CN112273231A - 一种诱导天门冬丛生芽增殖与植株再生的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种诱导天门冬丛生芽增殖与植株再生的方法，以种子无菌萌发苗的带腋芽茎段为外植体进行腋芽诱导、丛生芽增殖、生根培养、炼苗移栽获得天门冬植株再生。采用本发明的方法，腋芽诱导率可达85.05％，丛生芽增殖倍数达3.65，生根率达78.27％，移栽成活率达87.10％，能有效降低生产成本，缩短组培快繁周期，可在天门冬规模化种苗繁育及资源保护中加以应用。

Description

一种诱导天门冬丛生芽增殖与植株再生的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种诱导天门冬丛生芽增殖与植株再生的方法。
技术背景
天门冬Asparagus cochinchinensis(Lour.)Merr.为百合科天门冬属多年生攀援草本植物，别名天冬、天冬草、大当门根等；天门冬始载于东汉《神农本草经》，以其干燥块根入药，具有滋阴润燥、清肺降火之功效，主治燥热咳嗽、阴虚痨嗽、热病津伤、内热消渴、肠燥便秘、咽喉肿痛等症。天门冬在我国药用历史悠久，同时集药用、食用、观赏价值与一身，其开发利用前景广阔。
近年来，因人们无节制的滥采滥挖，致使天门冬野生资源资源急剧下降，已被列为国家三级重点保护野生药材物种。因此，开展天门冬人工种植，对保护天门冬野生资源并实现其永续利用具有重要意义。目前，天门冬种苗的繁殖主要以种子繁殖与分株繁殖为主，但存在育苗周期长、繁殖倍数低、生产成本高等问题，难以满足规模化生产需求。通过组织培养手段可以建立天门冬的种苗快繁技术，尤其是本课题组研究建立的丛生芽增殖与植株再生技术，已为实现天门冬种苗的产业化奠定了良好基础。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种诱导天门冬丛生芽增殖与植株再生的方法，克服现有技术中外植体诱导困难、丛生芽增殖效率低等问题。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了一种诱导天门冬丛生芽增殖与植株再生的方法，以种子无菌萌发苗的带腋芽茎段为外植体进行腋芽诱导、丛生芽增殖培养、生根培养、炼苗与移栽。具体步骤如下：
(1)种子处理与萌发成苗：选取成熟饱满的天门冬种子，用98％浓硫酸浸泡4-6min，35℃温水浸泡4-6h；置于超净工作台上再依次用75％酒精浸泡0.5-1min、0.1％升汞浸泡10-12min、无菌水冲洗3-5次备用；将种子接种于成苗培养基上，在温度25±2℃，光照强度为2500-3000lx，光照时间为12h/d培养条件下，诱导种子产生无菌萌发苗，其种子萌发成苗培养基为：MS+GA30.5 mg/L+6-BA 1.0mg/L+KT 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8-6.0；
(2)腋芽萌发：选取生长健壮的芽苗，切取带腋芽茎段，接入腋芽诱导培养基，腋芽诱导培养基为：MS+NAA 0.1mg/L+6-BA 1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8-6.0。培养条件同种子萌发(下同)；
(3)丛生芽增殖：切下腋芽萌发的单芽或丛生芽，接入增殖培养基上，增殖培养基为：MS+6-BA0.5 mg/L+KT 1.5mg/L+IAA 1.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8-6.0。如增殖培养过程中出现褐化现象，则在增殖培养基中添加0.5g/L的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)继代培养；
(4)生根培养：当丛生芽生长到3cm以上时，切下2-3个芽的芽块接种于生根培养基上进行生根培养，生根培养基为：1/2MS+PUT 1.0mg/L+IAA 1.5mg/L+IBA 1.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8-6.0；当生根过程中出现褐化现象时，在生根培养基中添加0.5g/L的活性炭(AC)；
(5)炼苗与移栽：将有两条根以上、茎枝舒展的生根苗，于组培室中打开瓶盖炼苗8～10d后，取出生根苗洗净根部培养基，移栽到椰糠:珍珠岩:园土＝2:2:1(体积比)的混合基质中；移栽时根宜浅至基质完全覆盖根发生部位，确保根系与基质充分接触，让组培苗保持挺拔状态；压实并浇透水后放置于透光率为20％-30％的环境中；缓苗一周后，每隔15d浇施稀释1000倍的花多多复合肥(N:P:K＝1:1:1)，采用见干见湿方法浇水。
优选的，步骤(2)所述种子萌发苗为生长健壮，高3cm以上。
优选的，步骤(3)当15-20d后腋芽萌发，选取腋芽诱导率高于60％且生长健壮的单芽与丛生芽切下接种于增殖培养基上。
本发明的有益效果：
(1)克服了天门冬种子繁殖与分株繁殖周期长、繁殖系数低等缺陷。
(2)本发明通过诱导种子萌发成苗，获得种子萌发苗，以其带芽茎段为外植体，此外植体材料来源不受母体年龄与时间的限制，且植株再生频率高，腋芽诱导率达85.05±4.35％，丛生芽增殖倍数达3.65±0.10，生根率达78.27±2.56％，移栽成活率达87.10±1.08％；可在天门冬规模化种苗繁育及资源保护中加以应用。
(3)本发明所述组织培养方案，不经过愈伤组织诱导培养阶段，将天门冬组织培养周期缩短20-50d；通过腋芽诱导、增殖培养，如此反复，可极大提高丛生芽诱导效率，降低生产成本。
附图说明
此处所说明的附图用以提供对本申请的进一步理解，并构成本申请的一部分。
图1：A为天门冬种子；B为种子在萌发成苗培养基上培养36d时的生长情况；C为选取的健壮芽苗；D为带腋芽茎段；
图2：A为0.5-1.0cm茎段在诱导培养基上培养21d时芽生长情况；B-C为单芽和丛生芽在增殖培养基上21d的增殖效果；
图3：A为在生根培养基上27d的生长情况；B为生根苗；C为移栽60d时的组培苗生长情况。
具体实施方式
将以下实施例来详细说明本发明的实施方式，对本发明如何应用技术手段来解决技术问题，并以此达成技术功效的实现过程，据实施例能充分理解并据以实施。
实施例1
(1)种子处理与萌发成苗
本实施例中的植物材料天门冬(Asparagus cochinchinensis(Lour.)Merr.)种子来自贵州省务川县天门冬种植基地。选取成熟饱满的天门冬种子，用98％浓硫酸浸泡4min，35℃温水浸泡4h后，置于超净工作台上再依次用75％酒精浸泡0.5-1min、0.1％升汞浸泡10-12min、无菌水冲洗3-5次备用；将种子接种于成苗培养基上，在温度25±2℃、光照强度为2500-3000lx、光照时间为12h/d培养条件下，诱导萌发成苗；所用萌发成苗培养基为MS+GA30.5 mg/L+6-BA 1.0mg/L+KT 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8-6.0；培养15d时，种子开始露白，培养36d左右芽苗生长到3cm以上，生长良好。
(2)腋芽萌发
选取高于3cm以上，生长良好的无菌萌发苗，在无菌环境下，将其用解剖刀切为0.5-1.0cm的带腋芽茎段，接种于腋芽诱导培养基上，在上述实施例1培养条件下培养，所用腋芽诱导培养基为：MS+NAA 0.1mg/L+6-BA 1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8-6.0，其诱导率为85.05±4.35％，芽生长健壮。
(3)丛生芽增殖
将萌发的单芽或丛生芽，切下接种于增殖培养基上，于2500-3000lx下培养，所用增殖培养基为：MS+6-BA 0.5mg/L+KT 1.5mg/L+IAA 1.5mg/L+PVP 0.5g/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8-6.0，培养21d后，其增殖倍数达3.65±0.10。
(4)生根培养
当丛生芽生长到3cm以上时，切下2-3株芽的芽块接种于生根培养基上进行生根培养。生根培养基为：1/2MS+PUT 1.0mg/L+IAA 1.5mg/L+IBA 1.5mg/L+AC 0.5g/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8-6.0。在生根培养基上生长27d后，其生根率达78.27±2.56％，根数5.22±0.42，生长状态良好。
(5)炼苗与移栽
将有两条根以上、茎叶舒展的生根苗，置于组培室中，拧松瓶盖3d，再打开瓶盖5-7d。炼苗完成后，取出生根苗洗净根部培养基，移栽到椰糠:珍珠岩:园土＝2:2:1(体积比)的混合基质中，将上述所得组培苗栽入口径12cm、高10cm的营养钵中，根宜浅至基质完全覆盖根发生部位，让组培苗保持挺拔状态，且移栽时根系与基质充分接触，压实并浇透水后放置在透光率为20％-30％的环境中。缓苗一周后，每隔15d浇施稀释1000倍的花多多复合肥(N:P:K＝1:1:1)，采用见干见湿方法浇水。生长60d时，成活率达86.11±1.62％，根冠比为1.04±0.03，壮苗指数为0.87±0.06，生长健壮。
实施例2
(1)种子处理与萌发成苗
本实施例中的植物材料天门冬(Asparagus cochinchinensis(Lour.)Merr.)种子来自贵州省务川县天门冬种植基地。选取成熟饱满的天门冬种子，用98％浓硫酸浸泡4min，35℃温水浸泡4h后，置于超净工作台上再依次用75％酒精浸泡0.5-1min、0.1％升汞浸泡10-12min、无菌水冲洗3-5次备用；将种子接种于成苗培养基上，在温度25±2℃、光照强度为2500-3000lx、光照时间为12h/d培养条件下，诱导萌发成苗；所用萌发成苗培养基为MS+GA31.0 mg/L+6-BA 1.5mg/L+KT 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8-6.0；培养15d时，种子开始露白，培养36d左右芽苗生长到3cm以上。
(2)腋芽萌发
选取高于3cm以上，生长良好的无菌萌发苗，在无菌环境下，将其用解剖刀切为0.5-1.0cm的带腋芽茎段，接种于腋芽诱导培养基上，在上述实施例1培养条件下培养，所用腋芽诱导培养基为：MS+NAA 0.1mg/L+6-BA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8-6.0。其芽诱导率为77.15±4.55％，芽生长良好。
(3)丛生芽增殖
将萌发的单芽或丛生芽，切下接种于增殖培养基上，于2500-3000lx下培养，所用增殖培养基为：MS+6-BA 0.5mg/L+KT 1.0mg/L+IAA 1.0mg/L+PVP 0.5g/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8-6.0，培养21d后，其增殖倍数为2.74±0.24。
(4)生根培养
当丛生芽生长到3cm以上时，切下2-3株芽的芽块接种于生根培养基上进行生根培养。生根培养基为：1/2MS+PUT 1.0mg/L+IBA 0.5mg/L+AC 0.5g/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8-6.0。在生根培养基上生长27d后，其生根率达71.36±1.92％，根数3.60±1.20，生长状态良好。
(5)炼苗与移栽
将有两条根以上、茎叶舒展的生根苗，置于组培室中，拧松瓶盖3d，再打开瓶盖5-7d。炼苗完成后，取出生根苗洗净根部培养基，移栽到椰糠:珍珠岩:蛭石＝1:1:1(体积比)的混合基质中，将上述所得组培苗栽入口径12cm、高10cm的营养钵中，根宜浅至基质完全覆盖根发生部位，让组培苗保持挺拔状态，且移栽时根系与基质充分接触，压实并浇透水后放置在透光率为20％-30％的环境中。缓苗一周后，每隔15d浇施稀释1000倍的花多多复合肥(N:P:K＝1:1:1)，采用见干见湿方法浇水。生长60d时，成活率达87.10±1.08％，根冠比为1.06±0.07，壮苗指数为1.10±0.02，根系发达，生长健壮。
上述实施例仅例示性说明本发明的方法与原理，而非用于限制本发明。对本领域普通技术人员来说，在本发明方法与原理下，能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (8)

1.一种诱导天门冬丛生芽增殖与植株再生的方法，其特征在于，包括以种子无菌萌发苗的带腋芽茎段为外植体进行腋芽萌发培养、丛生芽增殖培养、生根培养、炼苗移栽，具体步骤如下：
(1)种子处理与萌发成苗：选取成熟饱满的天门冬种子，用浓硫酸浸泡4-6min，温水浸泡4-6h；再依次用75％酒精浸泡0.5-1min，汞浸泡10-12min，无菌水冲洗3-5次备用；将种子接种于成苗培养基上，pH5.8-6.0，在温度为25±2℃、光照强度为2500-3000lx、光照时间为12h/d培养条件下，诱导种子萌发产生无菌苗；
(2)腋芽萌发：选取生长健壮的无菌芽苗，切取带腋芽茎段，接入腋芽诱导培养基上，pH5.8-6.0，使腋芽萌发产生单芽或丛生芽；培养条件同种子萌发；
(3)丛生芽增殖：切下腋芽萌发的单芽或丛生芽，接入增殖培养基上，pH5.8-6.0，使其增殖；
(4)生根培养：当丛生芽生长到3cm以上时，切下带2-3个芽的芽块接种于生根培养基上，pH5.8-6.0，使其生根形成再生植株；
(5)炼苗与移栽：将有两条根以上、茎枝舒展的生根苗，于组培室中打开瓶盖炼苗8-10d，取出生根苗洗净根部培养基，移栽入体积比为椰糠∶珍珠岩∶园土＝2∶2∶1的混合基质中。
2.根据权利要求1所述一种诱导天门冬丛生芽增殖与植株再生的方法，其特征在于，所述的成苗培养基为MS+GA30.5 mg/L+6-BA 1.0mg/L+KT 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L。
3.根据权利要求1所述一种诱导天门冬丛生芽增殖与植株再生的方法，其特征在于，步骤(2)所述无菌芽苗为生长健壮，高3cm以上。
4.根据权利要求1所述一种诱导天门冬丛生芽增殖与植株再生的方法，其特征在于，所述的腋芽诱导培养基MS+NAA0.1 mg/L+6-BA 1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L。
5.根据权利要求1所述一种诱导天门冬丛生芽增殖与植株再生的方法，其特征在于，所述的增殖培养基MS+6-BA 0.5mg/L+KT 1.5mg/L+IAA 1.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L。
6.根据权利要求1所述一种诱导天门冬丛生芽增殖与植株再生的方法，其特征在于，步骤(3)当15-20d后腋芽萌发，选取腋芽诱导率高于60％且生长健壮的单芽与丛生芽切下接种于增殖培养基上，如增殖培养过程中出现褐化现象，则在增殖培养基中添加0.5g/L的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)继代培养。
7.根据权利要求1所述一种诱导天门冬丛生芽增殖与植株再生的方法，其特征在于，所述的生根培养基1/2MS+腐胺(PUT)1.0mg/L+IAA 1.5mg/L+IBA 1.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L。
8.根据权利要求1所述一种诱导天门冬丛生芽增殖与植株再生的方法，其特征在于，步骤(4)当生根过程中出现褐化现象时，在生根培养基中添加0.5g/L的活性炭即可。
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