CN110669816A - 基于交变滞惯力打印的单细胞水平相互作用模型构建方法 - Google Patents

基于交变滞惯力打印的单细胞水平相互作用模型构建方法 Download PDF

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CN110669816A CN201911028487.3A CN201911028487A CN110669816A CN 110669816 A CN110669816 A CN 110669816A CN 201911028487 A CN201911028487 A CN 201911028487A CN 110669816 A CN110669816 A CN 110669816A
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Shangpu (beijing) Biotechnology Co Ltd
Tsinghua University
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Abstract

本申请实施例公开了基于交变滞惯力打印的单细胞水平相互作用模型构建方法。所述构建方法，包括：使用基于交变滞惯力的微滴喷射，自细胞悬液中获取一份单细胞液滴，每份单细胞液滴只包含一个单个细胞；对所述单细胞液滴中的所述单个细胞进行筛选；如果筛选合格，根据单细胞模型中的设定坐标，将所述单个细胞加入所述单细胞模型。本申请基于交变滞惯力的微滴喷射技术，可以获得含有单细胞的液滴并构建单细胞模型。

Description

基于交变滞惯力打印的单细胞水平相互作用模型构建方法
技术领域
本申请涉及生物技术领域，特别涉及基于交变滞惯力打印的单细胞水平相互作用模型构建方法。
背景技术
细胞模型是目前进行生物学研究和药物检测的主要工具，在揭示疾病发生、细胞相互作用机理和药物毒性等方面均起到了推进作用。细胞模型具有可控性强、变量单一的优点，可以保持细胞的体内形态，便于进行细胞抗药性等研究。利用大量细胞构建的细胞模型进行试验，所获得的平均结果会掩盖个体细胞的效果，或忽略特定细胞亚群的独特性。例如，肿瘤细胞基因组稳定性低，在增殖过程中易产生大量突变和亚型，使得亚群存在着药物敏感性和治疗效果的差异。同时，肿瘤细胞诱导基质细胞形成的复杂的肿瘤微环境，这也进一步阻止了药物的渗透和对肿瘤的杀伤。因此需要一种构建含有较少量细胞的细胞模型的方法。
发明内容
本申请实施例之一提供一种在单细胞水平观测细胞相互作用的方法。所述方法包括：使用基于交变滞惯力的微滴喷射，获取至少两份单细胞液滴，每份单细胞液滴只包含单个细胞；将所述至少两份单细胞液滴置于基底液体中，获得包含至少两个所述单个细胞的融合液滴；基于所述融合液滴，观测至少两个所述单个细胞之间的相互作用。
本申请实施例之一提供一种单细胞可控组装方法，包括：使用基于交变滞惯力的微滴喷射，自细胞悬液中获取一份单细胞液滴，每份单细胞液滴只包含单个细胞；对所述单细胞液滴中的所述单个细胞进行筛选；如果筛选合格，根据单细胞组装体系中的设定坐标，将所述单个细胞加入所述单细胞组装体系。
本申请实施例之一提供一种构建单细胞模型的方法，包括：使用基于交变滞惯力的微滴喷射，自细胞悬液中获取一份单细胞液滴，每份单细胞液滴只包含单个细胞；对所述单细胞液滴中的所述单个细胞进行筛选；如果筛选合格，根据单细胞组装体系中的设定坐标，将所述单个细胞加入所述单细胞组装体系。
附图说明
本申请将以示例性实施例的方式进一步说明，这些示例性实施例将通过附图进行详细描述。这些实施例并非限制性的，在这些实施例中，相同的编号表示相同的结构，其中：
图1是根据本申请一些实施例所示的在单细胞水平观测细胞相互作用的方法的示例性流程图；
图2是根据本申请一些实施例所示的构建单细胞模型的方法的示例性流程图；
图3是根据本申请一些实施例所示的单细胞模型示意图；
图4是根据本申请一些实施例所示的两种细胞相互作用动态显微观测图；
图5是根据本申请一些实施例所示的T细胞运动路径示意图；
图6是根据本申请一些实施例所示的三种细胞项目作用动态显微观测图；以及
图7是根据本申请一些实施例所示的细胞作用距离对两者相互作用影响的统计柱状图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些示例或实施例，对于本领域的普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图将本申请应用于其它类似情景。除非从语言环境中显而易见或另做说明，图中相同标号代表相同结构或操作。
如本申请和权利要求书中所示，除非上下文明确提示例外情形，“一”、“一个”、“一种”和/或“该”等词并非特指单数，也可包括复数。一般说来，术语“包括”与“包含”仅提示包括已明确标识的步骤和元素，而这些步骤和元素不构成一个排它性的罗列，方法或者设备也可能包含其它的步骤或元素。
本申请中使用了流程图用来说明根据本申请的实施例的方法所执行的操作。应当理解的是，前面或后面操作不一定按照顺序来精确地执行。相反，可以按照倒序或同时处理各个步骤。同时，也可以将其他操作添加到这些过程中，或从这些过程移除某一步或数步操作。
本申请的实施例可以应用于各个种类的单细胞的分离、转移、以及独立体系的构建。本申请可以基于交变滞惯力技术将单细胞分离、转移以及可控组装，从而构建独立的作用单元。本申请所建立的作用单元或单细胞模型可以用于多方面的观测或试验，其中包括但不限于：观测同一种类或不同种类单细胞之间的相互作用；细胞功能的验证；靶向筛选；不同刺激因子对细胞的影响等。
图1是根据本申请一些实施例所示的在单细胞水平观测细胞相互作用的方法的示例性流程图。
如图1所示，该在单细胞水平观测细胞相互作用的方法100可以包括以下步骤：
步骤110，使用基于交变滞惯力的微滴喷射，获取至少两份单细胞液滴，每份单细胞液滴只包含单个细胞。
基于交变滞惯力的微滴喷射技术是指利用细胞悬浮液的粘滞力和惯性力交替地作为动力即利用交变滞惯力的作用来实现细胞悬浮液的吸取、聚齐和喷射。该微滴喷射技术无论是在细胞悬浮液的吸取或喷射的过程中均无瞬间高温或瞬间强静电场产生，对细胞的损伤较小，细胞的存活率较高。
具体的，利用交变滞惯力进行细胞吸取的原理如下：微喷管在微位移往复运动机构(Micro Displacement Oscillating Mechanism，μ-DOM)的驱动下做往复运动，首先，当微喷管向负方向运动时，细胞盛放容器内的细胞悬浮液与微喷管外壁之间的粘滞力作为动力驱动细胞悬浮液向负方向运动，而细胞悬浮液的惯性力作为阻力阻碍细胞悬浮液向负方向运动。然后，当微喷管向正方向运动时，细胞悬浮液的惯性力作为动力驱动细胞盛放容器内的细胞悬浮液继续向负方向运动，而细胞悬浮液与微喷管的外壁之间的粘滞力作为阻力阻碍细胞悬浮液向负方向运动。此时如果通过控制微喷管运动的加速度和加速时间，实现当微喷管向负方向运动时作为阻力的细胞悬浮液的惯性力较小，而当微喷管向正方向运动时作为动力的细胞悬浮液的惯性力较大，那么在一个运动周期内，细胞悬浮液相对于微喷管产生一段沿负方向的位移，微喷管外的细胞悬浮液就被吸入微喷管内并从微喷管中喷射出。通过调节细胞悬浮液的细胞密度以及微滴喷射技术中的一些参数，可以制备包含单个细胞的微滴。
在一些实施例中，基于交变滞惯力的微滴喷射技术中所设定的参数包括：喷头口径可以为35-70微米，振动幅值可以为30-60微米，振动频率可以为200-2000Hz。例如，喷头口径可以为40微米，振动幅值可以为60微米，振动频率为600Hz。在一些实施例中，所述细胞悬浮液的细胞密度可以为1-15×105个/毫升。例如，所述细胞悬浮液的细胞密度可以为5×105个/毫升。具体的细胞悬浮液的制备过程详见图2的相关说明。
在一些实施例中，基于交变滞惯力的微滴喷射技术所喷射出的液滴体积可以为1-100pL。由于喷射液滴体积较小，提高了获取仅含有单细胞液滴的概率。同时，基于喷射液滴构建的多细胞体系，可以使得多个单细胞处于有限的空间内，细胞之间的距离较小，便于观测细胞之间的相互作用，例如，细胞运动和分泌等功能上的变化。
在一些实施例中，每份所述单细胞液滴所包含的单个细胞可以是相同种类的细胞也可以是不同种类的细胞。例如，每份单细胞液滴中包含的可以是相同种类的肿瘤细胞，用于观察肿瘤细胞的增殖和成团。例如，单细胞液滴中包含的还可以是肿瘤细胞、树突细胞或T细胞，基于以上至少两种单细胞用于观察不同种类细胞之间的相互作用。
在一些实施例中，使用基于交变滞惯力的微滴喷射，从细胞悬液中获得若干液滴，并对所述若干液滴进行筛选，获得所述单细胞液滴。在一些实施例中，对所述若干液滴进行筛选的方法包括通过集成或独立的显微观测***进行筛选。
步骤120，将所述至少两份单细胞液滴置于基底上，获得包含至少两个所述单个细胞的融合液滴。
在一些实施例中，所述基底可以为液体、溶胶或固体。其中液体可以为不溶于水的液体。从而，在液滴置于液体中或上时，可以依旧保持其原始体积。在一些实施例中，所述液体密度不大于细胞悬浮液的密度。从而，使得喷射出的液滴在置于液体后，可以沉降到液体底部，液体可以对液滴起到保护，减缓液滴中的水分蒸发。具体的，液体可以包括石蜡、矿物油或植物油等。
在一些实施例中，将第一单细胞液滴置于所述基底中，获取所述第一单细胞液滴的位置坐标。在一些实施例中，第一单细胞液滴的位置坐标可以为机械坐标，即在固定坐标系中的坐标位置。在一些实施例中，第一单细胞液滴的位置坐标也可以为运动坐标，即相对于喷头的坐标值。运动坐标值基于以下坐标值确定：液滴在显微观测视野中的图像坐标(x1，y1)，显微镜在机械坐标中的位置(x2，y2)，喷头在机械坐标中的位置(x3，y3)，其中液滴在显微观测视野中的图像坐标需要基于像素与实际距离的比例系数α进行纠正。机械坐标是指在预先设定的固定坐标系中的坐标位置。例如，液滴的位置坐标可以为(αx1+x2-x3，αy1+y2-y3)。将液滴的坐标换算成为运动坐标，可以便于后续喷射液滴时无需再次计算喷头的移动距离，还可以减少记录数据的数量，简化操作步骤。
在一些实施例中，基于所述第一单细胞液滴的位置坐标，将第二单细胞液滴置于所述第一单细胞液滴附近，使其与所述第一单细胞液滴融合。其中，附近是指上方或侧边任一方向，可以实现两个液滴进行融合即可。液滴之间可以通过重力、基底的振动，或第二液滴的运动惯性等其他任意方式进行融合。例如，可以将第二单细胞液滴置于第一单细胞液滴上方，利用喷射过程中产生的基底液体的振动使得第一单细胞液滴与第二单细胞液滴融合。也可以是，将第二单细胞液滴至于第一单细胞液滴的侧边，通过晃动基底，使的两个液滴融合。
在一些实施例中，待所述基底液体中的多个所述单细胞液滴融合后，获得融合液滴；将下一单细胞液滴置于所述融合液滴的附近。例如，待第一单细胞液滴与第二单细胞液滴融合后得到第一融合液滴，获取第一融合液滴的位置坐标，基于第一融合液滴的位置坐标将第三单细胞液滴置于第一融合液滴的附近。又例如，待第三单细胞液滴与第一融合液滴融合后得到第二融合液滴，获取第二融合液滴的位置坐标，基于第二融合液滴的位置坐标将第四单细胞液滴置于第二融合液滴的附近。其中，附近是指上方或侧边任一方向，可以实现两个液滴进行融合即可。液滴之间可以通过重力、基底的振动，或第二液滴的运动惯性等其他任意方式进行融合。
步骤130，基于所述融合液滴，观测至少两个所述单个细胞之间的相互作用。
在一些实施例中，进行观测时可以对融合液滴的环境条件进行调节控制。在一些实施例中，环境条件包括但不限于温度条件、光照条件、空气条件或湿度条件等。例如，融合液滴所处的环境状态可以为20-37℃，CO2含量可以为5％。
在一些实施例中，进行观测的方法包括：荧光标记法、动态观测法、单细胞测序法或/和质谱成像法等。例如，可以通过动态观测手段实现对细胞功能的初步评价；结合细胞作用过程中的形态变化、运动情况、荧光吞噬、作用时间和作用距离等参数，对细胞功能进行定量分析，初步评价杀伤能力等细胞功能。例如，还可以对微滴进一步进行单细胞测序、质谱成像等检测，通过更高精度的分析方式揭示细胞作用过程中发生的变化，对动态观测的结果提供补充。
在一些实施例中，可以对融合液滴中的细胞施加外部刺激。具体的，可以向融合液滴中加入可溶性因子，例如生长因子。从而实现细胞功能的增强或抑制，解释细胞相互作用机理。
图2是根据本申请一些实施例所示的构建单细胞模型的方法的示例性流程图。
如图2所示，该在单细胞水平观测细胞相互作用的方法200可以包括以下步骤：
步骤210，使用基于交变滞惯力的微滴喷射，自细胞悬液中获取一份单细胞液滴，每份单细胞液滴只包含一个单个细胞。
其中，所述单个细胞可以是任意种类的细胞。例如，单个细胞可以是肿瘤细胞、T细胞或树突细胞等。在一些实施例中，细胞悬液的制备方法可以包括以下步骤：将贴附生长的细胞进行消化、离心、冲洗，得到悬浮生长细胞；将悬浮生长的细胞进行离心、冲洗，重悬后制得细胞悬液。在一些实施例中，细胞悬液中细胞密度可以为1-15×105个/mL。例如，细胞悬液中细胞密度可以为5×105个/mL。在一些实施例中，进行冲洗使用的可以是粘度较低的液体。例如：磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)，1％海藻酸盐溶液，细胞培养基等。
在一些实施例中，所述单细胞液滴的体积可以为1-100pL。基于所述单细胞液滴可以构建皮升量级的单细胞模型，所述单细胞模型直径可以在100μm左右，细胞间的距离可以在50μm以内。体积如此小的单细胞模型可以使得多个单细胞处于有限的空间内，细胞之间的距离较小，便于观测细胞之间的相互作用，例如，细胞运动和分泌等功能上的变化。
在一些实施例中，单细胞模型可被构建在液体、支架或凝胶态环境中。在一些实施例中，液相作用体系可以保证细胞的***，多个细胞可通过运动和接触实现其相互识别和作用。在一些实施例中，支架环境结构可以对细胞提供更强的支撑和应力作用，便于进行细胞应力刺激、贴附和迁移运动的研究。在一些实施例中，凝胶态环境中富含多种细胞外基质，可以应用于细胞相互作用的研究。
步骤220，对所述单细胞液滴中的所述单个细胞进行筛选。
使用基于交变滞惯力的微滴喷射，获取的单细胞液滴可能是不含有单细胞的液滴，可能是仅含有单个细胞的液滴，也可能是含有多个细胞的液滴。在一些实施例中，筛选方法可以包括但不限于通过集成或独立的显微观测***进行筛选。利用显微观测***的成像结果可以获得所述单细胞液滴中的细胞数量。
步骤230，如果筛选合格，根据单细胞模型中的设定坐标，将所述单个细胞加入所述单细胞模型。
在一些实施例中，筛选合格是指所述单细胞液滴中仅含有一个单细胞。筛选合格的单细胞液滴可以用于后续单细胞模型的构建。
值得说明的是，本申请中所述的单细胞模型可以是包含一个或多个细胞的，也可以是指还未包含细胞的基底成分。例如，在未将单个细胞加入基底成分时，所述单细胞模型可以是指未包含细胞的基底成分。又例如，在将若干单个细胞加入基底成分后，所述单细胞模型可以是指包含有若干细胞的单细胞模型。
在一些实施例中，单细胞模型中的设定坐标是指在基底成分中设定的固定坐标系，该固定坐标系的原点在进行单细胞模型的构建过程中是不会改变的。在一些实施例中，将单个细胞加入所述单细胞模型中可以是基与设定坐标，也可以是基于包含有细胞的液滴的运动作标。关于运动坐标详见图1的相关描述。
在一些实施例中，可以对单细胞模型中细胞的环境条件进行改变。根据基底成分的不同，可以采用的改变手段也有所不同。具体的，当基底成分为液体时，环境的改变主要是通过可溶性因子的加入或调节加入的可溶性因子的浓度变化来实现。可溶性因子可以包括生长因子、包含特定元素的物质。其中生长因子可以包括：。包含特定元素的物质可以包括：包含有氮元素的有机或无机物、含有钠元素的有机或无机物或含有钾元素的有机或无机物等任意元素的有机或无机物。当基底成分为固体支架时，支架材料的表面力学性能也可对细胞施加影响。当基底成份为凝胶态时，则可通过改变凝胶成分和交联时间，实现生化条件和力学条件的同时改变。
在一些实施例中，还可以对所构建得到的单细胞模型进行观测。具体的观测手段及目的详见图1的相关描述。
应当理解，图1与图2中的两种方法是可以相互通用，相互补充的，将两种方法分开描述仅是为了便于阅读和理解，并不构成对本申请的限定。并且上述方法可以用于各种单细胞相关的处理。例如，在一些实施例中，可以利用上述方法进行单细胞可控组装。
利用上述方法可以根据设计目的，实现单种或多种细胞的构建；构建的模型中细胞处于单细胞量级；构建的模型可以包含生物友好的微环境，可保证细胞在其中的存活、***和功能实施；构建的模型具有高度灵活性，可根据模型设计实时对体系中细胞进行刺激；构建的模型具有高效和高通量的特点，可在较短时间内构建较大量的模型。
实施例1、细胞的培养与分选
树突细胞悬浮液由以下方法制备：C57Bl/6小鼠骨髓来源树突细胞，以1×105/ml接种于6孔板中，在培养基中补加200U/ml粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)和IL-4。次日半量更换培养基，去除漂浮细胞，并补加GM-CSF和IL-4。每3天进行半量换液。收获培养至第14天的成熟树突状细胞，利用Tripsin-EDTA消化，重悬。
T细胞悬浮液由以下方法制备：C57Bl/6小鼠脾脏来源单核细胞，以CD25，CD4和CD8混合标记细胞并进行流式分选获得CD8+亚群和CD4+CD25-亚群。分选后培养过夜备用。
肿瘤细胞悬浮液由以下方法制备：将小鼠B16-F10黑色素瘤细胞系置于含有10％血清的RPMI1640培养基中，利用Tripsin-EDTA消化，重悬。
实施例2、肿瘤细胞荧光标记
将肿瘤细胞进行红色荧光标记，使用荧光染料为CellTracker Red CMTPX。T细胞体积较另外两种细胞较小，在光镜下即可进行区分。肿瘤细胞通过标记来与树突细胞进行区分。
实施例3、单细胞模型的构建
调节肿瘤细胞、树突细胞和T细胞悬液密度分别为5×105，5×105，和l×106个/ml。首先装载肿瘤细胞悬液并利用基于交变滞惯力的微滴喷射技术得到微滴阵列。结合显微观测可得到微滴中细胞分布。装载树突细胞，并将其与前一步筛选的微滴进行融合。重复该筛选和打印过程，将T细胞定位到微滴中。每次更换打印液体前均使用胰蛋白酶和磷酸盐缓冲溶液清洗打印喷头。
实施例4、观察与分析
通过高分辨率活细胞成像***可对构建的体系进行动态观察。观察过程中细胞处在37℃和5％CO2环境中。观测时间在12-16小时不等。微滴中符合条件的微滴通过显微观测可得到在该过程中的细胞形态、位置及存活的变化。T细胞的运动可通过在培养时间中位置的改变观测得到，树突细胞的形变表面在细胞的伸长和收缩以及表面突触的变化，肿瘤细胞的死亡则通过荧光强度的变化以及细胞形态上的肿胀和破裂进行判断。具体的观测结果如下：
图3是根据本申请一些实施例所示的单细胞模型示意图。
如图3所示，其中区域310为树突细胞在单细胞模型中发生的形态变化，虚线包围中为树突细胞。其中区域311为单细胞模型刚构建时树突细胞的形态，区域312为单细胞模型构建9.6h后树突细胞的形态，区域313为单细胞模型构建16h后的树突细胞的形态。从区域310中可以看出树突细胞的位置基本没有改变，仅有形态上的变化。其中区域320为T细胞在单细胞模型中的状态变化。区域321位单细胞模型刚构建时T细胞的状态，虚线包围中为T细胞。区域312为单细胞模型构建9.6h后T细胞的状态，区域313为单细胞模型构建16h后的树突细胞的状态。从区域320中可以看出T细胞的形态没有太大变化，但是其在做***。区域330为包含单细胞微滴的多次喷射及存活测试结果，其中331为单细胞模型中细胞存活测试结果，其中白色亮点为存活细胞。332为在同一位置重复多次喷射单细胞微滴后较大量细胞存活测试结果，可以看出有较多细胞存活。区域340为包含有多个细胞的单细胞模型，其中341为包含有两种细胞的单细胞模型，其中3411为T细胞，3412为树突细胞。342为包含有三种细胞的单细胞模型，其中3421为T细胞，3422为肿瘤细胞，3423为树突细胞。
图4是根据本申请一些实施例所示的两种细胞相互作用动态显微观测图。其中411为肿瘤细胞，412为树突细胞，421为T细胞。
区域410展示了不同时间树突细胞与肿瘤细胞在单细胞模型中的相互作用，可以得出树突细胞向肿瘤细胞迁移，通过粘附形成细胞聚集。区域420展示了不同时间T细胞与树突细胞在单细胞模型中的相互作用，可以得出T细胞多次接触树突细胞并粘附在树突细胞上。区域430展示了不同时间T细胞与肿瘤细胞在单细胞模型中的相互作用，可以得出T细胞会与肿瘤细胞粘附，并且肿瘤细胞会发生裂解。
图5是根据本申请一些实施例所示的T细胞运动路径示意图。
其中区域510可以看出T细胞单独存在时，会呈现无规则布朗运动。区域520中间深色区域为树突细胞的运动轨迹，可以看出在树突细胞存在时，T细胞在首次接触树突细胞后又多次接触树突细胞。
图6是根据本申请一些实施例所示的三种细胞项目作用动态显微观测图。其中，611为T细胞，612为肿瘤细胞，613为树突细胞。
其中区域610是较大分辨率下T细胞、树突细胞和肿瘤细胞不同时间的状态，通过区域610可以得出三种细胞通过运动或形态变化进行聚集。三种细胞形成聚集的小细胞团簇，与体内肿瘤转移和免疫抑制具有类似性。区域620是较小分辨率下T细胞、树突细胞和肿瘤细胞不同时间的状态，通过区域620可以得出T细胞在与树突细胞接触后，寻找和靠近肿瘤细胞。这与体内肿瘤免疫过程中的识别-呈递-杀伤过程具有类似性。
图7是根据本申请一些实施例所示的细胞作用距离对两者相互作用影响的统计柱状图。
其中710为树突细胞与T细胞之间作用距离对两者接触所需时间的影响。通过区域710可以看出，细胞初始距离的增加导致树突细胞与T细胞首次接触所需的时间增加。其中720为细胞初始距离对树突细胞与T细胞发生接触的几率的影响。可以得出细胞初始距离的增加导致树突细胞与T细胞发生接触的几率下降。
本申请实施例可能带来的有益效果包括但不限于：(1)使用基于交变滞惯力喷射技术获取单细胞液滴，在单次喷射过程中便实现了单细胞的分离和转移；仅含有单个细胞的微滴中细胞保持较高的存活率。在培养和观察中可观察到细胞的形态变化和运动能力上的差异；(2)多细胞种类的可控组装可以模拟体内多细胞种类的相互作用，提高了构建的细胞模型的复杂程度，提供更为可靠的结果；(3)多细胞种类、多种基质和刺激因子的加入都使得在该体系下较容易地对体系中的细胞功能进行调控，增强细胞功能，揭示可能的细胞作用通路，为细胞治疗产品开发提供指导。需要说明的是，不同实施例可能产生的有益效果不同，在不同的实施例里，可能产生的有益效果可以是以上任意一种或几种的组合，也可以是其他任何可能获得的有益效果。
上文已对基本概念做了描述，显然，对于本领域技术人员来说，上述详细披露仅仅作为示例，而并不构成对本申请的限定。虽然此处并没有明确说明，本领域技术人员可能会对本申请进行各种修改、改进和修正。该类修改、改进和修正在本申请中被建议，所以该类修改、改进、修正仍属于本申请示范实施例的精神和范围。
同时，本申请使用了特定词语来描述本申请的实施例。如“一个实施例”、“一实施例”、和/或“一些实施例”意指与本申请至少一个实施例相关的某一特征、结构或特点。因此，应强调并注意的是，本说明书中在不同位置两次或多次提及的“一实施例”或“一个实施例”或“一个替代性实施例”并不一定是指同一实施例。此外，本申请的一个或多个实施例中的某些特征、结构或特点可以进行适当的组合。
此外，除非权利要求中明确说明，本申请所述处理元素和序列的顺序、数字字母的使用、或其他名称的使用，并非用于限定本申请流程和方法的顺序。尽管上述披露中通过各种示例讨论了一些目前认为有用的发明实施例，但应当理解的是，该类细节仅起到说明的目的，附加的权利要求并不仅限于披露的实施例，相反，权利要求旨在覆盖所有符合本申请实施例实质和范围的修正和等价组合。
同理，应当注意的是，为了简化本申请披露的表述，从而帮助对一个或多个发明实施例的理解，前文对本申请实施例的描述中，有时会将多种特征归并至一个实施例、附图或对其的描述中。但是，这种披露方法并不意味着本申请对象所需要的特征比权利要求中提及的特征多。实际上，实施例的特征要少于上述披露的单个实施例的全部特征。
一些实施例中使用了描述成分、属性数量的数字，应当理解的是，此类用于实施例描述的数字，在一些示例中使用了修饰词“大约”、“近似”或“大体上”来修饰。除非另外说明，“大约”、“近似”或“大体上”表明所述数字允许有±20％的变化。相应地，在一些实施例中，说明书和权利要求中使用的数值参数均为近似值，该近似值根据个别实施例所需特点可以发生改变。在一些实施例中，数值参数应考虑规定的有效数位并采用一般位数保留的方法。尽管本申请一些实施例中用于确认其范围广度的数值域和参数为近似值，在具体实施例中，此类数值的设定在可行范围内尽可能精确。
针对本申请引用的每个专利、专利申请、专利申请公开物和其他材料，如文章、书籍、说明书、出版物、文档等，特此将其全部内容并入本申请作为参考。与本申请内容不一致或产生冲突的申请历史文件除外，对本申请权利要求最广范围有限制的文件(当前或之后附加于本申请中的)也除外。需要说明的是，如果本申请附属材料中的描述、定义、和/或术语的使用与本申请所述内容有不一致或冲突的地方，以本申请的描述、定义和/或术语的使用为准。
最后，应当理解的是，本申请中所述实施例仅用以说明本申请实施例的原则。其他的变形也可能属于本申请的范围。因此，作为示例而非限制，本申请实施例的替代配置可视为与本申请的教导一致。相应地，本申请的实施例不仅限于本申请明确介绍和描述的实施例。

Claims (18)

1.一种在单细胞水平观测细胞相互作用的方法，其特征在于，包括：
使用基于交变滞惯力的微滴喷射，获取至少两份单细胞液滴，每份单细胞液滴只包含单个细胞；
将所述至少两份单细胞液滴置于基底液体中，获得包含至少两个所述单个细胞的融合液滴；
基于所述融合液滴，观测至少两个所述单个细胞之间的相互作用。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
每份所述单细胞液滴所包含的单个细胞，其种类各不相同。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单细胞液滴所包含的单个细胞，其种类包括肿瘤细胞、树突细胞或T细胞。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括:
使用基于交变滞惯力的微滴喷射，从细胞悬液中获得若干液滴；
对所述若干液滴进行筛选，获得所述单细胞液滴。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：对所述若干液滴分别进行筛选的方法包括通过集成或独立的显微观测***进行筛选。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述细胞悬液中细胞密度为1-15×105个/mL。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述液滴的体积为1-100pL。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基底液体不溶于水。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括：
将第一单细胞液滴置于所述基底液体中，获取所述第一单细胞液滴的位置坐标；
基于所述第一单细胞液滴的位置坐标，将第二单细胞液滴置于所述第一单细胞液滴附近，使其与所述第一单细胞液滴融合。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述将所述至少两份单细胞液滴先后置于基底液体中还包括：
待所述基底液体中的多个所述单细胞液滴融合后，获得融合液滴；
将下一单细胞液滴置于所述融合液滴的附近。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述观测至少两个所述单个细胞细胞之间的相互作用使用的观测方法包括：荧光标记法、动态观测法、单细胞测序法或/和质谱成像法。
12.一种单细胞可控组装方法，其特征在于，包括：
使用基于交变滞惯力的微滴喷射，自细胞悬液中获取一份单细胞液滴，每份单细胞液滴只包含单个细胞；
对所述单细胞液滴中的所述单个细胞进行筛选；
如果筛选合格，根据单细胞组装体系中的设定坐标，将所述单个细胞加入所述单细胞组装体系。
13.一种构建单细胞模型的方法，其特征在于，包括：
使用基于交变滞惯力的微滴喷射，自细胞悬液中获取一份单细胞液滴，每份单细胞液滴只包含一个单个细胞；
对所述单细胞液滴中的所述单个细胞进行筛选；
如果筛选合格，根据单细胞模型中的设定坐标，将所述单个细胞加入所述单细胞模型。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，还包括：
改变单细胞模型中细胞的环境条件。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述改变单细胞模型中微环境条件包括：
向单细胞模型中加入可溶性因子。
16.如权利要求13所述的方法，其特征在于，还包括：
构建所述单细胞模型的载体为液体、凝胶或固体。
17.一种单细胞模型，其特征在于，由权利要求13-16任一项所述的方法构建而成。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，还包括
对所述单细胞模型进行观测。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103333853A (zh) * 2013-07-12 2013-10-02 清华大学 细胞打印方法及细胞打印***
CN107407638A (zh) * 2014-12-03 2017-11-28 伊索普莱西斯公司 细胞分泌特征的分析和筛选
CN107667178A (zh) * 2015-03-26 2018-02-06 休斯敦大学*** 细胞的整合功能和分子概况

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103333853A (zh) * 2013-07-12 2013-10-02 清华大学 细胞打印方法及细胞打印***
CN107407638A (zh) * 2014-12-03 2017-11-28 伊索普莱西斯公司 细胞分泌特征的分析和筛选
CN107667178A (zh) * 2015-03-26 2018-02-06 休斯敦大学*** 细胞的整合功能和分子概况

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WEI SUN ET AL.: "An integrated cell printing system for the construction of heterogeneous tissue models", 《ACTA BIOMATERIALIA》 *

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