO4·7H2O 80-100mg/L，MnSO4·7H2O 80-100mg/L，α-酮戊二酸3-5g/L，其余为水，pH 7.0-7.2。
摇瓶发酵22-26h后羟基四氢嘧啶的产量可达4.3-4.6g/L。
(2)发酵罐发酵：
斜面活化培养：从-80℃冰箱保菌管中刮一环菌种，均匀涂布于活化斜面，37℃培养12-16h，转接茄形瓶继续培养12-16h；
种子培养：取适量无菌水于茄形瓶中，将菌悬液接入种子培养基中，pH稳定在7.0左右，温度恒定在37℃，溶氧在25-35％之间，培养至细胞干重达到5-6g/L；
发酵培养：按照15-20％接种量接入新鲜的发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制pH稳定在7.0左右，温度维持在37℃，溶氧在30-40％之间；当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加80％(m/v)的葡萄糖溶液，维持发酵培养基中的葡萄糖浓度在0.1-5g/L；发酵周期36-40h；
斜面培养基组成为：葡萄糖1-5g/L，蛋白胨5-10g/L，牛肉膏5-10g/L，酵母粉1-5g/L，NaCl 1-2.5g/L，琼脂15-20g/L，其余为水，pH 7.0-7.2；
种子培养基组成为：葡萄糖15-30g/L，酵母提取物5-10g/L，胰蛋白胨5-10g/L，KH2PO4 5-15g/L，MgSO4·7H2O 2-5g/L，FeSO4·7H2O 5-15mg/L，MnSO4·H2O 5-15mg/L，VB11-3mg/L，VH 0.1-1mg/L，消泡剂2滴，其余为水，pH 7.0-7.2。
发酵培养基组成为：葡萄糖15-25g/L，酵母提取物1-5g/L，胰蛋白胨1-5g/L，柠檬酸钠0.1-1g/L，KH2PO4 1-5g/L，MgSO4·7H2O 0.1-1g/L，FeSO4·7H2O 80-100mg/L，MnSO4·H2O 80-100mg/L，VB1 0.5-1mg/L，VH 0.1-0.5mg/L，α-酮戊二酸3-5g/L，消泡剂2滴，其余为水，pH 7.0-7.2
5L发酵罐发酵36-40h后羟基四氢嘧啶的产量可达17-24g/L。
实施例3
菌株E.coli HECT06在5L发酵罐上的发酵实验：
斜面活化培养：从-80℃冰箱保菌管中刮一环菌种，均匀涂布于活化斜面，37℃培养12h，转接茄形瓶继续培养12h；
种子培养：取适量无菌水于茄形瓶中，将菌悬液接入种子培养基中，pH稳定在7.0左右，温度恒定在37℃，溶氧在25-35％之间，培养6h；
发酵培养：按照15％接种量接入新鲜的发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制pH稳定在7.0左右，温度维持在37℃，溶氧在30-40％之间；当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加80％(m/v)的葡萄糖溶液，维持发酵培养基中的葡萄糖浓度在0.1-.5g/L；发酵周期40h；
斜面培养基组成为：葡萄糖1g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，NaCl2.5g/L，琼脂25g/L，其余为水，pH 7.0；
种子培养基组成为：葡萄糖15g/L，Yeast Extract 5g/L，Tryptone 5g/L，KH2PO45g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，FeSO4·7H2O 5mg/L，MnSO4·H2O 5mg/L，VB1 1mg/L，VH 0.1mg/L，消泡剂2滴，其余为水，pH 7.0。
发酵培养基组成为：葡萄糖15g/L，Yeast Extract 1g/L，Tryptone 1g/L，柠檬酸钠0.1g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，FeSO4·7H2O 80mg/L，MnSO4·H2O 80mg/L，VB10.5mg/L，VH 0.1mg/L，α-酮戊二酸5g/L，消泡剂2滴，其余为水，pH 7.0。
5L发酵罐发酵40h后羟基四氢嘧啶的产量达到了24g/L。发酵过程曲线见附图8。
上述参照具体实施方式对该一种高产羟基四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法与应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 天津科技大学
<120> 一种高产羟基四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法与应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 268
<212> DNA
<213> 木糖启动子PxylF(E.coli)
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(268)
<400> 1
gagataattc acaagtgtgc gctcgctcgc aaaataaaat ggaatgatga aactgggtaa 60
ttcctcgaag agaaaaatgc aataagtaca attgcgcaac aaaagtaaga tctcggtcat 120
aaatcaagaa ataaaccaaa aatcgtaatc gaaagataaa aatctgtaat tgttttcccc 180
tgtttagttg ctaaaaattg gttacgttta tcgcggtgat tgttacttat taaaactgtc 240
ctctaactac agaaggccct acaccatg 268
<210> 2
<211> 2652
<212> DNA
<213> RNA聚合酶T7RNAP(E.coli BL21DE3)
<220>
<221> protein_bind
<222> (1)..(2652)
<400> 2
atgaacacga ttaacatcgc taagaacgac ttctctgaca tcgaactggc tgctatcccg 60
ttcaacactc tggctgacca ttacggtgag cgtttagctc gcgaacagtt ggcccttgag 120
catgagtctt acgagatggg tgaagcacgc ttccgcaaga tgtttgagcg tcaacttaaa 180
gctggtgagg ttgcggataa cgctgccgcc aagcctctca tcactaccct actccctaag 240
atgattgcac gcatcaacga ctggtttgag gaagtgaaag ctaagcgcgg caagcgcccg 300
acagccttcc agttcctgca agaaatcaag ccggaagccg tagcgtacat caccattaag 360
accactctgg cttgcctaac cagtgctgac aatacaaccg ttcaggctgt agcaagcgca 420
atcggtcggg ccattgagga cgaggctcgc ttcggtcgta tccgtgacct tgaagctaag 480
cacttcaaga aaaacgttga ggaacaactc aacaagcgcg tagggcacgt ctacaagaaa 540
gcatttatgc aagttgtcga ggctgacatg ctctctaagg gtctactcgg tggcgaggcg 600
tggtcttcgt ggcataagga agactctatt catgtaggag tacgctgcat cgagatgctc 660
attgagtcaa ccggaatggt tagcttacac cgccaaaatg ctggcgtagt aggtcaagac 720
tctgagacta tcgaactcgc acctgaatac gctgaggcta tcgcaacccg tgcaggtgcg 780
ctggctggca tctctccgat gttccaacct tgcgtagttc ctcctaagcc gtggactggc 840
attactggtg gtggctattg ggctaacggt cgtcgtcctc tggcgctggt gcgtactcac 900
agtaagaaag cactgatgcg ctacgaagac gtttacatgc ctgaggtgta caaagcgatt 960
aacattgcgc aaaacaccgc atggaaaatc aacaagaaag tcctagcggt cgccaacgta 1020
atcaccaagt ggaagcattg tccggtcgag gacatccctg cgattgagcg tgaagaactc 1080
ccgatgaaac cggaagacat cgacatgaat cctgaggctc tcaccgcgtg gaaacgtgct 1140
gccgctgctg tgtaccgcaa ggacaaggct cgcaagtctc gccgtatcag ccttgagttc 1200
atgcttgagc aagccaataa gtttgctaac cataaggcca tctggttccc ttacaacatg 1260
gactggcgcg gtcgtgttta cgctgtgtca atgttcaacc cgcaaggtaa cgatatgacc 1320
aaaggactgc ttacgctggc gaaaggtaaa ccaatcggta aggaaggtta ctactggctg 1380
aaaatccacg gtgcaaactg tgcgggtgtc gataaggttc cgttccctga gcgcatcaag 1440
ttcattgagg aaaaccacga gaacatcatg gcttgcgcta agtctccact ggagaacact 1500
tggtgggctg agcaagattc tccgttctgc ttccttgcgt tctgctttga gtacgctggg 1560
gtacagcacc acggcctgag ctataactgc tcccttccgc tggcgtttga cgggtcttgc 1620
tctggcatcc agcacttctc cgcgatgctc cgagatgagg taggtggtcg cgcggttaac 1680
ttgcttccta gtgaaaccgt tcaggacatc tacgggattg ttgctaagaa agtcaacgag 1740
attctacaag cagacgcaat caatgggacc gataacgaag tagttaccgt gaccgatgag 1800
aacactggtg aaatctctga gaaagtcaag ctgggcacta aggcactggc tggtcaatgg 1860
ctggcttacg gtgttactcg cagtgtgact aagcgttcag tcatgacgct ggcttacggg 1920
tccaaagagt tcggcttccg tcaacaagtg ctggaagata ccattcagcc agctattgat 1980
tccggcaagg gtctgatgtt cactcagccg aatcaggctg ctggatacat ggctaagctg 2040
atttgggaat ctgtgagcgt gacggtggta gctgcggttg aagcaatgaa ctggcttaag 2100
tctgctgcta agctgctggc tgctgaggtc aaagataaga agactggaga gattcttcgc 2160
aagcgttgcg ctgtgcattg ggtaactcct gatggtttcc ctgtgtggca ggaatacaag 2220
aagcctattc agacgcgctt gaacctgatg ttcctcggtc agttccgctt acagcctacc 2280
attaacacca acaaagatag cgagattgat gcacacaaac aggagtctgg tatcgctcct 2340
aactttgtac acagccaaga cggtagccac cttcgtaaga ctgtagtgtg ggcacacgag 2400
aagtacggaa tcgaatcttt tgcactgatt cacgactcct tcggtaccat tccggctgac 2460
gctgcgaacc tgttcaaagc agtgcgcgaa actatggttg acacatatga gtcttgtgat 2520
gtactggctg atttctacga ccagttcgct gaccagttgc acgagtctca attggacaaa 2580
atgccagcac ttccggctaa aggtaacttg aacctccgtg acatcttaga gtcggacttc 2640
gcgttcgcgt aa 2652
<210> 3
<211> 2463
<212> DNA
<213> thrA基因(E.coli W3110ATCC 27325)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(2463)
<400> 3
atgcgagtgt tgaagttcgg cggtacatca gtggcaaatg cagaacgttt tctgcgtgtt 60
gccgatattc tggaaagcaa tgccaggcag gggcaggtgg ccaccgtcct ctctgccccc 120
gccaaaatca ccaaccacct ggtggcgatg attgaaaaaa ccattagcgg ccaggatgct 180
ttacccaata tcagcgatgc cgaacgtatt tttgccgaac ttttgacggg actcgccgcc 240
gcccagccgg ggttcccgct ggcgcaattg aaaactttcg tcgatcagga atttgcccaa 300
ataaaacatg tcctgcatgg cattagtttg ttggggcagt gcccggatag catcaacgct 360
gcgctgattt gccgtggcga gaaaatgtcg atcgccatta tggccggcgt attagaagcg 420
cgcggtcaca acgttactgt tatcgatccg gtcgaaaaac tgctggcagt ggggcattac 480
ctcgaatcta ccgtcgatat tgctgagtcc acccgccgta ttgcggcaag ccgcattccg 540
gctgatcaca tggtgctgat ggcaggtttc accgccggta atgaaaaagg cgaactggtg 600
gtgcttggac gcaacggttc cgactactct gctgcggtgc tggctgcctg tttacgcgcc 660
gattgttgcg agatttggac ggacgttgac ggggtctata cctgcgaccc gcgtcaggtg 720
cccgatgcga ggttgttgaa gtcgatgtcc taccaggaag cgatggagct ttcctacttc 780
ggcgctaaag ttcttcaccc ccgcaccatt acccccatcg cccagttcca gatcccttgc 840
ctgattaaaa ataccggaaa tcctcaagca ccaggtacgc tcattggtgc cagccgtgat 900
gaagacgaat taccggtcaa gggcatttcc aatctgaata acatggcaat gttcagcgtt 960
tctggtccgg ggatgaaagg gatggtcggc atggcggcgc gcgtctttgc agcgatgtca 1020
cgcgcccgta tttccgtggt gctgattacg caatcatctt ccgaatacag catcagtttc 1080
tgcgttccac aaagcgactg tgtgcgagct gaacgggcaa tgcaggaaga gttctacctg 1140
gaactgaaag aaggcttact ggagccgctg gcagtgacgg aacggctggc cattatctcg 1200
gtggtaggtg atggtatgcg caccttgcgt gggatctcgg cgaaattctt tgccgcactg 1260
gcccgcgcca atatcaacat tgtcgccatt gctcagggat cttctgaacg ctcaatctct 1320
gtcgtggtaa ataacgatga tgcgaccact ggcgtgcgcg ttactcatca gatgctgttc 1380
aataccgatc aggttatcga agtgtttgtg attggcgtcg gtggcgttgg cggtgcgctg 1440
ctggagcaac tgaagcgtca gcaaagctgg ctgaagaata aacatatcga cttacgtgtc 1500
tgcggtgttg ccaactcgaa ggctctgctc accaatgtac atggccttaa tctggaaaac 1560
tggcaggaag aactggcgca agccaaagag ccgtttaatc tcgggcgctt aattcgcctc 1620
gtgaaagaat atcatctgct gaacccggtc attgttgact gcacttccag ccaggcagtg 1680
gcggatcaat atgccgactt cctgcgcgaa ggtttccacg ttgtcacgcc gaacaaaaag 1740
gccaacacct cgtcgatgga ttactaccat cagttgcgtt atgcggcgga aaaatcgcgg 1800
cgtaaattcc tctatgacac caacgttggg gctggattac cggttattga gaacctgcaa 1860
aatctgctca atgcaggtga tgaattgatg aagttctccg gcattctttc tggttcgctt 1920
tcttatatct tcggcaagtt agacgaaggc atgagtttct ccgaggcgac cacgctggcg 1980
cgggaaatgg gttataccga accggacccg cgagatgatc tttctggtat ggatgtggcg 2040
cgtaaactat tgattctcgc tcgtgaaacg ggacgtgaac tggagctggc ggatattgaa 2100
attgaacctg tgctgcccgc agagtttaac gccgagggtg atgttgccgc ttttatggcg 2160
aatctgtcac aactcgacga tctctttgcc gcgcgcgtgg cgaaggcccg tgatgaagga 2220
aaagttttgc gctatgttgg caatattgat gaagatggcg tctgccgcgt gaagattgcc 2280
gaagtggatg gtaatgatcc gctgttcaaa gtgaaaaatg gcgaaaacgc cctggccttc 2340
tatagccact attatcagcc gctgccgttg gtactgcgcg gatatggtgc gggcaatgac 2400
gttacagctg ccggtgtctt tgctgatctg ctacgtaccc tctcatggaa gttaggagtc 2460
tga 2463
<210> 4
<211> 1266
<212> DNA
<213> lysC基因(C.glutamicum ATCC 13032)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1266)
<400> 4
gtggccctgg tcgtacagaa atatggcggt tcctcgcttg agagtgcgga acgcattaga 60
aacgtcgctg aacggatcgt tgccaccaag aaggctggaa atgatgtcgt ggttgtctgc 120
tccgcaatgg gagacaccac ggatgaactt ctagaacttg cagcggcagt gaatcccgtt 180
ccgccagctc gtgaaatgga tatgctcctg actgctggtg agcgtatttc taacgctctc 240
gtcgccatgg ctattgagtc ccttggcgca gaagcccaat ctttcacggg ctctcaggct 300
ggtgtgctca ccaccgagcg ccacggaaac gcacgcattg ttgatgtcac tccaggtcgt 360
gtgcgtgaag cactcgatga gggcaagatc tgcattgttg ctggtttcca gggtgttaat 420
aaagaaaccc gcgatgtcac cacgttgggt cgtggtggtt ctgacaccac tgcagttgcg 480
ttggcagctg ctttgaacgc tgatgtgtgt gagatttact cggacgttga cggtgtgtat 540
accgctgacc cgcgcatcgt tcctaatgca cagaagctgg aaaagctcag cttcgaagaa 600
atgctggaac ttgctgctgt tggctccaag attttggtgc tgcgcagtgt tgaatacgct 660
cgtgcattca atgtgccact tcgcgtacgc tcgtcttata gtaatgatcc cggcactttg 720
attgccggct ctatggagga tattcctgtg gaagaagcag tccttaccgg tgtcgcaacc 780
gacaagtccg aagccaaagt aaccgttctg ggtatttccg ataagccagg cgaggctgcg 840
aaggttttcc gtgcgttggc tgatgcagaa atcaacattg acatggttct gcagaacgtc 900
tcttctgtag aagacggcac caccgacatc accttcacct gccctcgttc cgacggccgc 960
cgcgcgatgg agatcttgaa gaagcttcag gttcagggca actggaccaa tgtgctttac 1020
gacgaccagg tcggcaaagt ctccctcgtg ggtgctggca tgaagtctca cccaggtgtt 1080
accgcagagt tcatggaagc tctgcgcgat gtcaacgtga acatcgaatt gatttccacc 1140
tctgagattc gtatttccgt gctgatccgt gaagatgatc tggatgctgc tgcacgtgca 1200
ttgcatgagc agttccagct gggcggcgaa gacgaagccg tcgtttatgc aggcaccgga 1260
cgctaa 1266
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 强启动子PT7(promoter)
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(19)
<400> 5
taatacgact cactatagg 19
<210> 6
<211> 2259
<212> DNA
<213> ectABC基因簇(H.elongata CGMCC 1.6329)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(2259)
<400> 6
atgaacgcaa ccacagagcc ctttacaccc tccgccgacc tggccaagcc cagcgtggcc 60
gatgccgtgg tcggccatga ggcctcaccg ctcttcatcc gcaagccaag ccccgatgac 120
ggctggggca tctacgagct ggtcaagtcc tgtccgcctc tcgacgtcaa ttccgcctac 180
gcctatctgt tgctggccac ccagttccgc gatagctgcg ccgtggcgac caacgaagag 240
ggcgagatcg tcggcttcgt ttccggctac gtgaagagca acgcccccga tacctatttc 300
ctctggcagg ttgccgtggg cgagaaggca cgtggcaccg gcctggcccg tcgtctggtg 360
gaagccgtga tgacacgccc ggaaatggcc gaggtccacc atctcgagac cactatcacg 420
cccgacaacc aggcgtcctg gggcttgttc cgccgtctcg ccgatcgctg gcaggcgccg 480
ttgaacagcc gcgaatactt ctccaccgat caactcggcg gtgagcatga cccggaaaac 540
ctcgttcgca tcggcccgtt ccagaccgac cagatctgaa tgcagaccca gattctcgaa 600
cgcatggagt ccgacgttcg gacctactcc cgctccttcc cggtcgtctt caccaaggcg 660
cgcaatgccc gcctgaccga cgaggaaggg cgcgagtaca tcgacttcct ggccggtgcc 720
ggcaccctga actacggcca caacaacccg cacctcaagc aggcgctgct cgactatatc 780
gacagcgacg gcatcgtcca cggcctggac ttctggactg cggccaagcg cgactatctg 840
gaaaccctgg aagaggtgat cctcaagccg cgcggtctcg actacaaggt gcatctgccc 900
ggaccgactg gcaccaacgc cgtcgaggcg gccattcgcc tggcccgggt cgccaagggg 960
cgccacaata tcgtctcctt caccaacggc tttcatggcg tcaccatggg cgcgctggcg 1020
accaccggta accgcaagtt ccgcgaggcc accggtggcg tgccgaccca ggctgcttcc 1080
ttcatgccgt tcgatggcta cctcggcagc agcaccgaca ccctcgacta cttcgagaag 1140
ctgctcggcg acaagtccgg cggcctggac gtgcccgcgg cggtgatcgt cgagacagtg 1200
cagggcgagg gcggtatcaa tgtcgccggc ctggagtggc tcaagcgcct cgagagcatc 1260
tgccgcgcca atgacatcct gctgatcatc gacgacatcc aggcgggctg cggccggacc 1320
ggcaagttct tcagcttcga gcatgccggc atcacgccgg atatcgtgac caactccaag 1380
tcgctgtccg gttacggcct gccgttcgct cacgtcctga tgcgccccga gctcgacaag 1440
tggaagcccg gtcagtacaa cggcaccttc cgcggcttca acctggcttt cgccactgct 1500
gctgccgcca tgcgcaagta ctggagcgac gacaccttcg agcgtgacgt gcagcgcaag 1560
gctcgcatcg tcgaggaacg cttcggcaag atcgccgcct ggctgagcga gaacggcatc 1620
gaggcctccg agcgcggccg cgggctgatg cggggcatcg acgtgggttc cggcgatatc 1680
gccgacaaga tcacccacca agccttcgag aacgggttga tcatcgaaac cagcggtcag 1740
gacggcgaag tggtcaagtg cctgtgcccg ctgaccattc ccgacgaaga cctggtcgag 1800
ggactcgaca tcctcgagac cagcaccaag caggccttta gctgaatgat cgttcgcaat 1860
ctcgaagaag cgcgccagac cgaccgtctg gtcaccgccg aaaacggcaa ctgggacagc 1920
acccgcctgt cgctggccga agatggtggc aactgctcct tccacatcac ccgcatcttc 1980
gagggtaccg agacccacat ccactataag catcacttcg aggctgttta ttgcatcgaa 2040
ggcgagggcg aagtggaaac cctggccgat ggcaagatct ggcccatcaa gccgggtgac 2100
atctacatcc tcgaccagca cgacgagcac ctgctgcgcg ccagcaagac catgcacctg 2160
gcctgcgtgt tcacgccggg cctgaccggc aacgaagtgc accgcgaaga cggttcctac 2220
gcacctgccg acgaagccga cgaccagaag ccgctgtaa 2259
<210> 7
<211> 999
<212> DNA
<213> ectD基因(H.elongata CGMCC 1.6329)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(999)
<400> 7
atgtcagtgc agacatcgtc caaccgaccg ctgccacaag cgaacctgca tatcgccacg 60
gagacacccg aggccgacag ccggatccgt agcgcgccgc gtccggggca ggatccctat 120
ccgacccgac tgagcgagcc gctggatctt ccctggctca atcgccgcga gccggtggtc 180
aagggagagg aggccgatgg gccgctctcg gccgcgcagc tcgatacctt cgagcgccag 240
ggcttcatct tcgagccgga cttcctgaaa ggcgaggaac tcgaggcgtt gcgccacgaa 300
ctcaacgccc tgctggcccg ggatgacttc cgcggacgag acttcgccat caccgagccg 360
cagggcaacg agatccgctc gctgttcgcg gtgcactacc tgtcgcgagt cttcagccgc 420
ctggccaacg acgaacgcct gatgggtcgc gcccggcaga ttctcggcgg cgagccctat 480
gtccatcagt cgcgcatcaa ctacaagccc ggcttcgagg gcaagggctt caattggcat 540
tccgattttg aaacctggca cgccgaggat ggcatgcccg ccatgcatgc ggtgagtgcg 600
tccatcgtgc tgaccgacaa ccacaccttc aacgggccgc tgatgctggt gcccggctca 660
caccgggtat tcgtgccgtg cctgggtgaa acgccggagg atcatcaccg gcagtcgctc 720
aagacccagg aattcggcgt gccgagccgc caggcgctgc gcgagttgat cgaccgacat 780
ggtatcgaag cgcccaccgg cgcggcgggt ggcctgctgc tgttcgactg caataccctg 840
cacggctcca acgccaacat gtcgccggat ccgcgcagca acgccttttt cgtctacaac 900
cgtcgtgaca accgctgcgt cgaaccttat gcggcctcca agcgccgccc gcgcttcctg 960
gcccacgagc cggatgaggc gtggtcgccg gatggctga 999

Claims (8)

1.一种高产羟基四氢嘧啶的基因工程菌，命名为E.coli HECT06，是以大肠杆菌为出发菌株，在其基因组上做如下改造而得到的：在大肠杆菌基因组上整合了由木糖启动子PxylF控制的来源于T7噬菌体的RNA聚合酶T7RNAP；敲除了编码高丝氨酸脱氢酶I的thrA基因，阻止L-天冬氨酸-β-半醛向分支代谢产物苏氨酸、赖氨酸、蛋氨酸的支路代谢；通过整合来源于谷氨酸棒状杆菌的lysC基因，由强启动子PT7启动，解除赖氨酸对四氢嘧啶合成途径中的关键酶天冬氨酸激酶Ask的反馈抑制；整合来源于伸长盐单胞菌Halomonas elongate的ectABC基因簇以及编码四氢嘧啶羟化酶的ectD基因，并由强启动子PT7启动，重构了羟基四氢嘧啶合成途径；在琥珀酰辅酶A合成酶sucCD位点整合了ectD基因，由强启动子PT7启动。
2.根据权利要求1所述的高产羟基四氢嘧啶的基因工程菌，其特征在于：所述大肠杆菌为E.coli W3110，保藏号ATCC 27325。
3.根据权利要求1所述的高产羟基四氢嘧啶的基因工程菌，其特征在于：所述木糖启动子PxylF具有序列表1所示核苷酸序列；所述RNA聚合酶T7RNAP具有序列表2所示核苷酸序列；所述thrA基因具有序列表3所示核苷酸序列；所述lysC基因具有序列表4所示核苷酸序列；所述强启动子PT7具有序列表5所示核苷酸序列；所述ectABC基因簇来源于H.elongata，保藏号CGMCC No.1.6329；所述ectABC基因簇具有序列表6所示核苷酸序列；所述编码四氢嘧啶羟化酶的ectD基因来源于H.elongata，保藏号CGMCC No.1.6329；所述ectD基因具有序列表7所示核苷酸序列。
4.权利要求1所述高产羟基四氢嘧啶的基因工程菌的构建方法，其特征在于：采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术对E.coli W3110进行定向改造，具体步骤如下：
(1)在大肠杆菌基因组上，将来源于T7噬菌体的RNA聚合酶T7RNAP基因整合在lacZ基因位点；
(2)为了减弱天冬氨酸支路代谢，将编码高丝氨酸脱氢酶I的thrA基因敲除；
(3)为增加前体物天冬氨酸半醛的供应，将来源于谷氨酸棒状杆菌的编码天冬氨酸激酶的lysC基因整合在yghX基因位点；
(4)将四氢嘧啶合成基因簇ectABC整合到ybeM基因位点，重构四氢嘧啶合成途径；
(5)将四氢嘧啶羟化酶基因ectD整合到trpR基因位点，重构羟基四氢嘧啶合成途径；
(6)为增加α-酮戊二酸量以提高EctD酶活，将ectD基因整合在编码琥珀酰辅酶A合成酶的sucCD基因位点。
5.权利要求1所述基因工程菌在发酵生产羟基四氢嘧啶方面的应用。
6.根据权利要求5所述基因工程菌的应用，其特征在于：具体方法为：
摇瓶发酵：
将菌种活化后制备种子液，按10-15％接种量接种到三角瓶中(终体积为30mL)，九层纱布封口，37℃，200r/min振荡培养，发酵过程中通过补加氨水维持pH在7.0-7.2；补加60％(m/v)葡萄糖溶液维持发酵进行，发酵液颜色不再变化时即视为缺糖，缺糖时补加1-2mL60％(m/v)葡萄糖溶液，发酵初始添加60％(m/v)木糖溶液诱导目的基因表达，发酵周期22-26h；或
发酵罐发酵：
将菌种活化后制备种子液，按照15-20％接种量接入新鲜的发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制pH稳定在7.0左右，温度维持在37℃，溶氧在30-40％；当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加80％(m/v)的葡萄糖溶液，维持发酵培养基中的葡萄糖浓度在0.1-5g/L；发酵周期36-40h。
7.根据权利要求6所述基因工程菌的应用，其特征在于：所述摇瓶发酵中采用的发酵培养基组成为：葡萄糖20-40g/L，(NH4)2SO4 1-3g/L，KH2PO4 1-3g/L，MgSO4·7H2O 1-2g/L，酵母提取物0.1-0.3g/L，玉米浆1-2mL/L，FeSO4·7H2O 80-100mg/L，MnSO4·7H2O 80-100mg/L，α-酮戊二酸3-5g/L，其余为水，pH 7.0-7.2。
8.根据权利要求6所述基因工程菌的应用，其特征在于：所述发酵罐发酵中采用的发酵培养基组成为：葡萄糖15-25g/L，酵母提取物1-5g/L，胰蛋白胨1-5g/L，柠檬酸钠0.1-1g/L，KH2PO4 1-5g/L，MgSO4·7H2O 0.1-1g/L，FeSO4·7H2O 80-100mg/L，MnSO4·H2O 80-100mg/L，VB1 0.5-1mg/L，VH 0.1-0.5mg/L，α-酮戊二酸3-5g/L，消泡剂2滴，其余为水，pH 7.0-7.2。
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Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109182236A (zh) * 2018-08-29 2019-01-11 浙江工业大学 一种重组大肠杆菌及合成四氢嘧啶的应用
CN109370966A (zh) * 2018-10-18 2019-02-22 天津科技大学 一种用于l-茶氨酸生产的基因工程菌及其发酵方法
CN110839943A (zh) * 2019-11-27 2020-02-28 河南中烟工业有限责任公司 一种基于生物发酵的烤甜香型烟草浸膏及制备方法
CN112280726A (zh) * 2020-10-30 2021-01-29 江南大学 一种高产四氢嘧啶工程菌株的构建方法与应用
CN112501102A (zh) * 2020-12-16 2021-03-16 江南大学 一株高效生产四氢嘧啶的大肠杆菌重组菌
CN112877270A (zh) * 2021-02-03 2021-06-01 天津科技大学 一种生产羟基四氢嘧啶的基因工程菌及其应用
CN112961815A (zh) * 2021-02-26 2021-06-15 南京工业大学 一种高产四氢嘧啶的基因工程菌及其应用
CN113186143A (zh) * 2021-04-14 2021-07-30 江南大学 一种产四氢嘧啶工程菌株的构建及优化的方法
CN113862205A (zh) * 2021-05-13 2021-12-31 西安交通大学 产羟基四氢嘧啶的嗜甲烷工程菌
CN114806995A (zh) * 2022-05-30 2022-07-29 深圳中科欣扬生物科技有限公司 一种基于乙酰辅酶a代谢改造后高效合成四氢嘧啶的基因工程菌的构建和应用
CN114934060A (zh) * 2022-04-27 2022-08-23 山东福瑞达生物科技有限公司 一种利用四氢嘧啶生产羟基四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法和应用
CN115851659A (zh) * 2022-11-14 2023-03-28 山东福瑞达生物科技有限公司 一种高产四氢嘧啶的重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060253936A1 (en) * 2000-08-24 2006-11-09 Pioneer Hi-Bred International Inc. Novel constructs and their use in metabolic pathway engineering
CN105177078A (zh) * 2015-09-30 2015-12-23 天津科技大学 一种羟基四氢嘧啶的制备方法
CN106754603A (zh) * 2017-01-09 2017-05-31 天津科技大学 利用木糖诱导产生四氢嘧啶的基因工程菌及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060253936A1 (en) * 2000-08-24 2006-11-09 Pioneer Hi-Bred International Inc. Novel constructs and their use in metabolic pathway engineering
CN105177078A (zh) * 2015-09-30 2015-12-23 天津科技大学 一种羟基四氢嘧啶的制备方法
CN106754603A (zh) * 2017-01-09 2017-05-31 天津科技大学 利用木糖诱导产生四氢嘧啶的基因工程菌及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YIKE NING ET AL.: "Pathway construction and metabolic engineering for fermentative production of ectoine in Escherichia coli", 《METABOLIC ENGINEERING》 *
于金龙 等: "大肠杆菌色氨酸生物合成途径关键酶的调控研究", 《生物工程学报》 *
王晓凌 等: "《生物化学第3版》", 31 December 2017, 江苏凤凰科学技术出版社 *

Cited By (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109182236A (zh) * 2018-08-29 2019-01-11 浙江工业大学 一种重组大肠杆菌及合成四氢嘧啶的应用
CN109370966A (zh) * 2018-10-18 2019-02-22 天津科技大学 一种用于l-茶氨酸生产的基因工程菌及其发酵方法
CN109370966B (zh) * 2018-10-18 2020-04-24 天津科技大学 一种用于l-茶氨酸生产的基因工程菌及其发酵方法
CN110839943A (zh) * 2019-11-27 2020-02-28 河南中烟工业有限责任公司 一种基于生物发酵的烤甜香型烟草浸膏及制备方法
CN112280726A (zh) * 2020-10-30 2021-01-29 江南大学 一种高产四氢嘧啶工程菌株的构建方法与应用
CN112280726B (zh) * 2020-10-30 2024-03-15 江南大学 一种高产四氢嘧啶工程菌株的构建方法与应用
CN112501102A (zh) * 2020-12-16 2021-03-16 江南大学 一株高效生产四氢嘧啶的大肠杆菌重组菌
CN112501102B (zh) * 2020-12-16 2022-10-11 江南大学 一株高效生产四氢嘧啶的大肠杆菌重组菌
CN112877270A (zh) * 2021-02-03 2021-06-01 天津科技大学 一种生产羟基四氢嘧啶的基因工程菌及其应用
CN112877270B (zh) * 2021-02-03 2022-09-30 天津科技大学 一种生产羟基四氢嘧啶的基因工程菌及其应用
CN112961815B (zh) * 2021-02-26 2022-07-01 南京工业大学 一种高产四氢嘧啶的基因工程菌及其应用
CN112961815A (zh) * 2021-02-26 2021-06-15 南京工业大学 一种高产四氢嘧啶的基因工程菌及其应用
CN113186143A (zh) * 2021-04-14 2021-07-30 江南大学 一种产四氢嘧啶工程菌株的构建及优化的方法
CN113186143B (zh) * 2021-04-14 2024-01-30 江南大学 一种产四氢嘧啶工程菌株的构建及优化的方法
CN113862205A (zh) * 2021-05-13 2021-12-31 西安交通大学 产羟基四氢嘧啶的嗜甲烷工程菌
CN113862205B (zh) * 2021-05-13 2023-08-01 西安交通大学 产羟基四氢嘧啶的嗜甲烷工程菌
CN114934060A (zh) * 2022-04-27 2022-08-23 山东福瑞达生物科技有限公司 一种利用四氢嘧啶生产羟基四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法和应用
CN114806995A (zh) * 2022-05-30 2022-07-29 深圳中科欣扬生物科技有限公司 一种基于乙酰辅酶a代谢改造后高效合成四氢嘧啶的基因工程菌的构建和应用
CN114806995B (zh) * 2022-05-30 2024-03-12 深圳中科欣扬生物科技有限公司 一种基于乙酰辅酶a代谢改造后高效合成四氢嘧啶的基因工程菌的构建和应用
CN115851659A (zh) * 2022-11-14 2023-03-28 山东福瑞达生物科技有限公司 一种高产四氢嘧啶的重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法和应用

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