JP2020519288A - 洗浄のためにリパーゼ酵素を使用する方法 - Google Patents

洗浄のためにリパーゼ酵素を使用する方法 Download PDF

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Abstract

リパーゼ酵素を使用して表面から汚れを除去する方法、及びリパーゼ酵素を含む製剤。【選択図】なし

Description

配列表
本出願は、「特許協力条約(PCT)に基づく国際特許出願におけるヌクレオチド及びアミノ酸配列表の提示の基準」ST.25に従った、ASC IIテキスト(.txt)ファイルとしてコンピュータ可読フォーム(CRF)のヌクレオチド及びアミノ酸配列表を含む。配列表は、以下で同定され、その全体が、全ての目的のため、本出願の明細書に参照によりここで組み込まれる。
Figure 2020519288
技術分野
遺伝子操作されたリパーゼ酵素、該酵素を含む組成物、及び該酵素又は該酵素を含む組成物を使用する方法。遺伝子操作されたリパーゼ酵素は、多くの異なる適用、例えば、洗濯洗剤、食器洗浄洗剤、並びに家庭、産業、車両ケア、パン焼き、動物用飼料、パルプ紙処理、でんぷん処理、及びエタノール生産のための洗浄製品において有用である。リパーゼは、脂肪性の汚れの除去において利用され、様々な組成物、例えば、洗浄製品に添加されている。現在の洗浄及び/又はファブリックケア組成物は、脂肪性の汚れを除去するリパーゼの能力と影響する多くの有効成分の製剤を含む。したがって、洗浄のために使用される組成物の過酷な環境において機能し得る遺伝子操作されたリパーゼ酵素の必要がある。
1.配列番号1のアミノ酸配列に従う少なくとも1つのポリペプチド、又はリパーゼ活性を有する、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、若しくは少なくとも99%の同一性を有する少なくとも1つのポリペプチド、及び少なくとも1つの洗剤成分を含む、洗剤製剤。
2.ポリペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列に対してアミノ酸残基位置番号:23、33、82、83、84、85、160、199、254、255、256、258、263、264、265、268、308、311、又はその任意の組合せにて少なくとも1個のアミノ酸残基挿入、欠失、又は置換を含み、ポリペプチドが、リパーゼ活性を有する、請求項1に記載の洗剤製剤。
3.少なくとも1個のアミノ酸置換が、配列番号1のアミノ酸配列に対してY23A、K33N、S82T、S83D、S83H、S83I、S83N、S83R、S83T、S83Y、S84S、S84N、84’Y、84’L、84’S、I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V、I85Y、K160N、P199I、P199V、I254A、I254C、I254E、I254F、I254G、I254L、I254M、I254N、I254R、I254S、I2454V、I254W、I254Y、I255A、I255L、A256D、L258A、L258D;L258E、L258G、L258H、L258N、L258Q、L258R、L258S、L258T、L258V、D263G、D263K、D263P、D263R、D263S;T264A、T264D、T264G、T264I、T264L、T264N、T264S、D265A、D265G、D265K、D265L、D265N、D265S、D265T、T268A、T268G、T268K、T268L、T268N、T268S、D308A、Y311E、又はその任意の組合せからなる群から選択され、ポリペプチドが、リパーゼ活性を有する、請求項2に記載の洗剤製剤。
4.ポリペプチドが、配列番号1に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含み、ポリペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも1個の単一アミノ酸置換を有し、1個の単一アミノ酸置換が、配列番号1のアミノ酸配列に対してY23A、K33N、S82T、S83D、S83H、S83I、S83N、S83R、S83T、S83Y、S84S、S84N、84’Y、84’L、84’S、I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V、I85Y、K160N、P199I、P199V、I254A、I254C、I254E、I254F、I254G、I254L、I254M、I254N、I254R、I254S、I2454V、I254W、I254Y、I255A、I255L、A256D、L258A、L258D;L258E、L258G、L258H、L258N、L258Q、L258R、L258S、L258T、L258V、D263G、D263K、D263P、D263R、D263S;T264A、T264D、T264G、T264I、T264L、T264N、T264S、D265A、D265G、D265K、D265L、D265N、D265S、D265T、T268A、T268G、T268K、T268L、T268N、T268S、D308A、Y311E、又はその任意の組合せからなる群から選択され、ポリペプチドが、リパーゼ活性を有する、請求項2〜3のいずれか一項に記載の洗剤製剤。
5.ポリペプチドが、配列番号1に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含み、バリアントポリペプチドが、表1に記載されるアミノ酸置換の組合せを有し、ポリペプチドが、リパーゼ活性を有する、請求項2〜4のいずれか一項に記載の洗剤製剤。
6.洗浄方法であって、
(a)脂肪性の汚れを落とすべき表面を用意する工程、
(b)請求項1〜5のいずれか一項に記載の洗剤製剤を用意する工程、
(c)(a)の脂肪性の汚れを落とすべき表面を(b)の洗剤と接触させる工程を含み、洗剤中のポリペプチドが、脂肪性の汚れを落とすべき表面から脂肪性の汚れを除去する、方法。
7.第2のリパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、マンナナーゼ、ラッカーゼ、ペクチナーゼ、及びヌクレアーゼからなる群の1つ以上から選択される第2の酵素を添加する工程をさらに含む、請求項1〜5のいずれか一項の洗剤製剤。
8.脂肪性の汚れを落とすべき表面が、布、織物、ファブリック、硬質表面、又は食器である、請求項6の方法。
9.脂肪性の汚れを落とすべき表面が、口紅、皮脂、マスタード、オリーブオイル、ココヤシ、チョコレート、チョコレートムース、チョコレートアイスクリーム、チョコレートドリンク、落花生油、牛脂、インドカレー、ナポリトマト、メーキャップ、血液牛脂、サラダドレッシング、卵黄、食品、揚げ物の脂肪、カレー、地中海ソース、カレー油ソース、バルサミコ、ハンバーガーグリース、バター脂から選択される汚れを含む、請求項6の方法。
10.洗濯洗剤、硬質表面クリーナー、食器洗浄洗剤、又は個人用衛生用製品である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の洗剤製剤。
11.少なくとも1つの洗剤成分が、洗濯若しくは洗浄性能において有効な又は洗剤の物理的特徴の維持において有効な量で、界面活性剤、ビルダー、ポリマー、アルカリ、漂白系、蛍光漂白剤、消泡剤及び安定剤、ヒドロトロープ、レオロジー改質剤、保存剤、並びに腐食防止剤から選択される、請求項1〜10のいずれか一項の洗剤製剤。
12.洗剤が、液体、ゲル、ペースト、棒状石鹸、粉末、又は粒状固体である、請求項1〜11のいずれか一項に記載の洗剤製剤。
酵素は、アミノ酸残基の配列を含む生物学的分子(ポリペプチド)であり、酵素が、反応を触媒することができる。酵素名は、国際生化学分子生物学連合(IUBMB)の命名法委員会の推奨に基づき決定される。酵素は、EC(酵素委員会)番号、推奨された名称、代替の名称(もしあれば)、触媒活性、及び他の因子により決定される。酵素は、ポリペプチド、タンパク質、ペプチドとしても知られるか、又は配列識別番号(配列番号)により特許及び特許出願に記載される。酵素の代替の名称は、互換的に使用され得る。
酵素は、植物、動物、細菌、古細菌、真菌、酵母、酵素をコードするDNAを含有する環境試料を含む、多くの異なる供給源から得られるか、若しくはもたらされるか、又は酵素は、実験室において生成された合成のものであり得る。例えば、細菌供給源の酵素は、バチルス(Bacillus)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、大腸菌(E. coli)及びシュードモナス(Pseudomonas)からもたらされた酵素を含み、真菌供給源の酵素は、アスペルギルス(Aspergillus)、フザリウム(Fusarium)、サーモマイセス(Thermomyces)及びトリコデルマ(Trichoderma)からもたらされた酵素を含み、酵母供給源の酵素は、ピキア(Pichia)、及びサッカロマイセス(Saccharomyces)からもたらされた酵素を含む。
リパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、マンナナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、及びヌクレアーゼを含む、異なる種類の酵素が、洗剤及び洗浄製品において有用であることが知られているが、産業において、さらに活性、温度特性、pH特性を有し、プロテアーゼの存在下での、改良された性能(汚れの除去)、安定性を有し、洗剤製剤における界面活性剤の量を低減し、匂いがなく、又はその組合せのリパーゼを提供する必要がある。バリアントポリペプチドリパーゼ酵素は、これらの産業上の必要を扱う。
世界知的所有権機関(WIPO)基準ST.25(1998年)は、アミノ酸残基が、頭文字としての1文字目を含む次の3文字記号を使用して配列表において表されるべきであると規定する。以下の表は、標準的な遺伝子基準を使用したアミノ酸識別子並びにアミノ酸をコードする対応するDNAコドンの概要を提供する。アミノ酸残基をコードするDNAコドンは、使用される生物に依存して異なり得るし、遺伝子コードの翻訳について若干異なる表を適用してもよい。そのような非標準的コード翻訳表の編集は、NCBIにおいて管理される。参考として、例えば、https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Utils/wprintgc.cgiを参照。
Figure 2020519288
「親」ポリペプチドアミノ酸配列は、親ポリペプチドアミノ酸配列の「バリアント」を生じる、配列に対する変異の導入(例えば、1個以上のアミノ酸置換、挿入、欠失、又はその組合せを導入することによる)のための開始配列である。親は、(さらなる)変化の導入のための開始配列として使用される、野生型ポリペプチドアミノ酸配列又は合成的に生成されたポリペプチドアミノ酸配列を含む。
「バリアントポリペプチド」は、そのアミノ酸配列においてその親と異なる酵素を指す。以下の定義は、アミノ酸変化の関係におけるバリアントを記載する一方、核酸が、例えば、置換により同様に修飾されてもよい。
本発明は、配列番号1の全長アミノ酸配列に対して少なくとも少なくとも80%同一である、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含むリパーゼ活性を有するポリペプチドを指す。
前記ポリペプチドは、アミノ酸残基挿入、欠失、又は置換から選択される変化を含んでもよい。前記ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列に対して次のアミノ酸残基位置:23、33、82、83、84、85、160、199、254、255、256、258、263、264、265、268、308、311、又はその任意の組合せの少なくとも1つに少なくとも1個の置換を含んでもよい。位置の番号は、配列番号1として提供されるアミノ酸配列に基づく。
具体的には、本発明のポリペプチドは、Y23A、K33N、S82T、S83D、S83H、S83I、S83N、S83R、S83T、S83Y、S84S、S84N、84’Y、84’L、84’S、I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V、I85Y、K160N、P199I、P199V、I254A、I254C、I254E、I254F、I254G、I254L、I254M、I254N、I254R、I254S、I2454V、I254W、I254Y、I255A、I255L、A256D、L258A、L258D;L258E、L258G、L258H、L258N、L258Q、L258R、L258S、L258T、L258V、D263G、D263K、D263P、D263R、D263S;T264A、T264D、T264G、T264I、T264L、T264N、T264S、D265A、D265G、D265K、D265L、D265N、D265S、D265T、T268A、T268G、T268K、T268L、T268N、T268S、D308A、及びY311Eから選択される少なくとも1個のアミノ酸置換を含んでもよい。1つの実施形態において、ポリペプチドは、前記置換の1個より多くを含む。
本発明は、リパーゼ活性を有するポリペプチドであって、バリアントポリペプチドが、配列番号1に記載される全長アミノ酸配列に対して少なくとも80%同一である、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列であり、バリアントポリペプチドが、本明細書の実施例1、表1に記載される組合せからなる群から選択される、配列番号1のアミノ酸配列に対するアミノ酸修飾の組合せを有する、ポリペプチドに関する。
1つの実施形態において、バリアントポリペプチドは、少なくとも位置83における置換を含む配列番号1に記載のポリペプチドであり、置換は、S83D、S83H、S83I、S83N、S83R、S83T、及びS83Yから選択される。好ましくは、位置83における置換は、S83H、S83I、S83N、及びS83Yから選択される。1つの実施形態において、バリアントポリペプチドは、少なくとも位置85における置換を含む配列番号1に記載のポリペプチドであり、置換は、I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V、及びI85Yから選択される。好ましくは、位置85における置換は、I85L、I85T、及びI85Vから選択される。1つの実施形態において、バリアントポリペプチドは、少なくとも位置255における置換を含む配列番号1に記載のポリペプチドであり、置換は、I255A、I255Lから選択される。1つの実施形態において、バリアントポリペプチドは、少なくとも位置264における置換を含む配列番号1に記載のポリペプチドであり、置換は、T264A、T264D、T264G、T264I、T264L、T264N、T264Sから選択される。好ましくは、位置264における置換は、T264A、T264D、T264N、及びT264Sから選択される。1つの実施形態において、バリアントポリペプチドは、少なくとも位置265における置換を含む配列番号1に記載のポリペプチドであり、置換は、D265A、D265G、D265K、D265L、D265N、D265S、及びD265Tから選択される。好ましくは、位置265における置換は、D265A、D265G、D265S、及びD265Tから選択される。
1つの実施形態において、バリアントポリペプチドは、少なくとも位置83における置換及び位置85における置換を含む、配列番号1に記載のポリペプチドであり、位置83における置換は、S83D、S83H、S83I、S83N、S83R、S83T、及びS83Yから選択され、位置85における置換は、I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V、及びI85Yから選択される。好ましくは、位置83における置換は、S83H、及びS83Iから選択され、位置85における置換は、I85L、I85P、I85T、及びI85Vから選択される。位置83における置換は、S83Hであってもよく、位置85における置換は、I85L、I85P、及びI85Tから選択されてもよい。位置83における置換は、S83Iであってもよく、位置85における置換は、I85Vであってもよい。
1つの実施形態において、バリアントポリペプチドは、少なくとも位置83における置換及び位置255における置換を含む、配列番号1に記載のポリペプチドであり、位置83における置換は、S83D、S83H、S83I、S83N、S83R、S83T、及びS83Yから選択され、位置255における置換は、I255A、及びI255Lから選択される。好ましくは、位置83における置換は、S83H、S83N、及びS83Yから選択され、位置264における置換は、T264A、T264D、T264N、及びT264Sから選択される。位置83における置換は、S83H、S83N、S83T及びS83Yから選択されてもよく、位置255における置換は、I255Aであってもよい。
1つの実施形態において、バリアントポリペプチドは、少なくとも位置83における置換及び位置264における置換を含む、配列番号1に記載のポリペプチドであり、位置83における置換は、S83D、S83H、S83I、S83N、S83R、S83T、及びS83Yから選択され、位置264における置換は、T264A、T264D、T264G、T264I、T264L、T264N、及びT264Sから選択される。好ましくは、位置83における置換は、S83H、S83N、及びS83Yから選択され、位置264における置換は、T264A、T264D、T264N、及びT264Sから選択される。位置83における置換は、S83Hであってもよく、位置264における置換は、T264A、T264N、及びT264Sから選択されてもよい。位置83における置換は、S83Nであってもよく、位置264における置換は、T264A、T264D、T264N、及びT264Sから選択されてもよい。位置83における置換は、S83Yであってもよく、位置264における置換は、T264A、及びT264Sから選択されてもよい。
1つの実施形態において、バリアントポリペプチドは、少なくとも位置83における置換及び位置265における置換を含む、配列番号1に記載のポリペプチドであり、位置83における置換は、S83D、S83H、S83I、S83N、S83R、S83T、及びS83Yから選択され、位置265における置換は、D265A、D265G、D265K、D265L、D265N、D265S、及びD265Tから選択される。好ましくは、位置83における置換は、S83H、S83I、S83N、S83T及びS83Yから選択され、位置265における置換は、D265A、D265G、D265S、及びD265Tから選択される。位置83における置換は、S83Hであってもよく、位置265における置換は、D265A、D265G、D265S、及びD265Tから選択されてもよい。位置83における置換は、S83Iであってもよく、位置265における置換は、D265G、及びD265Sから選択されてもよい。位置83における置換は、S83Nであってもよく、位置265における置換は、D265A、D265G、D265S、及びD265Tから選択されてもよい。位置83における置換は、S83Tであってもよく、位置265における置換は、D265A、D265S、及びD265Tから選択されてもよい。位置83における置換は、S83Yであってもよく、位置265における置換は、D265Tであってもよい。
1つの実施形態において、バリアントポリペプチドは、少なくとも位置85における置換及び位置265における置換を含む、配列番号1に記載のポリペプチドであり、位置85における置換は、I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V、及びI85Yから選択され、位置265における置換は、D265A、D265G、D265K、D265L、D265N、D265S、及びD265Tから選択される。好ましくは、位置85における置換は、I85A、I85H、I85L、I85P、I85S、I85T、及びI85Vから選択され、位置265における置換は、D265A、D265G、D265S、及びD265Tから選択される。位置85における置換は、I85Aであってもよく、位置265における置換は、D265Tであってもよい。位置85における置換は、I85Hであってもよく、位置265における置換は、D265Aであってもよい。位置85における置換は、I85Lであってもよく、位置265における置換は、D265A、D265G、D265S、及びD265Tから選択されてもよい。位置85における置換は、I85Pであってもよく、位置265における置換は、D265Aであってもよい。位置85における置換は、I85Sであってもよく、位置265における置換は、D265Sであってもよい。位置85における置換は、I85Tであってもよく、位置265における置換は、D265G、D265S、及びD265Tから選択されてもよい。位置85における置換は、I85Vであってもよく、位置265における置換は、D265A、D265G、D265S、及びD265Tから選択されてもよい。
1つの実施形態において、バリアントポリペプチドは、少なくとも位置85における置換及び位置255における置換を含む、配列番号1に記載のポリペプチドであり、位置85における置換は、I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V、及びI85Yから選択され、位置255における置換は、I255A、及びI255Lから選択される。バリアントポリペプチドは、I85H置換、及びI255A置換を含んでもよい。バリアントポリペプチドは、I85L置換、及びI255A置換を含んでもよい。バリアントポリペプチドは、I85S置換、及びI255A置換を含んでもよい。バリアントポリペプチドは、I85V置換、及びI255A置換を含んでもよい。
1つの実施形態において、バリアントポリペプチドは、少なくとも位置83における置換、位置85における置換、及び位置255における置換を含む、配列番号1に記載のポリペプチドであり、位置83における置換は、S83D、S83H、S83I、S83N、S83R、S83T、及びS83Yから選択され、位置85における置換は、I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V、及びI85Yから選択され、位置255における置換は、I255A、及びI255Lから選択される。バリアントポリペプチドは、S83H置換、I85A、I85L、I85P、I85S、I85T、及びI85Vから選択される位置85における置換、並びにI255A置換を含んでもよい。バリアントポリペプチドは、S83N置換、I85L、及びI85Vから選択される位置85における置換、並びにI255A置換を含んでもよい。バリアントポリペプチドは、S83T置換、I85H、及びI85Vから選択される位置85における置換、並びにI255A置換を含んでもよい。バリアントポリペプチドは、S83Y置換、I85A、及びI85Vから選択される位置85における置換、並びにI255A置換を含んでもよい。
1つの実施形態において、バリアントポリペプチドは、少なくとも位置85における置換及び位置264における置換を含む、配列番号1に記載のポリペプチドであり、位置85における置換は、I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V、及びI85Yから選択され、位置264における置換は、T264A、T264D、T264N、及びT264Sから選択される。バリアントポリペプチドは、I85A置換、及びT264A置換を含んでもよい。バリアントポリペプチドは、I85L置換、及びT264S置換を含んでもよい。バリアントポリペプチドは、I85S置換、及びT264A置換を含んでもよい。バリアントポリペプチドは、I85T置換、及びT264A置換を含んでもよい。バリアントポリペプチドは、I85V置換、並びにT264A、T264D、T264N、及びT264Sから選択される位置264における置換を含んでもよい。
1つの実施形態において、バリアントポリペプチドは、少なくとも位置255における置換及び位置264における置換を含む、配列番号1に記載のポリペプチドであり、位置255における置換は、I255A、及びI255Lから選択され、位置264における置換は、T264A、T264D、T264N、及びT264Sから選択される。バリアントポリペプチドは、I255A置換、並びにT264A、T264D、T264N、及びT264Sから選択される位置264における置換を含んでもよい。
1つの実施形態において、バリアントポリペプチドは、少なくとも位置255における置換及び位置265における置換を含む、配列番号1に記載のポリペプチドであり、位置255における置換は、I255A、及びI255Lから選択され、位置265における置換は、T264A、T264D、T264N、及びT264Sから選択される。バリアントポリペプチドは、I255A置換、並びにD265A、D265G、D265K、D265L、D265N、D265S、及びD265Tから選択される位置265における置換を含んでもよい。バリアントポリペプチドは、I255A置換、並びにD265A、D265G、D265S、及びD265Tから選択される位置265における置換を含んでもよい。バリアントポリペプチドは、I255A置換、及びD265S置換を含んでもよい。
1つの実施形態において、バリアントポリペプチドは、少なくとも位置264における置換及び位置265における置換を含む、配列番号1に記載のポリペプチドであり、位置264における置換は、T264A、T264D、T264N、及びT264Sから選択され、位置265における置換は、D265A、D265G、D265K、D265L、D265N、D265S、及びD265Tから選択される。バリアントポリペプチドは、T264A置換、並びにD265A、D265G、D265S、及びD265Tから選択される位置265における置換を含んでもよい。バリアントポリペプチドは、T264D置換、並びにD265A、及びD265Tから選択される位置265における置換を含んでもよい。バリアントポリペプチドは、T264N置換、並びにD265A、及びD265Tから選択される位置265における置換を含んでもよい。バリアントポリペプチドは、T264S置換、並びにD265A、D265G、D265S、及びD265Tから選択される位置265における置換を含んでもよい。
1つの実施形態において、バリアントポリペプチドは、少なくとも位置85における置換及び位置265における置換を含む、配列番号1に記載のポリペプチドであり、位置85における置換は、I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V、及びI85Yから選択され、位置265における置換は、D265A、D265G、D265K、D265L、D265N、D265S、及びD265Tから選択され、位置264における置換をさらに含み、置換は、T264A、T264D、T264N、及びT264Sから選択される。バリアントポリペプチドは、I85A置換、T264A置換、及びD265T置換を含んでもよい。バリアントポリペプチドは、I85L置換、T264S置換、並びにD265A、D265G、D265S、及びD265Tから選択される位置265における置換を含んでもよい。バリアントポリペプチドは、I85S置換、T264A置換及びD265T置換を含んでもよい。バリアントポリペプチドは、I85T置換、T264A置換、並びにD265G、D265S、及びD265Tから選択される位置265における置換を含んでもよい。バリアントポリペプチドは、I85V置換、T264A、T264D、T264N、及びT264Sから選択される位置264における置換、並びにD265A、D265G、D265S、及びD265Tから選択される位置265における置換を含んでもよい。
1つの実施形態において、バリアントポリペプチドは、少なくとも位置85における置換及び位置265における置換を含む、配列番号1に記載のポリペプチドであり、位置85における置換は、I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V、及びI85Yから選択され、位置265における置換は、D265A、D265G、D265K、D265L、D265N、D265S、及びD265Tから選択され、位置255における置換をさらに含み、置換は、I255A、及びI255Lから選択される。バリアントポリペプチドは、I85H置換、I255A置換及び置換D265A置換を含んでもよい。バリアントポリペプチドは、I85L置換、I255A置換、並びにD265A、D265G、D265S、及びD265Tから選択される位置265における置換を含んでもよい。バリアントポリペプチドは、I85S置換、I255A置換及びD265T置換を含んでもよい。バリアントポリペプチドは、I85V置換、I255A置換、並びにD265A、D265G、D265S、及びD265Tから選択される位置265における置換を含んでもよい。
1つの実施形態において、バリアントポリペプチドは、少なくとも位置85における置換、位置265における置換、位置255における置換、及び位置264における置換を含む、配列番号1に記載のポリペプチドであり、位置85における置換は、I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V、及びI85Yから選択され、位置265における置換は、D265A、D265G、D265K、D265L、D265N、D265S、及びD265Tから選択され、位置255における置換は、I255A及びI255Lから選択され、位置264における置換は、T264A、T264D、T264N、及びT264Sから選択される。バリアントポリペプチドは、I85L置換、I255A置換、T264S置換、並びにD265A、D265G、D265S、及びD265Tから選択される位置265における置換を含んでもよい。バリアントポリペプチドは、I85S置換、I255A置換、T264A置換、及びD265T置換を含んでもよい。バリアントポリペプチドは、I85V置換、I255A置換、T264A、T264G、T264S、及びT264Tから選択される位置264における置換、並びにD265A、D265G、D265S、及びD265Tから選択される位置265における置換を含んでもよい。
1つの実施形態において、バリアントポリペプチドは、少なくとも位置83における置換、位置85における置換、並びに位置264及び/又は位置265における置換を含む、配列番号1に記載のポリペプチドであり、位置83における置換は、S83D、S83H、S83I、S83N、S83R、S83T、及びS83Yから選択され、位置85における置換は、I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V、及びI85Yから選択され、位置264における置換は、T264A、T264D、T264N、及びT264Sから選択され、位置265における置換は、D265A、D265G、D265K、D265L、D265N、D265S、及びD265Tから選択される。バリアントポリペプチドは、S83H置換、I85A、I85L、I85P、I85S、I85T、及びI85Vから選択される位置85における置換、T264A、T264N、及びT264Sから選択される位置264における置換、並びにD265A、D265G、D265S、及びD265Tから選択される位置265における置換を含んでもよい。バリアントポリペプチドは、S83H置換、I85L置換、及びD265G置換を含んでもよい。バリアントポリペプチドは、S83H置換、I85L置換、T264A置換、及びD265T置換を含んでもよい。バリアントポリペプチドは、S83N置換、I85L、及びI85Vから選択される位置85における置換、T264A、T264D、T264N、及びT264Sから選択される位置264における置換、並びにD265A、D265G、D265S、及びD265Tから選択される位置265における置換を含んでもよい。バリアントポリペプチドは、S83Y置換、I85A、及びI85Vから選択される位置85における置換、T264A、及びT264Sから選択される位置264における置換、並びにD265T置換を含んでもよい。
1つの実施形態において、バリアントポリペプチドは、少なくとも位置83における置換、位置85における置換、及び位置255における置換を含む、配列番号1に記載のポリペプチドであり、位置264及び/又は位置265における置換をさらに含んでもよく、位置83における置換は、S83D、S83H、S83I、S83N、S83R、S83T、及びS83Yから選択され、位置85における置換は、I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V、及びI85Yから選択され、位置255における置換は、I255A、及びI255Lから選択され、位置264における置換は、T264A、T264D、T264N、及びT264Sから選択され、位置265における置換は、D265A、D265G、D265K、D265L、D265N、D265S、及びD265Tから選択される。バリアントポリペプチドは、S83H置換、I85A、I85L、I85P、I85S、I85T、及びI85Vから選択される位置85における置換、I255A置換、T264A、T264N、及びT264Sから選択される位置264における置換、並びにD265A、D265G、D265S、及びD265Tから選択される位置265における置換を含んでもよい。バリアントポリペプチドは、S83N置換、I85L、及びI85Vから選択される位置85における置換、I255A置換、T264A、T264D、T264N、及びT264Sから選択される位置264における置換、並びにD265A、D265G、D265S、及びD265Tから選択される位置265における置換を含んでもよい。バリアントポリペプチドは、S83Y置換、I85A、及びI85Vから選択される位置85における置換、I255A置換、T264A、及びT264Sから選択される位置264における置換、並びにD265T置換を含んでもよい。1つの実施形態において、バリアントポリペプチドは、上で開示された置換の組合せに加えて、次のさらなる置換:K160N、I254L、I256D、D263R、T268Gの少なくとも1個を含む、配列番号1に記載のポリペプチドである。
本発明は、リパーゼ活性を有するバリアントポリペプチドであって、配列番号1に記載される全長アミノ酸配列に対して少なくとも80%同一である、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列であり、配列番号1のリパーゼと比較して、酵素活性、pH安定性、タンパク質分解性の分解に対する安定性及び洗剤製剤における安定性における増大、又はその任意の組合せを有する、バリアントポリペプチドに関する。
「置換」は、オリジナルのアミノ酸、続いてアミノ酸配列内の位置の番号、続いて置換されたアミノ酸を提供することにより記載される。特定のアミノ酸残基は、オリジナルのものと異なる19個のアミノ酸残基のいずれかで置換されていてもよい。例えば、位置120におけるヒスチジンのアラニンでの置換は、「His120Ala」又は「H120A」と命名される。置換の組合せは、アミノ酸残基の間にコンマを挿入することにより記載され、例えば、K24E、D25P、L27H、A141R、G203I、S220L、S398Pは、親ポリペプチドと比較された場合、7個の異なるアミノ酸残基置換の組合せを表す。
アミノ酸欠失は、親酵素のオリジナルのアミノ酸、続いてアミノ酸配列内の位置の番号、続いて*を提供することにより、記載される。したがって、位置150におけるグリシンの欠失は、「Gly150*」又は「G150*」と命名される。或いは、欠失は、例えば、「D183及びG184の欠失」により示される。
アミノ酸挿入は、親酵素のオリジナルのアミノ酸、続いてアミノ酸配列内の位置の番号、続いてオリジナルのアミノ酸及び追加のアミノ酸を提供することにより、記載される。例えば、グリシンの次へのリジンの位置180における挿入は、「Gly180GlyLys」又は「G180GK」と命名される。1個より多くのアミノ酸残基が挿入される、例えば、Gly180の後にLys及びAla等の場合、これは、Gly180GlyLysAla又はG195GKAとして示され得る。
本発明は、本明細書における本発明のポリペプチドバリアントのフラグメントであって、前記ポリペプチドフラグメントが、リパーゼ活性を有する、フラグメントに関する。
本明細書において使用される「フラグメント」又は「部分配列」は、ポリヌクレオチド又はアミノ酸配列の部分であり、フラグメント又は部分配列は、それが関連する配列の少なくとも1つの機能活性を保持するか、又はコードする。
用語「機能フラグメント」は、それぞれ、単に、全長アミノ酸配列の一部を含むが、依然として、同じ又は類似の活性及び/又は機能を有する任意の核酸又はアミノ酸配列を指す。フラグメントは、オリジナルの配列の少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%を含む。機能フラグメントは、それぞれ、オリジナルの核酸又はオリジナルのアミノ酸配列と比較して、連続する核酸又はアミノ酸を含む。
本発明は、リパーゼ活性を有するバリアントポリペプチドであって、バリアントが、請求項1〜6のいずれかにおける少なくとも1つのバリアントポリペプチドと、リパーゼ活性を有する第2のポリペプチドのハイブリッドを含み、ハイブリッドが、リパーゼ活性を有する、バリアントポリペプチドに関する。「ハイブリッド」又は「キメラ」又は「融合タンパク質」は、第1の酵素のアミノ酸配列のフラグメントを、第2の酵素のアミノ酸配列のフラグメントと組み合わせて、ハイブリッド酵素を形成させ、ハイブリッドは、酵素活性を有することを意味する。
ハイブリッド酵素は、2つより多くの酵素のアミノ酸配列由来のフラグメントを用いて操作され得る。フラグメントは、本発明のリパーゼの触媒ドメインであってもよく、市販のリパーゼ、例えば、Lipolase(商標)、Lipex(商標)、Lipolex(商標)及びLipoclean(商標)(Novozymes A/S)、Lumafast(元々、Genencorより)並びにLipomax(Gist-Brocades/現DSM)の触媒ドメインと組み合わされて、ハイブリッド酵素を形成させてもよく、ハイブリッドは、リパーゼ活性を有する。
1つの実施形態において、本発明のリパーゼの少なくとも1つのドメイン又はフラグメントは、真菌トリアシルグリセロールリパーゼ(ECクラス3.1.1.3)から選択されるリパーゼの少なくとも1つのドメインと組み合わされる。真菌トリアシルグリセロールリパーゼは、サーモマイセス・ラヌギノーサ(Thermomyces lanuginosa)のリパーゼから選択されてもよい。1つの実施形態において、少なくとも1つのサーモマイセス・ラヌギノーサリパーゼは、米国特許第5,869,438号の配列番号2のアミノ酸1〜269に記載のトリアシルグリセロールリパーゼから選択される。
サーモマイセス・ラヌギノーサリパーゼは、米国特許第5,869,438号の配列番号2のアミノ酸1〜269と比較した場合、少なくとも次のアミノ酸置換:T231R及びN233Rを含むバリアントから選択されてもよい。前記リパーゼバリアントは、米国特許第5,869,438号の配列番号2のアミノ酸1〜269と比較した場合、次のアミノ酸交換:Q4V、V60S、A150G、L227G、P256Kの1つ以上をさらに含んでもよい。米国特許第5,869,438号の配列番号2のアミノ酸1〜269と比較した場合、T231R及びN233R置換を含むリパーゼは、本明細書においてLipexと呼ばれ得る。
サーモマイセス・ラヌギノーサリパーゼは、米国特許第5,869,438号の配列番号2のアミノ酸1〜269のポリペプチド配列内に少なくともアミノ酸置換T231R、N233R、Q4V、V60S、A150G、L227G、P256Kを含むバリアントから選択されてもよい。
サーモマイセス・ラヌギノーサリパーゼは、米国特許第5,869,438号の配列番号2のアミノ酸1〜269内のアミノ酸置換T231R及びN233Rを含むバリアントから選択されてもよく、米国特許第5,869,438号の配列番号2のアミノ酸1〜269の全長ポリペプチド配列と比較した場合、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%類似する。
アミノ酸置換を有するバリアントポリペプチドは、保存的アミノ酸置換であり得る。「保存的アミノ酸置換」又は「関連するアミノ酸」は、親アミノ酸配列と比較して、同じ位置における、類似の特性を有する異なるアミノ酸残基でのアミノ酸配列における1個のアミノ酸残基の置き換えを意味する。保存的アミノ酸置換の一部の例は、正に荷電したアミノ酸残基を異なる正に荷電したアミノ酸残基で置き換えること、極性アミノ酸残基を異なる極性アミノ酸残基で置き換えること、非極性アミノ酸残基を異なる非極性アミノ酸残基で置き換えること、塩基性アミノ酸残基を異なる塩基性アミノ酸残基で置き換えること、又は芳香族性アミノ酸残基を異なる芳香族性アミノ酸残基で置き換えることを含むが、これらに限定されない。
「成熟ポリペプチド」は、任意の翻訳後修飾、グリコシル化、リン酸化、切断、N末端修飾、C末端修飾、シグナル配列欠失を含む、その最終形態の酵素を意味する。成熟ポリペプチドは、発現系、ベクター、プロモーター、及び/又は産生プロセスに依存して変動し得る。
「酵素活性」は、酵素により発揮される少なくとも1つの触媒効果を意味する。酵素活性は、酵素の1ミリグラム当たりの単位(特定の活性)又は酵素の1分子当たり1分間当たりに変換される基質の分子の1ミリグラム当たりの単位(分子活性)として表される。酵素活性は、酵素の実際の機能、例えば、ペプチド結合の加水分解切断を触媒することによりプロテアーゼが発揮するタンパク質分解活性、エステル結合の加水分解切断によりリパーゼが発揮する脂肪分解活性等により特定することができる。
酵素活性は、酵素の保存中又は操作上の使用中に変化し得る。用語「酵素安定性」は、保存又は操作中の時間の関数としての酵素活性の保持に関する。本明細書において、用語「保存」は、製造された時間から、最終適用において使用される時間におけるポイントまで保存される製品又は組成物又は製剤を示すことを意味する。洗剤における保存中の時間の関数としての酵素活性の保持は、本明細書において「保存安定性」と呼ばれてもよい。
経時的な、ある種の条件下で保存されるか又は使用される酵素の触媒活性における変化を決定し、定量するために、「最初の酵素活性」が、定義された条件下で、時間ゼロにおいて(100%)及び後の時間におけるある種のポイントにおいて(x%)測定される。測定された値の比較により、酵素活性のポテンシャルの喪失の程度が、決定され得る。酵素活性の喪失の程度は、酵素安定性又は不安定性を決定する。
酵素の酵素活性及び/又は保存安定性及び/又は操作安定性に影響するパラメーターは、例えば、pH、温度、及び酸化基質の存在である。
バリアントポリペプチドは、広範なpHに渡り、約pH4.0〜約pH12.0の範囲内の任意の単一ポイントにて活性である。バリアントポリペプチド酵素は、pH4.0〜pH11.0、pH4.0〜pH10.0、pH4.0〜pH9.0、pH4.0〜pH8.0、pH4.0〜pH7.0、pH4.0〜pH6.0、又はpH4.0〜pH5.0の範囲に渡り活性であり得る。バリアントポリペプチドは、pH4.0、pH4.1、pH4.2、pH4.3、pH4.4、pH4.5、pH4.6、pH4.7、pH4.8、pH4.9、pH5.0、pH5.1、pH5.2、pH5.3、pH5.4、pH5.5、pH5.6、pH5.7、pH5.8、pH5.9、pH6.0、pH6.1、pH6.2、pH6.3、pH6.4、pH6.5、pH6.6、pH6.7、pH6.8、pH6.9、pH7.0、pH7.1、pH7.2、pH7.3、pH7.4、pH7.5、pH7.6、pH7.7、pH7.8、pH7.9、pH8.0、pH8.1、pH8.2、pH8.3、pH8.4、pH8.5、pH8.6、pH8.7、pH8.8、pH8.9、pH9.0、pH9.1、pH9.2、pH9.3、pH9.4、pH9.5、pH9.6、pH9.7、pH9.8、pH9.9、pH10.0、pH10.1、pH10.2、pH10.3、pH10.4、pH10.5、pH10.6、pH10.7、pH10.8、pH10.9、pH11.0、pH11.1、pH11.2、pH11.3、pH11.4、pH11.5、pH11.6、pH11.7、pH11.8、pH11.9、pH12.0、pH12.1、pH12.2、pH12.3、pH12.4、及びpH12.5、pH12.6、pH12.7、pH12.8、pH12.9以上において活性であり得る。
「pH安定性」は、特定のpH範囲において酵素活性を発揮する酵素の能力を指す。
バリアントポリペプチドは、広範な温度に渡り活性であり、温度は、約10℃〜約60℃の範囲における任意のポイントである。バリアントポリペプチドは、10℃〜55℃、10℃〜50℃、10℃〜45℃、10℃〜40℃、10℃〜35℃、10℃〜30℃、又は10℃〜25℃の温度範囲において活性であってもよい。バリアントポリペプチドは、20℃〜55℃、20℃〜50℃、20℃〜45℃、20℃〜40℃、20℃〜35℃、20℃〜30℃、又は20℃〜25℃の温度範囲において活性であってもよい。バリアントポリペプチドは、少なくとも10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃の温度、又はそれ以上の温度において活性であってもよい。
用語「熱による安定性」及び「熱安定性」は、特定の温度において、又は温度範囲内で触媒活性を発揮するタンパク質の能力を指す。酵素は、一般に、それらが触媒活性を発揮する温度の有限範囲を有する。中程度の温度(例えば、室温)において触媒活性を発揮する酵素に加えて、非常に高い又は非常に低い温度において触媒活性を発揮する能力がある酵素が存在する。熱安定性は、T50値(半減期とも呼ばれる、上記を参照)としても知られるものにより特徴付けられてもよい。T50は、熱処理を受けていない参照試料と比較した場合、50%の残りの酵素活性が、ある種の時間の熱不活性化後に依然として存在する温度を示す。
用語「熱抵抗性」及び「熱耐性」は、特定の温度、例えば、非常に高い又は非常に低い温度への曝露後に触媒活性を発揮するタンパク質の能力を指す。熱耐性タンパク質は、曝露温度において触媒活性を発揮し得ないが、好ましい温度に戻されると、触媒活性を発揮する。
ポリペプチドバリアントは、10〜100の間の整数である「n」を用いて、それぞれの親酵素のアミノ酸配列に少なくともn%同一であるアミノ酸配列として記載されてもよい。バリアントポリペプチドは、親酵素の全長アミノ酸配列と比較された場合、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一であり、酵素バリアントは、酵素活性を有する。
本発明は、本発明のバリアントポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにさらに関する。用語「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、「核酸分子」は、本明細書において互換的に使用され、任意の長さのポリマー非分岐形態の、ヌクレオチド、リボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチドのいずれか又は両方の組合せを指す。「遺伝子」は、ある種の遺伝子情報を有するDNAセグメントである。
「親」ポリヌクレオチド酸配列は、前記親ポリヌクレオチド配列の「バリアント」を生じる、配列の変異の導入のための開始配列である。「バリアントポリヌクレオチド」は、親ポリヌクレオチドがコードするものと同じ酵素をコードするポリヌクレオチドを指す。この場合におけるバリアントポリヌクレオチドは、その核酸配列においてその親ポリヌクレオチドと異なるが、コードされるポリペプチドは、未変化なままである。
本発明のポリヌクレオチドは、1つの態様において、配列番号2の全長ポリヌクレオチド配列と比較した場合、少なくとも80%同一である核酸配列を有する。本発明のポリヌクレオチドは、配列番号2の全長ポリヌクレオチド配列と比較した場合、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一である核酸配列を有し得る。
1つの実施形態において、配列番号2の全長ポリヌクレオチド配列と比較した場合、少なくとも80%同一であるバリアントポリヌクレオチドは、配列番号1の全長アミノ酸配列に対して少なくとも少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含むリパーゼ活性を有するポリペプチド配列をコードする。
本発明によるポリヌクレオチドは、配列番号1の全長アミノ酸配列に対して少なくとも少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含むリパーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。本発明のポリヌクレオチドは、配列番号1の全長アミノ酸配列に対して少なくとも少なくとも80%同一である、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含むリパーゼ活性を有するポリペプチドをコードし得る。
1つの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号1のアミノ酸配列に対してアミノ酸残基挿入、欠失、又は置換を含む、配列番号1の全長アミノ酸配列に対して少なくとも少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含むリパーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。アミノ酸残基挿入、欠失、又は置換は、アミノ酸残基位置番号:23、33、82、83、84、85、160、199、254、255、256、258、263、264、265、268、308、311、又はその任意の組合せにおいてであってもよい。アミノ酸置換は、Y23A、K33N、S82T、S83D、S83H、S83I、S83N、S83R、S83T、S83Y、S84S、S84N、84’Y、84’L、84’S、I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V、I85Y、K160N、P199I、P199V、I254A、I254C、I254E、I254F、I254G、I254L、I254M、I254N、I254R、I254S、I2454V、I254W、I254Y、I255A、I255L、A256D、L258A、L258D;L258E、L258G、L258H、L258N、L258Q、L258R、L258S、L258T、L258V、D263G、D263K、D263P、D263R、D263S;T264A、T264D、T264G、T264I、T264L、T264N、T264S、D265A、D265G、D265K、D265L、D265N、D265S、D265T、T268A、T268G、T268K、T268L、T268N、T268S、D308A、及びY311E、又はその任意の組合せから選択されてもよい。
本発明は、配列番号1に記載される全長アミノ酸配列に対して少なくとも80%同一である、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一である、リパーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、配列番号1のアミノ酸配列が、Y23A、K33N、S82T、S83D、S83H、S83I、S83N、S83R、S83T、S83Y、S84S、S84N、84’Y、84’L、84’S、I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V、I85Y、K160N、P199I、P199V、I254A、I254C、I254E、I254F、I254G、I254L、I254M、I254N、I254R、I254S、I2454V、I254W、I254Y、I255A、I255L、A256D、L258A、L258D;L258E、L258G、L258H、L258N、L258Q、L258R、L258S、L258T、L258V、D263G、D263K、D263P、D263R、D263S;T264A、T264D、T264G、T264I、T264L、T264N、T264S、D265A、D265G、D265K、D265L、D265N、D265S、D265T、T268A、T268G、T268K、T268L、T268N、T268S、D308A、及びY311Eから選択される少なくとも1個の置換を含む、ポリヌクレオチドに関する。
本発明は、配列番号1に記載される全長アミノ酸配列に対して少なくとも80%同一である、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一である、リパーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、配列番号1のアミノ酸配列が、Y23A、K33N、S82T、S83D、S83H、S83I、S83N、S83R、S83T、S83Y、S84S、S84N、84’Y、84’L、84’S、I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V、I85Y、K160N、P199I、P199V、I254A、I254C、I254E、I254F、I254G、I254L、I254M、I254N、I254R、I254S、I2454V、I254W、I254Y、I255A、I255L、A256D、L258A、L258D;L258E、L258G、L258H、L258N、L258Q、L258R、L258S、L258T、L258V、D263G、D263K、D263P、D263R、D263S;T264A、T264D、T264G、T264I、T264L、T264N、T264S、D265A、D265G、D265K、D265L、D265N、D265S、D265T、T268A、T268G、T268K、T268L、T268N、T268S、D308A、及びY311Eから選択される1個より多くの置換を含む、ポリヌクレオチドに関する。配列番号1のアミノ酸配列は、本明細書の実施例1、表1に記載される組合せのいずれかから選択される組合せを含んでもよい。
1つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、少なくとも位置83における置換を含む配列番号1のポリペプチドをコードし、置換は、S83D、S83H、S83I、S83N、S83R、S83T、及びS83Yから選択される。好ましくは、位置83における置換は、S83H、S83I、S83N、及びS83Yから選択される。1つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、少なくとも位置85における置換を含む配列番号1のポリペプチドをコードし、置換は、I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V、及びI85Yから選択される。好ましくは、位置85における置換は、I85L、I85T、及びI85Vから選択される。1つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、少なくとも位置255における置換を含む配列番号1のポリペプチドをコードし、置換は、I255A、I255Lから選択される。1つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、少なくとも位置264における置換を含む配列番号1のポリペプチドをコードし、置換は、T264A、T264D、T264G、T264I、T264L、T264N、T264Sから選択される。好ましくは、位置264における置換は、T264A、T264D、T264N、及びT264Sから選択される。1つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、少なくとも位置265における置換を含む配列番号1のポリペプチドをコードし、置換は、D265A、D265G、D265K、D265L、D265N、D265S、及びD265Tから選択される。好ましくは、位置265における置換は、D265A、D265G、D265S、及びD265Tから選択される。
1つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、少なくとも位置83における置換及び位置85における置換を含む、配列番号1のポリペプチドをコードし、位置83における置換は、S83D、S83H、S83I、S83N、S83R、S83T、及びS83Yから選択され、位置85における置換は、I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V、及びI85Yから選択される。本発明の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号1のポリペプチドをコードし、コードされるポリペプチドにおける少なくとも置換の次の組合せ:S83H、及びS83Iから選択される位置83における置換とI85L、I85P、I85T、及びI85Vから選択される位置85における置換;S83Hである位置83における置換とI85L、I85P、及びI85Tから選択される位置85における置換;S83Iである位置83における置換とI85Vである位置85における置換が生じる。
1つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、少なくとも位置83における置換及び位置255における置換を含む、配列番号1のポリペプチドをコードし、位置83における置換は、S83D、S83H、S83I、S83N、S83R、S83T、及びS83Yから選択され、位置255における置換は、I255A、及びI255Lから選択される。本発明の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号1のポリペプチドをコードし、コードされるポリペプチドにおける少なくとも置換の次の組合せ:S83H、S83N、及びS83Yから選択される位置83における置換とT264A、T264D、T264N、及びT264Sから選択される位置264における置換;S83H、S83N、S83T及びS83Yから選択される位置83における置換とI255Aである位置255における置換が生じる。
1つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、少なくとも位置83における置換及び位置264における置換を含む、配列番号1のポリペプチドをコードし、位置83における置換は、S83D、S83H、S83I、S83N、S83R、S83T、及びS83Yから選択され、位置264における置換は、T264A、T264D、T264G、T264I、T264L、T264N、及びT264Sから選択される。本発明の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号1のポリペプチドをコードし、コードされるポリペプチドにおける少なくとも置換の次の組合せ:S83H、S83N、及びS83Yから選択される位置83における置換とT264A、T264D、T264N、及びT264Sから選択される位置264における置換;S83Hである位置83における置換とT264A、T264N、及びT264Sから選択される位置264における置換;S83Nである位置83における置換とT264A、T264D、T264N、及びT264Sから選択される位置264における置換;S83Yである位置83における置換とT264A、及びT264Sから選択される位置264における置換が生じる。
1つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、少なくとも位置83における置換及び位置265における置換を含む、配列番号1のポリペプチドをコードし、位置83における置換は、S83D、S83H、S83I、S83N、S83R、S83T、及びS83Yから選択され、位置265における置換は、D265A、D265G、D265K、D265L、D265N、D265S、及びD265Tから選択される。本発明の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号1のポリペプチドをコードし、コードされるポリペプチドにおける少なくとも置換の次の組合せ:S83H、S83I、S83N、S83T及びS83Yから選択される位置83における置換とD265A、D265G、D265S、及びD265Tから選択される位置265における置換;S83Hである位置83における置換とD265A、D265G、D265S、及びD265Tから選択される位置265における置換;S83Iである位置83における置換とD265G、及びD265Sから選択される位置265における置換;S83Nである位置83における置換とD265A、D265G、D265S、及びD265Tから選択される位置265における置換;S83Tである位置83における置換とD265A、D265S、及びD265Tから選択される位置265における置換;S83Yである位置83における置換とD265Tである位置265における置換が生じる。
1つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、少なくとも位置85における置換及び位置265における置換を含む、配列番号1のポリペプチドをコードし、位置85における置換は、I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V、及びI85Yから選択され、位置265における置換は、D265A、D265G、D265K、D265L、D265N、D265S、及びD265Tから選択される。本発明の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号1のポリペプチドをコードし、コードされるポリペプチドにおける少なくとも置換の次の組合せ:I85A、I85H、I85L、I85P、I85S、I85T、及びI85Vから選択される位置85における置換とD265A、D265G、D265S、及びD265Tから選択される位置265における置換;I85Aである位置85における置換とD265Tである位置265における置換;I85Hである位置85における置換とD265Aである位置265における置換;I85Lである位置85における置換とD265A、D265G、D265S、及びD265Tから選択される位置265における置換;I85Pである位置85における置換とD265Aである位置265における置換;I85Sである位置85における置換とD265Sである位置265における置換;I85Tである位置85における置換とD265G、D265S、及びD265Tから選択される位置265における置換;I85Vである位置85における置換とD265A、D265G、D265S、及びD265Tから選択される位置265における置換が生じる。
1つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、少なくとも位置85における置換及び位置255における置換を含む、配列番号1のポリペプチドをコードし、位置85における置換は、I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V、及びI85Yから選択され、位置255における置換は、I255A、及びI255Lから選択される。本発明の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号1のポリペプチドをコードし、コードされるポリペプチドにおける少なくとも置換の次の組合せ:I85H置換である位置85における置換とI255A置換である位置255における置換;I85L置換である位置85における置換とI255A置換である位置255における置換;I85S置換である位置85における置換とI255A置換である位置255における置換;I85V置換である位置85における置換とI255A置換である位置255における置換が生じる。
1つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、少なくとも位置83における置換、位置85における置換、及び位置255における置換を含む、配列番号1のポリペプチドをコードし、位置83における置換は、S83D、S83H、S83I、S83N、S83R、S83T、及びS83Yから選択され、位置85における置換は、I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V、及びI85Yから選択され、位置255における置換は、I255A、及びI255Lから選択される。本発明の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号1のポリペプチドをコードし、コードされるポリペプチドにおける少なくとも置換の次の組合せ:S83H置換である位置83における置換、I85A、I85L、I85P、I85S、I85T、及びI85Vから選択される位置85における置換とI255A置換である位置255における置換;S83N置換である位置83における置換、I85L、及びI85Vから選択される位置85における置換とI255A置換である位置255における置換;S83T置換である位置83における置換、I85H、及びI85Vから選択される位置85における置換とI255A置換である位置255における置換;S83Y置換である位置83における置換、I85A、及びI85Vから選択される位置85における置換とI255A置換である位置255における置換が生じる。
1つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、少なくとも位置85における置換及び位置264における置換を含む、配列番号1のポリペプチドをコードし、位置85における置換は、I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V、及びI85Yから選択され、位置264における置換は、T264A、T264D、T264N、及びT264Sから選択される。本発明の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号1のポリペプチドをコードし、コードされるポリペプチドにおける少なくとも置換の次の組合せ:I85A置換である位置85における置換とT264A置換である位置264における置換;I85L置換である位置85における置換とT264S置換である位置264における置換;I85S置換である位置85における置換とT264A置換である位置264における置換;I85T置換である位置85における置換とT264A置換である位置264における置換;I85V置換である位置85における置換とT264A、T264D、T264N、及びT264Sから選択される位置264における置換が生じる。
1つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、少なくとも位置255における置換及び位置264における置換を含む、配列番号1のポリペプチドをコードし、位置255における置換は、I255A、及びI255Lから選択され、位置264における置換は、T264A、T264D、T264N、及びT264Sから選択される。本発明の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号1のポリペプチドをコードし、コードされるポリペプチドにおける少なくとも置換の次の組合せ:I255A置換である位置255における置換とT264A、T264D、T264N、及びT264Sから選択される位置264における置換が生じる。
1つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、少なくとも位置255における置換及び位置265における置換を含む、配列番号1のポリペプチドをコードし、位置255における置換は、I255A、及びI255Lから選択され、位置265における置換は、T264A、T264D、T264N、及びT264Sから選択される。本発明の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号1のポリペプチドをコードし、コードされるポリペプチドにおける少なくとも置換の次の組合せ:I255A置換である位置255における置換とD265A、D265G、D265K、D265L、D265N、D265S、及びD265Tから選択される位置265における置換;I255A置換である位置255における置換とD265A、D265G、D265S、及びD265Tから選択される位置265における置換;I255A置換である位置255における置換とD265S置換である位置265における置換が生じる。
1つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、少なくとも位置264における置換及び位置265における置換を含む、配列番号1のポリペプチドをコードし、位置264における置換は、T264A、T264D、T264N、及びT264Sから選択され、位置265における置換は、D265A、D265G、D265K、D265L、D265N、D265S、及びD265Tから選択される。本発明の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号1のポリペプチドをコードし、コードされるポリペプチドにおける少なくとも置換の次の組合せ:T264A置換である位置264における置換とD265A、D265G、D265S、及びD265Tから選択される位置265における置換;T264D置換である位置264における置換とD265A、及びD265Tから選択される位置265における置換;T264N置換である位置264における置換とD265A、及びD265Tから選択される位置265における置換;T264S置換である位置264における置換とD265A、D265G、D265S、及びD265Tから選択される位置265における置換が生じる。
1つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、少なくとも位置85における置換及び位置265における置換を含む、配列番号1のポリペプチドをコードし、位置85における置換は、I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V、及びI85Yから選択され、位置265における置換は、D265A、D265G、D265K、D265L、D265N、D265S、及びD265Tから選択され、位置264における置換をさらに含み、置換は、T264A、T264D、T264N、及びT264Sから選択される。本発明の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号1のポリペプチドをコードし、コードされるポリペプチドにおける少なくとも置換の次の組合せ:I85A置換である位置85における置換、T264A置換である位置264における置換とD265T置換である位置265における置換;I85L置換である位置85における置換、T264S置換である位置264における置換とD265A、D265G、D265S、及びD265Tから選択される位置265における置換;I85S置換である位置85における置換、T264A置換である位置264における置換とD265T置換である位置265における置換;I85T置換である位置85における置換、T264A置換である位置264における置換とD265G、D265S、及びD265Tから選択される位置265における置換;I85V置換である位置85における置換、T264A、T264D、T264N、及びT264Sから選択される位置264における置換とD265A、D265G、D265S、及びD265Tから選択される位置265における置換が生じる。
1つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、少なくとも位置85における置換及び位置265における置換を含む、配列番号1のポリペプチドをコードし、位置85における置換は、I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V、及びI85Yから選択され、位置265における置換は、D265A、D265G、D265K、D265L、D265N、D265S、及びD265Tから選択され、位置255における置換をさらに含み、置換は、I255A、及びI255Lから選択される。本発明の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号1のポリペプチドをコードし、コードされるポリペプチドにおける少なくとも置換の次の組合せ:I85H置換である位置85における置換、I255A置換である位置255における置換とD265A置換である位置265における置換;I85L置換である位置85における置換、I255A置換である位置255における置換とD265A、D265G、D265S、及びD265Tから選択される位置265における置換;I85S置換である位置85における置換、I255A置換である位置255における置換とD265T置換である位置265における置換;I85V置換である位置85における置換、I255A置換である位置255における置換とD265A、D265G、D265S、及びD265Tから選択される位置265における置換が生じる。
1つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、少なくとも位置85における置換、位置265における置換、位置255における置換、及び位置264における置換を含む、配列番号1のポリペプチドをコードし、位置85における置換は、I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V、及びI85Yから選択され、位置265における置換は、D265A、D265G、D265K、D265L、D265N、D265S、及びD265Tから選択され、位置255における置換は、I255A及びI255Lから選択され、位置264における置換は、T264A、T264D、T264N、及びT264Sから選択される。本発明の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号1のポリペプチドをコードし、コードされるポリペプチドにおける少なくとも置換の次の組合せ:I85L置換である位置85における置換、I255A置換である位置255における置換、T264S置換である位置264における置換とD265A、D265G、D265S、及びD265Tから選択される位置265における置換;I85S置換である位置85における置換、I255A置換である位置255における置換、T264A置換である位置264における置換とD265T置換である位置265における置換;I85V置換である位置85における置換、I255A置換である位置255における置換、T264A、T264G、T264S、及びT264Tから選択される位置264における置換とD265A、D265G、D265S、及びD265Tから選択される位置265における置換が生じる。
1つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、少なくとも位置83における置換、位置85における置換、並びに位置264及び/又は位置265における置換を含む、配列番号1のポリペプチドをコードし、位置83における置換は、S83D、S83H、S83I、S83N、S83R、S83T、及びS83Yから選択され、位置85における置換は、I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V、及びI85Yから選択され、位置264における置換は、T264A、T264D、T264N、及びT264Sから選択され、位置265における置換は、D265A、D265G、D265K、D265L、D265N、D265S、及びD265Tから選択される。本発明の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号1のポリペプチドをコードし、コードされるポリペプチドにおける少なくとも置換の次の組合せ:S83H置換である位置83における置換、I85A、I85L、I85P、I85S、I85T、及びI85Vから選択される位置85における置換、T264A、T264N、及びT264Sから選択される位置264における置換とD265A、D265G、D265S、及びD265Tから選択される位置265における置換;S83H置換である位置83における置換、I85L置換である位置85における置換とD265G置換である位置265における置換;S83H置換である位置83における置換、I85L置換である位置85における置換、T264A置換である位置264における置換とD265T置換である位置265における置換;S83N置換である位置83における置換、I85L、及びI85Vから選択される位置85における置換、T264A、T264D、T264N、及びT264Sから選択される位置264における置換とD265A、D265G、D265S、及びD265Tから選択される位置265における置換;S83Y置換である位置83における置換、I85A、及びI85Vから選択される位置85における置換、T264A、及びT264Sから選択される位置264における置換とD265T置換が生じる。
1つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、少なくとも位置83における置換、位置85における置換、及び位置255における置換を含む、配列番号1のポリペプチドをコードし、位置264及び/又は位置265における置換をさらに含んでもよく、位置83における置換は、S83D、S83H、S83I、S83N、S83R、S83T、及びS83Yから選択され、位置85における置換は、I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V、及びI85Yから選択され、位置255における置換は、I255A、及びI255Lから選択され、位置264における置換は、T264A、T264D、T264N、及びT264Sから選択され、位置265における置換は、D265A、D265G、D265K、D265L、D265N、D265S、及びD265Tから選択される。本発明の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号1のポリペプチドをコードし、コードされるポリペプチドにおける少なくとも置換の次の組合せ:S83H置換である位置83における置換、I85A、I85L、I85P、I85S、I85T、及びI85Vから選択される位置85における置換、I255A置換である位置255における置換、T264A、T264N、及びT264Sから選択される位置264における置換とD265A、D265G、D265S、及びD265Tから選択される位置265における置換;S83N置換である位置83における置換、I85L、及びI85Vから選択される位置85における置換、I255A置換、T264A、T264D、T264N、及びT264Sから選択される位置264における置換とD265A、D265G、D265S、及びD265Tから選択される位置265における置換;S83Y置換である位置83における置換、I85A、及びI85Vから選択される位置85における置換、I255A置換である位置255における置換、T264A、及びT264Sから選択される位置264における置換とD265T置換である位置265における置換が生じる。
1つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号1のポリペプチドをコードし、上で開示された置換の組合せに加えて、次のさらなる置換:K160N、I254L、I256D、D263R、T268Gの少なくとも1個がコードされる。
本発明のポリヌクレオチドは、1つの態様において、リパーゼ活性を有するバリアントポリペプチドをコードし、バリアントポリペプチドは、配列番号1に記載される全長アミノ酸配列に対して少なくとも80%同一である、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列であり、バリアントポリペプチドは、配列番号1のリパーゼと比較した場合、増大した酵素活性、pH安定性、タンパク質分解性の分解に対する安定性、又はその任意の組合せを発揮する。
本発明は、リパーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、上で開示された本発明の全長アミノ酸配列のフラグメントである、ポリヌクレオチドに関する。
本発明は、リパーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが、少なくとも1つの本発明のポリペプチドと本発明のポリペプチドと異なる少なくとも1つのポリペプチドのハイブリッドである、ポリヌクレオチドに関する。1つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、リパーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、ポリペプチドは、少なくとも1つの本発明のポリペプチドと本発明のポリペプチドと異なる少なくとも1つのリパーゼのハイブリッドである。
バリアントポリヌクレオチド及びバリアントポリペプチド配列は、親配列と比較された場合、それらの「配列同一性」により定義されてもよい。配列同一性は、通常、「%配列同一性」又は「%同一性」として提供される。配列同一性の計算のために、第1の工程において配列アライメントが生じなければならない。本発明によると、対の全体的なアライメントが生じなければならず、これは、2つの配列が、それらの完全な長さに渡りアライメントされなければならないことを意味し、アライメントアルゴリズムと呼ばれる、数学的アプローチを使用することにより通常生じる。
本発明によると、アライメントは、Needleman及びWunsch(J. Mol. Biol.、(1979年)、48、443〜453頁)のアルゴリズムを使用することにより、生成される。好ましくは、プログラム「ニードル(NEEDLE)」(The European Molecular Biology Open Software Suite(EMBOSS))が、プログラムデフォルトパラメーター(ポリヌクレオチド:ギャップ開始=10.0、ギャップ伸長=0.5及びマトリックス=EDNAFULL;ポリペプチド:ギャップ開始=10.0、ギャップ伸長=0.5及びマトリックス=EBLOSUM62)を使用して、現在の発明の目的のために使用される。
2つの配列をアライメントした後、第2の工程において、同一性の値は、生じたアライメントから決定される。
1つの実施形態において、%同一性は、同一の残基の数を、その完全な長さに渡る本発明のそれぞれの配列を示しているアライメント領域の長さで割り、100を掛けること:%同一性=(同一の残基/その完全な長さに渡る本発明のそれぞれの配列を示しているアライメント領域の長さ)×100により計算される。
好ましい実施形態において、%同一性は、同一の残基の数を、それらの完全な長さに渡る2つのアライメントされた配列を示しているアライメント領域の長さで割り、100を掛けること:%同一性=(同一の残基/それらの完全な長さに渡る2つのアライメントされた配列を示しているアライメント領域の長さ)×100により計算される。
バリアントポリペプチドは、親配列と比較された場合、それらの「配列類似性」により定義されてもよい。配列類似性は、通常、「%配列類似性」又は「%類似性」として提供される。%配列類似性は、アミノ酸の定義されたセットが、例えば、それらのサイズにより、それらの疎水性により、それらの電荷により、又は他の特徴により、類似の特性を共有することを考慮する。本明細書において、1つのアミノ酸の類似のアミノ酸での交換は、「保存的変異」と呼ばれてもよい。本発明による類似のアミノ酸は、以下の通り定義される。
Figure 2020519288
保存的アミノ酸置換は、機能的タンパク質、例えば、酵素のポリペプチド配列の配列の全長に渡り生じ得る。1つの実施形態において、そのような変異は、酵素の機能的ドメインに属さない。1つの実施形態において、保存的変異は、酵素の触媒中心に属さない。
配列類似性の計算のために、上で記載された通り、第1の工程において配列アライメントが生じなければならない。
1つの実施形態において、%類似性は、同一の残基の数プラス類似の残基の数を、その完全な長さに渡る本発明のそれぞれの配列を示しているアライメント領域の長さで割り、100を掛けること:%類似性=[(同一の残基+類似の残基)/その完全な長さに渡る本発明のそれぞれの配列を示しているアライメント領域の長さ]×100により計算される。
好ましい実施形態において、%類似性は、同一の残基の数プラス類似の残基の数を、それらの完全な長さに渡る2つのアライメントされた配列を示しているアライメント領域の長さで割り、100を掛けること:%類似性=[(同一の残基+類似の残基)/それらの完全な長さに渡る2つのアライメントされた配列を示しているアライメント領域の長さ]×100により計算される。
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、「発現」されていてもよい。「発現」は、通常、生物における前記ポリペプチドを実際に産生するためのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が受けるプロセスを説明する。
酵素の産業上の生産は、通常、発現系を使用することにより行われる。本明細書における「野生型細胞」は、ある種の修飾前の細胞を意味する。用語「組み換え細胞」(本明細書において「遺伝子修飾された細胞」とも呼ぶ)は、それがもたらされた野生型細胞と比較して、変化した、修飾された又は異なる遺伝子型を発揮するように、遺伝子変化させるか、修飾されるか、又は操作された細胞を指す。「組み換え細胞」は、ある種のタンパク質又は酵素をコードする外来性ポリヌクレオチドを含み、したがって、前記タンパク質又は酵素を発現してもよい。
「発現系」は、宿主微生物、発現宿主、宿主細胞、産生生物、又は産生株を意味し得、これらの用語のそれぞれは、互換的に使用され得る。発現系の例は、クロコウジカビ(Aspergillus niger)、ニホンコウジカビ(Aspergillus oryzae)、ハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、サーモマイセス・ラヌギノサス(Thermomyces lanuginosus)、フザリウム・オキシスポラム(fusarium oxysporum)、フザリウム・ヘテロスポルム(Fusarium heterosporum)、大腸菌(Escherichia coli)、バチルス、好ましくは、枯草菌(Bacillus subtilis)、又はバチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、シュードモナス、好ましくは、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)(コマガテラ・ファフィ(Komagataella phaffii)としても知られる)、ミセリオプトーラ・サーモフィル(Myceliopthora thermophile)(C1)、***酵母(Schizosaccharomyces pombe)、トリコデルマ、好ましくは、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)及びサッカロマイセス、好ましくは、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)を含むが、これらに限定されない。バリアントポリペプチドは、上で挙げられた発現系を使用して産生される。
用語「天然に存在しない」は、(ポリ)ヌクレオチド、アミノ酸、(ポリ)ペプチド、酵素、タンパク質、細胞、生物、又はそのオリジナルの天然に存在する環境若しくは供給源に存在しない他の物質を指す。
ポリヌクレオチド及びポリペプチドの関係における用語「異種性」(又は外来性若しくは外来若しくは組み換え)は、本明細書において
(a)宿主細胞にとって天然でない、
(b)宿主細胞にとって天然であるが、構造上の修飾、例えば、欠失、置換、及び/若しくは挿入が、天然の配列を変化させるための組み換えDNA技術により宿主細胞のDNAの操作の結果として含まれる、又は
(c)宿主細胞にとって天然であるが、発現が、定量的に変化するか、又は発現が、組み換えDNA技術により宿主細胞のDNAの操作の結果として天然の宿主細胞と異なるゲノム位置、例えば、より強力なプロモーターから指示される
として定義される。
2つ以上のポリヌクレオチド配列又は2つ以上のアミノ酸配列に関して、用語「異種性」を使用して、2つ以上のポリヌクレオチド配列又は2つ以上のアミノ酸配列が、互いとの特定の組合せにおいて天然に生じないことを特徴付ける。
本明細書において使用される「遺伝子コンストラクト」又は「発現カセット」は、本明細書に記載される1つ以上の制御配列に(少なくともプロモーターに)作動可能に結合された、発現されるべき目的の少なくとも1つの配列を含むDNA分子である。典型的には、発現カセットは、3つのエレメント:プロモーター配列、オープンリーディングフレーム、及び真核生物において、通常、ポリアデニル化部位を含有する3'非翻訳領域を含む。さらなる調節エレメントは、転写並びに翻訳エンハンサーを含んでもよい。イントロン配列をまた、5'非翻訳領域(UTR)に又はコード配列において加えて、細胞質において蓄積する成熟メッセージの量を増大してもよい。発現カセットは、ベクターの一部であってもよいか又は宿主細胞のゲノムに統合され、その宿主細胞のゲノムと一緒に複製されてもよい。発現カセットは、通常、発現を増大させるか、又は減少する能力がある。
本明細書において使用される用語「ベクター」は、別の細胞への移動のため、又は所定の細胞内での安定な若しくは一過性発現のため、外来ポリヌクレオチド配列を運ぶのに適した任意の種類のコンストラクトを含む。本明細書において使用される用語「ベクター」は、任意の種類のクローニングビークル、例えば、非限定的に、プラスミド、ファージミド、ウイルスベクター(例えば、ファージ)、バクテリオファージ、バキュロウイルス、コスミド、フォスミド、人工染色体、又は及び目的の特定の宿主に特異的な任意の他のベクターを包含する。少ないコピー数又は高いコピー数ベクターがまた含まれる。外来ポリヌクレオチド配列は、通常、「目的の遺伝子」として本明細書において言及されてもよいコード配列を含む。目的の遺伝子は、宿主細胞の起源又は行先の種類に依存して、イントロン及びエクソンを含んでもよい。
本明細書において使用されるベクターは、宿主細胞又は宿主細胞小器官への形質転換の際に外来ポリヌクレオチドの転写及び翻訳のためのセグメントを提供してもよい。そのようなさらなるセグメントは、調節ヌクレオチド配列、特定の細胞タイプにおけるその維持及び/又は複製のため要求される1つ以上の複製の起源、1つ以上の選択可能なマーカー、ポリアデニル化シグナル、外来コード配列の挿入に適した部位、例えば、複数のクローニング部位等を含んでもよい。1つの例は、ベクターが、細菌細胞においてエピソーム遺伝子エレメント(例えば、プラスミド又はコスミド分子)として維持されることが要求される場合である。複製の適当な起源の非限定的な例は、f1-ori及びcolE1を含む。
ベクターは、例えば、細菌宿主細胞においてプラスミドとして、宿主細胞のゲノムに統合することなく複製してもよいか、又はそれは、そのDNAの一部若しくは全てを宿主細胞のゲノムに統合し、これにより、そのDNAの複製及び発現を導いてもよい。
外来核酸は、クローニングによりベクターに導入されてもよい。クローニングは、適当な手段及び方法(例えば、制限酵素)によるベクター(例えば、複数のクローニング部位内)及び外来ポリヌクレオチドの切断により、前記外来核酸とベクターの制御された融合を可能にする個々の核酸内のフィッティング構造が、生成されてもよいことを意味し得る。
ベクターに導入されると、コード配列を含む外来核酸は、宿主細胞又は宿主細胞小器官に導入される(形質転換される、形質導入される、遺伝子導入される等)のに適当であり得る。宿主細胞又は宿主細胞小器官における外来ポリヌクレオチド配列の発現に適当な、クローニングベクターが選ばれてもよい。
本明細書において言及される用語「導入」又は「形質転換」は、移動のために使用される方法の無関係な宿主細胞への外来性ポリヌクレオチドの移動を包含する。すなわち、本明細書において使用される用語「形質転換」は、ベクター、シャトルシステム、又は宿主細胞に非依存性であり、それは、当該技術分野において公知の形質転換のポリヌクレオチド移動方法(例えば、Sambrook, J.ら、(1989年)、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2編、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NYを参照)に関するばかりでなく、任意のさらなる種類のポリヌクレオチド移動方法、例えば、非限定的に、形質導入又は遺伝子導入を包含する。器官形成によるものであっても胚形成によるものであっても、続くクローン増殖を可能にする植物組織は、遺伝子コンストラクト及びそれから再生された植物全体を用いて形質転換されてもよい。選ばれた特定の組織は、形質転換されている特定の種に利用可能であり、最も適したクローン増殖システムに依存して変動する。
本発明の1つの実施形態において、ベクターは、宿主細胞の形質転換のために使用される。
ポリヌクレオチドは、宿主細胞に一過性又は安定的に導入されてもよく、例えば、プラスミドとして統合されず維持されてもよい。「安定な形質転換」は、形質転換された細胞又は細胞小器官が、細胞又は細胞小器官の次の世代に外来コード配列を含む核酸を受け渡すことを意味し得る。通常、安定な形質転換は、外来コード配列を含む核酸の染色体への又はエピソーム(核DNAの別の片)としての統合に起因する。
「一過性形質転換」は、形質転換されると、細胞又は細胞小器官は、ある種の時間、大抵は、1世代の間、外来核酸配列を発現することを意味し得る。通常、一過性形質転換は、染色体に又はエピソームとして統合されていない外来核酸配列を含む核酸に起因する。
或いは、それは、宿主ゲノムに統合されてもよい。次に、得られた形質転換された植物細胞を使用して、当業者に公知の手法で、形質転換された細胞を再生してもよい。
組み換え細胞は、それぞれの野生型細胞と比較した場合、「増大した」又は「減少した」発現を示してもよい。
本明細書において使用される用語「増大した発現」、「増強された発現」又は「過剰発現」は、オリジナルの野生型発現レベル(発現が存在し得ないか、又は計り知れない発現であり得る)への追加である任意の形態の発現を意味する。本明細書における「増大した発現」、「増強された発現」又は「過剰発現」への言及は、対照生物と比べた、遺伝子発現における増大並びに/又は、ポリペプチドに言及される限り、増大したポリペプチドレベル及び/若しくは増大したポリペプチド活性を意味すると解釈される。発現における増大は、対照生物のものと比較して、好ましい順に小さい方から、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、若しくは100%又はさらにそれ以上であってもよい。
遺伝子又は遺伝子産物の発現を増大させる方法、例えば、適当なプロモーターによりもたらされる過剰発現は、転写エンハンサー又は翻訳エンハンサーを使用する。プロモーター又はエンハンサーエレメントとして働く単離された核酸は、目的のポリペプチドをコードする核酸の発現を増大させるように、ポリヌクレオチドの非異種性形態の適当な位置(典型的には、上流)に導入されてもよい。例えば、内在性プロモーターは、変異、欠失、及び/若しくは置換によりインビボで変化してもよく(Kmiec、米国特許第5,565,350号;Zarlingら、国際公開第93/22443号を参照)、又は単離されたプロモーターは、遺伝子の発現を制御するように、本発明の遺伝子から正しい方向及び距離で生物に導入されてもよい。
イントロン配列をまた、5'非翻訳領域(UTR)又は部分的なコード配列のコード配列に加えて、細胞質において蓄積する成熟メッセージの量を増大してもよい。発現コンストラクトにおけるスプライス可能なイントロンの転写単位への包含は、mRNAとタンパク質レベルの両方において最大1000倍遺伝子発現を増大させることを示した(Buchman及びBerg、(1988年)、Mol. Cell biol.、8:4395〜4405頁;Callisら、(1987年)、Genes Dev、1:1183〜1200頁)。遺伝子発現のそのようなイントロン増強は、典型的には、転写単位の5'末端近くに置かれた場合、最大である。
ポリペプチドの増大した発現又は過剰発現を得るために、最も一般的には、このポリペプチドをコードする核酸は、ポリアデニル化シグナルを用いてセンス方向で過剰発現される。イントロン又は他の増強エレメントは、意図される発現パターンを有する発現をもたらすのに適したプロモーターに加えて使用されてもよい。
酵素は、一般に、所望の酵素の発現に適した条件下での組み換え細胞の培養により所望の酵素を発現する組み換え細胞を使用することにより商業上生産されている。
培養は、通常、組み換え細胞を成長させ(このプロセスは、発酵と呼ばれ得る)、所望のタンパク質を発現させる適当な栄養培地において行う。発酵の終わりに、発酵ブロスが集められ、さらに処理されてもよく、発酵ブロスは、液体分画及び固体分画を含む。
目的の酵素は、発酵ブロスからさらに精製されてもよい。得られた産物は、本明細書において、「単離されたポリペプチド産物」又は「単離されたリパーゼ産物」と呼ばれてもよく、この関係においてポリペプチド又はリパーゼは、本発明のポリペプチド又はリパーゼを意味する。用語「精製」又は「精製すること」は、少なくとも1つの成分、例えば、目的のタンパク質が、少なくとも別の成分、例えば、発酵ブロスの粒子状物質から分けられ、異なるコンパートメント又はフェーズに移動されるプロセスを指し、異なるコンパートメント又はフェーズは、物理的障害により分けられることを必ずしも必要としない。そのような異なるコンパートメントの例は、濾過膜又は濾布により分けられた2つのコンパートメント、すなわち、濾液及び残余分であり、そのような異なるフェーズの例は、それぞれ、ペレットと上清又はケーキと濾液である。
目的の酵素は、(発酵ブロスの液体分画に)分泌されてもよいか、又は宿主細胞から分泌されなくてもよい(したがって、発酵ブロスの細胞に含まれる)。これに依存して、所望のタンパク質又は酵素は、発酵ブロスの液体分画から、又は細胞溶解物から回収されてもよい。所望の酵素の回収は、当業者に公知の方法を使用する。発酵ブロスからタンパク質又は酵素を回収する方法は、収集、遠心分離、濾過、抽出、及び沈殿を含むが、これらに限定されない。目的の酵素が、発酵ブロスにおいて沈殿するか、若しくは結晶化するか、又は発酵ブロスの粒子状物質に少なくとも一部結合するなら、バイオマスから酵素を放出させるか、又は酵素結晶及び沈殿物を溶解させるさらなる処理工程が、必要とされてもよい。米国特許第6,316,240B1号は、発酵中に、発酵ブロスから沈殿させ、及び/又は結晶化させる、酵素を回収する方法を記載する。所望の酵素が、発酵ブロスの細胞に含まれるなら、細胞からの酵素の放出が必要とされ得る。細胞からの放出は、例えば、非限定的に、当業者に周知の技術を用いた細胞溶解により、達成することができる。
「リパーゼ活性を有する純粋なポリペプチド」は、本発明のポリペプチドが、単離されたポリペプチド産物において、単離されたポリペプチド産物の総重量に対して少なくとも約80重量%の量で含まれることを意味する。「リパーゼ活性を有する純粋なポリペプチド」は、本発明のポリペプチドが、単離されたポリペプチド産物において、全て、ポリペプチド産物の総重量に対して、少なくとも約81重量%、少なくとも約82重量%、少なくとも約83重量%、少なくとも約84重量%、少なくとも約85重量%、少なくとも約86重量%、少なくとも約87重量%、少なくとも約88重量%、少なくとも約89重量%、少なくとも約90重量%、少なくとも約91重量%、少なくとも約92重量%、少なくとも約93重量%、少なくとも約94重量%、少なくとも約95重量%、少なくとも約96重量%、少なくとも約97重量%、少なくとも約98重量%、少なくとも約99重量%、又は100重量%の量で含まれることを意味し得る。好ましくは、「精製された」は、物質が、100%純粋な状態にあることを意味する。「リパーゼ活性を有する純粋なポリペプチド」は、単離されたポリペプチド産物に含まれる本発明のポリペプチドと異なる化合物の量が、全て、ポリペプチド産物の総重量に対して、20重量%未満、19重量%未満、18重量%未満、17重量%未満、16重量%未満、15重量%未満、14重量%未満、13重量%未満、12重量%未満、11重量%未満、10重量%未満、9重量%未満、8重量%未満、7重量%未満、6重量%未満、5重量%未満、4重量%未満、3重量%未満、2重量%未満、又は1重量%未満であることを意味し得る。単離されたポリペプチド産物において含まれる本発明のポリペプチドと異なる化合物は、例えば、成分、例えば、発酵培地が起源の塩、産生宿主細胞が起源の細胞デブリ、発酵中に産生宿主細胞により産生される代謝物であってもよい。
単離されたポリペプチド産物をさらに処理して、「酵素製剤」が形成されてもよい。
「液体」は、20℃及び101.3kPaにおける外観に関する。
「酵素製剤」は、少数の成分を含む任意の非複合製剤を意味し、成分は、酵素製剤において含まれる酵素を安定化する及び/又は酵素製剤自体の安定化の目的を果たす。用語「酵素安定性」は、保存又は操作中の時間の関数としての酵素活性の保持を指す。用語「酵素製剤安定性」は、保存又は操作中の酵素製剤の外観の維持、並びに保存又は操作中の微生物汚染の回避に関する。
「酵素製剤」は、それ自体が、最終使用のため決定されてもよい複合製剤に製剤化されることを意味する、組成物である。本発明による「酵素製剤」は、幾つかの成分を含む複合製剤ではなく、成分を複合製剤に製剤化して、最終適用において特定の作用をそれぞれ個別に発揮する。複合製剤は、洗剤製剤であってもよいが、これに限定されず、個々の洗剤成分は、洗剤製剤の洗濯性能において有効な量で製剤化される。
本発明の1つの態様において、本発明の少なくとも1つのアミラーゼバリアントは、酵素製剤に含まれる。
酵素製剤は、固体又は液体のいずれかであり得る。酵素製剤は、当該技術分野において公知の技術を使用することにより、得ることができる。例えば、非限定的に、固体酵素製剤は、押出又は造粒により得ることができる。適当な押出及び造粒技術が、当該技術分野において知られており、例えば、国際公開第9419444A1号及び国際公開第9743482A1号に記載されている。
液体酵素製剤は、全て、酸素濃縮物の総重量に対して、0.1%〜40重量%、又は0.5%〜30重量%、又は1%〜25重量%、又は3%〜10重量%の範囲内の酵素の量を含んでもよい。
液体酵素濃縮物は、1種より多くの酵素を含んでもよい。1つの実施形態において、酵素製剤は、本発明による1つ以上のリパーゼを含む。1つの実施形態において、酵素製剤は、本発明による1つ以上のリパーゼ、並びに本発明のリパーゼと異なるリパーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、ラッカーゼ、ペクチナーゼ、ヌクレアーゼ、及びその任意の組合せの群から選択される少なくとも1つのさらなる酵素を含む。本発明の水性酵素製剤は、全て、酵素製剤の総重量に対して、約50重量%より多い、約60重量%より多い、約70重量%より多い、又は約80重量%より多い量の水を含んでもよい。
1つの実施形態において、酵素製剤は、本発明の少なくとも1つのポリペプチドに加えて、他の酵素、保存剤及び安定剤からなる群から選択される1つ以上の化合物を含む。
1つの実施形態において、液体酵素製剤は、本発明の少なくとも1つのポリペプチドバリアント及び少なくとも1つの保存剤を含む。適当な保存剤の非限定的な例は、(四級)アンモニウム化合物、イソチアゾリノン、有機酸、及びホルムアルデヒド放出剤を含む。適当な(四級)アンモニウム化合物の非限定的な例は、塩化ベンザルコニウム、ポリヘキサメチレンビグアニド(PHMB)、ジデシルジメチルアンモニウムクロリド(DDAC)、及びN-(3-アミノプロピル)-N-ドデシルプロパン-1,3-ジアミン(ジアミン)を含む。適当なイソチアゾリノンの非限定的な例は、1,2-ベンゾイソチアゾリン-3-オン(BIT)、2-メチル-2H-イソチアゾール-3-オン(MIT)、5-クロロ-2-メチル-2H-イソチアゾール-3-オン(CIT)、2-オクチル-2H-イソチアゾール-3-オン(OIT)、及び2-ブチル-ベンゾ[d]イソチアゾール-3-オン(BBIT)を含む。適当な有機酸の非限定的な例は、安息香酸、ソルビン酸、L-(+)-乳酸、ギ酸、及びサリチル酸を含む。適当なホルムアルデヒド放出剤の非限定的な例は、N,N'-メチレンビスモルホリン(MBM)、2,2',2''-(ヘキサヒドロ-1,3,5-トリアジン-1,3,5-トリイル)トリエタノール(HHT)、(エチレンジオキシ)ジメタノール、アルファ,アルファ',アルファ''-トリメチル-1,3,5-トリアジン-1,3,5(2H,4H,6H)-トリエタノール(HPT)、3,3'-メチレンビス[5-メチルオキサゾリジン](MBO)、及びシス-1-(3-クロロアリル)-3,5,7-トリアザ-1-アゾニアアダマンタンクロリド(CTAC)を含む。
さらなる有用な保存剤は、ヨードプロピニルブチルカルバメート(IPBC)、ハロゲン放出化合物、例えば、ジクロロ-ジメチル-ヒダントイン(DCDMH)、ブロモ-クロロ-ジメチル-ヒダントイン(BCDMH)、及びジブロモ-ジメチル-ヒダントイン(DBDMH);ブロモ-ニトロ化合物、例えば、ブロノポール(2-ブロモ-2-ニトロプロパン-1,3-ジオール)、2,2-ジブロモ-2-シアノアセトアミド(DBNPA);アルデヒド、例えば、グルタルアルデヒド;フェノキシエタノール;ビフェニル-2-オール;並びにジンク又はナトリウムピリチオンを含む。
1つの実施形態において、液体酵素製剤は、本発明の少なくとも1つのポリペプチドバリアント及び少なくとも1つの酵素安定剤を含む。酵素安定剤は、液体酵素濃縮物に含まれる少なくとも1つの酵素の保存中に、酵素活性の喪失を低減する能力がある物質から選択される。本発明内の酵素活性の低減された喪失は、酵素活性の喪失が、保存前の最初の酵素活性と比較した場合、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は少なくとも99.5%低減されることを意味し得る。
1つの実施形態において、少なくとも1つの酵素安定剤は、リパーゼ安定化化合物から選択される。リパーゼは、「適用時に入手可能な」その脂質分解活性が、保存前の最初の脂肪分解活性と比較した場合、100%と等しい場合、本発明によると安定している。リパーゼは、適用時に入手可能なその脂肪分解活性が、保存前の最初の脂肪分解活性と比較した場合、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は少なくとも99.5%であるなら、本発明において安定であると呼ばれ得る。
リパーゼは、NaCl若しくはKClのような塩、又は乳酸及びギ酸のアルカリ塩から選択される少なくとも1つの化合物の存在下で安定化されてもよい。
本発明は、本発明の少なくとも1つのバリアントポリペプチドと少なくとも1つの他の酵素の組合せに関する。1つの態様において、そのような組合せは、20℃及び101.3kPaにおいて液体酵素製剤の一部である。
酵素の組合せは、同じ種類のもの、例えば、第1のリパーゼ及び第2のリパーゼを含む組成物であり得る。酵素の組合せは、異なる種類の酵素由来、例えば、リパーゼ及びアミラーゼを含む組成物であり得る。酵素の組合せは、本発明の少なくとも1つのバリアントリパーゼ及び1つの他の酵素を含んでもよい。組合せは、3つの酵素、4つの酵素、又は4つより多くの酵素を含んでもよい。
「他の酵素」は、本発明のリパーゼバリアントと異なる任意の酵素を意味する。少なくとも1つの「他の酵素」は、リパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、マンナナーゼ、ペクチン酸リアーゼ及びヌクレアーゼから選択され得る。
リパーゼ
「リパーゼ」、「脂肪分解酵素」、「脂質エステラーゼ」は全て、ECクラス3.1.1の酵素(「カルボン酸エステル加水分解酵素」)を指す。リパーゼ(E.C. 3.1.1.3、トリアシルグリセロールリパーゼ)は、通常、トリグリセリドをより親水性のモノ及びジグリセリド、遊離脂肪酸、並びにグリセロールに加水分解する。リパーゼ酵素はまた、通常、トリグリセリドと異なる基質上で活性であるか、又は特定の脂肪酸を切断する酵素、例えば、ホスホリパーゼA(E.C. 3.1.1.4)、ガラクトリパーゼ(E.C. 3.1.1.26)、クチナーゼ(EC 3.1.1.74)、並びにステロールエステラーゼ活性(EC 3.1.1.13)及び/又はワックス-エステル加水分解酵素活性を有する酵素(EC 3.1.1.50)を含む。
多くのリパーゼ酵素は、国際公開第2000032758号、国際公開第2003/089620号、国際公開第2005/032496号、国際公開第2005/086900号、国際公開第200600976号、国際公開第2006/031699号、国際公開第2008/036863号、国際公開第2011/046812号、及び国際公開第2014059360号を含むが、これらに限定されない、特許及び公開された特許出願に記載されている。
リパーゼを、洗剤及び洗浄製品において使用して、グリース、脂肪、油、及び乳製品の汚れを除去する。市販のリパーゼは、Lipolase(商標)、Lipex(商標)、Lipolex(商標)及びLipoclean(商標)(Novozymes A/S)、Lumafast(元々、Genencorより)並びにLipomax(Gist-Brocades/現DSM)を含むが、これらに限定されない。
本発明によるリパーゼは、「脂肪分解活性」を有する。脂肪分解活性を決定する方法は、文献(例えば、Guptaら、(2003年)、Biotechnol. Appl. Biochem.、37、63〜71頁を参照)に記載される。例えば、リパーゼ活性は、基質パラ-ニトロフェニルパルミテート(pNP-パルミテート、C:16)におけるエステル結合の加水分解により測定され得、黄色であり、405nmにおいて検出され得るpNPを放出する。
アミラーゼ
アルファ-アミラーゼ(E.C. 3.2.1.1)酵素は、通常、3つ以上の(1->4)-アルファ-結合D-グルコース単位を含有する多糖における(1->4)-アルファ-D-グリコシド結合の内部加水分解を行う。アミラーゼ酵素は、無作為な方法ででんぷん、グリコーゲン並びに関連する多糖及びオリゴ糖上で作用し、還元基は、アルファ配置において遊離する。アミラーゼ酵素の他の例は、ベータ-アミラーゼ(E.C. 3.2.1.2)、グルカン1,4-アルファ-マルトテトラヒドロラーゼ(E.C. 3.2.1.60)、イソアミラーゼ(E.C. 3.2.1.68)、グルカン1,4-アルファ-マルトヘキサオシダーゼ(E.C. 3.2.1.98)、及びグルカン1,4-アルファ-マルトヒドロラーゼ(E.C. 3.2.1.133)を含む。
多くのアミラーゼ酵素は、国際公開第2002/068589号、国際公開第2002/068597号、国際公開第2003/083054号、国際公開第2004/091544号、及び国際公開第2008/080093号を含むが、これらに限定されない、特許及び公開された特許出願に記載されている。
国際公開第95/10603号に記載される配列番号2を有する、バチルス・リケニフォルミスからもたらされたアミラーゼが、知られている。適当なバリアントは、アミロース分解活性を有する、国際公開第95/10603号に記載される配列番号2に対して少なくとも90%同一であり、並びに/又は次の位置:15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408、及び444において1個以上の置換を含むものである。そのようなバリアントは、国際公開第94/02597号、国際公開第94/018314号、国際公開第97/043424号及び国際公開第99/019467号の配列番号4に記載される。
国際公開第02/10355号に記載される配列番号6を有するバチルス・ステアロサーモフィルス(B. stearothermophilus)からもたらされたアミラーゼ、又はアミロース分解活性を有する、それに対して少なくとも90%同一であるアミラーゼが、知られている。配列番号6の適当なバリアントは、それに対して少なくとも90%同一であり、並びに/或いは位置181及び/若しくは182における欠失並びに/又は位置193における置換をさらに含むものを含む。
国際公開第99/19467号において開示される配列番号6を有するバチルス種(Bacillus sp.)707からもたらされたアミラーゼ、又はアミロース分解活性を有する、それに対して少なくとも90%同一であるアミラーゼが、知られている。
国際公開第96/23872号に記載され、SP-722としても記載される、配列番号2若しくは配列番号7を有するバチルス・ハルマパラス(Bacillus halmapalus)由来のアミラーゼ、又はアミロース分解活性を有する配列の1つに対して少なくとも90%同一であるアミラーゼが、知られている。
国際公開第00/22103号において開示される配列番号4を有するバチルス種DSM 12649からもたらされたアミラーゼ、又はアミロース分解活性を有する、それに対して少なくとも90%同一であるアミラーゼが、知られている。
国際公開第2009/061380号において開示される配列番号2を有するバチルス株TS-23由来のアミラーゼ、又はアミロース分解活性を有する、それに対して少なくとも90%同一であるアミラーゼが、知られている。
国際公開第2013/184577号において開示される配列番号1を有するサイトファーガ種(Cytophaga sp.)由来のアミラーゼ、又はアミロース分解活性を有する、それに対して少なくとも90%同一であるアミラーゼが、知られている。
国際公開第2010/104675号において開示される配列番号1を有するバチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)DSM 90由来のアミラーゼ、又はアミロース分解活性を有する、それに対して少なくとも90%同一であるアミラーゼが、知られている。
国際公開第00/60060号に記載される配列番号2のアミノ酸1〜485を有するアミラーゼ、又はアミロース分解活性を有する配列番号2のアミノ酸1〜485と少なくとも96%同一であるアミノ酸配列を含むアミラーゼが、知られている。
国際公開第2006/002643号に記載される配列番号12を有するアミラーゼ、又はそれに対して少なくとも80%の同一性を有し、アミロース分解活性を有するアミラーゼがまた、知られている。適当なアミラーゼは、配列番号12と比較して少なくとも80%の同一性を有し、並びに/又は位置Y295F及びM202LITVにおける置換を含むものを含み、アミロース分解活性を有する。
国際公開第2011/098531号に記載される配列番号6を有するアミラーゼ、又はアミロース分解活性を有する、それに対して少なくとも80%の同一性を有するアミラーゼがまた、知られている。適当なアミラーゼは、配列番号6と比較して少なくとも80%の同一性を有し、並びに/又は193[G、A、S、T又はM]、195[F、W、Y、L、I又はV]、197[F、W、Y、L、I又はV]、198[Q又はN]、200[F、W、Y、L、I又はV]、203[F、W、Y、L、I又はV]、206[F、W、Y、N、L、I、V、H、Q、D又はE]、210[F、W、Y、L、I又はV]、212[F、W、Y、L、I又はV]、213[G、A、S、T又はM]及び243[F、W、Y、L、I又はV]からなる群から選択される1つ以上の位置における置換を含むものを含み、アミロース分解活性を有する。
国際公開第2013/001078号に記載される配列番号1を有するアミラーゼ、又はアミロース分解活性を有する、それに対して少なくとも85%の同一性を有するアミラーゼが、知られている。適当なアミラーゼは、配列番号1と比較して少なくとも85%の同一性を有し、並びに/又は位置G304、W140、W189、D134、E260、F262、W284、W347、W439、W469、G476、及びG477に対応する2つ以上の(幾つかの)位置において変更を含み、アミロース分解活性を有するものを含む。
国際公開第2013/001087号に記載される配列番号2を有するアミラーゼ、又はそれに対して少なくとも85%の同一性を有し、アミロース分解活性を有するアミラーゼが、知られている。適当なアミラーゼは、配列番号2と比較して少なくとも85%の同一性を有し、及び/又はアミロース分解活性を有する、位置181+182、若しくは182+183、若しくは183+184の欠失を含むものを含む。適当なアミラーゼは、配列番号2と比較して少なくとも85%の同一性を有し、及び/又は位置181+182、若しくは182+183、若しくは183+184の欠失を含み、W140、W159、W167、Q169、W189、E194、N260、F262、W284、F289、G304、G305、R320、W347、W439、W469、G476及びG477に対応する位置のいずれかにおける1つ又は2つ以上の修飾を含み、アミロース分解活性を有するものを含む。
アミラーゼはまた、例えば、国際公開第2006/066594号に記載される、上述のアミラーゼ由来のハイブリッドα-アミラーゼを含む。
市販のアミラーゼ酵素は、Amplify(登録商標)、Duramyl(商標)、Termamyl(商標)、Fungamyl(商標)、Stainzyme(商標)、Stainzyme Plus(商標)、Natalase(商標)、Liquozyme X及びBAN(商標)(Novozymes A/Sより)、並びにRapidase(商標)、Purastar(商標)、Powerase(商標)、Effectenz(商標)(DuPontのM100)、Preferenz(商標)(S1000、S110及びF1000、DuPontより)、PrimaGreen(商標)(ALL、DuPont)、Optisize(商標)(DuPont)を含むが、これらに限定されない。
本発明によるアミラーゼは、多糖におけるグルコシド結合の(内部)加水分解に関与する、本発明による「アミロース分解活性」又は「アミラーゼ活性」を有する。α-アミラーゼ活性は、α-アミラーゼ活性の測定のためのアッセイにより決定されてもよい。α-アミラーゼ活性を測定するアッセイの例は、以下である:α-アミラーゼ活性は、基質としてPhadebas錠剤を利用する方法(Phadebasアミラーゼ試験、Magle Life Scienceにより供給される)により決定することができる。でんぷんは、溶解性の青色のフラグメントを生じるα-アミラーゼにより加水分解される。620nmにおいて分光光度法で測定された、得られた青色の溶液の吸光度は、α-アミラーゼ活性の関数である。測定された吸光度は、条件の所定のセット下で問題のα-アミラーゼの特定の活性(活性/純粋なα-アミラーゼタンパク質1mg)に正比例する。
アルファ-アミラーゼ活性はまた、エチリデン-4-ニトロフェニル-α-D-マルトヘプタオシド(EPS)を利用する方法により決定することができる。D-マルトヘプタオシドは、内部アミラーゼにより切断することができる遮断されたオリゴ糖である。切断後、α-グルコシダーゼは、基質を消化して、黄色を有し、これにより、405nmにおける可視分光光度法により測定することができる遊離PNP分子を遊離させるためにキットに含まれる。EPS基質及びα-グルコシダーゼを含有するキットは、Roche Costum Biotech(カタログ番号10880078103)により製造される。時間依存性吸収曲線の傾きは、条件の所定のセット下で問題のα-アミラーゼの特定の活性(酵素1mg当たりの活性)に正比例する。
プロテアーゼ
タンパク質分解活性を有する酵素は、「プロテアーゼ」又は「ペプチダーゼ」と呼ばれる。プロテアーゼは、「プロテアーゼ活性」又は「タンパク質分解活性」を発揮する活性なタンパク質である。
プロテアーゼは、アミノペプチダーゼ(EC 3.4.11)、ジペプチダーゼ(EC 3.4.13)、ジペプチジル-ペプチダーゼ及びトリペプチジル-ペプチダーゼ(EC 3.4.14)、ペプチジル-ジペプチダーゼ(EC 3.4.15)、セリン型カルボキシペプチダーゼ(EC 3.4.16)、メタロカルボキシペプチダーゼ(EC 3.4.17)、システイン型カルボキシペプチダーゼ(EC 3.4.18)、オメガペプチダーゼ(EC 3.4.19)、セリンエンドペプチダーゼ(EC 3.4.21)、システインエンドペプチダーゼ(EC 3.4.22)、アスパラギン酸エンドペプチダーゼ(EC 3.4.23)、メタロエンドペプチダーゼ(EC 3.4.24)、スレオニンエンドペプチダーゼ(EC 3.4.25)、未知の触媒機序のエンドペプチダーゼ(EC 3.4.99)を含むクラスEC 3.4プロテアーゼのメンバーである。
市販のプロテアーゼ酵素は、Lavergy(商標)Pro(BASF)、Alcalase(登録商標)、Blaze(登録商標)、Duralase(商標)、Durazym(商標)、Relase(登録商標)、Relase(登録商標)Ultra、Savinase(登録商標)、Savinase(登録商標)Ultra、Primase(登録商標)、Polarzyme(登録商標)、Kannase(登録商標)、Liquanase(登録商標)、Liquanase(登録商標)Ultra、Ovozyme(登録商標)、Coronase(登録商標)、Coronase(登録商標)Ultra、Neutrase(登録商標)、Everlase(登録商標)及びEsperase(登録商標)(Novozymes A/S)、商標名Maxatase(登録商標)、Maxacal(登録商標)、Maxapem(登録商標)、Purafect(登録商標)、Purafect(登録商標)Prime、Purafect MA(登録商標)、Purafect Ox(登録商標)、Purafect OxP(登録商標)、Puramax(登録商標)、Properase(登録商標)、FN2(登録商標)、FN3(登録商標)、FN4(登録商標)、Excellase(登録商標)、Eraser(登録商標)、Ultimase(登録商標)、Opticlean(登録商標)、Effectenz(登録商標)、Preferenz(登録商標)及びOptimase(登録商標)(Danisco/DuPont)の下で販売されているもの、Axapem(商標)(Gist-Brocases N.V.)、バチルス・レンタス(Bacillus lentus)アルカリプロテアーゼ、並びにKaoのKAP(バチルス・アルカロフィラス・スブチリシン(Bacillus alkalophilus subtilisin)を含むが、これらに限定されない。
少なくとも1つのプロテアーゼは、セリンプロテアーゼ(EC 3.4.21)から選択されてもよい。セリンプロテアーゼ又はセリンペプチダーゼ(EC 3.4.21)は、触媒反応中に基質との共有結合性付加物を形成する、触媒活性部位においてセリンを有することにより特徴付けられる。セリンプロテアーゼは、キモトリプシン(例えば、EC 3.4.21.1)、エラスターゼ(例えば、EC 3.4.21.36)、エラスターゼ(例えば、EC 3.4.21.37又はEC 3.4.21.71)、グランザイム(例えば、EC 3.4.21.78又はEC 3.4.21.79)、カリクレイン(例えば、EC 3.4.21.34、EC 3.4.21.35、EC 3.4.21.118、又はEC 3.4.21.119,)プラスミン(例えば、EC 3.4.21.7)、トリプシン(例えば、EC 3.4.21.4)、トロンビン(例えば、EC 3.4.21.5,)及びスブチリシン(スブチロペプチダーゼとしても知られる、例えば、EC 3.4.21.62)(後者は、以下、「スブチリシン」として言及されている)からなる群から選択されてもよい。
セリンプロテアーゼである暫定的に命名されたスブチラーゼのサブグループは、Siezenら、(1991年)、Protein Eng.、4:719〜737頁及びSiezenら、(1997年)、Protein Science、6:501〜523頁により提案されている。それらは、スブチリシン様プロテアーゼとして既に言及されているセリンプロテアーゼの170種より多くのアミノ酸配列の相同性解析により定義される。スブチリシンは、グラム陽性細菌又は真菌により産生されるセリンプロテアーゼとして既に頻繁に定義され、Siezenらに従い、ここでは、スブチラーゼのサブグループである。多種多様なスブチラーゼが同定されており、多数のスブチラーゼのアミノ酸配列が決定されている。そのようなスブチラーゼのより詳細な説明及びそれらのアミノ酸配列については、Siezenら、(1997年)、Protein Science、6:501〜523頁を参照する。スブチラーゼは、6つの小区分、すなわち、スブチリシンファミリー、テルミターゼファミリー、プロテイナーゼKファミリー、ランチビオティックペプチダーゼファミリー、ケキシンファミリー及びピロリジンファミリーに分けられ得る。
スブチラーゼのサブグループは、MEROPSデータベース(http://merops.sanger.ac.uk)により定義されるファミリーS8由来のセリンプロテアーゼであるスブチリシンである。ペプチダーゼファミリーS8は、セリンエンドペプチダーゼスブチリシン及びその相同体を含有する。サブファミリーS8Aにおいて、活性部位残基は、モチーフAsp-Thr/Ser-Gly(AA族におけるアスパラギン酸エンドペプチダーゼのファミリーにおける配列モチーフに類似する)、His-Gly-Thr-His及びGly-Thr-Ser-Met-Ala-Xaa-Proにおいて頻繁に生じる。ペプチダーゼファミリーS8の大抵のメンバーは、中性〜わずかにアルカリのpHにおいて活性である。ファミリーにおける多くのペプチダーゼは、耐熱性である。
ファミリーS8、サブファミリーAの卓越したメンバーは、以下である。
Figure 2020519288
スブチリシン型の親プロテアーゼ(EC 3.4.21.62)及びバリアントは、細菌プロテアーゼであってもよい。前記細菌プロテアーゼは、グラム陽性細菌ポリペプチド、例えば、バチルス、クロストリジウム(Clostridium)、エンテロコッカス(Enterococcus)、ゲオバチルス(Geobacillus)、乳酸菌(Lactobacillus)、乳酸球菌(Lactococcus)、オセアノバチルス(Oceanobacillus)、ブドウ球菌(Staphylococcus)、レンサ球菌(Streptococcus)、若しくはストレプトマイセスプロテアーゼ、又はグラム陰性細菌ポリペプチド、例えば、カンピロバクター(Campylobacter)、大腸菌、フラボバクテリウム(Flavobacterium)、フソバクテリウム(Fusobacterium)、ヘリコバクター(Helicobacter)、イリオバクター(Ilyobacter)、ナイセリア(Neisseria)、シュードモナス、サルモネラ(Salmonella)、若しくはウレアプラズマ(Ureaplasma)プロテアーゼであってもよい。このファミリーの総説は、例えば、R. Bott及びC. Betzelにより編集された「Subtilisin enzymes」、New York、1996年における、R. Siezenによる「Subtilases: Subtilisin-like Proteases」、75〜95頁において提供される。
少なくとも1つのプロテアーゼは、次の:バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)BPN'由来のスブチリシン(Vasanthaら、(1984年)、J. Bacteriol.、第159巻、811〜819頁及びJA Wellsら、(1983年)、Nucleic Acids Research、第11巻、7911〜7925頁により記載される);バチルス・リケニフォルミス由来のスブチリシン(スブチリシンカールスバーグ;EL Smithら、(1968年)、J. Biol Chem、第243巻、2184〜2191頁、及びJacobsら、(1985年)、Nucl. Acids Res、第13巻、8913〜8926頁において開示される);スブチリシンPB92(アルカリプロテアーゼPB92のオリジナルの配列は、欧州公開第283075A2号に記載されている);国際公開第89/06279号において開示される、スブチリシン147及び/又は309(それぞれ、Esperase(登録商標)、Savinase(登録商標));国際公開第91/02792号において開示されるバチルス・レンタス由来、例えば、バチルス・レンタスDSM 5483又は国際公開第95/23221号に記載されるバチルス・レンタスDSM 5483のバリアント由来のスブチリシン;ドイツ特許第10064983号において開示されるバチルス・アルカロフィラス(Bacillus alcalophilus)(DSM 11233)由来のスブチリシン;国際公開第2003/054184号において開示されるバチルス・ギブソニイ(Bacillus gibsonii)(DSM 14391)由来のスブチリシン;国際公開第2003/056017号において開示されるバチルス種(DSM 14390)由来のスブチリシン;国際公開第2003/055974号において開示されるバチルス種(DSM 14392)由来のスブチリシン;国際公開第2003/054184号において開示されるバチルス・ギブソニイ(DSM 14393)由来のスブチリシン;国際公開第2005/063974号に記載される配列番号4を有するスブチリシン;国際公開第2005/103244号に記載される配列番号4を有するスブチリシン;国際公開第2005/103244号に記載される配列番号7を有するスブチリシン;並びにドイツ特許出願第102005028295.4号に記載される配列番号2を有するスブチリシンから選択されてもよい。
少なくとも1つのスブチリシンは、国際公開第89/06279号の表Iにおける配列a)として開示される、スブチリシン309(本明細書においてSavinase(登録商標)と呼ばれてもよい)又はそれに対して少なくとも80%同一であり、タンパク質分解活性を有するバリアントであってもよい。
国際公開第92/19729号、国際公開第95/23221号、国際公開第96/34946号、国際公開第98/20115号、国際公開第98/20116号、国際公開第99/11768号、国際公開第01/44452号、国際公開第02/088340号、国際公開第03/006602号、国際公開第2004/03186号、国際公開第2004/041979号、国際公開第2007/006305号、国際公開第2011/036263号、国際公開第2011/036264号、及び国際公開第2011/072099号に記載されるバリアントを含むプロテアーゼが、知られている。適当な例は、特に、欧州特許第1921147号に記載される配列番号22からもたらされたスブチリシンプロテアーゼのプロテアーゼバリアント(タンパク質分解活性を有し、次の位置:3、4、9、15、24、27、33、36、57、68、76、77、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、131、154、160、167、170、194、195、199、205、206、217、218、222、224、232、235、236、245、248、252及び274の1つ以上におけるアミノ酸置換を有する)を含む。加えて、スブチリシンプロテアーゼは、位置Asp32、His64及びSer221において変異していない。
適当なプロテアーゼは、上で開示された親酵素の全長ポリペプチド配列と比較した場合、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%同一であるタンパク質分解活性を有するプロテアーゼバリアントを含む。
少なくとも1つのスブチリシンは、欧州特許第1921147号に記載される配列番号22を有してもよいか、又は欧州特許第1921147号に記載される配列番号22の少なくとも80%同一であり、タンパク質分解活性を有する、そのバリアントである。1つの実施形態において、スブチリシンは、欧州特許第1921147号に記載される配列番号22に対して少なくとも80%同一であり、位置101(BPN'のナンバリングに従う)においてアミノ酸グルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)、又はアスパラギン(N)、又はグルタミン(Q)、又はアラニン(A)、又はグリシン(G)、又はセリン(S)を有することにより特徴付けられ、タンパク質分解活性を有する。1つの実施形態において、スブチリシンは、欧州特許第1921147号に記載される配列番号22に対して少なくとも80%同一であり、位置101(BPN'のナンバリングに従う)においてアミノ酸グルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)を有することにより特徴付けられ、タンパク質分解活性を有する。そのようなスブチリシンバリアントは、位置101におけるアミノ酸置換、例えば、R101E若しくはR101Dを単独で、又は位置3、4、9、15、24、27、33、36、57、68、76、77、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、131、154、160、167、170、194、195、199、205、206、217、218、222、224、232、235、236、245、248、252及び/若しくは274(BPN'のナンバリングに従う)における1個以上の置換と組み合わせて含んでもよく、タンパク質分解活性を有する。1つの実施形態において、前記プロテアーゼは、1個以上のさらなる置換:(a)位置3におけるスレオニン(3T)、(b)位置4におけるイソロイシン(4I)、(c)位置63におけるアラニン、スレオニン又はアルギニン(63A、63T、又は63R)、(d)位置156におけるアスパラギン酸又はグルタミン酸(156D又は156E)、(e)位置194におけるプロリン(194P)、(f)位置199におけるメチオニン(199M)、(g)位置205におけるイソロイシン(205I)、(h)位置217におけるアスパラギン酸、グルタミン酸又はグリシン(217D、217E又は217G)、(i)(a)〜(h)に記載の2つ以上のアミノ酸の組合せを含む。
適当なスブチリシンは、欧州特許第1921147号に記載される配列番号22に対して少なくとも80%同一であってもよく、1つのアミノ酸((a)〜(h)に記載)又はアミノ酸101E、101D、101N、101Q、101A、101G、若しくは101S(BPN'のナンバリングに従う)と一緒に(i)に記載の組合せを含むことにより特徴付けられ、タンパク質分解活性を有する。
1つの実施形態において、スブチリシンは、欧州特許第1921147号に記載される配列番号22に対して少なくとも80%同一であり、変異(BPN'のナンバリングに従う)R101E、又はS3T+V4I+V205I、又はS3T+V4I+R101E+V205I又はS3T+V4I+V199M+V205I+L217Dを含むことにより特徴付けられ、タンパク質分解活性を有する。
別の実施形態において、スブチリシンは、欧州特許第1921147号に記載される配列番号22に対して少なくとも80%の同一性を有し、S3T+V4I+S9R+A15T+V68A+D99S+R101S+A103S+I104V+N218D(BPN'のナンバリングに従う)を含むことによりさらに特徴付けられるアミノ酸配列を含み、タンパク質分解活性を有する。
スブチリシンは、欧州特許第1921147号に記載される配列番号22に対して少なくとも80%同一であり、R101E、並びにS156D、L262E、Q137H、S3T、R45E、D、Q、P55N、T58W、Y、L、Q59D、M、N、T、G61D、R、S87E、G97S、A98D、E、R、S106A、W、N117E、H120V、D、K、N、S125M、P129D、E136Q、S144W、S161T、S163A、G、Y171L、A172S、N185Q、V199M、Y209W、M222Q、N238H、V244T、N261T、D及びL262N、Q、D(国際公開第2016/096711号に記載され、BPN'のナンバリングに従う)からなる群から選択される1個以上の置換を含むことにより特徴付けられるアミノ酸配列を有してもよく、タンパク質分解活性を有する。
本発明によるプロテアーゼは、タンパク質分解活性を有する。タンパク質分解活性を決定する方法は、文献(例えば、Guptaら、(2002年)、Appl. Microbiol. Biotechnol、60:381〜395頁を参照)において周知である。タンパク質分解活性は、サクシニル-Ala-Ala-Pro-Phe-p-ニトロアニリド(Suc-AAPF-pNA、ショートAAPF;例えば、DelMarら、(1979年)、Analytical Biochem、99、316〜320頁を参照)を基質として使用することにより決定されてもよい。pNAは、タンパク質分解性切断により基質分子から切断され、OD405を測定することにより定量することができる黄色の遊離pNAの放出をもたらす。
セルラーゼ
「セルラーゼ」、「セルラーゼ酵素」又は「セルロース分解性酵素」は、セルロースの加水分解に関与する酵素である。3つの主要な種類のセルラーゼ、すなわち、エンド-ss-1,4-グルカナーゼ(エンド-1,4-P-D-グルカン4-グルカノヒドロラーゼ、E.C. 3.2.1.4;セルロースにおけるβ-1,4-グルコシド結合を加水分解する)、セロビオヒドロラーゼ(1,4-P-D-グルカンセロビオヒドロラーゼ、EC 3.2.1.91)、及びss-グルコシダーゼ(EC 3.2.1.21)が知られている。
セルラーゼ酵素は、国際公開第1997/025417号、国際公開第1998/024799号、国際公開第2003/068910号、国際公開第2005/003319号、及び国際公開第2009020459号を含むが、これらに限定されない、特許及び公開された特許出願に記載されている。
市販のセルラーゼ酵素は、Celluzyme(商標)、Endolase(商標)、Carezyme(商標)、Cellusoft(商標)、Renozyme(商標)、Celluclean(商標)(Novozymes A/Sより)、Ecostone(商標)、Biotouch(商標)、Econase(商標)、Ecopulp(商標)(AB Enzymes、フィンランドより)、Clazinase(商標)、及びPuradax HA(商標)、Genencor洗剤セルラーゼL、IndiAge(商標)Neutra(Genencor International Inc./DuPontより)、Revitalenz(商標)(DuPontの2000)、Primafast(商標)(DuPont)及びKAC-500(商標)(花王株式会社より)を含む。
本発明によるセルラーゼは、「セルロース分解活性」又は「セルラーゼ活性」を有する。セルロース分解活性の測定アッセイは、以下を含む:セルラーゼは、カルボキシメチルセルロースを加水分解して、炭水化物を還元するという事実のおかげでセルロース分解活性が決定され得、Hoffman, W. S.、J. Biol. Chem.、120、51頁(1937年)に従い、フェリシアン化物反応により比色分析によりその還元能力を決定する。
マンナナーゼ
マンナーゼ(E.C. 3.2.1.78)酵素は、マンノースにおける内部β-1,4結合を加水分解する。ポリマー。「マンナナーゼ」は、ファミリー5又は26のアルカリマンナナーゼであってもよい。バチルス又はフミコーラ(Humicola)、特に、バチルス・アガラドハエレンス(B. agaradhaerens)、バチルス・リケニフォルミス(B. licheniformis)、バチルス・ハロデュランス(B. halodurans)、バチルス・クラウシイ(B. Clausii)、又はフミコーラ・インソレンス(H. insolens)の野生型からもたらされたマンナナーゼ酵素が、知られている。適当なマンナナーゼは、国際公開第99/064619号に記載される。
市販のマンナナーゼ酵素は、Mannaway(登録商標)(Novozymes AIS)を含む。
ペクチン酸リアーゼ
それらの非還元末端において4-デオキシ-アルファ-D-ガラクト-4-エヌロノシル基を有するオリゴ糖を生じる(1->4)-アルファ-D-ガラクツロナンのペクチン酸リアーゼ(E.C. 4.2.2.2)酵素除切断。
ペクチン酸リアーゼ酵素は、国際公開第2004/090099号を含むが、これらに限定されない特許及び公開された特許出願に記載されている。バチルス、特に、バチルス・リケニフォルミス若しくはバチルス・アガラドハエレンスからもたらされた、又は例えば、米国特許第6,124,127号、国際公開第99/027083号、国際公開第99/027084号、国際公開第2002/006442号、国際公開第2002/092741号、国際公開第2003/095638号に記載される、これらのいずれかのもたらされたバリアントであるペクチン酸リアーゼが、知られている。
市販のペクチン酸リアーゼ酵素は、Xpect(商標)、Pectawash(商標)及びPectaway(商標)(Novozymes A/S)、PrimaGreen(商標)、EcoScour(DuPont)を含む。
ヌクレアーゼ
デオキシリボヌクレアーゼI、又はDNaseとしても知られるヌクレアーゼ(EC 3.1.21.1)は、5'-ホスホジヌクレオチド及び5'-ホスホオリゴヌクレオチド末端産物へのヌクレオチド鎖切断を行う。
ヌクレアーゼ酵素は、米国特許第3,451,935号、英国特許第1300596号、ドイツ特許第10304331号、国際公開第2015155350号、国際公開第2015155351号、国際公開第2015166075号、国際公開第2015181287号、及び国際公開第2015181286号を含むが、これらに限定されない、特許及び公開された特許出願に記載されている。
本発明の1つの態様において、本発明の少なくとも1つのリパーゼバリアントは、少なくとも1つのスブチリシンと組み合わせて提供される。1つの実施形態において、本発明のリパーゼバリアントは、タンパク質分解性の分解に対して安定である。1つの実施形態において、本発明のリパーゼバリアントは、それぞれのリパーゼ親と比較した場合、タンパク質分解性の分解に対して増大した安定性を有する。1つの実施形態において、少なくとも1つのスブチリシンは、国際公開第89/06279号の表Iにおいて配列a)として開示されるスブチリシン309又はそれに対して少なくとも80%同一であり、タンパク質分解活性を有するそのバリアントから選択される。1つの実施形態において、本発明のリパーゼバリアントは、配列番号1に記載のリパーゼと比較した場合、スブチリシン309又はそれに対して少なくとも80%同一であるそのバリアントの存在下で、タンパク質分解性の分解に対して増大した安定性を有する。
プロテアーゼは、それ自体、プロテアーゼ安定剤により安定化されてもよいか、又はプロテアーゼは、安定化されなくてもよい。したがって、1つの実施形態において、本発明のリパーゼバリアントは、配列番号1に記載のリパーゼと比較した場合、非安定化スブチリシン309又はそれに対して少なくとも80%同一であるその非安定化バリアントなど、タンパク質分解性の分解に対して増大した安定性を有する。別の実施形態において、本発明のリパーゼバリアントは、配列番号1に記載のリパーゼと比較した場合、安定化スブチリシン309の存在下で、又はそれに対して少なくとも80%同一であるその安定化バリアントの存在下で、タンパク質分解性の分解に対して増大した安定性を有する。
プロテアーゼ安定剤は、ホウ素含有化合物から選択されてもよい。ホウ素含有化合物は、ホウ酸又はその誘導体から、及びボロン酸又はその誘導体、例えば、アリールボロン酸又はその誘導体から、その塩から、並びにその混合物から選択される。本明細書におけるホウ酸は、オルトホウ酸と呼ばれてもよい。
1つの実施形態において、ホウ素含有化合物は、アリールボロン酸及びその誘導体からなる群から選択される。1つの実施形態において、ホウ素含有化合物は、フェニルボロン酸(PBA)とも呼ばれるベンゼンボロン酸(BBA)、その誘導体、及びその混合物からなる群から選択される。1つの実施形態において、フェニルボロン酸誘導体は、式(I)及び(II)の式の誘導体からなる群から選択される。
Figure 2020519288
Figure 2020519288
式中、R1は、水素、ヒドロキシ、置換されていない又は置換されたC1〜C6アルキル、及び置換されていない又は置換されたC1〜C6アルケニルからなる群から選択され、好ましい実施形態において、Rは、ヒドロキシ、及び置換されていないC1アルキルからなる群から選択される。
式中、R2は、水素、ヒドロキシ、置換されていない又は置換されたC1〜C6アルキル、及び置換されていない又は置換されたC1〜C6アルケニルからなる群から選択され、好ましい実施形態において、Rは、H、ヒドロキシ、及び置換されたC1アルキルからなる群から選択される。
1つの実施形態において、フェニル-ボロン酸誘導体は、4-ホルミルフェニルボロン酸(4-FPBA)、4-カルボキシフェニルボロン酸(4-CPBA)、4-(ヒドロキシメチル)フェニルボロン酸(4-HMPBA)、及びp-トリルボロン酸(p-TBA)からなる群から選択される。
他の適当な誘導体は、2-チエニルボロン酸、3-チエニルボロン酸、(2-アセタミドフェニル)ボロン酸、2-ベンゾフラニルボロン酸、1-ナフチルボロン酸、2-ナフチルボロン酸、2-FPBA、3-FBPA、1-チアントレニルボロン酸、4-ジベンゾフランボロン酸、5-メチル-2-チエニルボロン酸、1-ベンゾチオフェン-2ボロン酸、2-フラニルボロン酸、3-フラニルボロン酸、4,4ビフェニル-ジボロン酸、6-ヒドロキシ-2-ナフタレンボロン酸、4-(メチルチオ)フェニルボロン酸、4-(トリメチルシリル)フェニルボロン酸、3-ブロモチオフェンボロン酸、4-メチルチオフェンボロン酸、2-ナフチルボロン酸、5-ブロモチオフェンボロン酸、5-クロロチオフェンボロン酸、ジメチルチオフェンボロン酸、2-ブロモフェニルボロン酸、3-クロロフェニルボロン酸、3-メトキシ-2-チオフェンボロン酸、p-メチル-フェニルエチルボロン酸、2-チアントレニルボロン酸、ジ-ベンゾチオフェンボロン酸、9-アントラセンボロン酸、3,5ジクロロフェニルボロン酸、ジフェニルボロン酸無水物、o-クロロフェニルボロン酸、p-クロロフェニルボロン酸、m-ブロモフェニルボロン酸、p-ブロモフェニルボロン酸、p-フルオロフェニルボロン酸、オクチルボロン酸、1,3,5トリメチルフェニルボロン酸、3-クロロ-4-フルオロフェニルボロン酸、3-アミノフェニルボロン酸、3,5-ビス-(トリフルオロメチル)フェニルボロン酸、2,4ジクロロフェニルボロン酸、4-メトキシフェニルボロン酸、及びその混合物を含む。
1つの実施形態において、少なくとも1つのホウ素含有化合物を、2〜6個のヒドロキシル基を含有する少なくとも1つのポリオールと一緒に使用して、プロテアーゼを安定化させる。適当な例は、グリコール、プロピレングリコール、1,2-プロパンジオール、1,2-ブタンジオール、エチレングリコール、ヘキシレングリコール、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、エリスリオール、グルコース、フルクトース、ラクトース、及びエリスリタンを含む。
本発明のバリアントポリペプチドは、リパーゼが、処理適用において有用である及び/又はリパーゼが、製剤の有用な成分である、幾つかの産業において使用されてもよい。
本発明のリパーゼバリアントは、食品製剤において使用されてもよく、例えば、酵素は、パン焼き用の添加剤であり得る(国際公開第2017/142904号を参照)。1つの実施形態において、リパーゼ活性を有する本発明のポリペプチドは、生地を調製する方法において、又は生地から調製した焼いた製品において使用することができ、方法は、(a)リパーゼ活性を有するポリペプチドを生地に加える工程及び(b)それを焼く工程を含む。
本発明のリパーゼバリアントはまた、油料種子処理産業において使用することができ、例えば、酵素は、植物(大豆、キャノーラ)油を処理するために使用される(国際公開第2005/086900号)。1つの実施形態において、リパーゼ活性を有する本発明のポリペプチドは、脂肪、油又は油料種子を処理する方法において使用することができ、方法は、(a)脂肪、油、又は油料種子を用意する工程、(b)リパーゼ活性を有するポリペプチドを用意する工程、及び(c)ポリペプチドを脂肪、油、又は油料種子と接触させる工程を含み、ポリペプチドは、脂肪を所望の産物に加水分解する。
本発明のリパーゼバリアントは、食餌製剤において使用することができる(米国特許第8,735,123号を参照)。1つの実施形態において、リパーゼ活性を有する本発明のポリペプチドは、動物に餌を与える方法において使用することができ、方法は、(a)食餌製剤又はペレットを用意する工程、(b)食餌製剤又はペレット中にリパーゼを提供する工程、及び(c)動物に食餌製剤を与える工程を含む。
本発明のリパーゼバリアントは、例えば、アミラーゼを用いたでんぷんのエタノール又は糖への変換のプロセス(高果糖コーンシロップ)において、副産物、例えば、油を処理するためのでんぷん処理産業において使用することができる(国際公開第2004/029193号を参照)。1つの実施形態において、リパーゼ活性を有する本発明のポリペプチドは、エタノールを生成する方法において使用することができ、方法は、(a)油を有する、エタノール生成からの材料を用意する工程、(b)リパーゼを用意する工程、及び(c)材料をリパーゼと接触させる工程を含み、リパーゼは、材料から油の回収を改善するのを助ける。別の実施形態において、本発明のリパーゼバリアントは、バイオディーゼル生成において使用することができる(米国特許第7,550,278号)。
本発明のリパーゼバリアントは、パルプ紙処理において使用され、例えば、酵素(リパーゼ)は、紙の強度を改善するため(国際公開第2006/031699号を参照)、及びピッチ制御のため(米国特許公開第2010/0269989号を参照)に使用することができる。1つの実施形態において、リパーゼ活性を有する本発明のポリペプチドは、パルプ又は紙を処理する方法において使用することができ、方法は、(a)パルプ又は紙を用意する工程、(b)リパーゼを用意する工程、及び(c)パルプ又は紙をリパーゼと接触させる工程を含み、リパーゼは、パルプ又は紙の強度を改善する。
本発明のリパーゼバリアントは、採鉱及び油井サービスのために使用することができ、例えば、セルラーゼ、アミラーゼ、及び/又はリパーゼは、油井採掘中にグアルを破壊するために使用することができる。
本発明のリパーゼバリアントは、洗剤製剤又は洗浄製剤において使用されてもよい。1つの実施形態において、リパーゼ活性を有する本発明のポリペプチドは、(a)脂肪性の汚れを落とすべき表面を用意する工程、(b)本発明の洗剤製剤を用意する工程、及び(c)(a)の脂肪性の汚れを落とすべき表面を(b)の洗剤と接触させる工程を含む洗浄方法であって、洗剤において含まれるポリペプチドが、脂肪性の汚れを落とすべき表面から脂肪性の汚れを除去する、方法において使用することができる。1つの実施形態において、本発明は、織物、硬質表面、又は食器を洗浄又は洗濯する方法であって、(a)織物、硬質表面、又は食器を用意する工程、(b)リパーゼを用意する工程、及び(c)織物、硬質表面、又は食器とリパーゼを接触させる工程を含み、リパーゼが、織物、硬質表面、又は食器から脂肪性の汚れを除去する、方法に関する。方法の工程(b)において用意される洗剤製剤は、少なくとも本発明のリパーゼを含む。方法の工程(b)において用意される洗剤製剤は、リパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、マンナナーゼ、ラッカーゼ、ペクチナーゼ、及びヌクレアーゼから選択される本発明のリパーゼと異なる、少なくとも1つのさらなる酵素を含んでもよい。
本発明は、本発明の少なくとも1つのリパーゼバリアント及び少なくとも1つの洗剤成分を含む洗剤製剤又は洗浄製剤に関する。「洗剤製剤」又は「洗浄製剤」は、汚れた物質を洗浄するために命名された組成物を意味する。洗浄は、洗濯及び硬質表面洗浄を含む。本発明による汚れた物質は、織物及び/又は硬質表面を含む。
用語「洗濯」は、家庭の洗濯と産業上の洗濯の両方に関し、本発明の洗剤製剤を含有する溶液を用いて織物を処理するプロセスを意味する。洗濯プロセスは、技術的装置、例えば、家庭又は産業上の洗濯機を使用することにより行われてもよい。或いは、洗濯プロセスは、手により行われてもよい。
用語「織物」は、糸を含む任意の織物材料(編み物若しくは機織りのために使用される天然又は合成繊維から作られるより糸)、糸の中間物、繊維、織られていない材料、天然材料、合成材料、並びにこれらの材料から作られるファブリック(機織り、編み物又はフェルト繊維により作られる織物)、例えば、衣類(織物から作られる衣服の任意の品目)、布及び他の品目を意味する。
用語「繊維」は、天然繊維、合成繊維、及びその混合物を含む。天然繊維の例は、植物(例えば、亜麻、ジュート及び綿)のもの、又はコラーゲン、ケラチン及びフィブロインのようなタンパク質を含む動物起源のもの(例えば、絹、羊毛、アンゴラ、モヘア、カシミヤ)である。合成起源の繊維についての例は、ポリウレタン繊維、例えば、Spandex(登録商標)又はLycra(登録商標)、ポリエステル繊維、ポリオレフィン、例えば、エラストフィン(elastofin)、又はポリアミド繊維、例えば、ナイロンである。繊維は、単一繊維又は織物、例えば、ニットウェア、織布、又は不織布の一部であってもよい。
用語「硬質表面洗浄」は、本明細書において硬質表面の洗浄として定義され、硬質表面は、家庭における任意の硬質表面、例えば、床、備え付け家具、壁、衛生陶器、ガラス、カトラリー又は食器を含む金属表面を含み得る。
用語「食器洗浄」は、例えば、手動又は自動食器洗浄による、食器を洗浄する全ての形態を指す。食器洗いは、全ての形態の瀬戸物、例えば、皿、コップ、グラス、ボウル、全ての形態のカトラリー、例えば、スプーン、ナイフ、フォーク及び給仕器具並びに陶磁器、プラスチック、例えば、メラミン、金属、陶器、ガラス及びアクリルの洗浄を含むが、これらに限定されない。
本発明の洗剤製剤は、1つ以上の洗剤成分を含む。選ばれた成分(複数可)は、洗剤製剤の所望の洗浄適用及び/又は物理的形態に依存する。
用語「洗剤成分」は、本明細書において、洗剤製剤、例えば、界面活性剤、構造剤、ポリマー、漂白系に適当である、任意の種類の成分を意味するよう定義される。公知の特徴を確認する当該技術分野において公知の任意の成分は、本発明による適当な洗剤成分である。洗剤成分は、1つの実施形態において、有効量で存在する場合、洗濯若しくは洗浄性能をもたらすか、又は処理を有効に助ける(処理、保存及び使用中に物理的特徴を維持する、例えば、レオロジー改質剤、ヒドロトロープ、乾燥剤)成分を意味する。
通常、洗剤製剤は、2つより多くの洗剤成分の複合製剤である。
洗剤成分は、洗剤製剤の最終適用において1つより多くの機能を有してもよく、したがって、本明細書において特定の機能の関係において述べられる任意の洗剤成分はまた、洗剤製剤の最終適用において別の機能を有してもよい。洗剤製剤の最終適用における特定の洗剤成分の機能は、通常、洗剤製剤内のその量、すなわち、洗剤成分の有効量に依存する。
用語「有効量」は、有効な汚れの除去及び有効な洗浄条件(例えば、pH、泡の量)をもたらすための個々の成分の量、蛍光上の利点(例えば、蛍光増白、染料移りの阻害)を有効にもたらすためのある種の成分の量、並びに処理を有効に助ける(処理、保存及び使用中に物理的特徴を維持する、例えば、レオロジー改質剤、ヒドロトロープ、乾燥剤)ためのある種の成分の量を含む。
1つの実施形態において、洗剤製剤は、2つより多くの洗剤成分の製剤であり、少なくとも1つの成分は、汚れの除去において有効であり、少なくとも1つの成分は、最適な洗浄条件をもたらすのに有効であり、少なくとも1つの成分は、洗剤の物理的特徴の維持において有効である。
洗浄性能は、関連する洗浄条件下で評価される。本明細書において用語「関連する洗浄条件」は、洗濯機、自動食洗器において、又は手動洗浄プロセスにおいて実際に使用される、条件、特に、洗浄温度、時間、洗浄機構、石鹸の泡の濃度、洗剤の種類及び水の硬さを指す。
リパーゼ含有洗剤の洗浄性能は、本明細書において脱脂洗浄性能と呼ばれてもよい。脱脂洗浄性能は、織物に沈着した脂肪性の汚れを除去する洗剤製剤の能力と関連付けられ得る。
脂肪は、融点に依存して、脂肪、グリース又は油に細分類することができる。油は、通常、室温において液体である。グリースは、室温において油より高い粘度を有し、のり様と呼ばれる。織物に沈着した油及びグリース汚れの除去は、油及びグリースの比較的低い融点に起因して、洗濯温度≧40℃により援助される。融点>30℃を有する脂肪性化合物を含む脂肪性沈着は、温度≦30℃において固体のままである脂肪を意味する。
織物に沈着した脂肪性の汚れは、本明細書において脂肪性沈着と呼ばれてもよい。1つの実施形態において、脂肪性沈着は、融点>40℃を有する脂肪性化合物を含み、これは、そのような脂肪性化合物が、洗濯温度≦40℃において固体のままであることを意味する。1つの実施形態において、脂肪性沈着は、融点>30℃を有する脂肪性化合物を含み、これは、そのような脂肪性化合物が、洗濯温度≦30℃において固体のままであることを意味する。
1つの態様において、本発明は、本発明の少なくとも1つのリパーゼバリアントを含む、洗濯温度≦40℃用の固体又は液体洗濯製剤、及び洗濯温度≦40℃において、融点>40℃を有する脂肪性化合物を含む脂肪性沈着を除去するための前記製剤の使用に関する。1つの実施態様において、本発明は、本発明の少なくとも1つのリパーゼバリアントを含む、洗濯温度≦30℃用の固体又は液体洗濯製剤、及び洗濯温度≦30℃において、融点>30℃を有する脂肪性化合物を含む脂肪性沈着を除去するための前記製剤の使用に関する。1つの実施形態において、本発明は、本発明の少なくとも1つのリパーゼバリアントを含む、洗濯温度≦30℃用の固体又は液体洗濯製剤、及び洗濯温度≦30℃において、融点>40℃を有する脂肪性化合物を含む脂肪性沈着を除去するための前記製剤の使用に関する。1つの実施態様において、本発明は、本発明の少なくとも1つのリパーゼバリアントを含む、洗濯温度≦20℃用の固体又は液体洗濯製剤、及び洗濯温度≦20℃において、融点>20℃を有する脂肪性化合物を含む脂肪性沈着を除去するための前記製剤の使用に関する。1つの実施形態において、本発明は、本発明の少なくとも1つのリパーゼバリアントを含む、洗濯温度≦20℃用の固体又は液体洗濯製剤、及び洗濯温度≦20℃において、融点>30℃を有する脂肪性化合物を含む脂肪性沈着を除去するための前記製剤の使用に関する。1つの実施形態において、本発明は、本発明の少なくとも1つのリパーゼバリアントを含む、洗濯温度≦20℃用の固体又は液体洗濯製剤、及び洗濯温度≦20℃において、融点>40℃を有する脂肪性化合物を含む脂肪性沈着を除去するための前記製剤の使用に関する。
本明細書において脱脂洗浄性能は、脂肪性の汚れの除去が改善される場合、改善されることを意味する。この関係における改善は、本発明のリパーゼ及び/又は少なくとも1つの本発明のリパーゼを含む洗剤製剤が、本発明以外のリパーゼ及び/又は本発明のリパーゼを欠く洗剤製剤及び/又は親リパーゼを含む洗濯製剤と比較した場合、良好な脱脂洗浄性能を示すことを意味し得る。脂肪性の汚れの除去は、織物に沈着した脂肪性化合物の酵素分解及び/又は可溶化及び/又は分散及び/又は乳化に起因して、生じ得る。
個々の洗剤成分及び洗剤製剤における使用は、当業者に公知である。適当な洗剤成分は、とりわけ、界面活性剤、ビルダー、ポリマー、アルカリ、漂白系、蛍光漂白剤、消泡剤及び安定剤、ヒドロトロープ、並びに腐食防止剤を含む。さらなる例は、例えば、「complete Technology Book on Detergents with Formulations (Detergent Cake, Dishwashing Detergents, Liquid & Paste Detergents, Enzyme Detergents, Cleaning Powder & Spray Dried Washing Powder)」、Engineers India Research Institute(EIRI)、第6編、(2015年)に記載される。当業者用の別の参考書籍は、「Detergent Formulations Encyclopedia」、Solverchem Publications、2016年であり得る。
洗剤成分は、所望の適用、例えば、白色の織物、染色された織物、及びウールの洗濯に依存して、洗剤製剤における種類及び/又は量が変動する。選ばれた成分は、洗剤製剤の物理的形態(パウチにおいて又は錠剤等として提供される、液体、固体、ゲル)にさらに依存する。例えば、洗濯製剤のため選ばれた成分は、それ自体が、使用される洗濯温度、洗濯機の機構(垂直対水平軸の機械)、1回の洗濯サイクル当たりの水の消費等のような態様に関連する地域の慣習、及び水の平均の硬さのような地域的特徴にさらに依存する。
例えば、低い洗剤濃度系は、約800ppm未満の洗剤成分が洗濯水に存在する、洗濯製剤を含む。中程度の洗剤濃度は、約800ppm〜約2,000ppmの間の洗剤成分が洗濯水に存在する、洗濯製剤を含む。高い洗剤濃度は、約2,000ppmより高い洗剤成分が洗濯水に存在する、洗濯製剤を含む。
個々の洗剤成分について列挙される数値範囲は、洗剤製剤に含まれる量を提供する。そのような範囲は、範囲を定義する数字の包含であり、定義された範囲内のそれぞれの整数を含むと理解されなければならない。
別段記載されないなら、「重量%」又は「%w/w」は、総洗剤製剤に関することを意味する。この場合、「重量%」又は「%w/w」は、次の通り計算される:組成物の総重量で割った物質の重量に、100を掛けたものとしてのその物質の濃度。
本発明の洗剤製剤は、1つ以上の界面活性剤を含んでもよい。「界面活性剤」(本明細書において、「表面活性薬」と同義的に使用される)は、液体に加えられた場合、界面におけるその液体の特性を変化させる、有機化学物質を意味する。そのイオン電荷に従い、界面活性剤は、非イオン性、陰イオン性、陽イオン性、又は両性と呼ばれる。
界面活性剤の非限定的な例は、McCutcheon's 2016 Detergents and Emulsifiers及びMcCutcheon's 2016 Functional Materials(両者とも、North American and International Edition、MC Publishing Co、2016年版)において開示されている。さらなる有用な例は、当業者に公知の同じ刊行物のより早い版において開示されている。
非イオン性界面活性剤は、正又は負に荷電した(すなわち、イオン性)官能基のどちらも含有しない界面活性剤を意味する。陰イオン性及び陽イオン性界面活性剤と対照的に、非イオン性界面活性剤は、溶液においてイオン化しない。
任意の種類の界面活性剤について以下で提供される例は、非限定的であると理解されるべきである。
非イオン性界面活性剤は、一般式(IIIa)及び(IIIb)の化合物であってもよい。
Figure 2020519288
一般式(IIIa)及び(IIIb)の変数は、以下の通り定義される。
R1は、C1〜C23アルキル及びC2〜C23アルケニルから選択され、アルキル及び/又はアルケニルは、直鎖又は分岐であり、例えば、n-C7H15、n-C9H19、n-C11H23、n-C13H27、n-C15H31、n-C17H35、i-C9H19、i-C12H25である。
R2は、H、C1〜C20アルキル及びC2〜C20アルケニルから選択され、アルキル及び/又はアルケニルは、直鎖又は分岐である。
R3及びR4は、C1〜C16アルキルからそれぞれ独立して選択され、アルキルは、直鎖又は分岐であり、例えば、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、n-ペンチル、イソペンチル、sec-ペンチル、ネオペンチル、1,2-ジメチルプロピル、イソアミル、n-ヘキシル、イソヘキシル、sec-ヘキシル、n-ヘプチル、n-オクチル、2-エチルヘキシル、n-ノニル、n-デシル、イソデシルである。
R5は、H及びC1〜C18アルキルから選択され、アルキルは、直鎖又は分岐である。
一般式(IIIa)及び(IIIb)の整数は、以下の通り定義される:mは、0〜200、好ましくは、1〜80、より好ましくは、3〜20の範囲内であり、n及びoは、それぞれ独立して、0〜100の範囲内であり、nは、好ましくは、1〜10、より好ましくは、1〜6の範囲内であり、oは、好ましくは、1〜50、より好ましくは、4〜25の範囲内である。m、n及びoの合計は、少なくとも1であり、好ましくは、m、n及びoの合計は、5〜100の範囲内であり、より好ましくは、9〜50の範囲内である。
一般式(IIIa)及び(IIIb)の非イオン性界面活性剤は、任意の構造のものであってもよく、ブロック又はランダム構造であり、提示された配置に限定されない。
1つの実施形態において、洗剤製剤は、一般式(IIIa)(mは、3〜11の範囲内であり、好ましくは、7以下であり、n及びoは、0であり、R1は、C12〜C14であり、R5は、Hである)から選択される少なくとも1つの非イオン性界面活性剤を含む。洗剤製剤は、一般式(IIIa)の化合物から選択される、少なくとも2つの非イオン性界面活性剤を含んでもよく、前記非イオン性界面活性剤の1つは、R1がC12であり、R5がHであり、mが7であり、n及びo=0であることを特徴とし、他方の界面活性剤は、R1がC14であり、R5がHであり、mが7であり、n及びo=0であることを特徴とする。
非イオン性界面活性剤は、さらに、一般式(IV)の化合物であってもよく、それは、アルキル-ポリグリコシド(APG)と呼ばれてもよい。
Figure 2020519288
一般式(IV)の変数は、以下の通り定義される。
R1は、C1〜C17アルキル及びC2〜C17アルケニルから選択され、アルキル及び/又はアルケニルは、直鎖又は分岐であり、例えば、n-C7H15、n-C9H19、n-C11H23、n-C13H27、n-C15H31、n-C17H35、i-C9H19、i-C12H25である。
R2は、H、C1〜C17アルキル及びC2〜C17アルケニルから選択され、アルキル及び/又はアルケニルは、直鎖又は分岐である。
G1は、4〜6個の炭素原子を有する単糖残基、例えば、グルコース及びキシロースから選択される。
一般式(IV)の整数wは、1.1〜4の範囲内であり、wは、平均の数である。
非イオン性界面活性剤は、さらに、一般式(V)の化合物であってもよい。
Figure 2020519288
一般式(V)の変数は、以下の通り定義される。
AOは、エチレンオキシド(EO)、プロピレンオキシド(PO)、ブチレンオキシド(BO)、及びその混合物から選択される。
R6は、C5〜C17アルキル及びC5〜C17アルケニルから選択され、アルキル及び/又はアルケニルは、直鎖又は分岐である。
R7は、H、C1〜C18-アルキルから選択され、アルキルは、直鎖又は分岐である。
一般式(V)の整数は、1〜70、好ましくは、7〜15の範囲内の数字である。
非イオン性界面活性剤は、さらに、ソルビタンエステル及び/又はエトキシル化若しくはプロポキシル化ソルビタンエステルから選択されてもよい。非限定的な例は、商標名SPAN及びTWEENの下で販売される製品である。
非イオン性界面活性剤は、さらに、アルコキシル化モノ-若しくはジ-アルキルアミン、脂肪酸モノエタノールアミド(FAMA)、脂肪酸ジエタノールアミド(FADA)、エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド(EFAM)、プロポキシル化脂肪酸モノエタノールアミド(PFAM)、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド、又はグルコサミンのN-アシルN-アルキル誘導体(グルカミド、GA、又は脂肪酸グルカミド、FAGA)、及びその組合せから選択されてもよい。
2つ以上の異なる非イオン性界面活性剤の混合物はまた、本発明による洗剤製剤に存在してもよい。
両性界面活性剤は、pHに依存して、陽イオン性、双性イオン性又は陰イオン性のいずれかであり得るものである。
界面活性剤は、一般式(VI)の両性構造を含む化合物であってもよく、それは、修飾されたアミノ酸(タンパク新生並びに非タンパク新生)と呼ばれてもよい。
Figure 2020519288
一般式(VI)における変数は、以下の通り定義される。
R8は、H、C1〜C4アルキル、C2〜C4アルケニルから選択され、アルキル及び/又はアルケニルは、直鎖又は分岐である。
R9は、C1〜C22アルキル、C2〜C22アルケニル、C10〜C22アルキルカルボニル、及びC10〜C22アルケニルカルボニルから選択される。
R10は、H、メチル、-(CH2)3NHC(NH)NH2、-CH2C(O)NH2、-CH2C(O)OH、-(CH2)2C(O)NH2、-(CH2)2C(O)OH、(イミダゾール-4-イル)-メチル、-CH(CH3)C2H5、-CH2CH(CH3)2、-(CH2)4NH2、ベンジル、ヒドロキシメチル、-CH(OH)CH3、(インドール-3-イル)-メチル、(4-ヒドロキシ-フェニル)-メチル、イソプロピル、-(CH2)2SCH3、及び-CH2SHから選択される。
Rxは、H及びC1〜C4アルキルから選択される。
界面活性剤は、さらに、一般式(VIIa)、(VIIb)、又は(VIIc)の両性構造を含む化合物であってもよく、それは、ベタイン及び/又はスルホベタインと呼ばれてもよい。
Figure 2020519288
一般式(VIIa)、(VIIb)及び(VIIc)における変数は、以下の通り定義される。
R11は、直鎖又は分岐C7〜C22アルキル及び直鎖又は分岐C7〜C22アルケニルから選択される。
R12は、それぞれ独立して、直鎖C1〜C4アルキルから選択される。
R13は、C1〜C5アルキル及びヒドロキシC1〜C5アルキル、例えば、2-ヒドロキシプロピルから選択される。
A-は、カルボキシレート及びスルホネートから選択される。
一般式(VIIa)、(VIIb)、及び(VIIc)における整数rは、2〜6の範囲内にある。
界面活性剤は、さらに、一般式(VIII)の両性構造を含む化合物であってもよく、それは、アルキル-アンホカルボキシレートと呼ばれてもよい。
Figure 2020519288
一般式(VIII)における変数は、以下の通り定義される。
R11は、C7〜C22アルキル及びC7〜C22アルケニルから選択され、アルキル及び/又はアルケニルは、直鎖又は分岐であり、好ましくは、直鎖である。
R14は、-CH2C(O)O-M+、-CH2CH2C(O)O-M+及び-CH2CH(OH)CH2SO3 -M+から選択される。
R15は、H及び-CH2C(O)O-から選択される。
一般式(VIII)における整数rは、2〜6の範囲内にある。
さらなる適当なアルキル-アンホカルボキシレートの非限定的な例は、ナトリウムココアンホアセテート、ナトリウムラウロアンホアセテート、ナトリウムカプリロアンホアセテート、二ナトリウムココアンホジアセテート、二ナトリウムラウロアンホジアセテート、二ナトリウムカプリルアンホジアセテート、二ナトリウムカプリロアンホジアセテート、二ナトリウムココアンホジプロピオネート、二ナトリウムラウロアンホジプロピオネート、二ナトリウムカプリルアンホジプロピオネート、及び二ナトリウムカプリロアンホジプロピオネートを含む。
界面活性剤は、さらに、一般式(IX)の両性構造を含む化合物であってもよく、それは、アミンオキシド(AO)と呼ばれてもよい。
Figure 2020519288
一般式(IX)における変数は、以下の通り定義される。
R16は、C8〜C18直鎖又は分岐アルキル、ヒドロキシC8〜C18アルキル、アシルアミドプロポイル及びC8〜C18アルキルフェニル基から選択され、アルキル及び/又はアルケニルは、直鎖又は分岐である。
R17は、C2〜C3アルキレン、ヒドロキシC2〜C3アルキレン、及びその混合物から選択される。
R18:それぞれの残基は、独立して、C1〜C3アルキル及びヒドロキシC1〜C3から選択することができ、R18基は、例えば、酸素又は窒素原子を通じて互いに結合して、環構造を形成することができる。
一般式(IX)における整数xは、0〜5の範囲内、好ましくは、0〜3、最も好ましくは、0である。
さらなる適当なアミンオキシドの非限定的な例は、C10〜C18アルキルジメチルアミンオキシド及びC8〜C18アルコキシエチルジヒドロキシエチルアミンオキシドを含む。そのような物質の例は、ジメチルオクチルアミンオキシド、ジエチルデシルアミンオキシド、ビス-(2-ヒドロキシエチル)ドデシルアミンオキシド、ジメチルドデシルアミンオキシド、ジプロピルテトラデシルアミンオキシド、メチルエチルヘキサデシルアミンオキシド、ドデシルアミドプロピルジメチルアミンオキシド、セチルジメチルアミンオキシド、ステアリルジメチルアミンオキシド、タロージメチルアミンオキシド及びジメチル-2-ヒドロキシオクタデシルアミンオキシドを含む。
適当なアミンオキシドのさらなる例は、コカミジルプロピルジメチルアミノキシドであり、時に、コカミドプロピルアミンオキシドと呼ばれる。
2つ以上の異なる両性界面活性剤の混合物は、本発明による洗剤製剤に存在してもよい。
陰イオン性界面活性剤は、負に荷電したイオン基を有する界面活性剤を意味する。陰イオン性界面活性剤は、疎水性の基、並びに通常、スルフェート、スルホネート、及びカルボキシレートから選択される少なくとも1個の水溶解性陰イオン性基を含有して、水溶解性化合物を形成する表面活性化合物を含むが、これらに限定されない。
陰イオン性界面活性剤は、一般式(X)の化合物であってもよく、それは、A-がSO3 -である場合、(脂肪性)アルコール/アルキル(エトキシ/エーテル)スルフェート[(F)A(E)S]、A-が-RCOO-である場合、(脂肪性)アルコール/アルキル(エトキシ/エーテル)カルボキシレート[(F)A(E)C]と呼ばれてもよい。
Figure 2020519288
一般式(Xa及びXb)における変数は、以下の通り定義される。
R1は、C1〜C23-アルキル(例えば、1-、2-、3-、4-C1〜C23-アルキル)及びC2〜C23-アルケニルから選択され、アルキル及び/又はアルケニルは、直鎖又は分岐であり、2-、3-、又は4-アルキルの例は、n-C7H15、n-C9H19、n-C11H23、n-C13H27、n-C15H31、n-C17H35、i-C9H19、i-C12H25である。
R2は、H、C1〜C20-アルキル及びC2〜C20-アルケニルから選択され、アルキル及び/又はアルケニルは、直鎖又は分岐である。
R3及びR4は、それぞれ独立して、C1〜C16-アルキルから選択され、アルキルは、直鎖又は分岐であり、例えば、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、n-ペンチル、イソペンチル、sec-ペンチル、ネオペンチル、1,2-ジメチルプロピル、イソアミル、n-ヘキシル、イソヘキシル、sec-ヘキシル、n-ヘプチル、n-オクチル、2-エチルヘキシル、n-ノニル、n-デシル、イソデシルである。
A-は、-RCOO-、-SO3 -及びRSO3 -から選択され、Rは、直鎖又は分岐C1〜C8-アルキル、及びC1〜C4ヒドロキシアルキルから選択され、アルキルがある。
M+は、H及び塩形成陽イオンから選択される。塩形成陽イオンは、1価又は多価であってもよく、故に、M+は、1/v Mv+と等しい。例は、モノ、ジ、及びトリエタノールアミンのナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アンモニウム、及びアンモニウム塩を含むが、これらに限定されない。
一般式(Xa)及び(VIIIXb)の整数は、以下の通り定義される:mは、0〜200、好ましくは、1〜80、より好ましくは、3〜20の範囲内であり、n及びoは、それぞれ独立して、0〜100の範囲内であり、nは、好ましくは、1〜10、より好ましくは、1〜6の範囲内であり、oは、好ましくは、1〜50、より好ましくは、4〜25の範囲内である。m、n及びoの合計は、少なくとも1であり、好ましくは、m、n及びoの合計は、5〜100の範囲内であり、より好ましくは、9〜50の範囲内である。
一般式(Xa)及び(Xb)の陰イオン性界面活性剤は、任意の構造、ブロックコポリマー又はランダムコポリマーのものであってもよい。
さらなる適当な陰イオン性界面活性剤は、C12〜C18スルホ脂肪酸アルキルエステル(例えば、C12〜C18スルホ脂肪酸メチルエステル)、C10〜C18-アルキルアリールスルホン酸(例えば、n-C10〜C18-アルキルベンゼンスルホン酸)及びC10〜C18アルキルアルコキシカルボキシレートの塩(M+)を含む。
全ての場合におけるM+は、塩形成陽イオンから選択される。塩形成陽イオンは、1価又は多価であってもよく、故に、M+は、1/v Mv+と等しい。例は、モノ、ジ、及びトリエタノールアミンのナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アンモニウム、及びアンモニウム塩を含むが、これらに限定されない。
1つの実施形態において、洗剤製剤は、一般式(Xa)(R1は、C11〜C13であり、R2は、Hであり、mは、1〜4であり、n及びo=0であり、A-は、SO3 -であり、M+は、Na+である)の化合物から選択される少なくとも1つの陰イオン性界面活性剤を含む。洗剤製剤は、一般式(Xa)の化合物から選択される、少なくとも2つの陰イオン性界面活性剤を含んでもよく、前記陰イオン性界面活性剤の1つは、R1がC11であり、R2がHであり、mが2であり、n及びo=0であり、A-がSO3 -であり、M+がNa+であることを特徴とし、他方の界面活性剤は、R1がC13であり、R2がHであり、mが2であり、n及びo=0であり、A-がSO3 -であり、M+がNa+であることを特徴とする。
さらなる適当な陰イオン性界面活性剤の非限定的な例は、分岐のアルキルベンゼンスルホネート(BABS)、フェニルアルカンスルホネート、アルファ-オレフィンスルホネート(AOS)、オレフィンスルホネート、アルケンスルホネート、アルカン-2,3-ジイルビス(スルフェート)、ヒドロキシアルカンスルホネート及びジスルホネート、二級アルカンスルホネート(SAS)、パラフィンスルホネート(PS)、スルホン化脂肪酸グリセロールエステル、アルキル又はアルケニルコハク酸、アミノ酸の脂肪酸誘導体、スルホ-コハク酸のジエステル及びモノエステルを含む。
1つの実施形態において、洗剤製剤は、一般式(XI)の化合物から選択される少なくとも1つの陰イオン性界面活性剤を含み、
Figure 2020519288
 式中、式(XI)におけるR1は、C10〜C13アルキルである。洗剤製剤は、一般式(XI)の化合物から選択される、少なくとも2つの陰イオン性界面活性剤を含んでもよく、前記陰イオン性界面活性剤の1つは、R1がC10であることを特徴とし、他方の界面活性剤は、R1がC13であることを特徴とする。
陰イオン性界面活性剤は、一般式(XII)の化合物であってもよく、それは、N-アシルアミノ酸界面活性剤と呼ばれてもよい。
Figure 2020519288
一般式(XII)における変数は、以下の通り定義される。
R19は、直鎖又は分岐C6〜C22-アルキル及び直鎖又は分岐C6〜C22-アルケニル、例えば、オレイルから選択される。
R20は、H及びC1〜C4-アルキルから選択される。
R21は、H、メチル、-(CH2)3NHC(NH)NH2、-CH2C(O)NH2、-CH2C(O)OH、-(CH2)2C(O)NH2、-(CH2)2C(O)OH、(イミダゾール-4-イル)-メチル、-CH(CH3)C2H5、-CH2CH(CH3)2、-(CH2)4NH2、ベンジル、ヒドロキシメチル、-CH(OH)CH3、(インドール-3-イル)-メチル、(4-ヒドロキシ-フェニル)-メチル、イソプロピル、-(CH2)2SCH3、及び-CH2SHから選択される。
R22は、-COOX及び-CH2SO3X(式中、Xは、Li+、Na+及びK+から選択される)から選択される。
適当なN-アシルアミノ酸界面活性剤の非限定的な例は、N-アシル化グルタミン酸、例えば、ナトリウムココイルグルタメート、ナトリウムラウロイルグルタメート、ナトリウムミリストイルグルタメート、ナトリウムパルミトイルグルタメート、ナトリウムステアロイルグルタメート、二ナトリウムココイルグルタメート、二ナトリウムステアロイルグルタメート、カリウムココイルグルタメート、カリウムラウロイルグルタメート、及びカリウムミリストイルグルタメートのモノ-及びジ-カルボキシレート塩(例えば、モノ、ジ、及びトリエタノールアミンのナトリウム、カリウム、アンモニウム及びアンモニウム塩);N-アシル化アラニン、例えば、ナトリウムココイルアラニネート、及びトリエタノールアミンラウロイルアラニネートのカルボキシレート塩(例えば、モノ、ジ、及びトリエタノールアミンのナトリウム、カリウム、アンモニウム及びアンモニウム塩);N-アシル化グリシン、例えば、ナトリウムココイルグリシネート、及びカリウムココイルグリシネートのカルボキシレート塩(例えば、モノ、ジ、及びトリエタノールアミンのナトリウム、カリウム、アンモニウム及びアンモニウム塩);N-アシル化サルコシン、例えば、ナトリウムラウロイルサルコシネート、ナトリウムココイルサルコシネート、ナトリウムミリストイルサルコシネート、ナトリウムオレオイルサルコシネート、及びアンモニウムラウロイルサルコシネートのカルボキシレート塩(例えば、モノ、ジ、及びトリエタノールアミンのナトリウム、カリウム、アンモニウム及びアンモニウム塩)である。
陰イオン性界面活性剤は、さらに、石鹸の群から選択されてもよい。飽和及び不飽和C12〜C18脂肪酸、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、オレイン酸、(水和)エルカ酸の塩(M+)が適当である。M+は、塩形成陽イオンから選択される。塩形成陽イオンは、1価又は多価であってもよく、故に、M+は、1/v Mv+と等しい。例は、モノ、ジ、及びトリエタノールアミンのナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アンモニウム、及びアンモニウム塩を含むが、これらに限定されない。
適当な石鹸のさらなる非限定的な例は、天然の脂肪酸、例えば、獣脂、やし油、パーム核油、ローレル油、オリーブオイル、又はキャノーラ油からもたらされる石鹸混合物を含む。そのような石鹸混合物は、石鹸がもたらされた天然の脂肪酸に依存して、異なる量で、ラウリン酸及び/又はミリスチン酸及び/又はパルミチン酸及び/又はステアリン酸及び/又はオレイン酸及び/又はリノール酸の石鹸を含む。
適当な陰イオン性界面活性剤のさらなる非限定的な例は、天然の脂肪酸、例えば、獣脂、やし油、パーム核油、ローレル油、オリーブオイル、又はキャノーラ油からもたらされるスルフェート、スルホネート又はカルボキシレートの塩(M+)を含む。そのような陰イオン性界面活性剤は、石鹸がもたらされた天然の脂肪酸に依存して、異なる量で、ラウリン酸及び/又はミリスチン酸及び/又はパルミチン酸及び/又はステアリン酸及び/又はオレイン酸及び/又はリノール酸のスルフェート、スルホネート又はカルボキシレートを含む。
2つ以上の異なる陰イオン性界面活性剤の混合物はまた、本発明による洗剤製剤に存在してもよい。
非イオン性及び/又は両性及び/又は陰イオン性界面活性剤の混合物はまた、本発明による洗剤製剤に存在してもよい。
陽イオン性界面活性剤は、正に荷電したイオン基を有する界面活性剤を意味する。
典型的には、これらの陽イオン部分は、窒素含有基、例えば、四級アンモニウム又はプロトン化アミノ基である。陽イオン性プロトン化アミンは、一級、二級、又は三級アミンであり得る。
陽イオン性界面活性剤は、一般式(XIII)の化合物であってもよく、それは、四級アンモニウム化合物(四級物)と呼ばれてもよい。
Figure 2020519288
一般式(XIII)における変数は、以下の通り定義される。
R23は、H、C1〜C4アルキル(例えば、メチル)及びC2〜C4アルケニルから選択され、アルキル及び/又はアルケニルは、直鎖又は分岐である。
R24は、C1〜C4アルキル(例えば、メチル)、C2〜C4アルケニル及びC1〜C4ヒドロキシアルキル(例えば、ヒドロキシエチル)から選択され、アルキル及び/又はアルケニルは、直鎖又は分岐である。
R25は、C1〜C22アルキル(例えば、メチル、C18アルキル)、C2〜C4アルケニル、C12〜C22アルキルカルボニルオキシメチル及びC12〜C22アルキルカルボニルオキシエチル(例えば、C16〜C18アルキルカルボニルオキシエチル)から選択され、アルキル及び/又はアルケニルは、直鎖又は分岐である。
R26は、C12〜C18アルキル、C2〜C4アルケニル、C12〜C22アルキルカルボニルオキシメチル、C12〜C22アルキルカルボニルオキシエチル及び3-(C12〜C22アルキルカルボニルオキシ)-2(C12〜C22アルキルカルボニルオキシ)-プロピルから選択される。
X-は、ハロゲン化物、例えば、Cl-又はBr-から選択される。
さらなる陽イオン性界面活性剤の非限定的な例は、アミン、例えば、C18アルキル又はアルケニル鎖を有する一級、二級及び三級モノアミン、エトキシ化アルキルアミン、エチレンジアミンのアルコキシレート、イミダゾール(例えば、1-(2-ヒドロキシエチル)-2-イミダゾリン、2-アルキル-1-(2-ヒドロキシエチル)-2-イミダゾリン等)、アルキル四級塩化アンモニウム界面活性剤のような四級アンモニウム塩、例えば、n-アルキル(C12〜C18)ジメチルベンジルアンモニウムクロリド、n-テトラデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド一水和物、並びにナフチレン置換四級塩化アンモニウム、例えば、ジメチル-1-ナフチルメチルアンモニウムクロリドを含む。
特に、適当な陽イオン性面活性剤は、
- N,N-ジメチル-N-(ヒドロキシ-C7〜C25-アルキル)アンモニウム塩、
- アルキル化剤を用いて四級化されたモノ及びジ(C7〜C25-アルキル)ジメチルアンモニウム化合物、
- エステル四級物、特に、C8〜C22-カルボン酸を用いてエステル化されている、四級エステル化モノ-、ジ-及びトリアルカノールアミン、
- イミダゾリン四級物、特に、式XIV又はXVの1-アルキルイミダゾリニウム塩
であり得る。
Figure 2020519288
Figure 2020519288
式(XIV)及び(XV)における変数は、以下の通り定義される。
R27は、C1〜C25-アルキル及びC2〜C25-アルケニルから選択される。
R28は、C1〜C4-アルキル及びヒドロキシ-C1〜C4-アルキルから選択される。
R29は、C1〜C4-アルキル、ヒドロキシ-C1〜C4-アルキル及びR*-(CO)-R30-(CH2)j-ラジカル(式中、R*は、C1〜C21-アルキル及びC2〜C21-アルケニルから選択される)から選択され、R30は、-O-及び-NH-から選択され、jは、2又は3である。
洗剤製剤は、一般式(IIIa)の化合物、一般式(Xa)の化合物、及び一般式(XI)の化合物から選択される界面活性剤の混合物を含んでもよい。
[実施例1]
バリアントリパーゼ酵素
天然に存在しないバリアントリパーゼ酵素を、合理的設計の単一部位変異誘発及び複数部位変異誘発を使用して実験室において作製した。バリアントリパーゼ酵素は、18個の異なるアミノ酸残基位置:23、33、82、83、84、85、160、199、254、255、256、258、263、264、265、268、308、311、又はその任意の組合せにおいて、親酵素(LIP062、配列番号1のアミノ酸配列であり、配列番号2の核酸配列によりコードされる)の単一点アミノ酸修飾、挿入、又は欠失を含み、バリアントリパーゼ酵素は、リパーゼ活性を有する。
親酵素(LIP062)の単一点修飾の様々な組合せを有するバリアントリパーゼ酵素も作製し、バリアントリパーゼ酵素は、リパーゼ活性を有する。例えば、単一点修飾及び単一点修飾の様々な組合せを表1に挙げる。
表は、LIP062のアミノ酸配列及びD265Sの1個のアミノ酸置換を有するバリアントポリペプチドである、LIP110のバリアントリパーゼ酵素を示し、バリアントポリペプチドは、リパーゼ活性を有する。この表はまた、LIP062のアミノ酸配列並びにS83H、I85L、及びD265Tのアミノ酸置換の組合せを有するバリアントポリペプチドである、LIP160のバリアントリパーゼ酵素を示し、バリアントポリペプチドは、リパーゼ活性を有する。この表はまた、LIP062のアミノ酸配列並びにI255A、及びD265Sのアミノ酸置換の組合せを有するバリアントポリペプチドである、LIP173のバリアントリパーゼ酵素を示し、バリアントポリペプチドは、リパーゼ活性を有する。表1はまた、親リパーゼのリパーゼバリアントを示し、バリアントは、アミノ酸残基の挿入を含む。アミノ酸残基の挿入を、(‘)、例えば、(84')として示す。
Figure 2020519288
Figure 2020519288
Figure 2020519288
Figure 2020519288
Figure 2020519288
[実施例2]
リパーゼ酵素の発現及び精製
発現
コードポリヌクレオチド配列を含有する発現プラスミドを構築し、プラスミドをピキア・パストリス(コマガテラ・ファフィ)を形質転換し、得られた発現株を以下の方法で成長させることにより、バリアントリパーゼ酵素を得た。配列を確認した株のグリセロールストックをゼオシンを含有する酵母抽出ペプトンデキストロース(YPD)寒天プレートに広げることにより、発現株の新鮮なピキア・パストリス細胞を得た。2日後、これらのプレート由来の細胞を使用して、産生株のスターターシード培養物を緩衝グリセロール複合培地(BMGY)100mLに接種し、20〜24時間、30℃及び225〜250rpmにて成長させた。適量を、バッフル付き発酵槽におけるBMMY培地2〜4Lに移すことにより、シード培養物をスケールアップした。30℃において、平刃羽根車を介して提供した1100rpmの撹拌下で、48〜72時間、発酵を行った。発酵の開始バッチフェーズ後、培養物中の溶解酸素レベルが30%より下に落ちたらいつでも、無菌濾過したメタノールを供給材料として加えた。或いは、0.5%v/v開始バッチ培養物において3時間毎に供給材料を加えた。最終発酵ブロスを、7000×gにおいて30分間、4℃で遠心分離して、細胞を含まない上清を得た。
以下の通り決定した、バリアントリパーゼ酵素の発現レベルを表2に示す:SDS-PAGE又はキャピラリー電気泳動のいずれかにより目的のタンパク質発現について、及びPNP-オクタノエートを基質として使用した酵素活性により、上清をアッセイした。以下、表2において、結果を提供し、親(LIP062)発現と比較したパーセンテージとしてデータを示す。バリアントリパーゼ酵素の一部について、発現レベルを決定しなかった「n.d.」が、十分な物質を生じ、バリアントリパーゼ酵素を実施例3におけるリパーゼ活性試験に移し、実施例1、表1において上で記載したアミノ酸配列同定のため送った。
Figure 2020519288
Figure 2020519288
回収
チーズクロスを通して濾過した後、5kDの分子量カットオフを有する実験室スケールのタンジェント流濾過(TFF)システム(SpectrumLabs)を使用して、細胞を含まない上清を限外濾過した。試料をまず10〜20倍濃縮し、次に、50mM HEPES、pH7.5に5回バッファー交換した。得られた残余分を、27000×gにおいて1時間遠心分離し、次に、0.2μmのフィルターを通して無菌濾過し、任意の産生生物又は粒子状物質を除去した。ブラッドフォードアッセイを使用して、終試料の総タンパク質含有量を決定した。リパーゼを凍結乾燥させて、粉末を形成させた。
[実施例3]
リパーゼ活性
溶液中の天然の基質を使用して、バリアントリパーゼ酵素の活性を決定した。超音波処理により、0.25%デオキシコール酸ナトリウム中の5mM終濃度にて、天然の脂質基質を調製した。基質(15μL)を、フルオレセイン(10mM CaCl2中の0.25μg/mL)30μL、及び5mM Hepes、pH7.5において予め希釈した、回収したリパーゼ(約1〜2μg/mL)10μLと混合した。pH変化に起因した蛍光における降下(励起/放出について485nm/525nm)により、脂質加水分解の産物をモニターし、30秒毎に、10分間26℃において動態を記録した。ログスケールの活性は、1分当たりの蛍光変化と正比例した。結果を表3において以下で示し、データを、同じタンパク質濃度における親(LIP062)蛍光変化のパーセンテージとして表す。基質の一部上でのバリアントリパーゼ酵素の一部について、バリアントの活性を決定しなかった「n.d.」が、十分な物質を実施例2に記載した通り生じ、実施例1、表1において上で記載したアミノ酸配列同定のため送った。
Figure 2020519288
Figure 2020519288
Figure 2020519288
Figure 2020519288
Figure 2020519288
[実施例4]
様々なpH値におけるリパーゼ比活性
バリアントリパーゼ酵素を、5mM Hepes、pH7.5中の適当な濃度にて希釈し、次に、pH6.5〜pH12.0の広範囲のバッファーにおいて調製した0.4mM PNP-オクタノエートにさらに16倍希釈した。広範囲のバッファーは、25mMリン酸、25mMクエン酸、25mMホウ酸、25mM CAPS、及び50mM NaClを含有していた。pH8.0については、バッファーに10mM Tris、pH8.0を添加した。405nmにおける吸光度を40秒毎に15分間記録することにより、26℃において活性を測定した。活性を、バックグラウンド(酵素なし)及び同一条件下でのそれぞれのpHにおけるPNPの吸光度について補正した。結果を表6において示し、データを、PNPマイクログラム/分/酵素1mgとして示す。
Figure 2020519288
[実施例5]
ラウンダー-o-メーターにおけるリパーゼの評価
1回の実施当たり2つの複数の汚れモニター(MSB、NSL、MSL1、及びMSL2)を使用して、2g/液体洗剤(ES1又はES4)1L又は2g/粉末洗剤(ECE2)1Lにおいて、リパーゼ酵素を試験した。試験した洗濯温度は、20℃及び40℃である。0及び0.5ppmにおいて、リパーゼを投与した。
選択した汚れモニターを、木綿袋ファブリック及びスチールボールと一緒に、20℃又は40℃のいずれかにおいて、洗濯液中、基本製剤ES1又はES4又はECE2を使用して、ラウンダー-o-メーター(LOM、LP2 Typ、SDL Atlas Inc.、USA)において、以下の洗濯条件下で洗濯した。
ES1液体洗剤製剤:
Figure 2020519288
WFKのECE2粉末洗剤製剤組成物(ISO 105-C08:2010):
Figure 2020519288
ES4液体洗剤製剤:
Figure 2020519288
試験条件
Figure 2020519288
洗濯後、ファブリックを洗い、スピン乾燥させ、空気乾燥させた。460nmにおいてFa. Datacolor(Elrepho 2000)の分光光度計を用いて、洗濯後の汚れたファブリックの軽減値を測定することにより、単一の汚れについての洗濯性能を決定する。一般的に、軽減値が高いほど、良好な性能である。複数の汚れモニターについて、洗濯していない汚れと洗濯した汚れの間で計算した(実施例7に従った計算)LAB値及びΔEを生じる、MACH5複数領域色測定を使用することにより、汚れ除去性能を決定した。結果はまた、表4、試験5〜8において以下で概説する。
試験した汚れ-汚れ試料は全て、CFT、Vlaardingen、NLより購入した。
Figure 2020519288
Figure 2020519288
Figure 2020519288
Figure 2020519288
Figure 2020519288
Figure 2020519288
Figure 2020519288
[実施例6]
フルスケールの洗濯におけるリパーゼの評価-基準リパーゼとの比較
1回の実施当たり2つの複数の汚れモニター(MSB、NSL、MSL1、及びMSL2)を使用して、2g/液体洗剤(英国において購入した、Persil small & mighty non bio2016)1Lにおいて、リパーゼ酵素を試験した。試験した洗濯温度は、20℃及び40℃である。0.5ppmのリパーゼを投与した。
試験を実施例5の通りセットアップした。
試験した汚れ:汚れ試料は全て、CFT、Vlaardingen、NLより購入した。
Figure 2020519288
Figure 2020519288
Figure 2020519288

Claims (12)

  1. 配列番号1のアミノ酸配列に従う少なくとも1つのポリペプチド、又はリパーゼ活性を有する、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有する少なくとも1つのポリペプチド、及び少なくとも1つの洗剤成分を含む、洗剤製剤。
  2. ポリペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列に対してアミノ酸残基位置番号:23、33、82、83、84、85、160、199、254、255、256、258、263、264、265、268、308、311、又はその任意の組合せにて少なくとも1個のアミノ酸残基挿入、欠失、又は置換を含み、ポリペプチドが、リパーゼ活性を有する、請求項1に記載の洗剤製剤。
  3. 少なくとも1個のアミノ酸置換が、配列番号1のアミノ酸配列に対してY23A、K33N、S82T、S83D、S83H、S83I、S83N、S83R、S83T、S83Y、S84S、S84N、84’Y、84’L、84’S、I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V、I85Y、K160N、P199I、P199V、I254A、I254C、I254E、I254F、I254G、I254L、I254M、I254N、I254R、I254S、I2454V、I254W、I254Y、I255A、I255L、A256D、L258A、L258D;L258E、L258G、L258H、L258N、L258Q、L258R、L258S、L258T、L258V、D263G、D263K、D263P、D263R、D263S;T264A、T264D、T264G、T264I、T264L、T264N、T264S、D265A、D265G、D265K、D265L、D265N、D265S、D265T、T268A、T268G、T268K、T268L、T268N、T268S、D308A、Y311E、又はその任意の組合せからなる群から選択され、ポリペプチドが、リパーゼ活性を有する、請求項2に記載の洗剤製剤。
  4. ポリペプチドが、配列番号1に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含み、ポリペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも1個の単一アミノ酸置換を有し、1個の単一アミノ酸置換が、配列番号1のアミノ酸配列に対してY23A、K33N、S82T、S83D、S83H、S83I、S83N、S83R、S83T、S83Y、S84S、S84N、84’Y、84’L、84’S、I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V、I85Y、K160N、P199I、P199V、I254A、I254C、I254E、I254F、I254G、I254L、I254M、I254N、I254R、I254S、I2454V、I254W、I254Y、I255A、I255L、A256D、L258A、L258D;L258E、L258G、L258H、L258N、L258Q、L258R、L258S、L258T、L258V、D263G、D263K、D263P、D263R、D263S;T264A、T264D、T264G、T264I、T264L、T264N、T264S、D265A、D265G、D265K、D265L、D265N、D265S、D265T、T268A、T268G、T268K、T268L、T268N、T268S、D308A、Y311E、又はその任意の組合せからなる群から選択され、ポリペプチドが、リパーゼ活性を有する、請求項2〜3のいずれか一項に記載の洗剤製剤。
  5. ポリペプチドが、配列番号1に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含み、バリアントポリペプチドが、表1に記載されるアミノ酸置換の組合せを有し、ポリペプチドが、リパーゼ活性を有する、請求項2〜4のいずれか一項に記載の洗剤製剤。
  6. 洗浄方法であって、
    (a)脂肪性の汚れを落とすべき表面を用意する工程、
    (b)請求項1〜5のいずれか一項に記載の洗剤製剤を用意する工程、
    (c)(a)の脂肪性の汚れを落とすべき表面を(b)の洗剤と接触させる工程
    を含み、洗剤中のポリペプチドが、脂肪性の汚れを落とすべき表面から脂肪性の汚れを除去する、方法。
  7. 第2のリパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、マンナナーゼ、ラッカーゼ、ペクチナーゼ、及びヌクレアーゼからなる群の1つ以上から選択される第2の酵素を添加することをさらに含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の洗剤製剤。
  8. 脂肪性の汚れを落とすべき表面が、布、織物、ファブリック、硬質表面、又は食器である、請求項6に記載の方法。
  9. 脂肪性の汚れを落とすべき表面が、口紅、皮脂、マスタード、オリーブオイル、ココヤシ、チョコレート、チョコレートムース、チョコレートアイスクリーム、チョコレートドリンク、落花生油、牛脂、インドカレー、ナポリトマト、メーキャップ、血液牛脂、サラダドレッシング、卵黄、食品、揚げ物の脂肪、カレー、地中海ソース、カレー油ソース、バルサミコ、ハンバーガーグリース、バター脂から選択される汚れを含む、請求項6に記載の方法。
  10. 洗濯洗剤、硬質表面クリーナー、食器洗浄洗剤、又は個人用衛生用製品である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の洗剤製剤。
  11. 少なくとも1つの洗剤成分が、洗濯若しくは洗浄性能において有効な又は洗剤の物理的特徴の維持において有効な量で、界面活性剤、ビルダー、ポリマー、アルカリ、漂白系、蛍光漂白剤、消泡剤及び安定剤、ヒドロトロープ、レオロジー改質剤、保存剤、並びに腐食防止剤から選択される、請求項1〜10のいずれか一項に記載の洗剤製剤。
  12. 洗剤が、液体、ゲル、ペースト、棒状石鹸、粉末、又は粒状固体である、請求項1〜11のいずれか一項に記載の洗剤製剤。
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