CN112753582B - 一种千年桐茎段消毒和快速增殖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种千年桐茎段消毒和快速增殖的方法。包括外植体的消毒、腋芽诱导、生根培养等过程。本发明克服了千年桐茎段初代培养污染率高，难培养的问题，本发明具有外植体污染率低,繁殖速率快,培育周期短的优点,不仅为快速繁殖优良千年桐无菌苗提供了一条途径,而且为千年桐的工厂化育苗及以后转基因技术提供可能。

Description

一种千年桐茎段消毒和快速增殖的方法

技术领域

本发明属于千年桐组织培养领域,具体涉及一种千年桐茎段消毒和快速增殖的方法。

背景技术

千年桐(Vernicia montana)为大戟科(Euphorbiaceae)油桐属(Vernicia Lour.)的落叶乔木,是典型的南亚热带树种，在我国北纬22°15′～34°30′,东经99°40′～122°07′均有栽培分布，主要栽培区为福建、广东、广西、江西、湖南等省。千年桐干种仁含油率60％～70％,栽培目的之一在于取种子榨油,可发展为生物质能源林。它具有良好的速生抗寒品质,作为用材树种也有良好的开发潜力，特别是极端低温危害的区域，其抗冻性能明显优于桉树。由于是落叶树种,在散生栽植时,可进行林农混种,能充分利用林地,实现主体生态栽植。另外，由于它栽植容易，还可以做为生态公益林更新的优良树种(钟寿望2011)。千年桐作为大型乔木在自然环境下生长缓慢，主要通过直接播种来种植，生长周期较长。组织培养是快速育苗且缩短生长周期的一条重要途径,具有广阔的商业化前景。目前,关于千年桐组织培养的报道还很少，千年桐组织培养还处于起步阶段，主要是因为千年桐带芽茎段在组织培养过程中存在初代培养外植体容易污染的问题,至今通过组织培养还未培育出脱毒苗,本发明主要从千年桐带芽茎段外植体的消毒、腋芽诱导、生根等一系列过程,快速获得了千年桐组培苗,大大缩短了千年桐的育种周期，且操作简单，无菌苗长势良好，污染率低，为千年桐的工厂化育苗及转基因技术提供可能。

目前，还没有千年桐组培的报道出现，仅有一些关于油桐组培方面的专利如下：

201310271826.7一种油桐叶片再生植株的方法

201410326807.4油桐下胚轴愈伤组织诱导及高效再生植株的方法

201410327567.X一种油桐叶柄高效直接再生植株的方法

201910934260.9一种物理辅促油桐带芽茎段再生植株的方法

201610089435.7一种利用油桐下胚轴为外植体直接诱导植株再生的方法

201010252415.X一种农杆菌介导的小油桐基因转化方法

201710077542.2油桐组培苗瓶内生根的方法

本发明与上述专利一一相比的优势在于操作简便、培养周期短，培养基的配方简单，所需成本低，关键是特别适合千年桐的快繁。

发明内容

本发明的首要目的是针对目前千年桐外植体灭菌较难,通过组织培养获得再生植株技术存在不足的问题，提供一种千年桐当年生半木质化带芽茎段的消毒方法。千年桐组织培养方面的研究较少，与同属的油桐带芽茎段组织培养进行对比分析，该方法操作简单、消毒效果好，省去了继代增殖培养的步骤，生长育苗周期明显缩短，腋芽诱导率高，根系生长健壮，为以后工厂化育苗及转基因技术提高可能性。

本发明的首要目的是通过以下方式实现的。

一种千年桐带芽茎段外植体消毒的方法，包括以下步骤：

(1)外植体的获得：在室内或者楼顶上种植千年桐幼苗，待幼苗长到25-35cm时即用当年生半木质化带芽茎段作为外植体材料；

(2)外植体的处理:将千年桐当年生半木质化的带芽茎段切成3-4cm长带单芽的茎段，用洗衣粉清洗1-2次，再用流水冲洗至少20min；

(3)外植体的消毒：将流水冲洗之后的半木质化的带芽茎段用75％的酒精浸泡1min，换新的75％的酒精再浸泡1min，无菌水冲洗3次，再用0.1％的升汞消毒45min，中间每15min换一次升汞，共换3次，最后无菌水冲洗5-6次。

本发明前期经过大量实验发现，千年桐带芽茎段进行消毒非常困难，尝试过多种消毒灭菌方式，发现污染率一直居高不下，经过多次尝试，最终得到了有效的解决方法，进行多次实验，发现效果非常显著。

本发明的第二个目的是提供千年桐当年生半木质化带芽茎段外植体直接诱导产生完整植株的方法,该方法通过带芽茎段外植体灭菌直接诱导腋芽，诱导率高，生长状况好。本发明主要通过腋芽诱导(即初代培养)，生根培养等方面进行探索，形成一套适合千年桐组织培养快繁技术体系,为千年桐的的工厂化育苗及以后转基因技术打下了基础。

一种诱导千年桐当年生半木质化带芽茎段快速增殖的方法，包括以下步骤：

(1)腋芽诱导：将消毒好的带单芽的千年桐茎段接种到1/2MS+0.1-2.0mg/L 6-BA+0.1mg/L IAA+0-0.2mg/L GA₃的培养基中进行诱导培养，暗培养后转到光照条件下进行培养；

(2)生根培养：将茎段分化得到的健壮腋芽切下接种到1/2MS+0.5-2.0mg/L IBA+0-1.0mg/L NAA的培养基中进行生根培养。

步骤(1)中诱导培养时使用的培养基优选为1/2MS+2.0mg/L 6-BA+0.1mg/L IAA。

步骤(2)中生根培养时使用的培养基优选为1/2MS+2.0mg/L IBA。

步骤(1)中腋芽诱导时暗培养36h后，转到光照条件下培养28-30天。

步骤(1)中培养温度为29±1℃，光照培养强度为2100-2200lx,光照培养时间12-14h/d。

上述的千年桐快速繁殖的方法,诱导培养基附加蔗糖30g/L,琼脂7g/L,pH调至5.5-5.8；生根培养基附加蔗糖20g/L,琼脂7g/L，pH调至5.5-5.8。

上述的千年桐当年生半木质化带芽茎段快速繁殖的方法，消毒好的带单芽的千年桐茎段采用前述的方法进行消毒。

此外,千年桐组织培养的研究比较少见。已研究的内容与本发明的区别及优势总结如下：

1、本发明采用的千年桐带芽茎段成功的培育出了千年桐组培苗,本发明具有生长周期短，初代培养腋芽诱导效果好,组培苗生长健壮的特点。

2、本发明利用千年桐带芽茎段从外植体的消毒处理，初代培养,生根培养及炼苗移栽等一系列过程,旨在建立一个高效稳定的千年桐组织培养快繁技术体系,为千年桐的工厂化育苗及转基因提供技术基础。

3、本发明在前期实验中，利用千年桐的茎段进行腋芽诱导及生根培养，虽然获得了生长旺盛的植株，但污染率和褐化率很高，无菌组培苗难以获得。经过大量的对比试验，最终获得了适合千年桐带芽茎段外植体消毒的最佳消毒方法。

4、本发明利用千年桐带芽茎段初代培养诱导出的生长健壮的腋芽直接诱导生根，生根效果好，幼苗生长旺盛，培育周期大大缩短。

5、本发明通过诱导培养可以获得再生植株，但经过初代培养诱导获得的腋芽存在生根困难的问题。本发明通过大量试验得到了适合千年桐腋芽诱导后直接生根培养的配方,与同属的油桐带芽茎段组织培养相比，本发明简单易行，操作方便。

6、本发明与同属的油桐带芽茎段组织培养相比，本发明的重点之一在于外植体的消毒灭菌，且千年桐外植体材料消毒灭菌效果显著，污染率得到了很好的控制，为后续的培养提供了重要的保障。

7、本发明的另外一个重点在于千年桐带芽茎段腋芽的直接生根，唐春艳等人用油桐的带芽茎段进行组织培养，虽然得到了完整的植株，但实验过程相当复杂，要经过初代培养、增殖培养、壮芽培养、生根培养等一系列步骤，从初代培养至生根培养，需要80-95d的时间，本发明只需经过初代培养和生根培养，从初代培养，经过39-51d的时间，即可获得生长健壮的完整植株。同时，本发明的培养基及配方简单，操作方便，对比之下，本发明具有周期短，操作简单方便，降低成本，效果显著等特点。

附图说明

图1为本发明千年桐茎段接种初期的照片；

图2为本发明千年桐茎段接种初期的照片；

图3为本发明千年桐茎段消毒时间过长褐化，但仍然污染的照片；

图4为本发明千年桐茎段腋芽萌发长大，但仍然污染的照片；

图5为本发明千年桐茎段在加入GA₃的照片；

图6为本发明千年桐茎段在加入GA₃中培养时的照片；

图7为本发明千年桐腋芽诱导25d的照片；

图8为本发明千年桐腋芽诱导30d的照片；

图9为本发明千年桐茎段生根培养初期的照片；

图10为本发明千年桐茎段生根的照片；

图11为本发明千年桐茎段生根培养24d的照片；

图12为本发明千年桐茎段生根培养24d的照片；

图13为本实验过程中培养的千年桐无菌苗的照片。

具体实施方式

以下结合实施例旨在进一步说明本发明,而非限制本发明。

实施例1

依次进行以下操作:

1、外植体消毒处理：在2019年4-6月间的晴天上午,在楼顶选取当年粗度适中无病虫害、幼嫩的千年桐茎段,喷水后带回实验室将采集的茎段去除叶片后,用适量的洗衣粉冲洗1-2次，再用流水冲洗至少20min左右，再用无菌水冲洗干净后置于超净工作台中,用75％的酒精、0.1％的升汞消毒,设置不同时间梯度如表1。消毒过程中用镊子不断搅动,无菌水冲洗5-6遍,用无菌滤纸吸干茎段表面的水分,用无菌刀片切掉两端褐化的部分,将单芽茎段接种到培养基中统计污染率及褐化率；

表1不同消毒处理对千年桐茎段的消毒效果

最终确认本发明优选的消毒方法如下：

(1)外植体的处理:将千年桐当年生半木质化的带芽茎段切成3-4cm带单芽的茎段，用洗衣粉清洗1-2次，再用流水冲洗20min以上。

(2)外植体消毒：将处理之后的半木质化的带芽茎段用75％的酒精浸泡1min，换新的75％的酒精再浸泡1min，用无菌水冲洗3次，再用0.1％的升汞消毒45min，期间每15min换一次升汞，共换3次，最后用无菌水冲洗5-6次。

2、将消毒好的外植体接种到按照表2中激素配方的1/2MS培养基中进行腋芽诱导,暗培养36h,再到光照条件下培养28-30d,最高诱导率可达84.32％。附加蔗糖30g/L,琼脂7g/L,pH 5.5-5.8；培养温度为29℃,光照强度为2100-2200lx,光照时间12-14h/d。

表2不同植物生长调节剂对千年桐茎段初代培养的影响

最终确认本发明优选的腋芽诱导培养基为：1/2MS+2.0mg/L 6-BA+0.1mg/L IAA。

3、将初代培养得到的腋芽接种到按照表3中激素配方的1/2MS培养基中进行生根诱导,附加蔗糖20g/L,琼脂7g/L,pH 5.5-5.8。培养温度为29℃,光照强度为2100-2200lx,光照时间12-14h/d。

表3不同激素配比对千年桐试管苗生根的影响

最终确认本发明优选的生根培养基为：1/2MS+2.0mg/L IBA。

将背景技术中提到的油桐专利从上到下依次编号为D1、D2、……D7,本发明为D8,对其从初代培养至形成完整植株所需时长进行分析：

D1:201310271826.7一种油桐叶片再生植株的方法

D2:201410326807.4油桐下胚轴愈伤组织诱导及高效再生植株的方法

D3:201410327567.X一种油桐叶柄高效直接再生植株的方法

D4:201910934260.9一种物理辅促油桐带芽茎段再生植株的方法

D5:201610089435.7一种利用油桐下胚轴为外植体直接诱导植株再生的方法

D6:201010252415.X一种农杆菌介导的小油桐基因转化方法

D7:201710077542.2油桐组培苗瓶内生根的方法

表4不同培养方式对培养时长的影响

由于，油桐和千年桐品种的差异，本发明的千年桐外植体采用上述专利中对油桐的一些初代或者增殖培养基，以及生根培养基代替本发明的初代诱导培养基和生根培养基对本发明千年桐的带芽茎段进行培养，都不适合，其诱导和生根效果极差，均远远不及本发明培养基。

在上表中，D4为本申请人课题组之前的专利，因此，完全了解该技术方案，该方案利用物理诱导促进油桐再生植株所经培养过程较多，还需要物理手段的辅助，在培养时间上远远超过本发明，且关键是该方案中的带芽茎段诱导培养基和生根培养基，以及培养方式均不适合本发明千年桐的培养，因此，本发明才重新探索了针对千年桐的培养方案；D6为一种农杆菌介导的小油桐基因转化方法，与本发明的主要方向相差较大，且所经培养过程较多，所以培养时间较长。通过上表中的数据可以明显的看出，本发明在培养时间上具有极大的优势，本发明从千年桐带芽茎段初代培养至长出根系，比其他专利所需时间几乎都缩短了两倍以上，充分的表现出了本发明最大的特点，即育种周期缩短，操作简单易行，培育成本降低，为工厂化育苗和转基因技术的发展提供了基础。

Claims (4)

1.一种诱导千年桐当年生半木质化带芽茎段快速增殖的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）腋芽诱导：将消毒好的带单芽的千年桐茎段接种到1/2 MS+ 2.0 mg/L 6-BA+ 0.1mg/L IAA的培养基中进行诱导培养，暗培养后转到光照条件下进行培养；

（2）生根培养：将茎段分化得到的健壮腋芽切下接种到1/2 MS+ 2.0 mg/L IBA的培养基中进行生根培养；

千年桐带芽茎段外植体消毒的方法如下：

1）外植体的获得：在室内或者楼顶上种植千年桐幼苗，待幼苗长到25-35cm时即用当年生半木质化带芽茎段作为外植体材料；

2）外植体的处理:将千年桐当年生半木质化的带芽茎段切成3-4cm长带单芽的茎段，用洗衣粉清洗1-2次，再用流水冲洗至少20min；

3）外植体的消毒：将流水冲洗之后的半木质化的带芽茎段用75%的酒精浸泡1min，换新的75%的酒精再浸泡1 min，无菌水冲洗3次，再用0.1%的升汞消毒45 min，中间每15 min换一次升汞，共换3次，最后无菌水冲洗5-6次。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中腋芽诱导时暗培养36h后，转到光照条件下培养28-30天。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）培养温度为29±1℃，光照培养强度为2100-2200 lx, 光照培养时间12-14 h/d。

4.根据权利要求1所述的方法, 其特征在于，诱导培养基附加蔗糖30 g/L, 琼脂7 g/L, pH调至5.5-5.8；生根培养基附加蔗糖20 g/L, 琼脂7 g/L，pH调至5.5-5.8。

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