CN112782140A - 细胞分泌特征的分析和筛选 - Google Patents
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Abstract
实施方案公开了用于进行生物筛选和分析的装置、方法和软件，其使用能够检测多种基于细胞的分泌物、表达蛋白和其他细胞组分的仪器平台实施。可将所述平台配置为用于同时多路检测多个生物组分，由此可对大量的离散样品进行独立分离和评价，以高度平行且可扩展的方式检测或鉴定来自所述样品的组分。
Description
本申请是与母案发明名称相同的分案申请，母案的中国申请号是201580075327.8，国际申请号是PCT/US2015/063754，申请日是2015年12月3日。
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年12月3日提交的标题为“用于针对单细胞功能和多功能特征筛选免疫细胞的方法和***”的美国临时专利申请系列号62/087,147 (代理人案号IPX-0200PRO)的权益，所述申请通过引用以其整体结合到本文中。
本公开内容的领域
本发明一般涉及细胞分析，以及更具体而言涉及用于细胞状态的生化评价和功能表征的装置、方法和软件。
发明背景
在包括细胞生物学和免疫学在内的领域，开发用于评价和定量细胞蛋白质表达和分泌特征的分析技术，对于阐明根本的生化过程和细胞信号转导机制而言非常重要。部分地因细胞常常表现出不同的行为所致，存在对这样的工具和程序的需求，其能够分析大量离散的细胞群体，亦适于在单细胞水平检测生物分子。细胞表型和功能性的灵敏而准确的评价，以及驱动子和单个细胞之间的相互作用的鉴定，已显示为生物***的能力和运行的重要标志。
例如，免疫细胞反应通过大量分泌蛋白来引导，包括细胞因子、趋化因子和生长因子，其代表介导一系列细胞行为和细胞-细胞信号转导过程的重要功能调节子。监测这些复杂的免疫-信号转导途径和细胞相互作用，对于鉴定可用于了解免疫***状态、预测临床结果和指导治疗或疗法的临床上相关的测量，显示出重大挑战。对用于细胞分析的灵敏且高度多路操作的技术存在日益增多的需求，其可用于鉴定并快速评价疾病的相关物、对各种化学物质和治疗剂的细胞反应以及涉及免疫干预的其他基于细胞的过程。所述技术亦可用于更好地理解免疫的根本机制。
本公开内容概述
本公开内容提供对于确定和研究细胞过程及功能特征而言有用的装置、方法和软件。在多个实施方案中，可在免疫细胞的细胞分析的情况下有利地应用本教导。例如，可在单细胞水平评价对各种疗法的T细胞功能性及相关反应、化学相互作用和/或疾病状态。
在多个实施方案中，公开了用于进行生物筛选和分析的装置、方法和软件，其使用能够检测多种基于细胞的分泌物、表达蛋白和其他细胞组分的仪器平台实施。可将所述平台配置为用于同时多路检测多个生物组分，由此可对大量的离散样品进行独立分离和评价，以高度平行且可扩展的方式检测或鉴定来自所述样品的组分。在多个实施方案中，将所述平台配置为用于自动或半自动处理，显著改进效率(time-to-result)、样品通量、检测准确性和灵敏性。
所述平台可有利地适用于分析少量细胞和单细胞。如在本文中所公开的，单细胞及单细胞之间的细胞相互作用(例如细胞-细胞相互作用)的分析在免疫学应用中特别有用，以帮助确定免疫细胞，例如B细胞、T细胞(例如CD4+、CD8+细胞)和/或巨噬细胞的功能特征。尽管提供和论述了涉及免疫细胞的多个实例和工作流，但要理解的是，本教导的装置、方法和软件可适于与多种不同的细胞类型一起使用。此外，所述样品分析技术可延伸到细胞或生物分析应用之外，用于其中需要基本上同时评价多个离散样品的多种不同分析物的其他化学测定。此外，可平行地评价除细胞之外的样品组分，例如含目标化学物质、化合物或其他分析物的珠粒或其他颗粒。在多个实施方案中，本文所公开的技术灵敏性足以检测、区分和定量以非常小的液体体积或水体积(例如，纳升和皮升体积或更小体积)存在的多个分析物。
在多个实施方案中，阐述了用于分离地解析与细胞群体相关的分析物的***，其包括：(a)多个样品保留区，其接收从一群细胞中分布的至少一个细胞并保留所述至少一个细胞释放的相关的多个分析物；(b)与多个独立放置的分析物检测部分匹配的多个分析物检测区，所述分析物检测区以与所述样品保留区匹配的有序模式排布，借此，在耦合时，释放的分析物选择性地与所述多个分析物检测部分结合，形成各分析物检测区的分析物图谱；(c)排布在所述多个样品保留区周围的多个第一比对标志物，和排布在所述多个分析物检测区周围的多个第二比对标志物；和(d)成像仪，其对所选样品保留区以及保留的至少一个细胞和另外至少一个第一比对标志物生成多个图像，所述成像仪进一步对与所选样品区对应的分析物检测区及相关的分析物图谱和另外至少一个第二比对标志物生成多个图像；和图像处理器，其使用至少一个第一比对标志物来比对所选样品保留区的相关图像，并使用至少一个第二比对标志物，将分析物检测区的图像与所选样品保留区的相应图像进一步比对，所述图像处理器进一步在各样品保留区和相应的分析物图谱中鉴定保留的至少一个细胞，以基于在所述分析物图谱中测得的分析物检测部分，分离地解析与所述保留的至少一个细胞相关的释放的分析物。
在其他实施方案中，描述了用于分离地解析与细胞群体相关的分析物的方法，其包括：(a)获取多个样品保留区的多个图像，所述样品保留区接收从一群细胞中分布的至少一个细胞并保留所述至少一个细胞释放的相关的多个分析物；(b)获取与多个独立放置的分析物检测部分匹配的多个分析物检测区的多个图像，所述分析物检测区以与所述样品保留区匹配的有序模式排布，借此，在耦合时，释放的分析物选择性地与所述多个分析物检测部分结合，形成各分析物检测区的分析物图谱；(c)解析排布在所述多个样品保留区周围的多个第一比对标志物；(d)解析排布在所述多个分析物检测区周围的多个第二比对标志物；(e)使用至少一个所述多个第一比对标志物来比对所选样品保留区的相关图像，并使用至少一个所述多个第二比对标志物，将分析物检测区的图像与所选样品保留区的相应图像进一步比对；和(f)在各样品保留区和相应的分析物图谱中鉴定保留的至少一个细胞，以基于在所述分析物图谱中测得的分析物检测部分，分离地解析与所述保留的至少一个细胞相关的释放的分析物。
在另外的实施方案中，阐述了这样的永久性计算机可读介质，其具有储存于其上的计算机可执行代码，用于分离地解析与细胞群体相关的分析物，所述代码包括：(a)用于获取多个样品保留区的多个图像的可执行程序，所述样品保留区接收从一群细胞中分布的至少一个细胞并保留所述至少一个细胞释放的相关的多个分析物；(b)用于获取与多个独立放置的分析物检测部分匹配的多个分析物检测区的多个图像的可执行程序，所述分析物检测区以与所述样品保留区匹配的有序模式排布，借此，在耦合时，释放的分析物选择性地与所述多个分析物检测部分结合，形成用于各分析物检测区的分析物图谱；(c)用于解析排布在所述多个样品保留区周围的多个第一比对标志物的可执行程序；(d)用于解析排布在所述多个分析物检测区周围的多个第二比对标志物的可执行程序；(e)用于以下的可执行程序，其使用至少一个所述多个第一比对标志物来比对所选样品保留区的相关图像，并使用至少一个所述多个第二比对标志物，将分析物检测区的图像与所选样品保留区的相应图像进一步比对；和(f)用于以下的可执行程序，其在各样品保留区和相应的分析物图谱中鉴定保留的至少一个细胞，以基于在所述分析物图谱中测得的分析物检测部分，分离地解析与所述保留的至少一个细胞相关的释放的分析物。
所公开的实施方案的另外的目标和优点，将部分地在接下来的描述中陈述，并且部分地将从所述描述中显而易见，或者可通过实施所公开的实施方案来了解。所公开的实施方案的目标和优点，将通过在随附权利要求中具体指出的要素及组合来认识和获得。要理解的是，前文概述和下文详述二者仅为示例性的和说明性的，且并非限制如通过权利要求所陈述的所公开的实施方案的范围。
附图简述
本公开内容的所述及其他实施方案，将参考下列示例性且非限制性图示来论述，其中对相似的元素进行类似编号，且其中：
图1A描述根据本公开内容用于进行样品分析的示例性高级工作流。
图1B图解根据本公开内容用于进行样品分析的示例性高级工作流。
图1C描述根据本公开内容的具有放大子部分的示例性样品阵列和分析物检测基底。
图1D描述根据本公开内容用于对样品阵列数据成像并解析的示例性详细分析工作流。
图1E描述根据本公开内容的与样品阵列的子区域的多个成像相关的过程的示例性概述。
图1F描述根据本公开内容对样品阵列和细胞/微粒的所选子区域的示例性成像。
图1G描述根据本公开内容对分析物图谱和比对标志物的示例性信号扫描。
图1H描述根据本公开内容的用于样品阵列的示例性光场和荧光图像画面，其具有用于相应分析物检测基底的相关图像画面和所述图像画面的合并。
图2描述根据本公开内容用于样品保留区位置确定和解析的示例性过程。
图3描述根据本公开内容用于定位比对特征的示例性方法。
图4图解根据本公开内容的样品保留区鉴定过程的示例性操作。
图5描述根据本公开内容用于比对特征定位和解析的示例性过程。
图6A描述根据本公开内容的示例性细胞/微粒位置鉴定过程。
图6B图解根据本公开内容用于样品区边界的示例性细胞检测和显影法。
图6C描述根据本公开内容的示例性细胞模板匹配过程。
图6D描述根据本公开内容的示例性细胞模板匹配过程。
图6E描述根据本公开内容用于生成细胞/微粒模板文库的示例性过程。
图7A描述根据本公开内容用于比对图像和扫描的示例性工作流。
图7B图解根据本公开内容的使用比对标志物的应用于示例性图像和扫描的示例性操作。
图7C描述根据本公开内容用于第一次和第二次图像比对的示例性方法。
图7D图解根据本公开内容用于第一次和第二次图像比对的示例性过程。
图8A描述根据本公开内容用于关联和比对特征的示例性过程800。
图8B图解根据本公开内容用于关联和比对特征的示例性过程。
图9A描述根据本公开内容用于细胞/微粒位置鉴定和甄别的示例性方法。
图9B图解根据本公开内容用于经表面标志物标记的细胞的示例性定位和甄别过程。
图10A描述根据本公开内容用于合并样品保留区图像/分析物扫描的示例性过程。
图10b图解根据本公开内容的示例性成像和像素比较过程。
图10C图解根据本公开内容的成像和像素比较过程的实例，其显示与示例性样品保留区的标志物图谱相关的成对读取。
图11描述根据本公开内容的用于选控异常数据和信号的示例性过程。
图12A阐述根据本公开内容的具有交叉的分析物检测区的一部分样品保留区的示例性图像。
图12B描述根据本公开内容用于评价多个分析物的的示例性散点图。
图12C阐述根据本公开内容的来自与两种细胞类型相关的测得分析物的标志物图谱/读取的示例性成像结果。
图13描述根据本公开内容用于展示和解释分析物数据和结果的示例性方法和工具。
图14A描述根据本公开内容用于评价实验结果的示例性数据库界面。
图14B描述根据本公开内容用于展示来自实验的信息的示例性结果界面。
图14C描述根据本公开内容的用于分析功能性和数据库查询的工作流。
图14D描述根据本公开内容的包含用于图像采集的组件和用于图像分析及后续分析物评价的计算组件的示例性平台。
发明详述
表征生物***或样品的状态或能力的工作，可能被整体分析方法混淆或掩盖。这在诸如免疫学测定等细胞分析中很明显，其中包含以常规体积或者介质分析的许多细胞的样品可掩盖或稀释分析物。因此在许多情况下需要提供极小体积样品和单细胞样品分析能力。对于小样品体积，包括含单细胞或少量细胞的小样品体积，进一步需要在独立的反应区或区域中隔离多个样品，由此其可经历平行分析。所述方法可能要求避免样品与样品串扰(cross-talk)和污染，同时提供使所述样品经历一致且独立处理的能力。以具有最小程度的用户干预的可扩展且多路的形式收集准确而灵敏的数据，亦很重要。
特别依从独立细胞分析的生化分析的一个具体实例涉及基于来自单个细胞或者因细胞与细胞相互作用而产生的分泌蛋白来评价功能状态。在包含免疫细胞分析的模型***中，可在单细胞水平上将细胞蛋白或化学分泌物特征与免疫反应的质量进行关联。例如，多种细胞因子可在CD4和CD8细胞群体二者中定义或区别分化阶段。另外，中心记忆细胞以及记忆/效应细胞可与分泌特定细胞因子，例如肿瘤坏死因子α (TNF-α)、白介素2 (IL2)和/或干扰素γ (IFN-γ)的增加概率相关。相比之下，主要产生和分泌IFN-γ的细胞更可能表现为与程序性细胞死亡(例如凋亡)相关的终末分化效应器。
为了利于筛选多种潜在的功能表型，例如在CD4细胞中展示的功能表型，以及允许测定多功能性，例如与细胞免疫反应相关的多功能性，需要同时分析多个分析物。对于所述分析，进一步需要使得能够从单个或少数细胞中基本上同时检测多个分析物，其中对数百个、数千个、数百万个或者更多离散的细胞、样品和/或独立的细胞相互作用评价多个分析物。此外，对于各样品而言，筛选用于各细胞或样品群体的分析物的数量，可介于相对较少(例如介于约1-5个分析物之间)或相对较多(例如介于约5-100个分析物之间)乃至于可能更多(例如超过100个分析物)之间。
在高度多路操作***中，其中可对许多离散样品合意地评价许多不同的分析物，就快速且准确获取相关数据并进行高质量分析而言，出现一定挑战。待通过所述***同时分析的小规模的和大量的离散样品，可能使得在不使用高度自动化和/或不依赖于用户的计算分析的情况下充分进行这些分析变得不切实际。这对于开发意图用以评价数百个、数千个或更多离散样品的单细胞技术和细胞分析***而言特别明显。
示例性单细胞分析技术近来已描述于例如“评价功能细胞异质性的单细胞的高通量分泌蛋白质组学分析(High-Throughput Secretomic Analysis of Single Cells toAssess Functional Cellular Heterogeneity)”分析化学，2013，第85卷，第2548-2556页，“用于基础及应用生物医学应用的基于微流体的单细胞功能蛋白组学(Microfluidics-Based Single-Cell Functional Proteomics for Fundamental and AppliedBiomedical Applications)”，分析化学年鉴，2014，第7卷，第275-95页，和“用于监测免疫***的单细胞技术(Single-cell technologies for monitoring immune systems)”，自然免疫学，2014，第15卷，第2期，第128-135页，可基于各细胞测定分泌蛋白。另外，用于单细胞和少量细胞分析的示例性装置和平台公开于PCT申请系列号PCT/US2013/056454 (PCT专利公布号WO2014031997)、美国专利申请系列号12/174,601 (美国专利公布号2009/0036324)、美国专利申请系列号12/174,598 (美国专利公布号2009/0053732)、美国专利申请系列号12/857510 (美国专利号8,865,479)和美国专利申请系列号13/132858 (美国专利公布号2012/0015824)。
如将在下文中更详细地阐述，诸如上述单细胞分析和少量细胞分析平台等***和技术，可适于从本教导的自动或半自动分析法中获益，以改进通量、准确性、推理发现和结果置信度。此外，在进行多路化学、生化或细胞分泌分析时，包括其中检测、鉴定和定量各样品的多个分析物的分析，本教导的装置、方法和软件可利于非常大量的离散样品的分析。
根据多个实施方案，所公开的检测方法可用于以多路方式分析多种化合物，包括例如与生物***(例如免疫细胞)相关的生化物质、细胞分泌物和/或表达蛋白。另外，可检测和分析与单个或少量细胞(包括细胞-细胞相互作用)相关的多种不同的蛋白质和/或化合物，以生成反映受试者或样品的代表性细胞群体、细胞亚群或单细胞的反应或状态的细胞分泌或表达特征。
在免疫学分析的情况下，因免疫细胞的表型和功能异质性以及免疫细胞分化的可塑性所致，整体分析细胞的常规方法在定义或鉴定免疫防护诸如癌症等疾病和诸如病原体等传染剂的相关物上产生困难。与免疫保护相关的分泌和表达特征为个体免疫的潜在有价值且可测量的预测子。所述特征可用于评价和定量对病原体、疾病或治疗的反应，且为在临床分析中有用的工具。
鉴定保护性免疫的相关物(例如与T细胞相关的)对于免疫学家而言尤其具挑战性，这至少在某种程度上因保护程度可能未明确匹配所述细胞的已知细胞表型和/或表面标志物或者与之具有类似性所致。另外，从初始CD4 T细胞分化的主要功能亚群之一的TH1细胞(I型辅助T细胞)的功能特征，已显示出显著的异质性，如通过其不同的细胞因子特征所反映。使用基于流式细胞术的常规方法，效应T细胞的功能分析试图描述细胞的功能亚群。已显示的是，这些细胞组群或类别中的每一个均可在免疫反应中产生并释放不同的细胞因子组合，例如通过细菌感染引发的免疫反应。
在多个实施方案中，本公开内容的***和方法提供测定细胞分泌物和/或细胞信号(例如与免疫细胞或免疫反应相关的细胞分泌物和/或细胞信号)的新方法。可在单细胞或少量细胞水平(包括细胞-细胞相互作用)进行分析，其中可跨越相对大量的细胞对每个细胞平行评价多种细胞因子的效应水平。
如将在下文中更详细地阐述，所公开的方法增强并改进了分析平台的性能，所述平台解决涉及区分细胞保留区或区域、鉴定细胞/微粒并将其分类的具体问题，解决***误差并使分析工作流自动化以使平行分析数百个、数千个、数百万个或更多个离散细胞或样品所需的高通量灵敏且准确的评价成为可能。所述方法可有利地用于改进现有分析平台和技术以产生有价值的发现和筛选工具，其可用于理解和测定许多不同类型的细胞多功能性，例如涉及免疫反应并与之相关的细胞多功能性。
图1A/1B描述用于进行样品分析的示例性高级工作流100。所述分析可包括评价一个或多个样品102、104，其包含从一个或多个所选样品来源采集或收集的细胞、珠粒或其他颗粒106的群体或分布(例如从代表所选生物状态的个体或培养物中获得的细胞，其以化学方式响应疾病、病原体或治疗性处理)。根据本公开内容，当提及细胞、珠粒或颗粒的一个或多个群体包含待分析的所选或所需样品时，与待检测和评价的分析物相关的其他类型的微粒亦可包含所述样品。此外，所述样品可包含细胞、珠粒或其它微粒的各种不同或有差异的群体，共同形成待分析物质的一个或多个混合群体。要理解的是，提及“细胞”或“珠粒”，意图其作为可对其分析相关分析物的示例性颗粒类别。因此，本教导可应用于多种不同类型和组成的微粒106，而不会背离本教导的范围。
如上所提及的，对样品102、104的细胞/微粒106评价与多个分析物108相关或包含其的组分。根据本公开内容，分析物108可采用许多形式。例如，分析物108可包括在与细胞/微粒106相关、由其分泌或释放的水介质(例如细胞培养基)或者流体/半流体载体中不稳定、分散、扩散或溶解的化学物质、化合物或物质。分析物108可进一步包括生物分子或有机分子，例如核酸、肽、肽片段、细胞表面受体、核酸、激素、抗原、生长因子、蛋白质、抗体、细胞因子、趋化因子或其他分子。分析物108可进一步包括其他类型的物质或化合物，例如与细胞/微粒106相关、由其分泌或释放的离子或无机化学物质。
根据多个实施方案，本公开内容的装置和方法尤其很好地适于分析与包含在样品102、104之内或包含样品102、104的离散的单个或少量细胞相关的低浓度的分析物108。所述分析物108可包括例如需要以高度多路的方式平行分析的由细胞样品102、104分泌或释放的细胞膜相关蛋白、细胞因子、趋化因子或者其他生化物质。可对样品群体或其细胞组分进一步比较在分析物存在、表达或丰度上的相似性和/或差异，例如其可来源于将第一种对照的正常或未处理的细胞群体与第二种测试的异常/患病或经处理的细胞群体进行比较。
根据图1A/1B，在步骤110中采集或收集待分析的包含细胞/微粒106的一个或多个样品102、104。然后在步骤120中使细胞/微粒106分布并保留在独立的部分中。使用包含样品阵列122的基底完成样品分布，所述样品阵列具有包含保留区124的多个独立的小室、孔、槽、通道或其他特征/区域。将保留区124进一步适当配置成包含、容纳或隔离至少一部分细胞/微粒106。在多个实施方案中，用于分布细胞/微粒106的阵列122包含多个保留区124，例如在样品阵列122上形成的孔、槽、穴或凹陷，其基于细胞/微粒106的尺寸(dimensionality)适当调整大小。所述细胞/微粒在步骤120中的分布可包括使所述样品分散在所选的流体体积中，由此基于所述区域的容积和待位于、排布或放置到其中的含流体样品的量，预期使所需数量的细胞/微粒排布到一个或多个所述保留区中。
在多个实施方案中，样品阵列122可包含多个独立保留区，各自可配置成容纳或放置所需数量的细胞/微粒。根据本教导，样品阵列122可包含大量的保留区124。例如，可在样品阵列122中形成数百个、数千个或数百万个独立保留区124。在一个示例性实施方案中，样品阵列122可包含长和/或宽介于约1-10 cm之间的结构，其具有介于约1,000-100,000个在其中形成的独立保留区。
在多个实施方案中，样品保留区124包含具有长约0.01-5毫米和深约0.5-100微米的尺寸的微室/微孔。在其他实施方案中，所述微室/微孔一般具有矩形截面，长约0.1-2000微米，宽约0.1-100微米，深约1-100微米。可将所述微室/微孔的大小和形状配置成用于各种应用和细胞/微粒类型。例如，相对较大的微孔可合意地用于容纳较大的细胞/微粒。另外，对于涉及待在各微室/微孔中评价多于一个细胞/微粒的实验，可相应地配置所述微室/微孔的大小和/或尺寸。另外，样品阵列122的密度可灵活配置，例如，每cm2有介于约100-50,000个微室/微孔。
使用诸如基于泊松(Poisson)统计等方法的稀释法，可实现细胞/微粒106的预期分布，致使至少一部分保留区124接收少量细胞/微粒或者在多个实施方案中接收单个细胞/微粒106。根据用于样品稀释/分布的所述方法，某些保留区124可能未接收细胞/微粒106，而其他保留区可能接收多于所需数量的细胞/微粒106 (例如多于一个或少量细胞)。在多个实施方案中，与少量细胞/微粒106以及更具体而言单个细胞/微粒106的样品群体相关的分析物108的分析，包括鉴定各保留区124中的细胞/微粒106的存在和数量(numerosity)。如将在下文中阐述，本公开内容的***和方法能够将不同的保留区有效地成像并区分所需的细胞/微粒分布，以鉴定含有所需量或数量的细胞/微粒的保留区。
样品分布之后，在状态130中使细胞/微粒106在各保留区中孵育所选的时间或持续时间。根据所选的标准或方案进行孵育，保留的细胞/微粒106将分析物108释放到独立保留区124内的周边空间(volume) 132中(例如其中保留含有离散的单个或少量细胞/微粒的培养基的空间)。样品阵列122的构型允许样品102、104的细胞/微粒106将分析物108分泌/释放到空间132中。在孵育期间，分析物浓度可在保留区124的空间132内积累和/或扩散。
例如通过分散或扩散至遍布至少一部分所述保留区而释放到保留区124的空间132中的分析物108，可在步骤140中与排布在或位于分析物检测基底134的所选位置周围的一个或多个检测部分135进一步结合或反应。检测部分135可包括抗体、核酸、蛋白质或其他化学/生化组分，其选择性地与一个或多个所选分析物108反应、偶联，识别或以其他方式区分所述分析物和/或检测其存在。一般而言，保留区124的大小和构型提供足以使分析物108以这样的方式分散的空间/区域，所述方式使其可通过与分析物检测基底134的所选部分或区域(例如其中放置或排布检测部分135的分析物检测区136)结合或位于其周围的检测部分135来独立检测。
在多个实施方案中，与保留在独立保留区124中的分布的细胞/微粒106相关的分泌物、生化物质、细胞因子、趋化因子、蛋白质、肽、肽片段、细胞表面受体、核酸、激素、抗原、生长因子或表达蛋白，在空间132中扩散和分布，并开始选择性地与排布或位于与分析物检测基底134结合的分析物检测区136中的一个或多个检测部分135结合、被其捕获或保留，形成可检测或可识别的图谱、指纹或条形码142，当其在状态150中检测时，形成与包含在所占据的保留区124中的各细胞/微粒106相关的分析物108的存在和组成的展示。
在多个实施方案中，分析物检测基底134配置有多个分析物捕获或检测部分135，其能够检测和区分多种分析物108 (例如介于约10-1000之间的不同类型的分析物)。分析物检测基底134上的分析物检测区136中的分析物检测部分135的定位或结合以这样的方式进行，其使得可基于图谱、指纹或条形码142，以高度多路的方式确定分析物108存在和/或丰度的同时测定。在多个实施方案中，排布在或位于分析物检测基底134上的分析物检测区136中的分析物检测部分135的排布或定位，允许基于分析物108的类型和存在，对分泌和/或释放的细胞因子、趋化因子、蛋白质或其他细胞组分进行容易且分别地分类。
分析物检测基底134可由多种捕获剂或检测部分135组成，其各自独立或特异地识别目标化合物、化学物质或生化物质。可将分析物检测部分135以独特的或在位置上离散的特征排列(例如分析物检测区136)在分析物检测基底134周围，提供不同分析物检测部分135之间的空间分离。分析检测部分135的所述在空间上隔离的排列，提供空间编码分析物检测区域136之中或周围的检测分析物108或形成其图谱，可基于与分析物检测基底134结合的分析物检测区136之中或周围的分析物检测部分135的已知分布对其进行解析。在多个实施方案中，分析物检测基底134可包含在分析物检测区136中排列成多个线条、点或其他离散图形或图形组合的分析物检测部分135。
各分析物检测区136可进一步由一种或多种类型的分析物检测部分135组成，所述分析物检测部分能够通过使用不同的标志物、标记、染料或者其他手段生成不同的信号或其他光谱可分离的特征来相互区分，例如在成像期间使用不同的光学特征或波长，可在成像后识别所述信号或特征。在多个实施方案中，分析物检测基底134包含一个或多个复制的、多余的或重复的分析物检测部分135或分析物检测区136，其可用于例如给待使用对相应的分析物检测区136获得的信号、读取或图谱进行识别和比较的分析物存在提供多次机会。
对于与各样品保留区124相关的细胞/微粒106，要求多个分析物108为可鉴定和/或可量化的。在多个实施方案中，使用相应的分析物检测部分135/分析物检测区136，分析物检测基底134提供检测和解析约5-1000个或更多个不同分析物108的能力。排布在或位于分析物检测基底134上的分析物检测部分135/分析物检测区136，通常以与样品阵列122的样品保留区124相对应或互补的方式排列或形成图案。因此，各分析物检测区136的长度和宽度以及分析物检测区136的总体尺寸和/或分组，可基于通过样品保留区124确定的相应面积或可得面积来可变地配置。
如将在下文中更详细地阐述，可将从分析物108与结合分析物检测区136的相应分析物检测部分135的偶联或结合所得的信号成像，形成可进行分析和解析的信号指纹、条形码或其他可识别图谱，以确定存在于样品阵列122的各样品保留区124中的分析物108。这些分析物108可进一步与确定存在于各样品保留区124中的细胞/微粒进行关联。
基于分析物检测部分135/分析物检测区136的空间分离、光谱分离或空间和光谱分离二者的组合，可将测得的分析物图谱解析成离散分析物的存在或数量。通过多路检测2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、10种或更多种、20种或更多种、40种或更多种、50种或更多种、100种或更多种、1000种或更多种目标分析物，本发明的装置和方法可用于解析多个分析物108的存在。因此，本公开内容的图像分析装置和方法提供对大量离散的单个细胞/微粒或离散的少量细胞/微粒(共同位于或共同定位于相应的样品保留区124中)平行检测大量不同分析物的能力。
步骤150中的分析物检测可包括将分析物检测基底134成像(直接成像或者在从样品阵列122上分离之后成像)，以鉴定代表与分析物检测部分135偶联或结合的分析物108的存在的信号或标志物(例如荧光的和或放射性的)。在多个实施方案中，分析物检测部分135可包括发光标志物、发出能量的标志物、染料或其他标记136，并利用诸如抗体捕获和ELISA分析等技术用于分析物检测。
通过将测得或识别的图谱、指纹、信号读取或条形码142与各保留区124进行关联，在步骤160中表征细胞/微粒106及其对应的分析物108。该处理包括鉴定和区分与分析物检测基底134的相应区域相关的独立保留区124。如将在下文中更详细地阐述，该过程可包括以高度多路的方式确定相应的细胞/微粒106、保留区124和测得或识别的图谱、指纹或条形码142的位置和/或方向的大量操作。该分析为以高度平行的方式识别单个或少量细胞的分泌物、生化物质和/或表达蛋白进一步奠定基础，其允许从测得分析物的所得图谱进行诸如表型表征等其他分析以表征单个样品，包括定量分析物、确定表达图谱、将样品分类或分组及其他分析功能。
高通量单细胞分析中的一定挑战是因为必须以基本上平行的方式快速准确地评价大量非常小的特征。所述装置和方法应不仅能够将单细胞分离并保留在独立区域，还应以高置信度准确识别大量离散的低丰度分析物。样品和基底特征通常尺寸很小，迫使需要以高分辨率且小心地成像(例如使用高分辨率仪器和/或显微镜)。在多个实施方案中，亦必须识别可能复杂的分析物检测图谱、指纹、信号读取或条形码或将其与单个孔或者分析物113或分析物115进行关联，提供从各样品同时检测和评价多个分析物的能力。同样，在进行准确分析方面，所述分析物区或区域的大小以及待测分析物的密集排布存在一定挑战。
图1C描述根据本公开内容的具有放大的子部分180的示例性样品阵列122的一部分的图像。样品阵列122可包含数百个、数千个或更多个独立样品保留区124，如在放大的子部分182中所示。各样品保留区124可进一步保留单细胞或少数细胞(或类似地保留颗粒)106。各细胞/微粒106应不仅能可信地识别并与其所处的各样品保留区124关联，还必须与各种可能的人为产物、噪声及其他误差来源区分开来。可直接影响成像质量的多个因素包括例如所述细胞相对于潜在污染物的大小、在混合群体中区分特定的细胞类型、图像采集中的低质量/对比度、样品阵列中的瑕疵、气泡及其他人为产物。如本领域技术人员将理解的，在所述混杂因子存在下对细胞/微粒进行成像和解析，存在一定挑战。
图1C进一步描述根据本公开内容的具有放大的子部分280、282的示例性分析物检测基底134的一部分的图像。分析物检测基底134可包含数百个、数千个或更多个独立分析物检测区136，如在放大的子部分282中所示。各分析物检测区136可形成对应于检测与细胞/微粒106相关的分析物108的标志物135的分析物图谱142。可直接影响成像质量的多个因素包括例如其中测得分析物标志物135/图谱142的区域的噪声和背景。如本领域技术人员将理解的，在所述混杂因子存在下对标志物135/分析物图谱142进行成像和解析，存在一定挑战。
图1C进一步描述样品阵列122和分析物检测基底134的部分的相应图像的示例性叠加、合并或组合291。比对和定位样品阵列122和分析物检测基底134的图像的对应部分，提供将来自检测分析物108形成分析物图谱142的多个标志物135的信号与将分析物108进一步与之相关联的细胞/微粒106进行关联的方法。用于比对和定位所述图像的对应部分并分析相关数据的机制，在下文中更详细地阐述。
如前所述以及在多个实施方案中，需要在分析100期间检测和关联的特征包括多个细胞或颗粒106、保留区或微室124以及所述图谱、指纹、信号读取或条形码。与对所述多个特征进行成像和解析相关的小尺寸(例如，通常至少一个尺寸为约20微米或更小)和独特特性表现出需要克服的众多挑战，特别是在要求实现可接受的通量和准确性而应用自动或半自动数据采集和处理机制时。本发明的方法和装置能够获取用于单个或两个细胞/微粒化学或生化特征读取(具体而言每个测定室或保留区124)的所需高质量数据，同时将大量所述特征成像，包括例如数千个细胞/微粒106、数千个微室或保留区124，以及如果没有数百万，则数十万个读取以便于检测和分析。
对于涉及极小特征尺寸的样品阵列的细胞分析，以非常高的分辨率成像可能为不切实际的和/或不可行的，迫使需要用于数据采集和分析的备选方法。该限制的一个原因为诸如扫描显微镜和荧光计等成像装置具有分辨率限制。对所述硬件组件的升级可以是非常昂贵的，且对于在临床和研究设施中可能为必需的标准化或经校准的工作流而言，新组分的集成难以进行。另外，因时间、费用和计算限制所致，通过利用常规捕获和平铺(tiling)方式解决在成像装置(例如可用于特征分辨率扫描的扫描显微镜)的视野上的限制为不切实际或不可行的。例如，对具有数千个或更多保留区124、细胞/微粒106和分析物信号读取的全样品阵列122进行成像和分析，可轻易地包括捕获和平铺数千个图像，其可过度耗时且在计算上为禁止的。所述平铺图像的大小可轻易地超过数亿像素或更大，使得非常难以处理和分析。或者，可在较低分辨率进行成像，然而，所述方式可致使分析质量降低并导致高量化误差，其中各特征具有有限数量的像素，其可阻碍细胞类型的准确评价、噪声校正和/或信号解析。
某些工作流的其他限制为所述细胞/微粒样品阵列的光学/检测特征和要求可能为独特的且与用于对分泌物特征或测得化合物进行解析/成像的特征和要求不同。因此，在单个装置上进行同时成像可能为不可能/不切实际的。因此，如果并非为必要条件，则使用不同的信号/数据采集装置(例如多个显微镜/信号捕获装置)进行多个成像为合乎需要的。这些装置可能不会以相同的形式输出数据(例如以相同的分辨率或方向)，并因此对于将测得的分泌物图谱与特定保留区和细胞/微粒进行比对和关联，显示出另外的挑战。
在用于对样品阵列和化学信号指纹二者成像的分辨率，所需的精细测定有可能受许多来源的缺陷所混淆。例如，即便在所述基底表面上的微米水平的弯曲或扭曲以及极小的污染物，都应对获得足够高质量和准确的结果负责。另外，对包含细胞的生物数据成像常常导致在细胞形态和测得结构以及信号(分泌物)读取的强度和质量上的不一致性。本公开内容的***、方法和软件有效解决了潜在的可见变异，诸如上文所列举的变异，同时以高置信度区分噪声/背景。
根据多个实施方案，本教导的所需特征包括使数据采集/提取过程自动化的能力，避免用于获取数据的耗时且易错的手动方法。即便在尝试利用当下现成/常用的图像处理软件时，分析数据的采集亦为既耗时(每个测定约数天)又不准确的。本发明的另一个益处为，本文所公开的集成且优化的成像解决方案的开发提供这样的能力，其以高准确度可信地检测大量极小的特征，保持经济和时间有效的方式，同时除其他挑战之外，适应特征的不一致性、噪声存在、所述基底材料中的变形和瑕疵。在多个实施方案中，所述方法可应用于开发自动化程序，从时间观点(例如小于30分钟的动手时间)和硬件观点(可在常规电脑上进行)二者来看，其同时为非常准确的，且对于分析而言为充分实用的。
如上所述，所述用于细胞分析的方法和装置解决了常规单细胞图像分析解决方案的许多问题和缺点。图1D描述详细的分析工作流1000，其可用于根据本公开内容对样品阵列数据(例如单细胞分析阵列)进行成像和解析。收集与样品阵列122的样品保留区124以及相关图谱、指纹、信号读取或条形码142 (代表来自排布在样品保留区124中的各种细胞/微粒106的测得分析物108的信号采集)相关的多个图像，在状态1100中开始工作流1000。
在多个实施方案中，通过评价用于样品阵列122的所选区域的相关图像和信号采集信息的组群或集合来进行样品成像和分析。样品阵列122的所选成像区，可显示其中在图像中捕获了来自样品阵列122的样品保留区124的一部分的子区域180/182 (参见图1C)。根据本公开内容，与尝试将整个样品阵列的图像缝合在一起(其为费力的、在计算上昂贵且易错的过程)相比，可使用廉价的商品计算***将各子区域180、182独立成像并评价，以快速获得高质量数据和结果。可在样品阵列122上包含、蚀刻或印制基准点、标记、标识符或其他位置特征(统称比对标志物)。所述比对标志物可进一步用于帮助穿过或跨越多个图像和扫描来定向或鉴定样品保留区124，由此可将样品阵列122的独立样品保留区124与存在或排布于其中的细胞/微粒106进行关联。可将细胞/微粒106与用于细胞/微粒106的鉴定图谱、指纹、信号读取或条形码(统称分析物图谱)进一步关联，促进对测得的释放的分泌物和分析物108的高准确表征。
如将在下文中更详细地阐述，对样品阵列122的所选子区域180、182获得第一图像或扫描(例如，高分辨率光场图)。所述高分辨率图像(例如可使用具有10x-50x目镜的光学显微镜获得)可用于初始细胞/微粒检测。使用所述第一图像，可识别样品阵列122的子区域180、182的多个样品保留区124中的细胞/微粒106的位置、数量和分布。另外，可鉴定含有所需数量的细胞/微粒106 (例如单个细胞或者两个或更多个相互作用细胞)的样品保留区122，并与不含细胞/微粒106或者含有多于所需数量的细胞/微粒106的样品保留区122进行区分。所述高分辨率图像亦有助于在相对小的效应细胞/微粒106之间进行鉴定和甄别(例如，在免疫学分析中鉴定T细胞和自然杀伤细胞并与可能存在于所述样品中的其他细胞区分。)
为了进一步帮助与样品保留区124和相关分析物检测区136相关的图像和/或比对标志物的准确比对，亦对基本上相同或类似的子区域180、182获取第二图像。所述第二图像可包括低分辨率图像或者应用与所述第一图像不同的光学参数的其他图像类型。用于成像的子区域180、182的所述第一和第二图像可一起协助多个图像/扫描的比对，并且与使用单一成像相比，提供改进的细胞/微粒检测和鉴定准确性。在多个实施方案中，所述第二图像可以多种方式获得，包括使用不同的光学设置，例如调整对比度或焦平面方向、改变数字分辨率、与所述第一图像相比在放大倍数上使用指定分数或百分数的降低(例如与用于所述第一图像或扫描的10x-50x相比，1x-5x用于低分辨率图像)，以及可使用不同的照明/显微镜学方法获取，(例如暗视野、相衬、荧光)。在多个实施方案中，所述分析***可使用所需光学设置预配置，或者可基于数据质量和实验设计参数，对于将何种类型的光学设置应用于处于各自分辨率设置的第一和第二图像二者进行即时确定。要理解的是，可容易地采用更高和/或更低的分辨率和放大倍数用于所述成像过程。在多个实施方案中，用于成像的放大倍数和其他光学参数，至少在某种程度上将通过样品阵列122/样品保留特征124和分析物检测基底134/分析物检测区136的尺寸以及细胞/微粒106的类型和所使用的分析物检测部分来确定。
除对所选的子区域180、182获取的第一和第二细胞/微粒图像之外，还进行另一次扫描或信号采集，以获得或鉴定代表与存在于子区域180、182的样品保留区122中的细胞/微粒106相关的测得、释放或分泌的化合物或分析物108的分析物图谱142。在多个实施方案中，对各子区域180、182获得的扫描或信号采集信息，可用独立的仪器和/或在不同的时间获取，以供更灵活的数据采集。另外，第一和第二成像可基于彼此不同或者与所述分析物图谱扫描相比不同的光学特性或特征。例如，所述第一和第二成像可以是基于可见光的图像，而所述分析物图谱扫描获自荧光信号。
在多个实施方案中，将用于所选子区域180、182的多个第一和第二图像组合并使用在所选的对应图像集中测得并解析的基准点或比对标志物精确比对。此外，可在样品阵列/微粒成像和分析物检测扫描二者中将一组分离的比对标志物成像(或者使用不同的标志物、染料或标记，在不同波长进行第一组比对标志物的另外成像)。因此，可进行所述样品阵列图像和所述分析物扫描之间的比对，以将从与所选样品保留区124相关的分析物图谱142中测得的分泌物或释放的分析物108，与位于或排布于其中的相应的细胞/微粒106进行匹配或关联。
要理解的是，许多因素有助于各图像的总体质量和各图像中的特征/细节的可见度。诸如在光照条件、亮度、对比度和焦点上的差异等因素，可显著影响成像。通过以上述方式获得多个图像，要理解的是，所述图像的组合结果可有助于改进样品保留区124和包含在其中的细胞/微粒106二者的鉴定可靠性。此外，因特征(例如所述图像中的样品保留区轮廓/边界和细胞/微粒特征)一般较小的尺寸所致，具有多于一个图像和处于不同的分辨率可证明为非常有助于对样品阵列122及其中组件进行解析/成像。如将在下文中更详细地阐述，可作用为掩盖子区域180、182内的部分或整个特征或导致细胞/微粒106和/或分析物图谱142的对准不良的各种潜在的噪声和误差来源，可使用本公开内容的多个成像法减少或消除。这些方法可有助于以增加的准确性和改进的定量能力从样品阵列122解析或区分可用数据。
图1E描述与在图1D的步骤1100中所述的样品阵列122的子区域180、182的多个成像相关的过程的概述。高分辨率图像1150可包含微室/样品保留区124和相关或附近的第一比对标志物(在所述图表中通过示例性“A”命名)的一个或多个光场/亮视场图像1155。第二图像1160可同样包含对于样品保留区124和相关细胞/微粒106具有与高分辨率图像1155类似的视野的一个或多个光场图。可使用存在于样品阵列122上的比对标志物比对第一和第二图像，并在对应图像中进行鉴定，以提供将第一和第二图像1155/1165彼此相互定向的能力。
例如通过荧光成像或扫描1170获得的相应的分析物图谱142，包含分析物图谱142的一个或多个扫描1175。可针对存在于样品保留区124中的细胞/微粒106释放或分泌的独立测得的分析物108进一步解析所述分析物图谱。扫描1175可进一步包含通过在不同的所选波长成像或者使用两种或更多种检测模式获得的独立的可识别图谱、指纹、检测图谱或条形码142，以形成分析物图谱的集合，将其组合并进行评价以鉴定与细胞/微粒108相关、通过其释放或分泌的测得分析物108。
在多个实施方案中，获得与所述第一和/或第二图像对应的区域的第二成像1166，以鉴定一个或多个第二比对标志物。在多个实施方案中，在不同的波长或发射光谱对所述第二比对标志物获取所述第二成像，由此其可与所述一个或多个第一比对标志物容易地区分。例如，可获得所述第一和/或第二图像的对应区域的荧光成像或扫描，以区分在图中命名为“B”的离散的标志物集。使用所述图像和相关的比对标志物集，包含对应比对标志物“B”的所述微阵列扫描/分析物图谱(对应于分析物108的可识别图谱、指纹或条形码)，可用于比对或定向具有对应微阵列扫描/分析物图谱的所述第一和/或第二图像。总之，使用上述过程，可合意地将用于样品阵列122上的各部分的多个图像和扫描，对于具有对应分析物108的相关细胞/微粒106进行定向和比对，以使高质量表征和化合物分析成为可能。
在某些实施方案中，可获得与在相应的第一和第二图像中成像的所选子区域180、182相关的细胞/微粒106的一个或多个另外的成像1167。细胞成像过程1167可采用与所述比对标志物成像或分析物检测扫描类似或不同的波长或扫描配置。在多个实施方案中，可用荧光或发光染料、染色剂或其他鉴定手段标记多个细胞或微粒106，以解析样品阵列122的多个样品保留区109中的细胞/微粒106的位置或排布。该信息可进一步用于决定性地鉴定所选样品保留区108中的细胞/微粒106的存在和/或数量，并可进一步用于协助将所鉴定的细胞/微粒106与其对应的可识别分析物图谱142和对应的释放或分泌的分析物108进行关联。
在多个实施方案中，进行分析的细胞/微粒106的尺寸及其他特征可确定待获取用于后续检测和分析的图像的数量和或类型。例如，相对较大的细胞(例如THP-1细胞)可在没有染色和后续荧光成像的情况下成像。对于相对较小的细胞(例如CD4细胞)，可不需要荧光染色，而是在不同放大倍数获得多个光场图。对于其他小型细胞，可使用染色和荧光成像以及一个或多个光场图。对于混合的细胞群体和非常小的细胞，可使用表面标志物并用适当的成像参数检测以区分细胞类型和/或验证细胞的存在。
图1F图(a)描述包含多个样品保留区124的样品阵列122的所选子区域180的示例性高分辨率成像。在多个样品保留区124中进一步定位细胞/微粒106 (在展开图中进一步显示)。在样品保留区122周围进一步定位第一和第二位置/比对标志物1168、1171 (例如包含“A”和“B”的标志物集)，用于如上所述的图像比对。图1F图(b)描述包含相同的多个样品保留区124的样品阵列122的所选子区域180的示例性的对应的第二图像。细胞/微粒106以如在所述第一图像中所见的类似或相同的位置位于样品保留区124中。位置比对标志物1168在样品保留区122周围为可见的，用于如上所述的比对。图1F图(c)描述从荧光标记和成像得到的细胞/微粒106的另外的成像(图1E中的步骤1166)。可保存细胞/微粒相对于其他细胞/微粒的定位和方向，并与上文图(a)和(b)中对所述光场图获得的细胞/微粒比较。尽管细胞/微粒位置不一定需要固定或维持在单个位置，但是所述细胞/微粒位于其中的样品保留区122可限制细胞/微粒106的总体运动。
图1G图(a)描述显示与细胞/微粒106释放或分泌的测得分析物108相关的微阵列/分析物图谱的示例性信号和比对扫描。如上所述，可针对与排布或保留在多个保留区122中的细胞/微粒106相关的单个或独立的测得分析物108解析分析物谱图142。通过将所述分析物扫描和潜在的测得分析物图谱142与具有细胞/微粒106的样品保留区122的第一和/或第二图像进行关联，可认为单个细胞/微粒或细胞/微粒的集合以平行和多路的方式释放或分泌多个分析物108。
根据所述设备成像过程(图1E，状态1175)，可使用多个波长或成像/扫描模式检测分析物图谱142。例如，多个独立和差异标志或标记的分析物检测部分135，可排布于或共同占据分析物检测基底134的相同分析物检测区或区域136。不同的分析物108可选择性地与所述差异标记的分析物检测部分135结合或缔合，并基于与分析物检测部分135结合的标签或标记135进行分离地解析或检测。可基于与所述标签或标记相关的不同的发射信号/波长来确定共同位于相同分析物检测区136中的分析物108的分离地解析。另外，可在不同的波长或使用不同的过滤或光学设置来获得多个图像，以分离地解析这些区域中的分析物108。在某些实施方案中，可对相同的分析物检测区136获得独立成像，以基于分析物108存在和与分析物检测部分135结合的标签、标志物、染料或标记来生成不同的分析物图谱142。
图1G图(b)描述与分析物检测基底134相关的测得的第二比对标志物1171。第二比对标志物1171在所述设备成像过程中可以是可解析的，如前所述(图1E，状态1166)。图1G图(c)描述与样品阵列122相关的测得的第二比对标志物1171。第二比对标志物1171在所述设备成像过程中可以是可解析的，如前所述(图1E，状态1166)。根据多个实施方案，用于分析物检测基底134和样品阵列122的测得的比对标志物，可用于关联和定向样品阵列122的第一和/或第二图像(图1E，状态1168)。因此，这些成像和扫描之间的比对，提供将各分析物图谱142与在分析物检测区136中释放或分泌分析物106的特定细胞/微粒106进行关联的能力，如将在下文中更详细地阐述。
图1H描述具有保留了单个细胞/微粒106的样品保留区124的示例性样品阵列122的一部分的光场图(图a)。图1H进一步描述显示细胞106的对应荧光图像(图b)，其通过例如指出细胞/微粒106上的所选表面标志物的存在的染色来显示。图1H进一步描述具有与标志物135相对应的分析物图谱142的示例性分析物检测基底134的一部分的对应图像(图c)，所述标志物检测与细胞/微粒106相关的分析物108。图1H进一步描述合并多个图像(图d)以提供将各分析物图谱142与测得其分析物108的相关细胞/微粒106进行关联的机制。
再次参考图1D，根据详细分析工作流1000，将收集的样品阵列122和分析物检测基底134的多个子区域180、182的图像用于进一步的处理步骤。首先，在状态1200中，对各图像定位并解析样品阵列124的微室/样品保留区124。在某种程度上因样品保留区124的小特征尺寸以及与所述结构本身及所得图像相关的可能的人为产物和变形所致，需要进行所述多个图像和扫描的详细评价。这些过程有助于高质量分析并帮助准确确定与各细胞/微粒106相关的多种分析物。
根据多个实施方案，样品阵列122可配置有序模式或有序定位的样品保留区124。一个示例性模式可采用具有行和列的二维网格的形式，如在图1C中所述。为了帮助定向和确定样品保留区124和存在于其中的细胞/微粒106，可使用规则模式，其中跨越样品阵列122的各部分或片段，样品保留区124的尺寸一般彼此类似且通常几乎彼此相等。样品保留区124之间的偏移(offset)可同样配置，跨越样品阵列122的各部分或片段，一般彼此类似且通常几乎彼此等同。
样品保留区鉴定过程期间的主要操作为确定成像的样品保留区的相对位置或位点。所选样品保留区124的图像区或像素区随后可用于确定位于其中的细胞/微粒106的各自定位并与分析物图谱142比对。改进所述成像***的自动分析能力为增加总体分析通量的一个重要考虑。因此，需要增加或最大化可被检测的样品保留区122的数量或比例。
在多个实施方案中，样品保留区122的规则排序或模式一般提供一致或预期的尺寸和间隔，其有助于用于自动化分析。另外，所述相关的检测程序对于样品阵列122上的许多不同方向、尺寸、间隔和数量的样品保留124而言可以是可扩展或可配置的。根据具体测定或用户偏爱，所述***亦可配置用于分析不同的阵列构型。
所述成像和鉴定过程可进一步适应样品阵列122和相关样品保留区124中的不同缺陷和瑕疵。在某些实施方案中，样品阵列122可以这样的方式制备，其因制造和/或加工而导致可能存在多个瑕疵和/或缺陷。在一些情况下，样品保留区124可能略微在比对范围之外或者彼此相互偏轴或者批次之间或阵列之间具有变异。跨越样品阵列122在样品保留区尺寸和间隔上亦可存在微小变异。另外，各种人为产物和碎片可存在于所述样品阵列上或者与多个样品保留区124结合，其掩盖样品保留区轮廓或特征。另外，所述样品阵列和样品保留区的合成图像可包含缺陷，例如模糊的区域或者损坏/变形的样品保留区轮廓。
在图2中显示与步骤1200相关的用于微室/样品保留区124定位和解析的更详细的过程400。另外，图4以图示方式阐述了样品保留区鉴定的主要操作500。如在图4中所示，示例性样品保留区124可具有不同的缺陷512和人为产物514，其掩盖分析或使之混淆，且需要在自动图像分析期间得到解决。
可对样品阵列122的所选、所需或基本上所有成像进行过程400，例如使用在图1F(a)中显示的高分辨率光场图和/或在图1F (b)中显示的第二光场图。对于各输入图像(410)，其代表样品阵列122的所选子区域180、182，可应用噪声去除过程(415/515)。所述噪声去除过程可使用多种方法来鉴定所述图像中的噪声和人为产物，包括应用高斯(Gaussian)差分法。所述噪声去除处理的结果可排除低质量的样品保留区部分或者不能可信地从环境背景、噪声或人为产物中解析或区分的样品保留区部分，并且亦可用于消除或解决小缺陷和图像模糊。另外，包括成像灰尘在内的人为产物和碎片，可由从所述图像中去除和/或从进一步处理和图像分析中排除。人为产物去除可以这样的方式进行，其避免从所述图像排除细胞/微粒的高可能性。
在噪声去除(415/515)之后，可进行轮廓检测程序(420/520)以检测图像410中的多个样品保留区124的***、边界或边缘。样品保留区124的边缘、轮廓及其他基于形状的特征，可通过许多方法来确定，包括应用Canny边缘检测法。可评价样品保留区124的形态或特征，作为该过程的部分，以鉴定影响所选样品保留区124的各种变形，例如膨胀532和/或腐蚀534。如果不加以解决，这些变形可在后续操作中产生困难并可能导致不准确或错误的分析物分析。
上述过程的应用帮助鉴定并去除所述图像的可能未决的特征和组分，并且联合过滤过程(425/525)一起使用。排除受人为产物和噪声影响的样品保留区以及具有显著瑕疵或其他问题的样品保留区，留下经过滤样品保留区的子集542，其一般具有可在下游操作中容易分析的合乎需要的和/或可容许的特征。特定的过滤过程可包括通过应用不同标准来限制或排除小室。例如，可基于在轮廓长度、宽度、高度上的差异或偏差或者因为在所述保留室中观察到重叠来选控所选样品保留区。
要理解的是，排除受噪声、人为产物和其他问题影响的样品保留区，导致可能丢失与细胞/微粒106和测得分析物108相关的数据和信息。在某些情况下，用于分析的样品可能特别罕见或贵重，使用的分析物108和检测部分135可能很昂贵且需要及时的结果，这使得从给定分析或运行中获取与实际一样多的信息非常重要。
本公开内容对图像分析程序的显著改进为重获或填补程序(430/530)的应用。根据该方案，可使用样品保留区124之间的规则排序的模式来确定样品保留区124的预期或预测位置。例如，对于未在前述操作中定位或者在前述操作中被排除的样品保留区124，可确定邻近样品保留区124的相对位置。使用迭代过程，恰位于缺失区546之上和/或之下的现有/鉴定的样品保留区544可用于帮助鉴定缺失区546中的样品保留区的预期位置。可基于隔离邻接的鉴定样品保留区124的距离或间隔，进一步尝试重新建立或添加缺失的样品保留区546。轮廓描绘和重估尺寸操作亦可用于确定样品保留区124的近似或预期位置。总之，当成功应用这些操作时，可将缺失的样品保留区添加或构建到所述图像中。因此，应用这些过程提供从所述图像恢复或复原可能丢失或废弃的数据的能力。
遵循上述操作，可对所述多个图像中的鉴定/留下的样品保留区进行分选和整理(435/535)。在多个实施方案中，可相对于邻近样品保留区，对所选图像中的样品保留区124进行定向和/或分组。例如，垂直排列的样品保留区可以成列方式标记，并进行分选/分类以便于进一步分析。然后可输出所述图像中的测得、定位和/或鉴定的样品保留区124 (440)，完成所述过程(1200/400/500)。
除上述微室/样品保留区鉴定过程1200之外，可进行另外的操作1220、1240以鉴定和定位与分析物扫描和相应的细胞/微粒成像相关的相关比对特征或标志物。可对样品阵列122和分析物检测基底136的所选、所需或基本上所有成像进行所述过程。例如，可使用在图1G (c)中所示的与样品阵列122结合的测得的第二比对标志物1171的扫描，进行第一个比对特征鉴定过程1220。可使用在图1G (b)中所示的与分析物检测基底134结合的测得的第二比对标志物1171的扫描，进行相应的第二个比对特征鉴定过程1240。根据在图3中概述的步骤450和在图5中阐述的解读550，可进行代表样品阵列122的部分和分析物检测基底134的对应部分的扫描的比对特征的定位。
使用所选的输入图像/扫描(455、555)，首先可使用Canny边缘检测法和/或应用诸如Hough变换等线条检测法来检测比对特征轮廓、边缘或***(460、560)。在多个实施方案中，所述比对特征包括微小细节、尺寸和/或几何形状558，包括例如可协助可信确定和解析所述比对特征的位置的角、转角和轮廓。所述比对特征可进一步解析为一个或多个片段的组群，以协助确定可清楚鉴定的比对特征的部分以及未能清楚解析的部分。
在多个实施方案中，将清楚解析的比对部分或片段过滤和分组(465、565)。过滤操作可包括鉴定所选的预期或成像的角、确定所述片段的部分的方向和/位置，并合并类似或预期的部分/片段，同时去除或排除更不可信评价的比对部分。例如可根据角度和定位，对留下的片段/比对部分进行进一步鉴定、标记和/或排列(470/570)。一部分所述操作可基于方向或角度572来分类和/或标记片段部分，如在图5中所示。使用对所述比对标志物而言为已知或预期的方向，可填补或重建可能从所述图像/扫描缺失或不良解析的部分(475/575)。比对标志物之间的预期和实际间隔之间的比较，可用于重建缺失区或缺失片段。
使用所述实际的和重建的比对标志物，随后可例如在邻接片段之间进行额外的内插操作(480/580)，以获得分析物检测区、流动通道和细胞/微粒保留区的预期方向和定位。因此，将这些操作应用于分析物检测区和分析物图谱的各图像，利于确定细胞/微粒106和分析物检测部分134存在于其中的预期和实际的区域。
再次参考图1D，使用在步骤1200中确定的存在的样品保留区122，分析1000的后续阶段1300确定可能存在于样品保留区122中的可能的细胞/微粒106。细胞/微粒定位1300的操作解决与可发生在细胞/微粒之间的变异相关的问题，且利于从可能存在于相同样品保留区122中的其他细胞/微粒106鉴定/区分所需细胞/微粒106，以及从诸如灰尘或者可能与分析物释放或分泌不相关的颗粒等其他物质识别细胞/微粒。
在多个实施方案中，细胞在进行分析时可具有预期的形态、形状或大小。例如，可预期细胞为近似圆形和凸面的。类似地，微粒可具有已知的尺寸和均匀性。在成像期间，所述细胞的图像可具有预期特征，例如与通常较亮的内部部分相比具有通常较暗的轮廓或***部分。类似地，微粒可具有其他的预期特征，例如被均匀照亮或者显示不同的其他光学特性。因单个细胞的物理特征之间的变异所致，以高置信度鉴定细胞可特别具挑战性。例如，虽然细胞大小可变化，但可假设其处于所选的范围之内(例如在约5-20微米的范围内)，其中细胞形态保持相当一致且与大小无关。另外，在涉及少量或单个细胞/微粒的测定中，样品保留区124内的大多数空间可以是保持开放的，且细胞/微粒可位于样品保留区124内的各种不同的位置。
根据位置鉴定步骤1300，可确定所选的先前鉴定的微室/样品保留区124内的一个或多个细胞/微粒106的占位和位置(例如对应图像中的像素区)。这些过程合意地适应细胞-细胞变异以及在图像质量上的瑕疵和差异，且帮助提供精确且准确的检测。检测过程1300亦合意地配置为可扩展至具有不同物理特性和尺寸的不同细胞/微粒类型，同时能够处理与待分析的大量样品保留区124相关的大量独立鉴定。
图6A阐述用于细胞/微粒位置鉴定的示例性详细过程600。从状态610开始，可使用对多个样品保留区124获得的光场图。所述图像可包括在图1F (a)和1F (b)中描述的第一或第二光场图。细胞定位600可包括基于候选鉴定建立上下边界或梯度阈值(步骤615)，用以确定用于包含或排除细胞的标准。在多个实施方案中，可通过对所选小室/样品保留区124计算平均或中值图像强度梯度来确定阈值。然后，可使用统计学参数或计算来确定上下边界阈值，例如基于所述平均或中值图像强度梯度的所选标准差的数值或百分数来鉴定边界。然后可将所述图像强度梯度用于后续分析，以容易自动化的方式包含或排除候选细胞/微粒。
为了确定候选细胞/微粒可存在的可能位置660，鉴定一个或多个样品区框架(mask)或边界(状态620)。在图6B中的示例性显影650中描述，样品区边界框架655提供描绘待对细胞/微粒106进行研究或分析的区域658的便利工具。框架655可进一步用于枚举待考虑的小室或者颗粒保留区或区域，以及可应用逻辑流程，其中分别分析各个区域658 (连续地或平行地)，进行至处理完所有区域658为止。在状态625中，对通过边界框架655描绘的各区域658，可进行假定细胞/微粒鉴定662。鉴定662可基于所选择的标准，例如位于考虑中的区域658中的特征的大小/尺寸。这些标准可进一步匹配或符合预期位于区域658中的细胞/微粒106应符合的预期比例原则或标准。细胞/微粒鉴定可包括各区域658内的一个或多个特征，其描绘一个或多个可能的细胞/微粒鉴定。各假定细胞/微粒鉴定662可进一步包括进行梯度强度分析，其中基于上文所确定的建立的梯度阈值，可鉴定候选细胞/微粒106，如在下文中更详细地阐述。
为了改进细胞/微粒确定的准确性和/或为了在所需细胞/微粒106之间进行选择或甄别，进行特征模板比较(状态630)。图6C和6D描述对应于所述特征模板比较过程的示例性细胞模板匹配过程670、672。在多个实施方案中，可获得多个细胞/微粒模板图像674的集合或目录。所述目录可进一步用于与具有假定细胞/微粒的图像或区域进行比较。
在多个实施方案中，将从数据库中检索到的细胞模板674与对应于各样品保留区124的目标假定目标细胞/微粒的指定区/区域进行比较。可对细胞/微粒模板674和/或考虑中的所选区域676二者进行多个成像/解读678。图像674、676、678可通过多个操作标准化、缩放和/或平衡(例如将强度标准化为约0-1的范围)。在多个实施方案中，多个解读678可包括用于所述多个图像的多个强度梯度和/或放大倍数(例如代表在原始和/或模板图像的强度或放大倍数上的变化)。
应用定向梯度成像法，可确定在所述图像的强度上的所选择的或计算的变化。如所阐述的，对假定676和模板674图像描述了三个梯度图像。然后可将所述对应的三对图像各自进行相互比较(例如逐像素)，以确定假定676和模板674图像之间的相似性和差异。在多个实施方案中，计算跨越所述多个图像的总体强度差并确定假定区域676和模板674之间的相似性测定结果。该信息可与指定阈值联合用于包含或排除假定细胞/微粒鉴定以及进一步将所述鉴定归类为可能的/低准确性/假阳性鉴定682或者确定的/高准确性/匹配细胞鉴定684。以保留确定的/高准确性/匹配细胞鉴定661来完成状态630。
为了增加有用的细胞/微粒分析物分析的百分数，可在状态635中重新检验可能的/低准确性/假阳性鉴定682。例如，可对照前述标准考虑未指认为确定的但其排名靠前或很可能为候选细胞/微粒的假定鉴定，其中可将额外的细胞/微粒作为确定的/高准确性/匹配细胞鉴定661进行纳入或保留。
如在图6B中所示，可基于在上述过程中鉴定的细胞/微粒，对样品区框架或边界655和对应区域658进一步分类。例如，通过与所选区域658相关的细胞/微粒的数量，可将所述区域指认或标记为被进一步分析667排除在外(例如在单细胞实验或分析中含有多个细胞/微粒)。可将含有所需数量的细胞/微粒的其他区域658指认或标记为包含在进一步分析668中(例如在单细胞实验或分析中含有单个细胞/微粒)。另外，可对获得不确定结果的区域或小室(例如不能进行细胞/微粒的存在与否的明确鉴定)进行标记669。在多个实施方案中，不确定的小室或区域669可经历进一步处理或检验645。在一些情况下，可联合对样品阵列122获取的额外的图像/扫描来评价所述区域669，例如在图1F (c)中所述的荧光细胞染色/标志物图像。在一些情况下，以前述方式进行额外处理可改进细胞/微粒鉴定的置信度并“挽救”可保留用于进一步分析的相关区域。
在图6A中所述的细胞/微粒位置鉴定过程600随着在状态649中输出图像分类而完成。来自过程600的输出可包括涉及鉴定的细胞/微粒102的信息(例如在所述各样品保留区内的位置或定位、可信测定、细胞/微粒分类或鉴定等)。可额外输出关于鉴定的样品保留区122的进一步信息，包括涉及各区域中包含的细胞/微粒106的数量以及区域成像的整体质量。
图6E描述用于生成细胞/微粒模板文库、数据库或群体674的示例性过程，其结合鉴定的前述方法，用于与图6C和6D相关的比较。使用已知细胞/微粒的先前成像或扫描691，可鉴定一个或多个代表性的细胞/微粒图像692。在多个实施方案中，可将具有不同特征(例如不同的形态、大小、强度或其他特性)的细胞/微粒692的子集的鉴定与所选细胞/微粒106的类型或类别进行关联。使用从实验结果和分析中获得的数据和信息，可进一步优化(refine)和改进子集692以形成代表性细胞/微粒子集693。在多个实施方案中，通过应用考虑形态的类似性、实验质量、匹配率的置信度的标准及其他标准，自动化方法可选择代表性的细胞/微粒模板。可从不同的实验、文献描述和信息及其他来源收集多个代表性细胞/微粒子集693，随时间改进所述数据集。另外，在一些情况下，使用来自当前实验的图像和数据，可实时确定代表性细胞/微粒子集，在所述实验中，将所选细胞/微粒图像用作用于与其他细胞/微粒图像比较的模板或基础。在多个实施方案中，优先选择这样的代表性细胞/微粒图像，其与可能存在于样品保留区124中的其他假阳性或非所需细胞或微粒在外观上不同。
再次参考图1D，与样品阵列122的所选图像(例如，如对应于高分辨率和低分辨率图像的第一和第二图像)比对和定向与从分析物检测基底134的成像中获得的一个或多个扫描相关的分析物图谱142 (步骤1310、1320)。如前所述，将样品保留区124与分析物图谱142进行关联，提供确定存在于所选样品保留区124中的细胞/微粒108分泌、释放或与之相关的分析物108的能力。在多个实施方案中，例如在所述成像过程期间使用不同的光谱或光学特征，可获得分析物图谱142的多个成像。以此方式的多个成像，可用于解析相同分析物检测区136中的位置相同或多个使用的分析物检测部分135，其具有可独立鉴定和/或可光谱分离的标签或染料，提供从分析物检测基底134的特定区域区分多个分析物108的能力。
图7A描述用于比对上述图像和扫描的详细工作流。图7B进一步阐述使用基准点/比对标志物1168用于示例性图像和扫描的操作。根据多个实施方案，对应于例如高分辨率和低分辨率图像的样品保留区124的第一和第二图像，可具有不同的目标区域。所述成像装置(例如扫描光学显微镜)可基于不同的所选目标区域来获取多个子图像(例如约数十或数百个)。尽管可将这些图像平铺或相互比对，但所述过程可能是不完善的，并且高分辨率和低分辨率图像之间的结果可显著不同。
为了减少比对中的可能问题以及改进总体准确性，使比对标志物1168位于样品阵列122周围。在多个实施方案中，比对标志物1168可邻接或靠近所选样品保留区124出现，如前所述。可存在用于每列样品保留区124的比对标志物，或者其可排布在样品阵列122周围的多个其他位置。在多个实施方案中，比对标志物1168的数量和/或大小可以重复模式或者以所选顺序变化，进一步利于判断和比对所述图像和扫描。
在多个实施方案中，在某种程度上因目标区域的不一致性或变异所致，可合意地比对图像以允许将对应于测得分析物108的扫描与鉴定细胞/微粒106的相应图像进行精确匹配或比对。在一些情况下，例如因平铺不一致性以及样品阵列122和分析物检测基底134的小特征尺寸(例如样品保留区124/分析物检测区136)以及进一步包括与所述特征本身有关的可能变异、不一致性和问题所致，单次全局比对操作可能对于准确比对所有图像/扫描中的全部区域而言为不足够的。因此，常常需要提供使用比对标志物的子集局部比对各图像/扫描的区域的机制。
根据结合图7A阐述的方法，可容易地将第一(例如高分辨率)标准或光场图像与第二(例如低分辨率)标准或光场图像进行比对。在多个实施方案中，通过具有相似视野以及随所述分析物扫描减少比对复杂性而平铺的低分辨率图像来促进所述图像和扫描比对的过程。在步骤710中，可选择一个或多个第一(高)和第二(低)分辨率图像(对应于例如在图1F (a)和1F (b)中描述的图像)，作为进入标志物检测和比对过程700的输入。噪声去除操作(步骤715)改进图像质量并去除人为产物。可使用如高斯差分法以及其他噪声去除方法来完成所述过程。将输入图像细分(步骤720)，由此各图像包含一系列所选或所需数量的样品保留区124。例如，可进行图像细分，由此各子图像包含近似单列的样品保留区124 (例如介于10和100或其他所选数量之间)。
对于各子图像，可通过应用标志物轮廓检测法来鉴定比对标志物1168 (步骤725)。在多个实施方案中，可采用Canny边缘检测法。边缘检测可进一步包括对所述图像中包含的特征进行其他质量评价，例如所述比对标志物区的膨胀和腐蚀形态评价以及特征轮廓检测。图7B阐述包含多个比对标志物1168和相关样品保留区124的子图像区域755的示例性处理。可根据上述轮廓检测和大小选控操作转换原始图像755，以独立鉴定或定位多个比对标志物1168。在标志物轮廓检测法(步骤725)之后，可进行假标志物或错误标志物鉴定(步骤730)。为帮助确保将真实或充分解析的比对标志物用于后续比对操作，可基于多个标准来评价测得的标志物。例如，可评价所述比对标志物和样品分析物区的尺寸或定位以及与所述多个比对标志物相关的像素面积。可进一步评价代表不良解析的比对标志物的重叠轮廓。在上述多个比对标志物评价操作中，可将低质量和/或不良解析的比对标志物排除在进一步分析之外，从而合意地避免潜在的下游比对问题。在多个实施方案中，存在于各子图像中的比对标志物的数量合意地为过剩的或者超过可能用于图像/扫描比对的数量。所述过剩给所述比对过程提供更大的公差和灵活性。
除鉴定假阳性、低质量和/或不良解析的标志物之外，方法700还可包括用于鉴定缺失的比对标志物的预期位置或者提供填补操作以校正低质量和/或不良解析的标志物的过程(步骤735)。在这些过程之后，通过明暗处理、着色或其他方法来更清楚地鉴定留下的比对标志物1168，以助于确保在各子图像中清楚区分所述标志物(步骤740以及进一步阐述于图7B (c))。然后可输出所得的鉴定和处理的比对标志物1168及相关的子图像765，用于进一步处理(步骤745)。
参考图1D，如上所述，类似的操作1310、1320可用于与在高分辨率和低分辨率成像中获得的多个图像相关的各子图像755 (例如，图1F (a)和1F (b))，得到具有在各种情况下鉴定的高质量比对标志物1168的处理图像。然后，可将相应的第一(例如高分辨率)和第二(例如低分辨率)图像相互比对。
在图7C中显示用于第一和第二图像比对的示例性方法770，在图7D中显示用于所述比对过程的相应的示例性图解792。首先，接收具有用于对应的第一(例如高分辨率)和第二(例如低分辨率)图像的测得和验证的比对标志物的子图像，用于进行处理(步骤775)。如前所述，可将对应于相似或相同的目标区域的多个子图像合意地进行比对。选择待覆盖有/面向(oriented)对应的第二子图像的第一子图像进行子图像比对，其应用一个或多个偏移来协助所述比对过程(步骤780)。
各偏移可代表在定位各图像框上的移动，其具有使用例如通过反映偏移距离或位置的许多像素确定的偏移距离。对于各偏移，评价存在于各子图像中的测得比对标志物，以确定在各子图像之间重叠的比对标志物的数量。如将更详细地阐述，所述比对标志物之间的重叠的数量和程度，可用作确定子图像重叠的程度或质量的因素。对于所述多个所选择的或确定的子图像偏移，可鉴定具有最大像素/比对标志物重叠的图像偏移。
图7D阐述步骤780的多个偏移过程，其中使所选子图像793覆盖有/面向用另一个相关子图像794，分别达到对应于近似450像素、800像素、1200像素和1800像素的比对标志物重叠的独立偏移间隔(a)、(b)、(c)和(d)。使用对应于最大像素重叠的图像偏移(例如图7D中的(d))，对所述子图像中的样品保留区124分配或关联与所选偏移(步骤785)。然后可对另外的对应子图像重复该过程，直至完成跨越所述一个或多个第一和第二图像的基本上所有的对应子图像。过程770的输出提供用于比对各相应的第一和第二图像的各子图像中的相关样品保留区124的详情和值。然后可将所述经比对的图像用于下游处理并进一步与所述分析物图谱进行关联，如将在下文中更详细地阐述。
再次参考图1D，检测和解析位于样品阵列122的各样品保留区124中的细胞/微粒106分泌或释放的独立分析物108，需要关联和比对在分析物检测基底134上形成或与之相关的对应指纹、条形码或分析物图谱142。如在别处所述，跨越多个图像和扫描显影的小尺寸且大量的特征，使得提供用于相对于彼此定向和比对所述图像和扫描的高准确性手段很重要。比对失败可导致包含缺失和错误的分析物鉴定的低质量数据分析。本文所述的方法合意地避免所述问题并提供关联和评价所述图像和扫描的高准确性手段。
在多个实施方案中，有利地利用了可定位的基准点或比对标志物1168，鉴定和定位相互关联的图像和扫描。例如，与样品阵列122的样品保留区124结合、位于其周围或与之匹配的比对标志物1168 (例如在图1F (b)中测得的)，可与结合或位于分析物检测基底134的分析物检测区136周围的相应或其他的比对标志物1171 (例如在图1G (b)中测得的)联合使用。
要理解的是，样品阵列122和分析物检测基底134之间的精确和/或独特比对为合乎需要的。所述比对帮助确保微室/样品保留区124适当地匹配相应的流动通道/分析物检测区136。在这点上，多种类型、数量和/或定位的比对标志物1168、1171可帮助利于鉴定样品阵列122和分析物检测基底134的多个图像和扫描之间的最佳比对。
比对标志物1168、1171可进一步协助解析扫描和/或图像之间在比例上的变化或在成像特征上的差异。例如，旋转和/或平移差异可存在于所述图像和扫描之间，需要对其进行解释并校正以改进比对。为解决这些问题，准确的比对标志物检测为合乎需要的，且可用于精确比对所述多个成像。在比对标志物鉴定和解析期间可考虑数个变量，包括例如x和y平移或偏移、图像/扫描旋转角度差异以及图像/扫描比例因子。考虑这些因素，测得的比对标志物可用于以高准确性水平定向具有分析物检测区136的样品保留区124。图8A阐述用于关联和比对上文指出的特征的详细过程800。图8B提供在图8A中阐述的过程的图解850，用于具有对应的分析物检测区136的样品保留区124的示例性子图像部分。
在步骤805中，可收集并关联从分析物检测基底134和样品阵列122的对应扫描中测得的比对标志物。(例如图1F (2b)和1F (3b))。比对标志物可以多种方式放置在分析物检测基底134和样品阵列122的表面周围，以辅助以不同的方向定向，例如水平地、垂直地和/或对角地。例如，可从前述步骤获得比对标志物详情和比对信息，例如在分析物检测区定位和鉴定的分析期间生成的信息(例如图5)。在步骤810中，可使用所选的比对标志物(例如诊断标志物)确定所选样品保留区124的大致位置和方向。在步骤815中，可进行额外的操作以优化第一次确定的样品保留区124的定位和方向。使用一组或多组不同的比对标志物(例如水平标志物和/或垂直标志物)，可根据一个或多个操作进行样品保留区124的更精确定位和比例确定。然后可将样品保留区124的校正的位置和比对详情用于与相关分析物检测区136的定位进行比对。然后在状态820中输出所述各图像和扫描的比对结果。
图8B提供样品保留区124和分析物检测区136之间的比对850的图解。在图855中，对子图像描绘对应于分析物检测区136的测得流动通道，其可通过相关比对标志物856的定位来确定。在图860中，用比对标志物857描绘具有对应样品保留区124的子图像。从所述图像中可注意的是，所述两个图像的相对定位显示轻微的相互偏移。使用上述过程，可利用来自两个子图像855、860的比对标志物856、857来帮助提供所述两个子图像之间更精确的比对。因此，在子图像860定位和比对中，使用两组比对标志物856、857提供使在样品保留区124和分析物检测区136的交叉处形成的分析物图谱142显影的准确方法。基于排布于其中的分析物检测部分135的类型以及从与样品保留室124相关的一个或多个细胞/微粒中分泌或释放的测得分析物108的存在，将这些重叠区进一步对应于预期分析物108的信号存在于其中的位置。
再次参考图1D，在步骤1340中确定分析物检测区136的位置和定位。在多个实施方案中，用于分析物检测区136的位置信息可在某种程度上从先前分析、计算和评价中得到帮助。例如，可利用用于在步骤1220、1240中的比对特征鉴定的图像分析操作和信息来进一步鉴定相关的流动通道/分析物检测区136 (亦参见图3和5)。如在图5(f)中所示，基于流动通道/分析物检测区相对于比对特征/标志物的预期定位，可使用所述比对特征/标志物所处的位置和方向进一步鉴定与测得的比对特征/标志物相关的流动通道/分析物检测区136。
如在分析工作流1000中所示，步骤1400、1410和1420可用于进行用于细胞/微粒鉴定的额外操作。例如，在基于细胞的测定(例如单细胞测定和/或细胞-细胞相互作用测定)和相关分析物108分析中，可能需要进行额外的操作以在各种不同的细胞类型之间进行识别。另外，可能需要评价或确定对其检测分析物108的所选细胞106的生理或生化状态。根据多个实施方案，可检测一个或多个细胞表面标志物(例如对应于CD4+、CD8和/或CD3的表面标志物)和/或评价其他斑点或染色(例如有活力的斑点或染色)。
根据多个实施方案，通过检测表达的膜相关/分泌蛋白的一个或多个代表性细胞表面标志物或指示物，可鉴定、分选和/或区分所选的细胞群体和细胞特征。因此，可将保留在所选样品保留区124中的单细胞以及多细胞106暴露给除图谱142之外亦进行评价或者结合其评价的多个标志物、染料、染色剂和/或试剂，其来自分泌或释放的化学物质、生化物质或其他细胞相关组分。
在单细胞或少量细胞分析期间，上述鉴定和表征操作可进一步用于优化和/或确认所选微室或样品保留区124内的细胞位置和定位(步骤1400)。可使用获得的多个图像和扫描评价与在所述图像和扫描中可见的细胞相关的特征性光学特性或细胞特征来进行所述步骤。例如，可观察到的是，当用适当的染料和/或抗体对细胞进行标记、标示或染色时，可通过通常较高的荧光或信号强度来确定细胞位置。所述信号可进一步指出例如与所述细胞相关的一种或多种对应且可识别的表面标志物(例如CD4+、CD8和/或CD3)的存在，或者在活体染色或其他染色的情况下，指出另一些可识别的特征(例如活细胞/死细胞)。
对细胞表面标志物测得的荧光或高信号强度提供细胞定位的良好指示，预期所述细胞位于靠近或恰好位于与观测荧光或观测信号相同的区域。然而在一些情况下，表面标志物抗体、染料、染色剂或其他标志物可生成相对有噪声或弥散的信号，其可导致包含细胞106的样品保留区124内的相对高背景的区域。高背景或噪声可掩盖与样品保留区124相关的细胞/微粒106的显影或检测。可合意地鉴定、标记这些高背景样品保留区124和/或将其排除在进一步分析之外(步骤1410)。
另外，在不同样品保留区124中的细胞/微粒106之间，信号强度或荧光可表现出差异，每次试验之间不同和/或随使用的染色剂、标志物或染料的质量或特征变化。在一些情况下，存在这样的细胞/微粒106的群体，尽管其具有相应的表面标志物或者已使用所选的染色剂、标志物或染料标记，但仍未显示可检测的信号或者仅具有弱信号。此外，在其中相同类型或相同一般特征的两个或更多个细胞/微粒106紧密靠近或紧挨彼此存在的情况下，可观察到在区分所述荧光或信号的来源上的困难。对于细胞分泌、蛋白质表达和其他类型的生物分析而言，准确确定与各检测细胞相关的细胞类型和表面标志物或其他特征，可以是非常重要的。因此，可能需要基于与所述细胞相关的细胞表面标志物或其他信号特性，将潜在或候选的细胞鉴定标记为确定细胞或假阳性细胞(步骤1420)。
图9A描述用于细胞/微粒位置鉴定和识别的详细方法900。图9B进一步阐述定位和识别过程970，描述了样品保留区124的示例性子集，其具有用表面标志物985 (CD8 & CD3)标记以用于细胞表征和识别的细胞。过程900从接收对应于可使用染料、标志物或标记鉴定的细胞/微粒106的输入图像开始，所述染料、标志物或标记可例如通过荧光检测来显影(图1F(c))。如所论述的，所述标志物可包括同时或在不同时间成像/扫描的一种或多种细胞/微粒表面标志物，且通过本文所述的比对和定位机制来汇集其数据。在比对过程900中亦可采用另外的信息，其对应于鉴定的微室/样品保留区、确定的和潜在的候选细胞以及比对的微室/样品保留区信息。(例如，从结合图4、6和7阐述的过程400、600、700中分别获得的信息)
首先，在步骤910中，可确定平均背景信号或噪声比(例如鉴定因用于所述分析的染料、标志物或标记所致的背景荧光)。通过评价不含存在于其中的细胞/微粒106的一个或多个样品保留区124，可进一步确定所述平均背景信号。在多个实施方案中，可预期不含细胞/微粒106的样品保留区124显示较低背景或者反映存在于各样品保留区124各处的平均标称背景。
在步骤915中，将样品保留区或区域124与输入图像(例如图1F(c))进行关联。该过程915可进一步采用先前对第一和第二比对图像(例如图1F(a)、1F(b))确定的偏移信息。在步骤920中，确定微室或样品保留区框架以隔离或集中待评价的各区域。该过程920的一部分可包括鉴定其中细胞/微粒106被检出或预测的位置之外的区域中的平均像素强度或密度，以确定各样品保留区124内的背景。例如，通过排除测得的或可能的细胞区域、信号或强度，可对所选样品保留区124的部分鉴定平均像素强度。然后，可确定用于所选微室/样品保留区124的背景信号(例如荧光)。
在步骤925中，可评价样品保留区124，进一步鉴定靠近鉴定或预测的细胞/微粒位置的区域中的高信号强度。例如，可对一个或多个表面标志物或图像确定存在于细胞/微粒106周围或与之靠近的最高荧光信号。考虑上文鉴定的背景信号/强度信息和存在的细胞/微粒相关的最大信号，可以高准确度确定样品保留区124的各图像内的细胞/微粒106的相对位置。可将该信息与和相应样品保留区124中的细胞/微粒106相关的分析物图谱142的一个或多个扫描进一步关联。
在步骤930中，可评价细胞/微粒表面标志物强度，以确定和定量测得的标志物。在多个实施方案中，对于正在进行分析的各细胞，测得的或与所述细胞相关的一个或多个表面标志物的存在，可用于确定所述细胞的特征和/或状态。另外，对于其中基于上述测定和计算而存在高背景信号的情况，可标记相关的样品保留区124并将其排除在步骤935中的进一步分析之外。以此方式标记或排除样品保留区可辅助得到高质量结果和/或防止对所述样品数据的异常或错误解读。最后，在步骤940中，连同相关的细胞/微粒位置和包括表面标志物图谱或描述(如果存在)在内的鉴定特征一起，输出具有可接受背景的样品保留区以用于进一步处理。
图9B提供在图9A中阐述的过程的图示展示970，其中在示例性单细胞测定中，将CD3和CD8的表面标志物独立成像并比对。成像972反映对CD8表面标志物检测测得的信号。成像972中的一部分细胞106显示足以鉴定所述CD8标志物的存在的信号。在成像974中，相同样品保留区124的示例性光场图指出存在于成像972中的细胞和其他细胞106的存在。如所描述的通过复合成像978比较、叠加或合并与两个成像972、974相关的信号，可使用类似于前述比对标志物和过程的比对标志物和过程来完成。
类似地，成像976反映对CD3表面标志物检测测得的信号。成像976中的一部分细胞106显示足以鉴定所述CD8标志物的存在的信号。如所描述的通过复合成像980比较、叠加或合并与两个成像972、976相关的信号，可使用类似于前述比对标志物和过程的比对标志物和过程来完成。可进一步比较或叠加复合成像978和980，以提供组合了来自各前述画面的数据和信号信息的最终成像。总之，可确定细胞位置以及测得的细胞表面标志物985。差异检测的标志物(CD8、CD3)的存在显示对所述细胞而言不同的特征和/或表达图谱。该信息可进一步用于将所述细胞分类或分组，并在不同的细胞类型和/或状态之间进行识别。可相对于上文所述的测得的各分析物图谱142来进一步考虑所述分类和分组。
再次参考图1D，在对与样品阵列122的样品保留区124和分析物检测基底134的分析物检测区136相关的多个图像和扫描的定位和比对操作之后，可定位和鉴定与所选细胞/微粒106相关或由其所得的分析物图谱142来继续进行分析工作流1000 (步骤1430)。图10A提供用于分泌物读取确定的工作流1510的详情。另外的分泌物读取图解在图10B中提供。
在多个实施方案中，对应于通过细胞/微粒106表达、分泌或释放的一个或多个测得分析物108的所选分析物图谱142，包含一个或多个独立信号，其各自与位于分析物检测基底134的多个已知或预期的位置周围的各分析物相关。在分析物检测基底134的周围制造、放置和/或排布多个分析物检测部分135/分析物检测区136的方式，确定所得检测分析物108的方向和位置。
在多个实施方案中，两个或更多个分析物可能在几乎相同的位置或区域检出，但在不同的扫描中观察到。因此，可通过发出信号的类型和/或其出现的扫描或成像，逐个解析位置重合(positionally multiplexed)的分析物检测部分135。(例如，位置相同或位置重合的分析物检测部分可包含可分别检测和/或区分的独立标签或荧光基团)。
通过将所选样品保留区124与分析物检测部分135位于其中的分析物检测基底134上的一系列对应的一个或多个位置或区域136进行关联，可鉴定或“读取”用于所选细胞/微粒106的分析物图谱142。因此，通过评价用于所述细胞图像的一个或多个所选像素区域和其中以在下文中更详细阐述的方式发生叠加的分析物检测扫描，可确定得到检测分析物108的各细胞/微粒106的排布。可将在代表性信号/扫描图像中鉴定的信号强度值映射至所述成像区域中的独立像素和/或代表像素的指定数值，以便于鉴定和处理。在多个实施方案中，可对所选阈值的鉴定的信号强度取平均值，以获得可与测得分析物108进行关联的值。在多个实施方案中，使用两个或更多个区域的分析物检测/像素分析，可确定分析物108的更准确定量和/或所选分析物108的存在的确认。用于这些区域的扫描/成像提供在样品保留区124和分析物检测区136之间的两个或更多个区域或位置中的独立叠加。在多个实施方案中，可将对各相应的重叠区观察到的强度值进行比较和/或取平均值，以得到各测得分析物108的更高置信度鉴定。
如在图10A中所示，分析过程1510可从获得已与对应的微室或样品保留区124进行比对的测得流动通道或分析物检测区136开始。在多个实施方案中，对应于测得分析物108的子图像可用于鉴定其中检出一个或多个分析物的亮度区(参见例如图1G(a)和(b))。然后可将对应的流动通道或样品保留区124用于覆盖或合并所述分析物扫描，以定位重叠区。如上所述，可根据所述多个图像和扫描中的像素来确定重叠。然后可以成对的方式将重叠区或区域分配给对应的样品保留区124/分析物检测区136。
对于鉴定重叠的分配的区或区域，可从各位置提取相关的强度数据或信号信息(步骤1525)。可对来自所选区域的相关或对应信号进一步取平均数，以提供对应于测得分析物108的输出信号或读取。在某些情况下，可去除或标记低置信度或者异常数据或信号，如在下文中对图11更详细地阐述。在生成测得分析物108的最终分析物读取之前，对于有效性和/或置信度，可对与相同的成对细胞/微粒106和分析物108相关的重复或多余的信号强度进行进一步比较和/或取平均值。然后，可输出有效的测得分析物108、相关的强度及其他特征(步骤1530)。
图10B阐述了在图10A中所述的成像和像素比较过程的实例1550。如在子图像1555中所示，可使多个分析物检测区136 (鉴定为“蛋白质泳道”)与多个样品保留区124 (鉴定为“小室”)重叠。根据示例性子图像1555，分析物检测区136一般为垂直排布的，覆盖或面向一般水平排布的样品保留区124。进一步鉴定具有可观测信号强度的重叠区1557。子图像1560提供分析物“泳道”15和样品“小室”23之间的所选重叠区的放大视图。如通过重叠区1558所描述，可认定分析物读取区，指示检测分析物108的存在。子图像1570进一步阐述用于对应于相同细胞/微粒106和测得分析物108区的两个不同重叠区1572、1574的成对读取。如上所述，可独立评价这些区域，并对所述结果进行比较和/或取平均值。
图10C阐述在上文图10B中所述的成像和像素比较过程的又一个实例1551，显示与用于示例性样品保留区124的标志物图谱142相关的成对读取1552。可同时独立检测多个分析物(例如细胞因子) 108并从标志物图谱142中进行解析。如在图像画面(a)和(b)中所述，可使用例如不同波长或者以不同的图像采集特征来获得多个图像，以独立鉴定可能位置相同或位于相同的分析物检测区135周围的标志物135。可进一步叠加或合并以不同的图像采集特征获得的图像，如在画面(c)中所示。
再次参考图1D，在分析物/分泌物位置鉴定和分析之后，可进行背景信号评价和异常值检测分析(步骤1440)。图11描述用于选控、排除和/或标记可能低置信度、易错或异常的数据和信号的过程1610。如上文结合图10所述，多个扫描或图像(或其部分)可受高背景区域和噪声以及其他可能的人为产物影响，其可降低通过分析方法1000输出的信号数据和结果的质量。为帮助避免从所述分析输出错误和低质量的结果，可将多个质量检验或选控程序1620应用于从步骤1530获得的输出分析物鉴定、读取和相关的图像/扫描数据。可首先接收该数据用于质量评审(步骤1625)，其中应用了一个或多个质量检查1620。
示例性质量检验1630可包括基于像素信息来评价图像/扫描质量。可进行Grubb检验以在所述图像/扫描中排除或标记鉴定为可能异常值的像素。在多个实施方案中，可考虑对应于与分析物检测区136重叠的样品保留区124的部分的图像/扫描的像素数据(在图10B中举例说明)以及其他区域的像素数据。未通过Grubb检验的像素数据可充当指示物，这些区域中的相关图像/扫描数据为可疑的，并可排除或标记结果/读取以用于进一步评审。
另一个示例性质量检验1635可包括评价其中提取和评价强度信息的区域的像素面积或大小。大小阈值可用于与像素面积相关的图像/扫描数据和分析物结果/读取，排除或标记落入所选阈值之下或不符合所选阈值的像素面积以用于进一步评审。例如，分析物检测区136和相关样品保留区124之间不充分重叠可导致不足以准确确定或评价所述数据的像素信息。在具有如通过预选标准所确定的不充分重叠的区域中，可排除或标记所述结果/读取以用于进一步评审。
另一个示例性质量检验1640可包括评价图像/扫描数据以鉴定高间隙背景的区域。在多个实施方案中，在基本上邻接或靠近鉴定的分析物检测区136和/或样品保留区124的区域中评价图像/扫描(例如向上、向下、向左或向右)，可指出超出与所述分析物信号相关的阈值的一个或多个间隙区。所述结果可表明，相关的数据/读取表示假阳性结果。因此，可排除或标记所述结果/读取以用于进一步评审。
另一个示例性质量检验1645可考虑与所选样品保留室124相关的观察到的分析物结果。在多个实施方案中，可排除或标记未与用于所选分析物的至少一个可靠的分析物检测/读取关联的样品保留室，以用于进一步评审。在一些情况下，应从两个或更多个相关的分析物成像区中获得至少一个可靠读取。
在应用上述一个或多个不同的选控和质量评价检查之后，可认为所得的分析物数据/读取为有效的并将其输出(步骤1650)。要理解的是，应用多个质量评价合意地改进所述数据分析的总置信度和质量。因此，可应用额外的质量评价来进一步增进输出分析物数据/读取质量。
再次参考图1D，在排除高背景信号和相关的分析物数据之后，可定量在一个或多个分析物检测区136中测得的分析物108的信号来继续进行数据分析1000 (步骤1450)。图12A阐述示例性成像1610、1620，描述具有交叉的分析物检测区136的一部分所选样品保留区124。在图像画面1610中显示，鉴定了先前已确定缺乏包含或存在于其中的细胞/微粒106的样品保留区124 (鉴定为“无细胞小室”小室3、5、22)。与多个交叉的分析物检测区136(例如泳道15)相关的区域中的信号强度，可用于确定或表征背景信号强度。
例如，可在所选交叉区1630中评价与不含细胞/微粒106的一个或多个样品分析物区相关的信号强度，以确定相关的背景信号。在多个实施方案中，可对一个或多个分析物检测区136和/或对一个或多个样品保留区124确定背景信号。可通过组合、取平均值或其他方法进一步处理背景结果，以确定总体背景信号值，其将用于其他信号强度数据或独立用于位于靠近已确定背景信号的区域1630的样品保留区124的所选的或对应的信号强度数据。
如在图像面板1620中所示，对于先前已鉴定为含有至少一个细胞/微粒106的样品保留区(例如小室19、23)，随后可将背景信号强度用于所述信号强度数据相关的测得分析物108。在多个实施方案中，背景信号强度可用于评价与所选分析物检测区136相关的分析物信号/读取，以进一步表征所得的测得分析物信号。例如，如在图像面板1620中所示，可对各样品保留区124 (例如小室19、23)评价所选分析物检测区136 (例如泳道15)的信号强度并相对于背景进行表征。例如，可进行从相关信号强度中减去背景信号并将相应区域表征为高于背景(例如1640)或低于背景(例如1645)。以此方式的背景分析可进一步用于验证对应于所述减背景区的分析物108的存在与否。
图12B描述用于其中对多个样品(例如细胞106)评价多个分析物(例如细胞因子108)的实验的示例性散点图1700。分析结果显示为表现出相对于背景信号或背景阈值1720的分析物信号/读取的数字或百分数1710。纵轴1730提供在横轴1740上描述的所选细胞因子的相对强度值或单位。对各细胞因子独立确定背景阈值1720，并通过测得的高于阈值的分析物1750或低于阈值的分析物1760的存在来表征细胞。
以上述方式描述的分析物分泌或检测结果，提供对潜在大量的细胞同时评价所选分析物的总体表达、分泌或存在的便利方法。使用该信息，可基于单个细胞对细胞评价分析物存在和/或反应，同时允许共同表征潜在大量的细胞，揭示对所述细胞的行为、反应或特征的理解。因此，应用所公开的分析方法提供这样的实用手段，凭借所述手段同时评价从跨越大量细胞的相同细胞中分泌的包括生化物质、细胞因子和趋化因子在内的多个分析物，同时保持检测单细胞或细胞-细胞相互作用的分析物分泌的灵敏性和准确性。
图12C阐述用于具有相关标志物图谱/读取的样品保留区124的所选子集的合并图像的示例性成像结果1701，所述标志物图谱/读取从与包含在样品保留区124内的一个或多个细胞106相关的测得分析物108得到。如前所述显示成对的分析物检测结果并进一步与细胞数量1702和细胞类型1703进行关联。相对于含两个或更多个不同类型的细胞的样品保留区124的分析物结果来评价来自含单一细胞类型1703 (例如K-562和NK细胞)的各样品保留区124的测得分析物结果，可提供例如关于细胞-细胞相互作用以及在细胞分析物反应或细胞分泌物上的相关变化的信息和理解。另外，评价含两个或更多个相同类型细胞的样品保留区124的分析物结果，可提供例如关于细胞-细胞相互作用的信息和理解，并进一步用于与存在于所述小室中的细胞数量相关的定量分析物分析。
再次参考图1D，数据分析1000可包括用于评价独立细胞的群体以确定相关的分析物(例如细胞因子/趋化因子)反应和样品的功能表征的额外的操作和工具(步骤1460)。在多个实施方案中，可对根据所公开的方法获得的实验数据和结果进一步进行分析、比较和关联，提供用于发现、筛选、测定许多不同类型的细胞特征、反应和功能性的强大工具，例如涉及和关联免疫反应的细胞特征、反应和功能性。如在图13中所示，可利用用于展示和解读分析物数据和结果的多种方法和工具1800。例如，在单细胞实验中，可提供跨越一群细胞的多功能性的评价，作为来自所述数据分析的输出。可将从一个或多个实验获得的单细胞表达数据和信息进行关联，以鉴定多功能表达中的图谱和趋势(例如，从相同细胞中分泌多种效应蛋白/细胞因子的能力)。对应于对所选细胞因子的示例性多功能测定的分泌特征，在示例性饼形图1805、条形图1810和热点图1815中描述。可进行另外的关联，例如，比较来自多个样品的细胞类型并将测得分析物与已知或已确立的参数进行比较，以确定分析物表达或分泌特征、生理相关性、疾病状态和/或治疗响应。
再次参考图1D，数据分析1000可包括利于将实验分析物反应结果与其他信息进行比较和/或关联的额外的操作和工具，例如通过与现有文献/出版物/数据集的数据库比较(步骤1470)。图14A描述包含可用于评价单细胞实验结果的信息的数据库界面1850，提供用于推论确定和发现的工具。
数据库1850例如可包含来自先前实验以及文献/已发布数据的单细胞分泌/分析物表达信息。示例性实验过滤器1855、出版物过滤器1860和数据过滤器1865给用户提供聚焦于可用于查询储存的实验数据和出版物信息的所需或相关信息的能力。实验过滤器1855例如可允许基于特定的或所选的信息来源、疾病/病况、受试者类型、细胞类型和/或技术(用于样品分析，例如流式细胞术、酶联免疫斑点(ELISPOT)、本文所述技术等)来选择或检索数据/信息。出版物过滤器1860例如可允许基于特定或所选的目标区域、科学分类、作者、出版年限和/或关键词来选择或检索相关的文献/信息。数据过滤器1865例如可允许基于特定的或所选的细胞因子或其他目标分析物来选择数据/信息/文献。数据过滤器1865可进一步提供用于基于数据检索在细胞因子/分析物分泌特征或值之间进行比较以及基于多功能细胞因子/分析物反应进行选择的功能性。可选择多个指标来自动比较总体细胞因子/分析物分泌和/或多功能特征的相似性。为进一步利于用户与所述数据库工具的交互，多个过滤器可自动装有检索和数据选择标准。结合任何用户选择的过滤器，可进行关于目录数据集与用户当前数据集的相关性或相似性的总体确定。在多个实施方案中，当不能确定最终相关性时，提供一小组相关的过往实验/数据集可帮助引导或协助用户确定可有益地运行何种后续检验、可如何相对于其他处理来进行处理等。
图14B描述用于展示来自所选单细胞实验的信息的示例性结果界面1875。通过方便链接到出版物和相关数据，可更详细地选择和检验结果和有关的相关数据集1880。可基于例如其与实验或所需细胞特征的相似性的结果1880，进一步得到分数或排序1885，提供所述文献/出版物与获得的/实验细胞反应数据之间的详情和相关性。
图14C描述用于上述数据分析功能性和数据库的总体工作流1900，以提供在免疫学表征分析的情况下表征单细胞的能力。利用本文所公开的***和方法的通量、灵敏性和准确性，使单细胞、细胞群体和多组或多类型细胞的功能表征成为可能，提供额外的数据汇集、证据评价和推论确定功能性以评价实验结果。
在多个实施方案中，以及如在图14D中所示，上述以及在相关附图中描述的方法和过程，可使用平台1950来实施，其包含用于图像采集的组件，进一步包含用于图像分析和后续分析物评价的计算组件。平台1950可进一步包含集成***，例如能够进行输出所需分析物结果和相关数据的各功能的单个装置或仪器。同样，平台1950可包含用于进行多个所需功能性的多个仪器和计算组件的独立或单独的组件。
在多个实施方案中，通过获取多个图像/扫描的成像装置1952来处理样品阵列122和相关的分析物检测基底134。成像装置1952可包含一个或多个成像装置，包括例如显微镜、荧光检测器、微阵列扫描仪和/或其他光学和信号检测装置。可配置包含例如具有合适的图像处理和数据分析软件的计算装置的图像处理器1953，以接收信号信息、图像、扫描和与所述成像处理相关的其他数据。图像处理器1953可进一步评价和分析所述信息，确定或关联导致所显示的信号的分析物，同时确定与测得分析物相关的对应细胞/微粒。
图像处理器1953例如可确定通过成像装置1952测得的细胞因子信号和测得的单细胞小室/微孔之间的对应性，并将所述细胞因子信号与一个或多个特定细胞进一步关联，逐细胞生成用于单个细胞的分泌蛋白的特征。图像处理器1953可进一步定量测得分析物并将该信息与测得的细胞/微粒进行关联。图像处理器1953可进一步进行额外的分析，其跨越每个细胞/微粒的一个或多个分析物，针对多个测得细胞/微粒关联测得分析物。所述图像处理器可进一步确定细胞/微粒功能反应和特征，并利用包含在一个或多个数据储存库1954中的信息进行进一步关联、确定结果数据并与现有信息/文献进行比较，如上所述。
可采用使用标准编程技术的计算机程序的软件来实施所述成像和分析方法。可在各自包含电子处理器、数据储存***(包括记忆和/或储存元件)、至少一个输入装置和至少一个输出装置(例如显示器或打印机)的可编程计算机上执行所述程序。
在一些实施方案中，应用代码来获得和分析图像和扫描数据(例如用于样品保留区124、分析物检测区136和相关的细胞/微粒106和分析物图谱142的图像和扫描)、执行本文所述的功能和生成输出信息(例如评价/定量分析物、多功能性确定和相关的关联/推论)，其可用于一个或多个输出装置。所述计算机程序各自可以高级程序或面向对象编程语言或者汇编语言或机器语言执行。此外，所述语言可以是编译型或解释型语言。各所述计算机程序可储存在计算机可读的储存介质上(例如CD ROM或软磁盘)，当被计算机读取时，可导致所述计算机中的处理器执行本文所述的分析。
本公开内容的***和方法的速度、准确性和通量能力，对于在单细胞测定以及单细胞之间的细胞信号转导测定水平的细胞群体分析而言为有用的。具体而言，本教导可有利地应用于细胞群体分析，以在诸如免疫细胞(例如B细胞、T细胞、巨噬细胞和其他免疫细胞类型)等高度多能细胞类别之间进行甄别。免疫细胞与通过细胞分泌许多细胞因子相关，且对于单个细胞，常常在细胞因子分泌特征之间表现出显著差异。应用本文所公开的教导，临床医生和研究人员能够以灵敏且可重现的方式分析细胞和蛋白质分泌特征。可对一个或多个患者或样品同时分析单细胞细胞因子分泌特征(例如分析物读取)，并相对于免疫细胞细胞因子反应的数据库进行评价，以评价免疫功能性、免疫调节和毒性。如前所述，所述***提供用于处理多个细胞图像、分析物检测扫描以及查询信息数据库的高自动化程度，以使所述单细胞功能分析自动化。
T细胞亚群的组成(基于例如CD4/CD8比率)及其相关的效应物/细胞因子分泌特征，可与临床结果和/或治疗反应相关。其中所述分析可以是有用的实例包括但不限于对患有人类获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的患者的免疫细胞反应，以及对抗病原体感染的适应性免疫保护反应。
在多个情况下，所述相同或类似的细胞类型(例如CD4或CD8细胞)可包含具有动态和进展的功能表型的高度异质群体。通过其免疫效应功能(例如细胞因子分泌特征)，可合意地在单细胞水平将所述细胞分类。免疫反应的效力和持续性可进一步与多能性相关，并因此需要分析来自相同细胞的多个免疫效应蛋白。考虑到细胞因子分泌的性质，所述免疫保护程度可与同时分泌不同细胞因子的多能免疫细胞(例如T细胞)的频率以及细胞因子分泌的质量和/或数量二者相关。
免疫细胞不仅显示独特且不同的免疫分泌特征，亦影响其存在的微环境的活动。诸如肿瘤坏死因子(TNF)等细胞因子通过免疫细胞产生，并且一经引入癌症环境中，便可改进T细胞初免的功效并诱导适应性抗肿瘤免疫。相反，其他细胞因子与不良的患者结果相关，且报道为促进肿瘤生长并抑制抗肿瘤免疫反应。例如，白介素6 (IL-6)、血管内皮生长因子(VEGF)或巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的不均衡产生，通过阻抑树突细胞成熟和激活调节性T细胞(Treg)以辅助肿瘤细胞逃避免疫监视，来抑制适应性抗肿瘤免疫。在许多病理条件下大量表达的转化生长因子β (TGF-β)，严重影响肿瘤生长和维持，因为所述生长因子在形成肿瘤微环境和促进血管发生上起重要作用。应用本公开内容的教导，跨越多个细胞和细胞群体/样品，可在单细胞水平进行前述免疫细胞因子反应物的准确测定。可对单个细胞或细胞集合的细胞因子进一步评价分泌特征，并与现有信息和文献值进行比较，以产生可操作的患者免疫特征和/或提供对抗癌症的免疫反应和功能激活的指示物或相关物。
在其他应用中，可基于具有与发病机制相关的多个分泌特征的细胞因子分泌，评价诸如恶性血液病细胞或实体瘤细胞等患病细胞的多功能性。可分析的细胞因子可包括例如CCl-11、GM-CSF、粒酶B、IFN-γ、IL-10、IL-12、IL-13、IL-17A、IL-17F、IL-18、IL-1β、IL-2、IL-21、IL-22、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IP-10、MCP-1、MCP-4、MIP-1α、MIP-1β、穿孔蛋白、RANTES、sCD137、sCD40L、TGF- β1、TNF-α、TNF-β。另外，本公开内容的***和方法可合意地应用于多个临床应用，其中在例如细胞免疫和肿瘤学工具领域中跨越广谱或大量单细胞表征效应物功能，有利于准确的诊断或治疗评价。
尽管结合本文所示的示例性实施方案阐述本公开内容的要素，但本公开内容的要素不限于所述实施方案，且包括其任何修改、变动或排列。另外，提供上述实例以给本领域普通技术人员提供如何制造和使用本公开内容的装置、***和方法的实施方案的完整公开内容和描述，且不意图其限制本发明人视为其公开内容的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的用于实施本公开内容的上述模式的修改，意图其在下列权利要求的范围之内。在本说明书中提及的所有专利和出版物，均体现本公开内容所属领域的技术人员的水平。
本文使用的术语仅以描述具体实施方案为目的，且不意图其为限制。除非文段另有明确指示，否则如在本说明书和随附权利要求中所使用的单数形式“a”、“an”和“the”可包括复数所指。除非文段另有明确指示，否则术语“多个的”包括两个或更多个所指。描述了本公开内容的大量实施方案。然而，要理解的是，在不背离本公开内容的精神和范围的情况下，可进行各种修改。因此，其他实施方案亦在下列权利要求的范围之内。
Claims (20)
1.一种用于分离地解析与细胞群体相关的分析物的***，其包括：
多个样品保留区，其接收从一群细胞中分布的至少一个细胞并保留所述至少一个细胞释放的相关的多个分析物；
与多个分离地放置的分析物检测部分匹配的多个分析物检测区，所述分析物检测区以与所述样品保留区匹配的有序模式排布，借此，在耦合时，释放的分析物选择性地与所述多个分析物检测部分结合，形成各分析物检测区的分析物图谱；
排布在所述多个样品保留区周围的多个第一比对标志物，和排布在所述多个分析物检测区周围的多个第二比对标志物；
成像仪，其对所选样品保留区以及保留的至少一个细胞和另外至少一个第一比对标志物生成多个图像，所述成像仪进一步对与所选样品区对应的分析物检测区及相关的分析物图谱和另外至少一个第二比对标志物生成多个图像；和
图像处理器，其使用至少一个第一比对标志物来比对所选样品保留区的相关图像，并使用至少一个第二比对标志物，将分析物检测区的图像与所选样品保留区的相应图像进一步比对，所述图像处理器进一步在各样品保留区和相应的分析物图谱中鉴定保留的至少一个细胞，以基于在所述分析物图谱中测得的分析物检测部分，分离地解析与所述保留的至少一个细胞相关的释放的分析物。
2.权利要求1的***，其中所述图像处理器进一步评价所述样品保留区图像，以确定相关样品保留区的图像特征。
3.权利要求2的***，其中所述图像处理器基于所述样品保留区的图像特征来选控分析物和细胞关联的解析。
4.权利要求1的***，其中所述图像处理器进一步评价所述样品保留区图像，以确定所述保留的至少一个细胞的图像特征。
5.权利要求4的***，其中所述***进一步包含含有通过所述图像处理器评价的多个细胞图像的细胞模板数据库，以通过与所述多个细胞图像比较图像特征来鉴定所述保留的至少一个细胞。
6.权利要求5的***，其中所述图像处理器基于与所述细胞模板数据库的至少一个细胞图像的图像特征相似性来鉴定所述保留的至少一个细胞。
7.权利要求1的***，其中用鉴定所述多个图像的至少一个中的至少一个表面标志物的存在的至少一种染色剂或染料标记的所述至少一个细胞，被所述图像处理器用于细胞鉴定。
8.权利要求7的***，其中在所述多个图像的至少一个中测得的所述至少一种染色剂或染料，将细胞鉴定为活的或死的，或者突显细胞的代谢过程。
9.权利要求7的***，其中所述图像处理器使用在所述多个图像的至少一个中测得的所述至少一种染色剂或染料来在不同类型的细胞之间进行甄别。
10.权利要求1的***，其中通过所述图像处理器评价与所选择的至少一个细胞相关的所述分析物图谱的至少两个或更多个独立区域来解析所选择的至少一个细胞的释放的分析物。
11.权利要求1的***，其中对于至少一个所选择的样品保留区不含相应的保留细胞的图像，所述图像处理器进一步进行背景强度确定。
12.权利要求11的***，其中所述图像处理器将确定的背景强度与待评价的所选至少一个细胞相关的分析物图谱的区域相关的强度进行比较，以解析所选择的至少一个细胞的释放的分析物。
13.权利要求1的***，其中所述图像处理器进一步鉴定保留单细胞的样品保留室并比较所述单细胞的分离地解析的释放分析物，以反映所述细胞群体的测得分析物的分布。
14.权利要求13的***，其中所述细胞群体的测得分析物的分布表征来自所述细胞群体的单细胞释放多个分析物的多功能性能力。
15.权利要求13的***，其进一步包含分析物反应数据库，所述数据库包括用于与所选分析物相关的患者、治疗或疾病反应的分析物特征，其中所述图像处理器将所述细胞群体的测得分析物的分布与所述分析物反应数据库进行比较，以将在所述细胞群体中测得的释放分析物与所述分析物反应数据库中的分析物特征进行关联。
16.权利要求1的***，其中所述分析物选自生物分子、有机分子、无机分子、核酸、肽、蛋白质、抗体、细胞因子、趋化因子和离子。
17. 权利要求1的***，其中所述分析物包括通过来自所述细胞群体的所述至少一个细胞分泌的细胞因子或蛋白质，且选自CCl-11、GM-CSF、粒酶B、IFN-γ、IL-10、IL-12、IL-13、IL-17A、IL-17F、IL-18、IL-1β、IL-2、IL-21、IL-22、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IP-10、MCP-1、MCP-4、MIP-1α、MIP-1β、穿孔蛋白、RANTES、sCD137、sCD40L、TGF- β1、TNF-α和TNF-β。
18.权利要求1的***，其中所述细胞选自B细胞、T细胞、CD4+细胞、CD8+细胞、巨噬细胞、树突细胞、上皮细胞、脑细胞、肿瘤细胞、恶性细胞和患病细胞。
19.一种用于分离地解析与细胞群体相关的分析物的方法，其包括：
获取多个样品保留区的多个图像，所述样品保留区接收从一群细胞中分布的至少一个细胞并保留所述至少一个细胞释放的相关的多个分析物；
获取与多个分离地放置的分析物检测部分匹配的多个分析物检测区的多个图像，所述分析物检测区以与所述样品保留区匹配的有序模式排布，借此，在耦合时，释放的分析物选择性地与所述多个分析物检测部分结合，形成各分析物检测区的分析物图谱；
解析排布在所述多个样品保留区周围的多个第一比对标志物；
解析排布在所述多个分析物检测区周围的多个第二比对标志物；
使用至少一个所述多个第一比对标志物来比对所选样品保留区的相关图像，并使用至少一个所述多个第二比对标志物，将分析物检测区的图像与所选样品保留区的相应图像进一步比对；和
在各样品保留区和相应的分析物图谱中鉴定保留的至少一个细胞，以基于在所述分析物图谱中测得的分析物检测部分，分离地解析与所述保留的至少一个细胞相关的释放的分析物。
20.一种或多种永久性计算机可读介质，其具有储存于其上的计算机可执行代码，用于分离地解析与细胞群体相关的分析物，所述代码包括：
用于获取多个样品保留区的多个图像的可执行程序，所述样品保留区接收从一群细胞中分布的至少一个细胞并保留所述至少一个细胞释放的相关的多个分析物；
用于获取与多个独立放置的分析物检测部分匹配的多个分析物检测区的多个图像的可执行程序，所述分析物检测区以与所述样品保留区匹配的有序模式排布，借此，在耦合时，释放的分析物选择性地与所述多个分析物检测部分结合，形成各分析物检测区的分析物图谱；
用于解析排布在所述多个样品保留区周围的多个第一比对标志物的可执行程序；
用于解析排布在所述多个分析物检测区周围的多个第二比对标志物的可执行程序；
用于以下的可执行程序，其使用至少一个所述多个第一比对标志物来比对所选样品保留区的相关图像，并使用至少一个所述多个第二比对标志物，将分析物检测区的图像与所选样品保留区的相应图像进一步比对；和
用于以下的可执行程序，其在各样品保留区和相应的分析物图谱中鉴定保留的至少一个细胞，以基于在所述分析物图谱中测得的分析物检测部分，分离地解析与所述保留的至少一个细胞相关的释放的分析物。
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