CN112745384A

CN112745384A - 猪pd-l14qn-gf表位多肽及其应用

Info

Publication number: CN112745384A
Application number: CN202110052246.3A
Authority: CN
Inventors: 岳锋; 王选年; 史叶萍; 周娟娟; 孙国鹏; 李鹏; 朱艳平; 郭东光; 张欣欣
Original assignee: Xinxiang University
Current assignee: Xinxiang University
Priority date: 2021-01-15
Filing date: 2021-01-15
Publication date: 2021-05-04

Abstract

本发明涉及一种猪PD‑L14QN‑GF表位多肽，其氨基酸序列为QDAQINECLIGYGGASFPRITLKVN。本发明的多肽PD‑L14QN‑GF具有与PD‑L1蛋白上对应序列高度一致的空间结构，确保改良后多肽PD‑L14QN‑GF具有更有效的受体识别能力。本发明将两个关键亲水氨基酸突变为结构相近的疏水氨基酸，通过增强疏水作用力增加了与PD‑1蛋白的亲和力，从而发挥出更显著的免疫效应。在PBMC细胞增殖实验中，本发明的表位多肽PD‑L14QN‑GF细胞增殖百分比为42.4％，能显著减缓PRRSV增殖效率，下调PD‑1的表达，能显著的上调IFN‑γ及IL‑2基因的表达与分泌。在体内实验中，改良的多肽PD‑L14QN‑GF能作为免疫佐剂显著提升PCV2疫苗免疫后的抗体保护率，相对于正常免疫组升高近2倍。

Description

猪PD-L14QN-GF表位多肽及其应用

技术领域

本发明涉及一种猪PD-L14QN-GF表位多肽及其应用，属于动物分子免疫学领域。

背景技术

目前，猪瘟(CSF)、猪断奶后多***衰竭综合征(PMWS)和猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)等多种病毒性疾病对我国养猪业造成巨大经济损失。不少学术研究认为猪PD-1/PD-Ls通路活化是CSFV、PCV2或PRRSV感染引起免疫功能损伤或免疫抑制的重要致病机制之一。如淋巴细胞性脉络丛脑炎病毒(LCMV)、人免疫缺陷病病毒(HIV)、乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)等，多种慢性或持续性病毒感染过程中，PD-1过量表达，活化免疫负调节信号通路，造成机体免疫功能损伤或免疫抑制。

在感染HIV-1的病人体内，嗜中性粒细胞高表达PD-L1，与T细胞表达PD-1和CD57成正相关，通过PD-1/PD-L1通路活化，抑制T细胞免疫功能。目前，抗PD-1或PD-Ls的单克隆抗体治疗病毒性疾病已经进入临床研究阶段。PD-1与PD-L1相互识别能产生负免疫调节信号，该信号通路被激活后可引起免疫功能下降，阻断PD-1与PD-L1的结合可以逆转上述免疫抑制机制，可以恢复免疫细胞的功能，有助于提高机体的免疫***清除病毒的能力，这也为阻断PD-1/PD-L1介导的感染性疾病免疫疗法提供了可靠的理论基础。抗体阻断PD-1/PD-L1通路是目前研究的主要领域，但是抗体药物易引发免疫相关不良反应，且价格昂贵，而小分子多肽类药物能避免抗体药物难以被快速清除的缺点，毒副作用小，是阻断PD-1/PD-L1通路的新策略。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种猪PD-L14QN-GF表位多肽及其应用。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种猪PD-L14QN-GF表位多肽，其氨基酸序列为：QDAQINECLIGYGGASFPRITLKVN。

所述的猪PD-L14QN-GF表位多肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)筛选多肽PD-L14：多肽PD-L14的序列位于猪PD-L1蛋白的FG loop区域，起始自第106位氨基酸Ala截止到第126位氨基酸Lys，氨基酸序列为：

AQINECLISYGGASYPRITLK；

(2)优化多肽PD-L14：在多肽PD-L14序列的头尾两端各延长2个氨基酸，起始自第104位氨基酸Gln截止到第128位氨基酸Asn，得到多肽PD-L14QN，其氨基酸序列为：QDAQINECLISYGGASYPRITLKVN；

(3)多肽PD-L14QN的突变：将多肽PD-L14QN的氨基酸序列中第123位氨基酸Tyr突变为Phe，得到多肽PD-L14QN-F，其氨基酸序列为：

QDAQINECLISYGGASFPRITLKVN；

(4)多肽PD-L14QN-F的突变：将多肽PD-L14QN-F的氨基酸序列中第117位氨基酸Ser突变为Gly，得到多肽PD-L14QN-GF，其氨基酸序列为：

QDAQINECLIGYGGASFPRITLKVN。

所述的猪PD-L14QN-GF表位多肽作为免疫佐剂在制备PCV2疫苗中的应用。

所述的猪PD-L14QN-GF表位多肽作为免疫佐剂在制备CSFV疫苗中的应用。

所述的猪PD-L14QN-GF表位多肽作为免疫佐剂在制备PRRSV疫苗中的应用。

所述的猪PD-L14QN-GF表位多肽作为免疫佐剂在制备PRV疫苗中的应用。

所述的猪PD-L14QN-GF表位多肽在制备提高体液免疫药物中的应用。

所述的猪PD-L14QN-GF表位多肽在制备提高细胞免疫药物中的应用。

本发明有益效果

本发明改良后的多肽PD-L14QN-GF具有与PD-L1蛋白上对应序列高度一致的空间结构，确保了改良后多肽PD-L14QN-GF较PD-L14具有更有效的受体识别能力。另外，将两个关键亲水氨基酸突变为结构相近的疏水氨基酸，相较与未做突变的PD-L14，改良多肽PD-L14QN-GF通过增强疏水作用力增加了与PD-1蛋白的亲和力，从而发挥出更显著的免疫效应，具有更显著的免疫调节功能，为研制新型免疫调节佐剂奠定基础。

在PBMC细胞增殖实验中，本发明改良表位多肽PD-L14QN-GF和PD-L14细胞增殖百分比分别为42.4％和27.7％。改良多肽PD-L14QN-GF较PD-L14能更显著的减缓PRRSV增殖效率，下调PD-1的表达；并且能更显著的上调IFN-γ及IL-2基因的表达与分泌。在体内实验中，改良多肽PD-L14QN-GF能作为免疫佐剂显著提升PCV2疫苗免疫后的抗体保护率，PD-L14QN-GF组的抗体滴度较PD-L14组提高1.5倍以上，相对于正常免疫组升高近2倍。

附图说明

图1为多肽空间构象的三维模型结构；

其中：A，涵盖多肽PD-L14片段原始结构的多肽PD-L1三维模型结构；B，多肽PD-L14moden1预测三维模型结构；C，多肽PD-L14QN moden1预测三维模型结构；D，多肽PD-L14QN-F moden1预测三维模型结构；E，多肽PD-L14QN-GF moden1预测三维模型结构；

图2为PD-L1蛋白103-132序列比对结果；

其中：Mus，小鼠；Homo，人类；cat，家猫；dog，狗；bos，牛；pig，猪；cons，一致度；

图3为流式细胞术对PBMC细胞增殖能力的测定结构；

其中，PE-A表示荧光信号强度，count表示细胞数；

图4为多肽刺激后PRRSV载量变化的分析图；

其中，PRRSV load表示PRRSV载量；ns表示无显著性差异，*表示有统计学差异(P<0.05)，**表示差异显著(P<0.01)，***表示差异极显著(P<0.001)，下图5-10同；

图5为多肽刺激后PD-1转录变化的分析图；

其中，Relative levels ofmRNA表示相对表达量；

图6为多肽刺激后细胞因子转录变化的分析图；

其中，Relative levels ofmRNA表示相对表达量；

图7为多肽刺激后IL-2分泌情况的分析图；

图8为多肽刺激后IFN-γ分泌情况的分析图；

图9为多肽刺激后IL-10分泌情况的分析图；

图10为仔猪疫苗免疫后的抗体滴度。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

实施例1多肽PD-L14的筛选及长度优化

多肽PD-L14的筛选：根据计算机重新构建的猪PD-1/PD-L1复合体结构以及作用面分析结果，对多肽的原始空间结构进行解析，筛选得到多肽PD-L14。多肽PD-L14的序列位于猪PD-L1蛋白的FG loop区域，起始自第106位氨基酸Ala截止到第126位氨基酸Lys，涵盖了一个完整的loop区且包含热点氨基酸Ala121、Asp122、Tyr123和Arg125，氨基酸序列为：AQINECLISYGGASYPRITLK(SEQ ID NO：1)。

多肽PD-L14的优化：由蛋白作用面分析可知，多肽PD-L14所在的片段形成发夹的二级结构，Tyr118、Gly119、Gly120、Lys131、Ala121形成β转角，其转折点的中心位于Gly119。以Gly119为中心，截取PD-L14多肽长度优化后的多肽PD-L14QN。多肽PD-L14QN是在多肽PD-L14序列的头尾两端各延长2个氨基酸，起始自第104位氨基酸Gln截止到第128位氨基酸Asn，得到多肽PD-L14QN，其氨基酸序列为：QDAQINECLISYGGASYPRITLKVN(SEQ ID NO：2)。

使用蛋白质三级结构在线软件QUARK对多肽进行从头计算法预测空间构像，moden1为出现概率最高构像。分析可知，涵盖多肽PD-L14片段原始结构的多肽PD-L1三维模型结构，该段肽链顶部Tyr118、Gly119、Gly120构成转角，Gly119为转角中心，Arg125与Cys113对称，两残基的R基均朝向与PD-1的结合面，如图1A所示。多肽PD-L14预测三维模型结构，多肽PD-L14顶部Tyr118、Gly119、Gly120构成的转角较原始结构错位，Gly119、Gly120两个氨基酸残基构成转角中心，Arg125与Cys113不能对称，且两残基的R基面相相反的方向，未能保持原有的空间结构，如图1B所示。多肽PD-L14QN预测三维模型结构，多肽PD-L14QN顶部TYR118、GLY119、GLY120构成转角，ARG125与CYS113对称，与涵盖多肽PD-L14片段原始结构的多肽PD-L1三维模型结构高度相似，如图1C所示。因此，优化后的多肽PD-L14QN相对于多肽PD-L14能较稳定的保持原始空间构像，可作为多肽PD-L14的长度优化方案。

实施例2多肽PD-L14的氨基酸残基突变方法

PD-1及PD-L1在多个物种间均有表达，本实验选取一些有代表性物种的氨基酸进行序列比对。它们分别来源于人类(Homo Sapiens)、猪(Sus scrofa)、牛(Bos taurus)、小鼠(Mus musculus)、家猫(Felis catus)、狗(Canis lupus familiaris)，有助于我们对猪PD-1及PD-L1的结构、功能、性质、同源性等方面的研究，为多肽设计的优化提供思路。Expresso是T-Coffee网站下特有的针对蛋白质的比对工具。利用Expresso将6条PD-L1蛋白序列进行多序列比对，结果如图2所示。

分析可知，猪PD-L1蛋白的Tyr123的苯环嵌入PD-1蛋白的疏水活性中心凹槽，与PD-1蛋白Tyr68的苯环形成π-π共扼，有效增强作用力。由于Tyr是亲水氨基酸，可将猪PD-L1表位多肽上对应Tyr的羟基去掉，突变为同样有苯环的疏水氨基酸Phe，既不影响π-π共扼，同时增加疏水作用力。猪PD-L1蛋白Ser117与PD-1蛋白疏水区域接触，不贡献化学键。Ser亲水不带电荷，猫源和狗源PD-L1蛋白的第117位是疏水的Gly，可将猪PD-L1表位多肽上对应的Ser突变为Gly。

因此，本申请表位多肽设计时，将Tyr123改为疏水有芳香环的Phe，在此基础上同时将Ser117突变为Gly。

多肽PD-L14QN的突变：将多肽PD-L14QN的氨基酸序列中第123位氨基酸Tyr突变为Phe，得到多肽PD-L14QN-F，其氨基酸序列为：QDAQINECLISYGGASFPRITLKVN(SEQ ID NO：3)。

多肽PD-L14QN-F的突变：将多肽PD-L14QN-F的氨基酸序列中第117位氨基酸Ser突变为Gly，得到多肽PD-L14QN-GF，其氨基酸序列为：QDAQINECLIGYGGASFPRITLKVN(SEQ IDNO：4)。

使用QUARK对多肽进行从头计算法预测空间构像，moden1为出现概率最高构像。分析可知，突变后的多肽PD-L14QN-F、多肽PD-L14QN-GF具有与PD-L1蛋白上对应序列高度一致的空间结构(如图1D、图1E所示)，确保了改良后的多肽PD-L14QN-GF较PD-L14具有更有效的受体识别能力。另外，将两个关键亲水氨基酸突变为结构相近的疏水氨基酸，相较未做突变的PD-L14，改良多肽增加了与PD-1蛋白的亲和力。

实施例3荧光定量PCR检测PRRSV方法的建立

(1)PPRSV体外感染猪PBMC

猪外周血PBMC分离：抽取健康猪前腔静脉血4mL，加入枸橼酸钠抗凝剂，全血与抗凝剂比例为10：1，轻柔上下颠倒混匀，以1:1比例加入PBS溶液稀释全血。在无菌离心管中加入同样容量的淋巴细胞分离液，离心管倾斜，用无菌的一次性塑料试管将稀释好的猪血沿着管壁轻柔平铺到分离液的液面上方。用水平离心机以500～1000g的转速离心约20～30min，注意离心转速不能超过1200g。轻轻取出离心管，观察可见血浆层与分离液层之间有薄薄的白膜层，即为猪PBMC，用200微升加样枪小心的吸取白膜层，置于另一无菌离心管，并加入2mL无菌PBS轻轻吹打混匀，250g离心10min，弃上清，取出用适量无菌PBS重悬，重复两次，即为PBMC细胞悬液，若离心管底部沉积大量红细胞，可加入几毫升红细胞裂解液，冰上裂解3～5min，并离心重悬。

PRRSV体外感染猪PBMC：取出少量PBMC加入10％台盼蓝溶液，显微镜下观察PBMC死细胞比并计数。用10％RPMI-1640培养基将PBMC浓度调整到1×10⁶个/mL。加conA调整至终浓度为9mg/mL，加入10％无菌猪血浆，将PBMC悬液分成分离接毒组和对照组两部分。将PRRSV细胞毒以滴度为100TCID₅₀的病毒量感染接毒组PBMC，分别将两组细胞转至24孔细胞培养板中，0.5ml/孔，每个样品做3个重复。轻轻摇匀后转入37℃5％CO₂恒温培养箱中。

(2)引物的设计与合成

根据NCBI Gen Bank中PRRSV的ORF7基因序列(登录号：JN654459)，使用Beacondesigner 8.0软件在基因保守位置设计一对特异性引物。

上游引物F：5′-AAAGCCGACCAGAGCCGCAACC-3′(SEQ ID NO：5)，下游引物R：5′-TCTGTCGC GAGGCAATTGTTCC-3′(SEQ ID NO：6)，预期扩增片段大小为72bp。送宝生物工程(大连)有限公司合成。

(3)qPCR阳性标准品的制备

PRRSV基因的获取：PBMC接毒3天后，收集细胞。把培养板底部吹打干净，细胞悬液移入EP管，4℃8000g离心2min，弃上清，用无菌PBS清洗一次，弃上清。

按照说明书的要求用量加入50×DTT Solution的Buffer RL，吹打混匀，不能有沉淀。提取PRRSV的RNA，具体参照RNA提取试剂盒说明书。取冰盒冰上操作，取小EP管，加入30μL 5×Prime Script QRT Master Mix，加入120μL提取好的RNA模板，两者体积比为1:4。轻柔混匀后立即进行反转录反应，37℃孵育15min，85℃反应5sec，4℃冷却，即为cDNA，-20℃保存备用。

表1 PRRSV基因cDNAPCR扩增反应体系

试剂	使用量
		DNA聚合酶预混液	12.5μL
上游引物(10μM)	0.5μL
		下游引物(10μM)	0.5μL
cDNA模板	1.0μL
		灭菌水	10.5μL
总体积	25.0μL

qPCR阳性标准品准备：取cDNA进行PCR扩增，扩增反应体系见表1。按照反应体系吹打混匀后，瞬时离心，PCR反应程序为：94℃高温预变性5min，进行29个循环：94℃高温变性45s，55℃退火40s，72℃延伸1min；72℃延伸10min。

纯化回收后连接pMD19-T载体，转化DH5a感受态细胞，PCR鉴定无误后进行测序，测序正确后，OD_260/280检测质粒浓度，代入公式计算重组质粒拷贝数，用做qPCR的标准品。

(4)荧光定量qPCR标准曲线的建立

取阳性标准品，10倍倍比稀释，浓度从高到低依次为1.0×10⁹copies/μL到1.0×10¹copies/μL，这6个浓度梯度同时上机检测建立qPCR标准曲线，每个拷贝数的标准孔至少做3个重复，按表2配制qPCR反应液(冰上配制)。将以上体系轻柔混匀后，进行qPCR扩增，扩增反应程序为：95℃预变性30sec，进行40个循环：95℃变性5sec，60℃反应34sec；溶解曲线：95℃30sec，60℃1min，95℃15sec。得到标准曲线以及R²值。

需要注意，在20μL反应体系中，cDNA的质量一般在100ng以下，如果浓度过大，反而会影响扩增的效率，如果效果不好R²值偏离1，可扩大反应体系到50μL。

表2 qPCR扩增反应体系

试剂	使用量
		SYBR预混液	10.0μL
上游引物(10μM)	0.8μL
		下游引物(10μM)	0.8μL
标定液(50X)	0.4μL
		cDNA模板	2.0μL
灭菌水	6.0μL
		总体积	20.0μL

实施例4多肽阻断对猪PBMC增殖能力的影响

参照实施例3的方法分离培养猪PBMC，将PBMC细胞悬液调整为1×10⁶个/mL，每毫升细胞悬液加入1μL浓度为5mM的CFSE染液，需要注意新鲜的CFSE染液无色透明，颜色如果发黄禁止使用，轻轻混匀，37℃避光水浴15min，中间轻轻震荡数次，加入2到3倍体积的冰冷FBS(胎牛血清)淬灭多余CFSE染料。250g离心15min，弃上清，洗涤3次，用10％RPMI-1640培养基加入SFSE标记过的PBMCs，显微镜下观察，细胞密度调整为1×10⁶个/mL。

加conA调整至终浓度为9mg/mL、加入10％无菌猪血浆、将PRRSV细胞毒以滴度为100TCID₅₀的病毒量感染PBMC，转至24孔细胞培养板中0.5ml/孔。将PBMC悬液设置为加毒对照组和加毒加多肽阻断组2部分。所加多肽阻断分别为多肽PD-L14、多肽PD-L14QN-GF。加多肽阻断组PBMC分别对应加入终浓度为0.1mg/mL的未标记多肽，每个样品做3个重复。轻轻摇匀后转入37℃5％CO₂恒温培养箱中培养6d，提取细胞，无菌PBS洗涤至少3次，200目尼龙网过滤，流式细胞仪检测PBMC的CFSE荧光信号，计数20000个细胞，横坐标为荧光强度，纵坐标为细胞数量，绘制细胞增殖直方图(如图3)。

用FlowJo软件分析结果显示，加多肽组细胞的荧光强度峰左移，CFSE含量减少的细胞比例增加。对照组(图3A)细胞增殖百分比为11.4％(图3A中10.26％±3.21％表示多次重复试验的平均增殖百分比)。加多肽PD-L14组(图3B)细胞增殖百分比为27.7％，加多肽PD-L14QN-GF组(图3C)细胞增殖百分比为42.4％。其中，加多肽PD-L14组与对照组相比，细胞增殖百分比上升16.3％(P﹤0.01)；加多肽PD-L14QN-GF组与对照组相比，细胞增殖百分比上升31％(P﹤0.01)，与加多肽PD-L14组相比，细胞增殖百分比上升14.7％(P﹤0.01)。说明突变多肽PD-L14QN-GF刺激PBMC增殖能力的作用更为显著，可选用多肽PD-L14QN-GF进行免疫学功能的进一步验证。

实施例5多肽阻断对PPRSV载量和PD-1转录水平的影响

参照实施例3的方法分离培养猪PBMC，参照实施例4的方法得到浓度为9mg/mL的PBMC细胞悬液，加入10％无菌猪血浆、将PBMC细胞悬液分成对照组、接毒组和接毒加多肽阻断组。所加多肽阻断分别为多肽PD-L14、多肽PD-L14QN-GF。

将PRRSV细胞毒以滴度为100TCID₅₀的病毒量感染接毒组和接毒加多肽阻断组PBMC，分别将3组细胞转至24孔细胞培养板中0.5ml/孔，接毒加多肽阻断组每孔加入终浓度为0.1mg/mL的未标记多肽，每个样品做3个重复。

于72h收集各组PBMC，提取RNA反转录得cDNA，参照实施例3的方法进行qPCR反应，每个样品做3个重复，记录CT值，根据标准曲线计算各组样品中PRRSV载量。设置β-actin为内参，记录CT值，对照组样品的PD-1表达量定义为1×，用△△CT法计算各实验组样品中PD-1、IL-2、IFN-γ和IL-10的相对表达量。

分析可知，PD-L14组PRRSV载量下调21.1％，改良后多肽PD-L14QN-GF的PRRSV载量较PRRSV组下调约43.8％(P<0.05)，见图4。PRRSV组较对照组PD-1表达量上升2倍以上(P<0.01)，加多肽PD-L14阻断后的PD-1相对表达量下调约44.9％(P<0.01)，加多肽PD-L14QN-GF阻断组PD-1相对表达量较PRRSV组分别下调65.3％(P<0.01)，相比于PD-L14，改良后的多肽抑制更显著(P<0.01)，见图5。

实施例6 qPCR检测细胞因子IL-2、IFN-γ和IL-10转录变化

参照实施例5的方法，分析可知，PRRSV组IL-2、IL-10和IFN-γ基因表达量较对照组均被抑制(P<0.05)。与PRRSV组对比，多肽阻断组的各细胞因子相对表达量均有提高，改良后多肽较PD-L14效果更为显著。其中PD-L14QN-GF组较PD-L14组IL-2、IL-10和IFN-γ的基因表达量分别上升2.1倍(P<0.001)、1.4倍(P<0.05)和2.8倍(P<0.001)，见图6。

实施例7 ELISA检测PBMC培养上清中IL-2、IL-10、IFN-γ的蛋白水平变化

(1)样品收集

分别收集培养第48h和72h各组PBMC培养上清，用无菌的EP管收集，3000r/min离心20min。

(2)标准品准备

严格按照ELISA检测试剂盒说明书要求，用标准品稀释液稀释标准品干粉，稀释为500pg/mL后，取无菌EP管7个，每个EP管中加入200μL的标准品稀释液，第一个管加入等体积的标准液，依次倍比稀释成500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL、31.2pg/mL、15.6pg/mL和7.8pg/mL标准品稀释液作为空白孔。

(3)加样

分别设置标准孔、样品孔和空白孔。加入100μL系列标准品，待测样品设置3个重复孔，按照说明书操作。

(4)测定

酶标仪在450nm波长下读取各孔OD值。

(5)计算

浓度为纵坐标，OD值为横坐标，绘制标准曲线。需要特别注意，系列标准品及样本OD值务必要扣除空白孔OD值后作图。计算机拟合标准曲线，得出公式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，得出样品的实际浓度。

分析可知，48h和72h PRRSV组较对照组IL-2、IL-10和IFN-γ表达量均降低(P<0.05)，多肽刺激组细胞因子相对表达量普遍明显提高，改良后多肽较PD-L14效果更为显著。其中加多肽PD-L14QN-GF阻断组72h刺激IL-2和IFN-γ分泌量较PD-L14组分别上升2.5倍(P<0.001)和1.7倍(P<0.01)，对IL-10的基因表达的提升与PD-L14相比不显著，优化后多肽刺激效果优于PD-L14，见图7-9。多肽对细胞因子浓度的刺激规律与qPCR检测的细胞因子基因表达规律基本一致。

实施例8多肽对PCV2疫苗抗体水平的增强效果

(1)动物分组

选取7日龄未免疫PCV2疫苗的仔猪40头，随机分为4组，每组10头，其中A组为正常免疫组、B组为改良前多肽组，C组为改良多肽组，D组为无关多肽组。无关多肽为PD-L13(氨基酸序列为CRAQLLKDQLFLGKASLQIT(SEQ ID NO：7))，经本实验室前期验证该多肽对猪免疫细胞无功能影响。猪的多肽免疫量为100μg/头，将100μg多肽溶于400μL无菌水，颈部肌肉注射多肽400μL/头(每侧200μL)，注射后做好标记。初次免疫后21天再用同样方式进行二次免疫，具体处理见表3。

表3 实验动物分组及接种制剂

组别	动物头数	分子制剂	接种方式	免疫剂量
					A	10	PCV2疫苗	肌肉注射	100μg/头
B	10	PCV2疫苗+PD-L14	肌肉注射	100μg/头
					C	10	PCV2疫苗+PD-L14QN-GF	肌肉注射	100μg/头
D	10	PCV2疫苗+无关多肽	肌肉注射	100μg/头

(2)抗体水平检测

于第二次免疫后第14天抽取仔猪前腔静脉血4mL，采血分离血清，检测不同免疫组仔猪的PCV2抗体水平。

ELISA抗体检测具体步骤如下：将待测猪血清与样品稀释液按照1:12.5、1:25、1:50、1:100、1:200和1:400共6个稀释倍数依次稀释；取所需用量酶标板条，设阴性/阳性对照各2孔，阴、阳性对照孔分别加入阴、阳性对照100μL；样品孔每孔加入不同倍比稀释的血清100μL，37℃孵育15min，洗涤液洗板3次，5min/次(洗板时避免串孔)；加入酶标记物100μL/孔，37℃孵育15min，弃掉，洗涤液洗板3次，5min/次；加显色液100μL/孔，37℃避光孵育15min，每加终止液50μL反应，在450nm波长下读取OD值。结果判定：样品50倍稀释后，OD≥0.8为阳性；OD＜0.6为阴性；0.6≤样品OD值＜0.8为可疑。计算每组仔猪血清抗体阳性率和抗体的几何平均滴度(Geometric mean titer，GMT)。

检测结果见表4，A组为正常免疫组，阳性率只有30％，可见大部分仔猪并没有被疫苗刺激产生足够量的保护抗体。B组增加多肽PD-L14作为佐剂与疫苗共同免疫，阳性率为50％，较A组提高20％。C组为改良后多肽PD-L14QN-GF，阳性率达到80％，较改良前多肽的B组提高30％，是正常免疫组的2.5倍以上。D组为无关对照组，较正常免疫组并无显著变化。

表4 仔猪疫苗免疫后抗体阳性率结果

组别	分子制剂	阳性率％
			A	PCV2疫苗	30
B	PCV2疫苗+PD-L14	50
			C	PCV2疫苗+PD-L14QN-GF	80
D	PCV2疫苗+无关多肽	20

由于血清抗体滴度成偏态分布，只用阳性率来考量抗体水平存在一定的片面性，为了客观评估多肽对疫苗的免疫增强效果，根据组内每份血清的抗体滴度值，计算每组血清抗体的几何平均滴度(Geometric mean titer，GMT)，统计结果如图10。PD-L14组和无关多肽组的抗体滴度较正常疫苗免疫组并无显著差异，而改良后多肽PD-L14QN-GF组较PD-L14组显著提高了PCV2疫苗免疫后的抗体水平，且提高了1.5倍以上(P<0.01)，相对于正常免疫组，抗体水平升高了近2倍(P<0.01)。

序列表

<110> 新乡学院

<120> 猪PD-L14QN-GF表位多肽及其应用

<130> 多肽的制备

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 1

Ala Gln Ile Asn Glu Cys Leu Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Ser Tyr Pro

1 5 10 15

Arg Ile Thr Leu Lys

20

<210> 2

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 2

Gln Asp Ala Gln Ile Asn Glu Cys Leu Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Ser

1 5 10 15

Tyr Pro Arg Ile Thr Leu Lys Val Asn

20 25

<210> 3

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 3

Gln Asp Ala Gln Ile Asn Glu Cys Leu Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Ser

1 5 10 15

Phe Pro Arg Ile Thr Leu Lys Val Asn

20 25

<210> 4

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 4

Gln Asp Ala Gln Ile Asn Glu Cys Leu Ile Gly Tyr Gly Gly Ala Ser

1 5 10 15

Phe Pro Arg Ile Thr Leu Lys Val Asn

20 25

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

aaagccgacc agagccgcaa cc 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

tctgtcgcga ggcaattgtt cc 22

<210> 7

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 7

Cys Arg Ala Gln Leu Leu Lys Asp Gln Leu Phe Leu Gly Lys Ala Ser

1 5 10 15

Leu Gln Ile Thr

20

Claims

1.一种猪PD-L14QN-GF表位多肽，其特征在于，其氨基酸序列为：

QDAQINECLIGYGGASFPRITLKVN。

2.一种如权利要求1所述的猪PD-L14QN-GF表位多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

AQINECLISYGGASYPRITLK；

(2)优化多肽PD-L14：在多肽PD-L14序列的头尾两端各延长2个氨基酸，起始自第104位氨基酸Gln截止到第128位氨基酸Asn，得到多肽PD-L14QN，其氨基酸序列为：

QDAQINECLISYGGASYPRITLKVN；

(3)多肽PD-L14QN的突变：将多肽PD-L14QN的氨基酸序列中第123位氨基酸Tyr突变为Phe，得到多肽PD-L14QN-F，其氨基酸序列为：QDAQINECLISYGGASFPRITLKVN；

QDAQINECLIGYGGASFPRITLKVN。

3.如权利要求1或2所述的猪PD-L14QN-GF表位多肽作为免疫佐剂在制备PCV2疫苗中的应用。

4.如权利要求1或2所述的猪PD-L14QN-GF表位多肽作为免疫佐剂在制备CSFV疫苗中的应用。

5.如权利要求1或2所述的猪PD-L14QN-GF表位多肽作为免疫佐剂在制备PRRSV疫苗中的应用。

6.如权利要求1或2所述的猪PD-L14QN-GF表位多肽作为免疫佐剂在制备PRV疫苗中的应用。

7.如权利要求1或2所述的猪PD-L14QN-GF表位多肽在制备提高体液免疫药物中的应用。

8.如权利要求1或2所述的猪PD-L14QN-GF表位多肽在制备提高细胞免疫药物中的应用。