CN108004332B - 一种影响猪主蹄生长的分子标记及其应用 - Google Patents

一种影响猪主蹄生长的分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于家畜分子标记制备技术领域，具体涉及一种影响猪主蹄生长的SNP标记及其应用。所述SNP标记为猪基因组第16号染色体第52293663位碱基由A到G的位点突变，对应于SEQ ID NO:1所示序列中的第218bp处。本发明提供的分子遗传标记可以用于种猪的主蹄生长情况的筛选，能够有效减少实际生产中种猪因主蹄过度生长而引发肢蹄疾病后被淘汰的机率，有效增加种猪的使用年限，提高经济效益。

Description

一种影响猪主蹄生长的分子标记及其应用
技术领域
本发明属于分子标记辅助选择技术及动物遗传育种领域，特别涉及一种影响猪主蹄生长性状的分子标记及其应用。
背景技术
猪(Susscrofa)是偶蹄目哺乳动物，其第3、4趾特别发达，长短相等，称之为主蹄(图1)。主蹄主要用于承受猪体重，在猪行走、站立过程中起重要支撑作用。通常，母猪的主蹄长度在5厘米左右，而过度生长的主蹄长度能够达到13厘米。主蹄过长的带来的弊端是容易造成机械损伤，又因为蹄结构的特殊性，使得损伤很难恢复，进而又会影响猪的站立及饮食，增加怀孕母猪流产的机率。因此，肢蹄损伤种母猪通常会被淘汰，导致种母猪的使用年限缩短，造成较大的经济损失。
由于猪主蹄的最终长度在成年后才能观察到，而种猪的选种却在此之前，因此早期选择就显得尤为重要。然而，猪主蹄的生长涉及多个基因、位点及位点之间的相互作用。如果通过传统的选择手段进行将很难取得有效进展；而分子标记辅助选择(markerassisted selection，MAS)则可以通过影响选择时间、选择强度以及准确性而提高该性状的选择效果。目前应用较广泛的是利用单核苷酸多态性标记(single nucleotidepolymorphism，SNP)进行的分子标记辅助选择技术，即通过选择与目标性状紧密连锁的SNP标记来对育种材料进行选择，综合改良畜禽重要经济性状，是传统遗传育种与现代分子生物学育种相结合的育种方法。相较于传统的育种方法而言，分子标记辅助选择育种的方法能够实现早期选种和提高育种准确性的目标，从而加快育种进程。目前，尚未有人发现关于猪主蹄性状的分子标记。
大白猪(Yorkshire或Large White)是世界上著名的瘦肉型猪种之一，因其较高的繁殖力，较好的生长育肥性和适应性等特点，常被作为诸多合成系商品猪的母本，应用范围十分广泛。因此，对大白母猪的主蹄生长性状进行改良，将可以有效避免母猪因肢蹄异常而被淘汰，提高母猪的使用年限，能较大限度提高养殖效益。
发明内容
为克服上述现有技术中存在的缺点与不足，本发明的首要目的是提供一种影响猪主蹄生长性状的SNP标记，该分子标记可用于早期鉴定猪的主蹄性状，实现辅助育种。
本发明的另一目的在于提供一对引物用于检测该影响猪主蹄生长性状的SNP标记。
本发明的再一个目的在于提供一种早期鉴定猪主蹄生长情况的方法。
本发明的再一目的在于提供一种猪主蹄生长性状的遗传改良方法。
本发明的上述目的通过以下技术手段实现：
一方面，本发明提供了一种影响猪主蹄生长性状的分子标记，该分子标记的核苷酸序列SEQ ID NO:1所示，其中序列中的M是A或G，导致猪主蹄性状出现多态性。如果M是A，则猪主蹄生长为正常长度，如果M是G，则猪蹄生长过长。进一步地，作为一种优选的评价方式，猪主蹄生长长度过长为猪成体主蹄长度≥10cm；猪主蹄长度正常为猪成体主蹄长度＜10cm。
该分子标记的SNP位点对应于国际猪参考基因组11.1版本16号染色体上第52293663bp处的A>G突变；或者，所述分子标记的SNP位点为SEQ ID NO:1序列片段标注位置g.218A>G。
上述影响猪主蹄生长性状的分子标记在猪主蹄生长性状遗传育种中的应用，该应用也属于本发明的保护范围。
另一方面，本发明还提供了一种用于检测上述分子标记的引物对，该引物对上游引物序列如SEQ ID NO：2所示；下游引物序列如SEQ ID NO：3所示。
上述引物对在早期鉴定猪主蹄生长情况中的应用也在本发明的保护范围内。
上述引物对在猪分子标记辅助育种中的应用也在本发明的保护范围内。
上述引物对在改良猪主蹄生长情况中的应用也在本发明的保护范围内。
另一方面，本发明还提供了一种早期鉴定猪主蹄生长情况的方法，该方法为检测上述分子标记的SEQ ID NO:1序列的5’端第218bp为A还是G，或者是或者检测猪16号染色体上52293663bp处的碱基是A还是G。其中，检测的方法可以是现有技术中已经公知的检测SNP的方法。作为本发明一种优选的实施方式，采用如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的引物对进行检测。
另一方面，本发明还提供了一种猪的遗传改良方法，该方法为确定种猪核心群中种猪的权利要求1所述的分子标记，即检测上述分子标记的SEQ ID NO:1序列的5’端第218bp为A还是G，或者是或者检测猪16号染色体上52293663bp处的碱基是A还是G。然后，根据检测出的分子标记做出相应的选择：种猪的继代选育国际猪参考基因组11.1版本16号染色体上52293663bp处的GG型个体，淘汰该点的AA型和AG型个体。其中，所述的种猪包括大白猪及其合成系。
本发明相对于现有技术具有如下优点及效果：
本发明首次提供一种早期鉴定大白猪及其合成系的主蹄生长情况的分子标记，使用该分子标记进行标记辅助选择，使得猪主蹄生长情况的早期鉴定更加方便易行，为选种人员更加准确判断猪主蹄的生长情况，为增加母猪使用年限奠定基础，能够极大增加大白猪及其合成系主蹄生长性状的育种进程，具有重要的经济效益。
附图说明
图1为猪主蹄示意图；
图2为所述分子标记的两种等位基因频率；
图3为全基因组关联分析(GWAS)提供的与主蹄生长性状显著相关的SNP图；其中：横坐标表示猪的染色体编号；纵坐标表示-logP值；
图4为检测主蹄生长性状显著相关SNP的测序峰图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
其中，大白猪是我们市场上占比70％以上的杜长大三元杂商品猪的母本，这个三元杂就是文中的大白母猪的合成系。可见，如果大白猪能得到改良，将具有十分重大的经济效益。
实验猪群：本实验一共使用种猪核心群652头纯种大白猪。
实施例1为具体解释得到本发明中猪主蹄生长情况的发明过程。
表型数据采集：通过皮尺量准确取猪主蹄长度，精确到毫米，量取过程中保持标准一致，并做好长度记录。由于主蹄长度大于10cm极容易造成肢蹄损伤而被淘汰，因此我们将主蹄长度为10cm定义为主蹄过度生长。上述实验在广东温氏食品集团股份有限公司的华东育种种猪场中进行，所有大白母猪均饲养于长×宽×高为2.1m×0.7m×1.1m规格的限位栏中，自由饮水，并按统一饲养标准，统一日粮饲喂，定时定量采食。
实施例2为具体解释得到本发明中基因标记的发明过程。
(1)组织DNA提取与质控：采集上述实施例1中大白母猪的耳组织，及时将耳组织浸泡于75％乙醇中置于-20℃冰箱备用。参照苯酚-氯仿法提取大白母猪的全基因组DNA，用Nanodrop-ND1000核酸浓度仪和琼脂糖凝胶电泳对大白母猪的DNA进行浓度测定和质量检测。具体地是将核酸浓度仪测得的A260/280比值在1.8-2.0，A260/230比值在1.7-1.9判定为纯度合格，将浓度高于300纳克/微升判定为浓度合格；将纯度及浓度合格的DNA样品统一稀释成50纳克/微升。再6μl稀释过的DNA样品与2μl LoadingBuffer混合，上样到1％的琼脂糖凝胶中，150V电压下电泳25min，在紫外分光光度仪和凝胶成像设备下观察并拍照，观察DNA的完整度。将浓度、纯度及完整度都合格的DNA样品判定为质量合格样品。
(2)基因分型与标记质控：将上述获得的合格DNA样品送至纽勤生物科技(上海)有限公司，在IlluminaBeadstration平台上，采用公司标准化流程进行芯片杂交与结果扫描。最后通过GenomeStudio软件读取基因型数据。然后利用PLINK软件对所有样本80K芯片的基因型数据进行质量控制，剔除检出率<90％，最小等位基因频率<0.05，偏离哈代温伯格平衡(Hardy-Weinberg Equilibrium，HWE)P≤10-6以及处于未知位置和性染色体上的SNP标记，删除SNP检出率<90％的个体最终得到50206个SNP标记和652个样本用于后续数据分析。
(3)全基因组关联(GWAS)分析：为了消除群体层化效应，本发明采用线性混合模型单点回归分析并结合GEMMA软件包进行GWAS分析，分析模型中利用个体间基因组的相似度校正层化效应。采用Bonferroni法确定全基因组关联分析得显著性阈值，基因组水平的显著阈值为0.05除以有效SNP位点数量，即0.05/50206＝9.96e-7；染色体水平显著阈值为1除以有效SNP位点数量，及1/50206＝1.99e-5。GWAS结果显示，猪16号染色体上存在与大白母猪主蹄过度生长性状显著相关的SNP位点(图3)。
实施例3具体解释发明检测SNP标记的发明过程。
(1)含有与大白猪主蹄生长情况显著相关SNP位点的目的片段的扩增目的片段为16号染色体中一段310bp的核苷酸序列，序列扩增的上下游引物为：
SEQ ID NO:2上游引物5’—TCTCTGCTGTGGTGAATATC—3’
SEQ ID NO:3下游引物5’—ACTCTGTCTTGGTGTGTTC—3’
(2)PCR扩增体系以及条件设置：配置10ul体系，其中包括DNA样品1ul，上游引物0.2ul，下游引物0.2ul，PCR Mix 5ul,ddH2O 3.6ul；PCR条件设置为95℃预变性3min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，共36个循环，最后延伸为72℃7min。
(3)DNA序列测序检测：PCR产物送至深圳华大基因科技有限公司进行双向测序。将测得的序列与NCBI数据库中猪基因组序列对比，得出对应SNP位点的突变。然后就可以通过SNP分子标记与纯种大白猪主蹄生长情况的关联分析的应用，为猪的分子标记辅助选择提供一个新的标记。
测序结果如下所示(测序峰图见图4):
SEQ ID NO:1
序列表中标注的M为突变位点，用标有下划线显示(括号中为突变碱基，为等位基因突变)，在该序列的首尾加粗显示为设计引物序列位置。
表1.三种基因型频率及对应的表型差异
括号中的数字表示个体数，P<0.01表示两种等位基因频率对对应主蹄生长情况具有极显著差异
本发明提供了一个能够显著改良大白猪主蹄生长性状的SNP标记，使用该SNP进行标记辅助选择，能够显著改良大白猪及其合成系的主蹄生长情况选育的育种进程。本发明的影响大白猪主蹄生长性状的分子标记的AA型和AG型个体，全部选育成GG型个体，则可有效降低主蹄过度生长猪的数量，为养猪业提供收益的潜力是巨大的。本SNP标记个体中，包含等位基因A的个体与不包含等位基因A的个体的主蹄过度生长概率存在显著差异(P<0.01)(表1)，通过优选大白母猪及其合成系该SNP的优势等位基因(G)，可最终实现提高繁殖母猪使用年限进而增加经济效益的目的。
申请人所在的国家生猪种业工程技术研究中心，为广东温氏集团与华南农业大学联合申报，经科技部批准成立。温氏集团前期积累了约6000头纯种大白猪主蹄生长情况的表型，并使用猪50K SNP芯片对其中652头个体进行了高通量SNP分型。通过全基因组关联分析，首次发现猪16号染色体上存在着显著影响主蹄过度生长的SNP位点，该SNP位于国际猪参考基因组11.1版SSC16上第52293663bp处。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南农业大学 广东温氏食品集团股份有限公司
<120> 一种影响猪主蹄生长的分子标记及其应用
<130> 20171219
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 310
<212> DNA
<213> Susscrofa
<400> 1
tctctgctgt ggtgaatatc agctggcata aggaggatct ttgctacttt taagcataag 60
gatgtttacc ataatgttat aataaagaaa atttagaaat aatcccccag atataggcaa 120
ctggttaaca tgaattataa tttatctata caaagtacta taattatata gccattaaaa 180
gtaggcttat aacgtaagat tttaataaca agagaacmag tgtttatgaa ataatattaa 240
gaaacgaaag aattttatat agcacatgat caaaataatt tctgtgaagg ggaacacacc 300
aagacagagt 310
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> artificial sequence
<400> 2
tctctgctgt ggtgaatatc 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> artificial sequence
<400> 3
actctgtctt ggtgtgttc 19

Claims (4)

1.一种影响猪主蹄生长性状的分子标记，其特征在于：所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其中序列中的M是A或G，导致猪主蹄性状出现多态性。
2.权利要求1所述的分子标记在猪的主蹄生长遗传育种中的应用。
3.一种种猪的遗传改良方法，其特征在于：所述方法包括：确定种猪核心群中种猪的权利要求1所述的分子标记，并根据检测出的分子标记做出相应的选择：种猪的继代选育国际猪参考基因组11.1版本16号染色体上52293663bp处的GG型个体，淘汰该点的AA型和AG型个体。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的种猪为大白猪及其合成系。
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