JP5710155B2 - 植物細胞培養培地及びこれを利用した植物細胞培養方法 - Google Patents
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ではなく本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変形実施可能である。例えば、上述の実施形態では、アブラギリ属植物及びナンヨウアブラギリ属植物の具体例として、シナアブラギリを用いた場合について説明したが、シナアブラギリ以外にも例えばアブラギリ、カントンアブラギリ、ククイノキ、フィリピンアブラギリ、ナンヨウアブラギリ、サンゴアブラギリ、モミジバサンゴアブラギリ、ニシキサンゴ、ナンヨウザクラ、アカバヤトロファ、サケバヤトロファ等に適用することも可能である。
シナアブラギリは4〜5月に開花し受粉と受精を経て結実する。その際、前胚乳組織は***と増殖を繰り返し、その後油脂合成を開始して10月頃には高レベルの油脂を蓄積する。培養細胞調製のためには***及び増殖能力を維持した肥大前の胚乳を単離する必要があるが、自生するシナアブラギリ胚乳発生時期の詳細は明らかではない。そこで、開花後のシナアブラギリ果実を収集し、培養細胞開発に適した発育時期及び種子の大きさを決定した。実験材料としては、静岡県島田市に自生するシナアブラギリを用いた。
(実施例1)
未成熟種子を結実後1〜4ヶ月と推定される未成熟果実から採種した。未成熟果実は3〜4個の子房で構成され1室あたり1つの胚珠(未成熟種子)を含んでいた。その未成熟種子は70体積%エタノールに10分間浸漬し、種子表面を滅菌した後に殻を取り除いて、長径と短径とをスケールで計測した。その結果を図2に白丸で示す。その結果、結実4ヶ月までは両軸方向へ種子生長が直線的に進行することが明らかとなった(R2 =0.9137)。また、得られた短径/長径比のヒストグラムを図3に白抜きで示す。
成熟種子を自然落下していた乾果から採種した。その殻を取り除いた後に、長径と短径とをスケールで計測した。その結果を図2に黒丸で示す。その結果、成熟種子では長径16.9〜23.0mm、短径13.5〜20.4mmであり、結実4ヶ月を超えると短径方向へ生長することが判明した。また、得られた短径/長径比のヒストグラムを図3に黒抜きで示す。
胚乳肥大時期と発達方向の詳細を明らかにするため、短径サイズを元に採種した未成熟種子の発達過程を4ステージに分類して実体顕微鏡観察を行った。短径1〜4mmの種子をステージI(推定:結実1ヶ月以内)、4〜8mmの種子をステージII(推定:結実2ヶ月以内)、8〜12mmの種子をステージIII(推定:結実3ヶ月以内)、12mm以上の種子をステージIV(推定:結実4ヶ月以内)として分類した(表1)。
ステージIの未成熟種子を用いて観察を行った。その結果、シナアブラギリ胚珠では基部に長径0.5〜1mmの受精胚が観察され、透明な扁平構造の胚乳に内包されていた(図4(A),(B))。この時期の胚では既に幼根、胚軸、子葉の分化が認められ、内部の維管束構造も観察された(図4(C))。
ステージIIの未成熟種子を用いて最長短径部から横断切片を作製し観察を行った。その結果、発達した珠心が認められる一方で、子葉周りに約1mmの胚乳層が観察された(図5)。
ステージIIIの未成熟種子を用いて果皮および珠心を除去し胚乳の観察を行った。さらに、胚乳の基部から厚さ1.5〜2.0mmの連続切片を形成し順に並べ比較した。その結果、この時期には基部付近でのみ胚乳肥大が認められる胚珠が存在した(図6(A)(B))。また、連続切片では、基部の胚乳肥大部では全体が、端部では表層が成熟胚乳と同様に乳白色へと変化していた(図6(C)(D))。この結果は、シナアブラギリ種子では珠心に近傍する胚乳表層から順次成熟し、基部から端部へと成熟が進行することを示している。
ステージIVの未成熟種子を用いて観察を行った。その結果、既に胚乳肥大がほぼ完了し、珠心の挫滅が観察された(図7)。
シナアブラギリ植物片からのカルス誘導(細胞の脱分化)に際する各種条件を検討した。使用した植物片は、ステージIIIの果皮を除去した胚珠端部(子葉を含まない)をアンチホルミン(有効塩素濃度1重量%)に5分間浸漬した後、蒸留水で3回洗浄したものとした。この植物片は、珠皮、珠心、胚乳から構成される。
カルス誘導に際して、2種の植物ホルモン(オーキシン、サイトカイニン)の濃度条件を検討した。培養は23℃、16時間日長の培養室で行い、1ヶ月培養後にカルス形成の有無を実体顕微鏡下で判定した。
2,4−Dを単独で添加した場合は、いずれの濃度(5,10,20μmol/L)でも置床した植物片からはカルス形成は認められなかった(表2)。
IAAを単独で添加した場合は、2,4−Dと同様にいずれの濃度(5,10,20μmol/L)でもカルス形成は全く観察されなかった(表3、図1)
BAを単独で添加した場合は、カルス形成は11.1〜22.2%と低頻度で観察された(表2,3、図1)。
BA及び2,4−Dの両方を添加した場合は、全ての実験区でカルス形成が認められた(表2)。BA:10μmol/L、2,4−D:10μmol/L添加培地(実施例9)で、カルス形成率が最高の77.8%となった。これはBA:10μmol/Lのみを添加した比較例10のカルス形成率11.1%と2,4−D:10μmol/Lのみを添加した比較例4のカルス形成率0%とを合計した値より飛躍的に大きくなった。
BA及びIAAの両方を添加した場合は、全ての実験区でカルス形成が認められた(表3、図1)。また、図1に示すように、カルスにおいて、胚乳からの増殖細胞(図中、明色*)及び珠皮からの増殖細胞(図中、暗色*)が観察された。一方、珠心からの細胞増殖は観察されなかった。そして、BA:10μmol/L、IAA:10μmol/L添加培地(実施例18)で、カルス形成率が最高の100%となった。これはBA:10μmol/Lのみを添加した比較例13のカルス形成率11.1%とIAA:10μmol/Lのみを添加した比較例7のカルス形成率0%とを合計した値より飛躍的に大きくなった。
継代カルスにおける好適な培養温度の検討を行った。
カルス塊を継代した後に、温度16〜27℃で2週間培養した(表4)。その結果、増殖が認められた。特に、温度23℃(実施例24)で、カルス形成率が最高の100%となった。
カルス塊を継代した後に、温度4、33℃で2週間培養した(表4)。その結果、増殖は認められなかった(表4)。
Claims (4)
- 植物細胞を培養するための基本培地に、サイトカイニンを5〜20μmol/L及びオーキシンを5〜20μmol/L添加し、前記サイトカイニンはベンジルアデニンであり、前記オーキシンは3−インドール酢酸及び/又は2,4−ジクロロフェノキシ酢酸であることを特徴とするアブラギリ属植物またはナンヨウアブラギリ属植物の胚乳細胞培養用の植物細胞培養培地。
- 請求項1に記載の植物細胞培養培地を用いて、アブラギリ属植物またはナンヨウアブラギリ属植物の胚乳細胞を培養することを特徴とする植物細胞培養方法。
- 前記アブラギリ属植物またはナンヨウアブラギリ属植物はシナアブラギリ(Aleurites fordii)であると共に、前記胚乳は短径が8〜12mmの種子から収集したことを特徴とする請求項2に記載の植物細胞培養方法。
- 前記培養の培養温度は16〜27℃であることを特徴とする請求項2又は3に記載の植物細胞培養方法。
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