CN112760387B - 与猪总***数相关的snp分子标记及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种与猪总***数相关的SNP分子标记及应用。本发明筛选得到一种SNP位点对应于国际基因组11.1版本参考序列2号染色体第123564644位G>T突变的SNP分子标记,通过逐代筛选该SNP的优势等位基因,能够提高优势等位基因频率,进而提高猪总***数,提升猪的繁殖性能,提高仔猪的成活率,加快猪遗传改良进度,从而有效提高猪养殖的经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及猪标记辅助选择(MAS)技术领域,具体涉及一种与猪总***数相关的SNP分子标记及应用。
背景技术
母猪的***是仔猪在哺乳期获取营养和免疫力的重要器官。近年来,对增加窝产仔猪数的选育,加剧了母猪饲喂更多仔猪的负担。因此,使母猪拥有足够多数量的***一直是种猪选育的重要标准之一。总***数(
total teat number,TTN)是猪非常重要的繁殖性状,***数多的母猪可以哺育更多的仔猪,所以增加母猪总***数有利于提高仔猪存活率、促进仔猪体重增加,是非常重要的技术手段。因此,为提高猪生产性能,对总***数性状的选育非常必要。
母猪繁殖性能的强弱对猪场的生产效益有着非常重要的影响,而猪的总***数是评价种猪繁殖性能的重要指标之一。拥有足够多的***数才能更好的保障仔猪的成活率。***数是中等遗传力性状,然而在实际的生产工作中,育种工作者一般从表型上直接对***数进行选择,但简单的淘汰与留种选择并不能满足日常的生产需要,并且没有充分发挥猪的生产潜能。因此,采用遗传手段对核心猪群总***数进行性状改良,可以加快目标性状的选育进展。这不仅有利于充分挖掘猪繁殖性能还能提高仔猪存活率和生长性能,进而提高经济效益,增强商品猪生产的核心竞争力。
***数是典型的由多基因控制的数量性状。国内外研究人员利用
QTL定位和候选基因法对影响***数的数量性状基因座(
Quantitative trait loci,
QTL)进行了研究,但是结果并不理想。
发明内容
本发明的目的在于提供一种与猪总***数相关的SNP分子标记及应用,并将其在基因型鉴定、遗传育种等方面加以应用,旨在解决母猪总***不足的技术问题。
基于猪全基因组序列的公布和高密度SNP(
single nucleotide polymorphism,单核苷酸多态) 芯片的开发,使得全基因组关联分析 (
Genome-wide association study,GWAS)在鉴别影响复杂性状的分子标记和候选基因方面具备了强有力的检测工具;本发明研究基于GWAS分析策略鉴别到一些与猪总***数相关的分子标记,如将效应大的SNP运用到分子标记辅助选择和基因组选择中,从而可加快猪总***数性状的遗传改良进展提高经济效益。具体技术方案如下:
筛选得到一种位于猪2号染色体上与猪总***数相关的SNP分子标记,其SNP位点对应于国际基因组11.1版本参考序列2号染色体第123564644位G>T突变。
所述分子标记的SNP位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,其中序列中的M是G或T,导致猪总***数的不同。
所述影响猪有效***数性状的分子标记可应用在鉴定猪总***数性状和猪遗传育种中。
用于鉴定上述位于猪2号染色体上与***数相关的SNP分子标记的引物对,包含引物P001-F和引物P002-R,其核苷酸序列如下所示:
引物P001-F:5’- TTTTCCCTTTGCTGATTTGG -3’
引物P002-R:5’- TGTCTCTTGGAGTTCCCATTG -3’。
鉴定所述与猪总***数相关的SNP位点的方法,包括以下步骤:
(1)取猪的组织样品并提取其基因组DNA;
(2)以所述基因组DNA为模板,使用所述引物进行PCR扩增;
(3)对扩增产物进行测序,基于国际猪基因组11.1版本参考序列,查看2号染色体上第123564644个核苷酸位点,判读该位点的G>T多态性。
提高***数的生猪品系选育方法,包含如下步骤:
确定种猪核心群中的种猪的上述位于猪2号染色体上与***数相关的SNP分子标记的位点,并根据所述分子标记做出相应的选择:
在所述种猪核心群中选择国际猪参考基因组11.1版本2号染色体上第123564644位点为TG、TT基因型的种猪个体,淘汰在第123564644位点为GG基因型的种猪个体,以逐代提高该位点的等位基因T的频率,从而提高后代猪的总***数。
所述种猪为大白猪及其合成系。
与现有技术相比,本发明的主要有益技术效果在于:
1. 本发明研究并确定与猪总***数相关的分子标记位于猪的2号染色体上的核苷酸序列上,验证了其对总***数性状的影响效应,以其建立高效准确的分子标记辅助育种方法,应用于种猪提高***数的遗传改良中,可以快速准确地对猪进行选育,加快猪只的育种进程,提高后代猪的繁殖性能,进而达到提高企业利润,增加核心竞争力之目的。具体可以为:通过逐代筛选该SNP的优势等位基因,提高优势等位基因频率,进而提高猪总***数,提高猪的繁殖性能,加快猪遗传改良进展从而有效提高经济效益。
2. 本发明提供一种鉴定上述位于猪2号染色体上与总***数相关的SNP分子标记的引物对,通过该引物对,可建立高效准确的分子标记辅助育种技术体系,从而快速准确地对猪进行选育,加快育种进程。
附图说明
图1为本发明实施例中在大白猪2号染色体上关于总***数性状的全基因组关联分析(GWAS)曼哈顿图;其中横坐标表示猪染色体编号,纵坐标表示-logP值。
图2为本发明实施例中关于基因的检测结果;琼脂糖凝胶浓度为1%;图中泳道:M为DL2000Maker;泳道1为基因型TT,233bp;泳道2为基因型GG,233bp;泳道3为基因型TG,233bp。
图3为本发明实施例中有关大白猪有效总***数性状主效突变位点g .114G>T不同基因型的测序结果峰图;其中,(a)为TT基因型的测序结果峰图;(b)为GG基因型的测序结果峰图;(c) 为TG基因型的测序结果峰图。
图4为本发明实施例中以引物P001-F、引物P002-R进行PCR扩增的产物测序结果图;图中M为突变位点,用标有下划线表示(其中括号内为突变碱基,为等位基因突变),在该序列的首位加粗,表示为设计引物序列位置。
具体实施方式
下面结合实施例来说明本发明的具体实施方式,但以下实施例只是用来详细说明本发明,并不以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明,均为常规仪器设备;所涉及的试剂及原材料如无特别说明,均为市售常规产品;所涉及的试验方法,如无特别说明,均为常规方法。
实施例:SNP标记的克隆及基因型验证
1. 试验动物来源
本发明使用的实验群体是河南鑫欣牧业股份有限公司的1118头纯种大白猪群体。
本实验所选取该资源群体中大白猪,猪群自由采食、饮水,整个饲喂方式、饲养条件等始终保持一致,为常规方法。
2. 样本采集及表型记录
采集上述猪的耳组织,放于75%酒精,-20℃冰箱保存,记录左***数,右***数及总***数。
3. 猪全基因组50K SNP判型
从大白猪群体的耳组织中,利用动物组织DNA提取试剂盒(购自上海捷瑞生物工程有限公司,编号GK0122)提取全基因组。利用紫外分光光度计,测定每一个样本的浓度和OD值,抽取100ng DNA 与1μLoading Buffer 混合,上样至1%的琼脂糖凝胶中,120V电压电泳30min,凝胶成像设备观察并拍照,检测DNA的完整性,如图2所示。
将DNA稀释至20ng/μL左右,送样至纽勤生物科技(上海)有限公司,在
Illumina
Beadstration平台上根据公司标准流程进行猪全基因组50K SNP芯片(
Illumina,美国)基因型判定。用plink 1.9 对50K芯片数据质控,剔除检出率低于90%的个体及位点、最小等位基因频率小于0.05且哈代-温伯格平衡显著性水平高于10-6的位点,排除没有对应到猪11.1参考基因组上的位点以及X和Y 染色体上的位点,最后得到1118个有效个体及46033个SNP的有效基因型数据。
4. 全基因组关联分析
利用GCTA v1.24软件做主成分分析;利用GEMMA v0.94 软件进行GWAS分析。
使用单变量混合线性模型对质控后的芯片数据与***数表型进行关联分析,模型如下:
;
y为对应的繁殖性状的表型值,n个样本对应n个性状,w是包括固定效应矩阵,包括前两个PCA和季节;α是包括截距在内的相应系数的c向量;x是标记基因型的n向量;β是标记的效应大小;u是随机效应的n向量;是误差的n向量;t-1是残差方差;λ是两个方差分量之比;k是已知的n×n相关矩阵,ln是n×n恒等矩阵;MVNn表示n维多元正态分布。
GWAS分析结果如图1和图2所示。从图1和图2可知,在大白猪群体中,在2号染色体中存在显著影响总***数的位点,最强关联的SNP为g .114G>T(P=1 .31748e-05)。
5. 不同基因型与总***数表型的关联性分析
根据表1可知,分子标记的SNP位点g .114G>T(SEQ NO .1中核苷酸,对应于国际猪基因组11 .1版本参考序列2号染色体上第123564644G>T突变)与总***数和右***数状极显著相关(P<0.01) ,说明此分子标记显著影响猪的总***数性状,可以通过对猪的此SNP位点的辅助选择,从而提高该群体的总***数,进而加快育种进程。
另外由表1可知,TT型、GT型比GG型的平均总***数高,TT型较GG型、GT型显著,GG型与GT型也显著,说明等位基因T对总***数是不利的。总***数是衡量猪繁殖性能的重要指标,总***数更高说明猪的繁殖性能更好。因此,在进行育种的过程中需要淘汰GG型的种猪,保留TT型、GT型的种猪,以逐代提高该位点的等位基因T的频率,进而带来更多的经济效益。
表1分子标记的SNP位点g .114 G>T效应分析
。
6. 目的DNA序列扩增及测序
设计的引物DNA序列如下所示:
引物P001-F:5’- TTTTCCCTTTGCTGATTTGG -3’
引物P002-R:5’- TGTCTCTTGGAGTTCCCATTG -3’;
PCR扩增:25μL的反应体系中加入DNA模板1.25μL,双蒸水8.75μL,2×Tag PCRStanMix with Loading Dye 12.5μL,引物P001-F和P002-R各1.25μL。
PCR反应条件为:94℃预变性5min后,94℃变性30s、65℃退火30s,72℃延伸40s以后每个循环退火温度降低1℃,共12个循环—退火温度从65℃降落到54℃;94℃变性40s;54℃退火30s,72延伸40s;30个循环,72延伸10min。
DNA序列测定:在生工生物工程(上海)股份有限公司进行,基因片段测正反两个反应。将所测得的序列与
Ensembl上基因组序列对比,得出对应SNP位点的突变。测序结果如图4所示。
分子标记的SNP位点g .114 G>T效应分析:
本发明通过对SEQ ID NO:1序列中的第114个位碱基突变位点进行检测,初步进行其猪的总***数性状与基因型之间的关联分析,为猪的分子标记辅助选择提供了一个新的分子标记。由表1可知,平均每头TT型种猪总***数比GG型种猪总***数多0.223个,且差异极显著。通过分子标记辅助选择,可促进大白种猪的育种进程,增加猪的繁殖性能,从而促进猪肉生产,带动养猪产业经济效益更大化。具体表现为:
通过分子标记辅助选择,对群体内基因型为GG的猪进行淘汰,显著提高了群体的总***数,其中,每头猪的有效总***数提高在0.104~0.223个之间,10000头的能繁母猪每胎就能多哺乳1040~2230头仔猪,以这些仔猪直接育肥到100kg上市计算,按照80%的屠宰率估算,则一万头母猪每胎能够多提供83.2~178.4吨猪肉,能够给企业带来巨大的经济收入和效应,增加其核心竞争力。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但是,所属技术领域的技术人员能够理解,本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其它的任何未背离本发明构思的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南省黄泛区农投牧业有限公司;河南农业大学
<120> 与猪总***数相关的SNP分子标记及应用
<130> 1
<160> 3
<170> PatentIn version 3 .3
<210> 1
<211> 233
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> /
<400> 1
ttttcccttt gctgatttgg ttttgtatcc tttggcttcc acaagcatta 50
gtcgtgaaca caactatatg cttagtcctt tgagcctttc tagggagtca 100
ttgaagctgg gtggggtcat ggggatcccc tttacaggaa taaataggaa 150
aaatgacctt ttcatatatc atagaatttc tataccagta ataaaaccaa 200
gataaaaatt attgtctctt ggagttccca ttg 233
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物P001-F
<400> 2
ttttcccttt gctgatttgg 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物P002-R
<400> 3
tgtctcttgg agttcccatt g 21
Claims (3)
1. SNP分子标记在大白猪总***数性状鉴定或选择中的应用,所述SNP分子标记为对应于国际猪基因组11.1版本参考序列2号染色体上第123564644位碱基处存在一个G>T转换类型的单核苷酸多态性变异。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,包括以下步骤:
(1)取大白猪的组织样品并提取其基因组DNA;
(2)以所述基因组DNA为模板,利用如下引物进行PCR扩增:
上游引物P001-F:5’- TTTTCCCTTTGCTGATTTGG -3’
下游引物P002-R:5’- TGTCTCTTGGAGTTCCCATTG -3’;
(3)对扩增产物进行测序,基于国际猪基因组11.1版本参考序列,查看2号染色体上第123564644个核苷酸位点,判读该位点的G>T多态性,基于基因型TT、GT比GG的平均总***数高的特征,对大白猪总***数性状进行鉴定或选择。
3.一种提高总***数的生猪品系选育方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)检测确定种猪核心群中的种猪的基于国际猪参考基因组11.1版本2号染色体上第123564644个位点的基因型;
(2)在所述种猪核心群中选择第123564644位点为TG、TT基因型的种猪个体,淘汰该位点为GG基因型的种猪个体,以逐代提高该位点的等位基因T的频率,从而提高后代猪的总***数;
所述种猪为大白猪。
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