CN109762048B - 阻断鸡pd-1/pd-l1信号通路的表位多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了阻断鸡PD‑1/PD‑L1信号通路的表位多肽及其应用，所述多肽的氨基酸序列为：VSGAEELFTVEVPQQLYVV。本发明公开了一条能有效阻断PD‑1/PD‑L1信号通路的表位多肽，并对鸡免疫抑制状态下阻断PD‑1/PD‑L1信号通路后机体免疫抑制情况的恢复和逆转情况进行研究。本发明通过研究多肽与IBDV感染鸡PBMCs结合能力，进而研究多肽作用后T淋巴细胞增殖抑制的恢复作用，以及免疫调节相关细胞因子IL‑2、IL‑6及IFN‑γ等的基因表达情况，使得PD‑1/PD‑L1信号通路的激活而导致的免疫抑制成为免疫治疗临床应用的潜力靶点，并为多肽作为一种新的免疫检查点的阻断抑制剂提供理论依据，为获得提高免疫效应的多肽药物以及免疫佐剂疫苗奠定理论基础。

Description

阻断鸡PD-1/PD-L1信号通路的表位多肽及其应用

技术领域

本发明涉及阻断鸡PD-1/PD-L1信号通路的表位多肽及其应用，属于分子病理学与免疫学技术领域。

背景技术

程序性死亡因子(programmed death-1，PD-1或CD279)是T细胞表面一种抑制性受体，作为免疫应答的负调节物在中枢和外周免疫反应中发挥着关键作用。PD-1有两个配体PD-Ls(Ligand of Programmed-1)分别为PD-L1和PD-L2，相比较于PD-L1，PD-L2表达更受限制，但PD-L2对PD-1具有更高的亲和力。已经证明，表达PD-1的T细胞接触表达其配体PD-L1或PD-L2的细胞时，PD-1/PD-Ls信号通路激活，抑制响应抗原刺激的T细胞受体的激活信号功能，包括增殖，细胞因子分泌和细胞毒性降低。PD-1/PD-L1是重要的免疫负调节信号通路，作为T细胞免疫反应的协同刺激信号，其在机体适应性免疫中发挥着重要的负调节作用。

PD-1及其配体相互作用在感染或肿瘤消退期间或在自身耐受性发展期间下调免疫应答。慢性抗原刺激，例如在肿瘤疾病或慢性感染期间发生的刺激，导致T细胞表达PD-1水平升高。已经证明肿瘤发生和病毒持续性感染可以引起机体T细胞免疫抑制性受体PD-1及其配体PD-Ls的表达量变化，进而激活PD-1/PD-L1信号通路，致使细胞毒性T细胞活性下调，抑制细胞的增殖活性，影响各免疫细胞的程序性死亡等免疫反应，继而在中枢免疫和外周免疫反应中传递免疫耐受和免疫抑制信号，引发机体的免疫抑制和病毒持续性感染。阻断该通路后可以有效的恢复或逆转由于病毒感染或某些疾病引发的T细胞免疫功能耗竭或抑制，为提高免疫水平和免疫抑制性疾病提供新的思路和方法。

在慢性感染***中发现，阻断PD-1/PD-L1相互作用可以增强T细胞活性。慢性淋巴细胞性绒毛膜脑膜炎病毒感染小鼠发现，通过阻断PD-1/PD-L1也表现出病毒清除率的改善和免疫力的恢复。此外，在慢性病毒感染期间通过阻断PD-1/PD-L1可以恢复功能疲惫的CD8⁺T细胞。通过PD-L1的单克隆抗体阻断PD-1/PD-L1可以恢复HIV患者，HCV患者或HBV患者的T细胞体外抗原特异性功能。除了增强对慢性抗原的免疫应答外，还显示阻断PD-1/PD-L1途径可增强对疫苗接种的反应，包括在慢性感染的情况下进行治疗性疫苗接种。通过靶向PD-L1蛋白阻断PD-1/PD-L1相互作用已被证明可在体外和体内恢复抗原特异性T细胞免疫功能，包括在肿瘤或慢性感染的情况下对疫苗接种的增强反应。因此，需要阻断PD-L1与PD-1相互作用的试剂。

目前国内外科研机构及制药公司开展了大量关于治疗性PD-1及其配体PD-L1的单克隆抗体开发工作，一些药物已经进入临床研究阶段。大量动物实验和体外实验研究结果表明，利用特异性单克隆抗体对PD-1及其配体的相互结合进行封闭，免疫功能耗竭的T细胞功能得到了有效的恢复和逆转，包括抗炎症及病毒类细胞因子的分泌、细胞毒性T细胞杀伤能力、免疫细胞增殖活性、CTL反应活性、抗体分泌能力等，加速了体内病原的清除。因此，这使得PD-1及其配体介导的信号通路成为免疫治疗临床应用的潜力靶点。但是抗体药物有很多不利因素，比如生产成本高，稳定性、免疫原性，以及在原发性耐药和继发性耐药成为主要障碍。因此，针对PD-1/PD-L1小分子抑制剂被引入，小分子抑制剂在动力学以及稳定性方面提供固有的优势。并为多肽作为一种新的免疫检查点的阻断抑制剂提供理论依据。而目前多肽作为阻断制剂的相关信息还鲜有报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供阻断鸡PD-1/PD-L1信号通路的表位多肽及其应用。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

阻断鸡PD-1/PD-L1信号通路的表位多肽的氨基酸序列为：VSGAEELFTVEVPQQLYVV。

多肽位于PD-L2蛋白的IgV结构域A区段。

一种阻断鸡PD-1/PD-L1信号通路的表位多肽在IBDV感染PBMCs细胞实验中的应用。

一种阻断鸡PD-1/PD-L1信号通路的表位多肽在恢复IBDV感染后的细胞因子的应用。

一种阻断鸡PD-1/PD-L1信号通路的表位多肽在阻断PD-1/PD-L1信号通路，提高PBMCs增殖能力中的应用。

一种阻断鸡PD-1/PD-L1信号通路的表位多肽在提高细胞免疫中的应用。

本发明有益效果：

研究证实，鸡传染性法氏囊病毒IBDV感染后，随着病毒在机体内复制，PD-1的表达量逐渐升高，PD-1与其配体PD-L1相互作用进而激活PD-1/PD-L1重要的免疫负调节信号通路；PD-1/PD-L1信号通路的激活与免疫调节相关细胞因子IL-2、IL-2和IFN-γ的表达变化之间存在一定关系，PD-1/PD-L1信号通路的激活，引起了鸡T淋巴细胞免疫功能和增殖活性的下降，导致健康鸡或亚临床感染鸡免疫抑制反应的持续存在。本发明对鸡PD-1与PD-L1相互作用的表位多肽进行筛选，为阻断由于病毒感染引起的PD-1/PD-L1信号通路激活而导致的免疫抑制提供理论指导。

本发明公开了一条能有效阻断PD-1/PD-L1信号通路的表位多肽，并对鸡免疫抑制状态下阻断PD-1/PD-L1信号通路后机体免疫抑制情况的恢复和逆转情况进行研究。本发明通过研究多肽与IBDV感染鸡PBMCs结合能力，进而研究多肽作用后T淋巴细胞增殖抑制的恢复作用，以及免疫调节相关细胞因子IL-2、IL-6及IFN-γ等的基因表达情况，使得PD-1/PD-L1信号通路的激活而导致的免疫抑制成为免疫治疗临床应用的潜力靶点，并为多肽作为一种新的免疫检查点的阻断抑制剂提供理论依据，为获得提高免疫效应的多肽药物以及免疫佐剂疫苗奠定理论基础。

本发明的鸡PD-1与PD-Ls相互作用表位多肽的筛选方法，为检测雏鸡感染免疫抑制性疾病IBDV(鸡传染性法氏囊病)所导致的免疫抑制状态中PD-1/PD-L1信号通路的激活提供了技术平台，研究结果为进一步揭示IBDV免疫抑制发生的机理，以及寻求能够阻断或逆转禽类病毒感染所导致的免疫抑制方法等提供理论依据。

附图说明

图1是本发明多肽的高效液相图。

图2是本发明多肽的质谱图。

图3是本发明的PBMCs镜检结果(20×)。

图4是本发明的PBMCs流式细胞仪散点图。

图5是本发明多肽与PBMCs结合免疫荧光图。图中，A：无关多肽阴性对照组；B：多肽3-1处理组。

图6是本发明多肽与PBMCs结合的流式散点图(左)和曲线图(右)。图中，上排：无关多肽阴性对照组，下排：多肽3-1处理组。

图7是本发明多肽对PBMCs增殖的流式散点图(左)和曲线图(右)。图中，上排：无关多肽阴性对照组，下排：多肽3-1处理组。

图8是本发明多肽对CD4⁺、CD8⁺T淋巴细胞增殖的活性影响。图中，A：健康鸡组；B：IBDV感染鸡组；C：无关多肽处理组；D：多肽3-1处理组。

图9是本发明多肽对PBMCs表面细胞因子IL-2、IL-6、IFN-γ基因的转录水平的变化情况。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

实施例中的实验动物和菌种：1日龄健康雏鸡，SPF隔离器中饲养至4周龄；IBDV，LD₅₀10⁶/0.1mL，为本实验室分离并保存。

实施例1、多肽3-1纯度及氨基酸序列

应用RCSB PDB(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)对已公布的其它种源PD-1及PD-L1相互作用复合物三维结构进行检索收集，并以其为参比结构对鸡PD-1及PD-Ls相互作用表位进行预测与分析。通过同源性比对分析，PD-L2上的表位序列有三段，分别位于A、CC`以及FG区段上，含有可能的表位多肽。

经过筛选，得到多肽3-1，其氨基酸序列为：VSGAEELFTVEVPQQLYVV(SEQ ID NO.1)，其位于PD-L2蛋白的IgV结构域A区段。多肽的合成可交给专业多肽合成服务公司，也可采用常规的方法合成，如固相多肽合成法，并用FITC标记多肽3-1。利用HPLC检测多肽3-1的纯度，HPLC结果显示在洗脱时间大约为11min左右出现单一狭窄峰，表明多肽纯度较高(图1)，质谱分析(MS)分析结果表明氨基酸数量和顺序正确(图2)。

实施例2、FITC标记的多肽与PBMCs的结合

2.1外周血单个核细胞(PBMCs)分离

(1)分别采集IBDV感染雏鸡以及健康雏鸡翅下静脉血4mL，加入1mL抗凝剂(抗凝剂为10％(w/v)柠檬酸钠)以防止血液凝固，加入5mL含有2％(v/v)胎牛血清的PBS与上述抗凝血混合，吹打混匀，均匀分为两等份；

(2)从步骤(1)混匀血的上部缓慢加入5mL淋巴细胞分离液(注：动作一定要缓慢)，使得分离液与混匀血形成明显的分层；

(3)水平转子800r/min，室温离心15min(注：一定要配平，使离心过程之中晃动降低到最低，离心机上升和下降速度需调至最低，以减少对细胞损伤)；

(4)离心后细胞会发生明显的分层，最上层是稀释的血浆层，中间是透明的分离液层，血浆与分离液之间的白膜层即为淋巴细胞层，离心管底部是红细胞与粒细胞。用毛细滴管小心吸取白色细胞薄层于新的离心管中，加入5mL含有2％(v/v)胎牛血清的PBS，轻轻悬浮细胞，水平转子800r/min，室温离心10min，弃上清；

(5)加入5mL含有2％(v/v)胎牛血清的PBS，重复离心，弃上清，加入0.5mL PBS即得到PBMCs细胞悬液。

(6)流式细胞仪、台盼蓝镜检PBMCs活力。流式细胞仪流式散点图(图3)以及台盼蓝染色(图4)结果表明，提取得到的细胞纯度及活力都比较好，可以满足后续实验的需求。

2.2荧光显微镜检测多肽3-1与PBMCs结合

PBMCs来源于上述提取获得IBDV感染雏鸡，用PBS调整PBMCs为10⁶/mL，取35μL调整后的PBMCs细胞悬液，加入100μL 4％(w/v)多聚甲醛将上述细胞固定至载玻片上，酒精灯火焰上轻轻灼烧以固定细胞。加入200μL 0.3％(v/v)Triton X-100通透细胞20min，PBS洗涤3次，2min/次；使用5％(w/v)脱脂奶粉-PBST溶液在湿盒内37℃封闭40min，PBS洗涤3次，2min/次；滤纸轻轻吸去多余的封闭液，加入终浓度为0.1mg/mL的FITC标记多肽3-1，同时设置无关多肽(氨基酸序列LERDEMYGYVNIARNLDGYQ，SEQ ID NO.2)作为阴性对照组，湿盒内37℃孵育60min。PBS洗涤3次，5min/次。荧光显微镜下观察多肽3-1与PBMCs结合情况。

荧光显微镜结果表明(图5)，FITC标记的无关多肽在荧光场强度调节至最高条件下仍未观察到明显的荧光，与无关多肽组相比，FITC标记的多肽3-1处理组可见明显的荧光染色细胞，证实上述多肽3-1与PBMCs发生明显的结合，具有较好的与PBMCs表面的PD-1蛋白结合能力。

2.3流式细胞术检测多肽3-1与PBMCs结合

PBMCs来源于IBDV感染雏鸡，用PBS调整10⁶/mL，加入终浓度为0.1mg/mL的FITC标记多肽3-1，同时设置无关多肽组作为阴性对照，混合均匀后于冰上避光结合2.5h，期间多次悬浮细胞，PBS洗涤5-8次，300目尼龙网筛过滤细胞悬液，流式细胞仪检测多肽3-1与PBMCs结合情况，流式细胞仪计数20000个细胞。

流式细胞术结果表明(图6)，FITC标记的多肽3-1处理组在488nm激光器下相应BB515通道中收集到明显的荧光信号，与FITC标记的无关多肽组收集到荧光信号相比大约高出一个数量级，证实多肽3-1与PBMCs发生明显的结合，具有较好的与PBMCs表面的PD-1蛋白结合能力。

实施例3、流式细胞术检测多肽3-1阻断后PBMCs增殖变化

(1)为进一步研究多肽3-1作用后对IBDV感染后PBMCs体外增殖情况的影响，于IBDV攻毒7天后，分别分离感染IBDV的雏鸡和未感染IBDV雏鸡的PBMCs作为样品，分离方法同实施例2，使用RPMI-1640培养基调整细胞浓度至10⁶/mL；

(2)加入终浓度10μmol/L的羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)，37℃避光孵育10min，PBS洗去未结合的CFSE，加入预冷的胎牛血清在冰上终止反应，1500r/min，室温离心5min，弃上清，洗涤两次，将未结合的CFSE洗去；

(3)加入终浓度为0.1mg/mL的未标记多肽3-1，冰上避光孵育2.5h，PBS洗涤3次，5min/次，以洗去未结合多肽；

(4)将上述PBMCs按照每孔100μL，20000个每孔，转至12孔板，每个样品做3个重复，然后加入100μL灭活的胎牛血清，浓度为10mg/mL的刀豆蛋白A(ConA)5μL，浓度为4mmol/LL-谷氨酰胺20μL，10μL(0.22μm滤器过滤除菌)鸡血清，最后加入终浓度为100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素，37℃，5％CO₂培养箱中培养3天，流式细胞仪检测CFSE荧光信号的变化强弱，判定PBMC增殖强弱。

流式细胞仪结果表明(图7)，IBDV感染7天后PBMCs增殖能力较健康鸡有大幅下降，荧光信号较高，无关多肽处理对IBDV感染雏鸡的PBMCs细胞增殖能力并无大的影响。多肽3-1处理组的PBMCs荧光信号峰值明显向左偏移，比例大约76.9％，说明多肽3-1不仅能结合PBMCs上的PD-1蛋白，而且还能阻断PD-1/PD-L1信号通路，提高细胞免疫活性，为进一步研究多肽3-1的免疫功能奠定基础。

实施例4、流式细胞术检测多肽阻断后CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞亚群增殖影响

取实施例3中培养过后的感染IBDV雏鸡和未感染IBDV雏鸡的PBMCs，按照10⁵个/mL，每mL细胞悬液分别加入浓度均为0.5μg/μL的藻红蛋白(PE)染料标记的鸡CD4⁺单抗2μL和Cy5染料标记的鸡CD8⁺单抗2μL，充分混匀后于冰上避光孵育30min，PBS洗涤细胞，800r/min，室温离心5min，弃上清，最后用1mL 10％(v/v)1640完全培养基重悬细胞。选择流式细胞仪中488nm激光器下PE通道和633nm激光器下APC通道对鸡CD4⁺T淋巴细胞和鸡CD8⁺T淋巴细胞进行收集和鉴定。

流式细胞仪结果表明(图8)，健康鸡群中CD4⁺T淋巴细胞和CD8⁺T淋巴细胞分别占外周血单个核细胞的23.8％和19.0％，IBDV感染鸡后第7天检测发现鸡CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞分别降至9.74％和12.3％，无关多肽处理后，鸡CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞与IBDV感染后无明显差异，分别为9.42％和12.4％；多肽3-1作用后鸡CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞恢复至16.8％和14.3％，同时CD4⁺和CD8⁺双阳性细胞比例升高，说明多肽3-1对鸡CD4⁺/CD8⁺双阳性T细胞的增殖有更为显著的促进效应。

实施例5、RT-PCR检测多肽阻断后细胞因子IL-2、IL-6和IFN-γ转录水平变化

为检测IBDV感染鸡群后引起的免疫效应变化，采集IBDV感染鸡群后第7天外周血液，并以未感染IBDV的同日龄雏鸡为对照，分离淋巴细胞，细胞计数后，用含有10％(v/v)血清的1640培养基调整细胞浓度为10⁶个/mL，加入到96孔细胞培养板中，100μL/孔，每孔加入浓度为10mg/mL的ConA 5μL，浓度为4mmol/L的L-谷氨酰胺20μL，10μL(0.22μm滤器过滤除菌)鸡血清，终浓度为100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素，最后加入终浓度0.1mg/mL的多肽3-1 20μL，做三个重复，设置无关多肽作为阴性对照组，以及不加多肽的IBDV感染雏鸡的PBMCs作为空白对照，同时设置健康鸡群PBMCs作为对照，于37℃、5％的CO₂培养箱中培养72h后收集细胞，RNA提取试剂盒(大连宝生物工程有限公司)提取细胞总RNA，利用反转录试剂盒(大连宝生物工程有限公司)反转录合成cDNA，采用实时荧光定量RT-PCR技术检测细胞因子变化水平，分析多肽3-1对细胞因子IL-2、IL-6及IFN-γ的阻断作用。

结果表明(图9)，IBDV感染后IL-2、IL-6及IFN-γ转录水平均发生了显著的变化，与未攻毒健康鸡对照组相比，IL-2在病毒感染后的第7天其表达水平下降至健康鸡对照组的1/3左右(*p<0.05)，IL-6表达水平虽然有所降低但较未攻毒健康鸡对照组无显著差异，IFN-γ的转录水平较未攻毒健康鸡对照组提高了6.3倍(**p<0.01)，说明鸡在感染IBDV后，机体免疫调节相关的重要细胞因子IL-2、IL-6及IFN-γ表达水平均出现异常。多肽3-1处理后，IL-2转录水平较未攻毒健康鸡对照组上升了3.4倍，与无关多肽处理组之间差异显著；IFN-γ转录水平较IBDV攻毒未处理组有所下降，但无差异显著性。

序列表

<110> 新乡学院

<120> 阻断鸡PD-1/PD-L1信号通路的表位多肽及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> PRT

<213> 鸡(Gallus gallus)

<400> 1

Val Ser Gly Ala Glu Glu Leu Phe Thr Val Glu Val Pro Gln Gln Leu

1 5 10 15

Tyr Val Val

Claims (5)

1.一种多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列为：VSGAEELFTVEVPQQLYVV。

2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽位于PD-L2蛋白的IgV结构域A区段。

3.一种如权利要求1所述的多肽在制备恢复IBDV感染后的细胞因子IL-2表达水平的体外试剂中的应用。

4.一种如权利要求1所述的多肽在制备提高PBMCs增殖能力的体外试剂中的应用。

5.一种如权利要求1所述的多肽在制备提高细胞免疫的体外试剂中的应用。

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