CN112730386B - 一种基于电化学发光的异丙托溴铵/硒糖检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于电化学发光的膜吸附过程评价***，该***将富勒烯/锌卟啉作为发光体，覆盖甲基三辛基溴化铵薄膜以模拟生物双层膜***；将统计所得发光强度与发光体和薄膜浓度及缓冲液种类相关联，得到最适发光条件；不同于传统的锌卟啉发光体，富勒烯/锌卟啉发光体具有更强的电化学发光，更易于观测待测物的光强变化。本发明电化学发光的设备简单，操作简便，可以方便地检测出光强随反应物的浓度变化趋势；利用电致化学发光检测，可通过调节电势将反应初始条件、速度和历程予以控制，方便地进行原位、现场分析；适用于硒糖与异丙托溴铵的检测。

Description

一种基于电化学发光的异丙托溴铵/硒糖检测方法
技术领域
本发明属于物化分析技术领域，尤其涉及一种基于电化学发光的膜吸附过程评价***。
背景技术
电化学发光是指将电化学与化学发光相结合以进行分析的一种技术，这种技术有化学分析高灵敏度和电化学电势可控性的这两个优点，具有广阔的研究前景。电化学发光的基本原理是通过电极对含有化学发光物质的化学体系施加一定的电压或通过一定的电流，来产生某种新的物质，这种物质与发光物质可以相互反应提供足够的能量，使得发光物质从基态跃迁到激发态，再返回基态时能发出光；或者利用电极提供能量直接使发光物发生氧化还原反应，生成某种不稳定的中间态物质迅速分解从而导致发光。电化学发光由于其电致化学发光强度与电化学发光速率有关，所以影响电化学发光反应速率的因素都可以作为建立测定方法的依据，从而进行分析测定。电化学发光的发光强度与电化学反应速率，激发态产物的效率和激发态物质的发光效率有关，所以在一定条件下，通过测定电化学发光强度就可以测定反应体系中某种物质的浓度。其中电化学发光分析测定的物质可以分成三种：第一种是电化学发光反应的反应物；第二种是电化学发光反应中的催化剂，协同剂，增敏剂或抑制剂；第三种是偶合及衍生反应种的反应物，催化剂或者增敏剂等。而且通过标记方式利用这三种物质还可以测定感兴趣的其他物质，进一步扩大电化学发光分析的应用范围。
1927年，Dufford等人在无水***介质中电解格氏试剂时就观察到ECL(electrochemiluminescence，电化学发光)现象。1929年，Harvey在点解碱性鲁米诺水溶液时，发现电极附近有发光现象。随后在20世纪60，70年代，人们在将ECL作为一种工具研究那些具有新的光化学和电化学性质的化合物，络合物和团簇分子时，逐渐认识到这方面工作对阐明化学发光机理有很大帮助，ECL现象的研究从此得到重视起来。20世纪80年代以来，随着多种电极和仪器***的改进以及多种新体系的发现，ECL反应机理研究日趋成熟， ECL作为一种高灵敏度和较高的选择性的分析方法，日益受到人们的关注，已成为分析化学中有效的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种基于电化学发光的膜吸附过程评价***。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种基于电化学发光的膜吸附过程评价***，包括检测***、ECL发光体、溴化铵薄膜、和膜相互作用的分子、计量方法和分析流程；所述计量方法包括物理参数、ECL发光仪参数和数值拟合原理；所述检测***为ECL发光仪。
进一步地，所述ECL发光体为富勒烯(C70)/锌卟啉复合物。
进一步地，所述溴化铵薄膜为甲基三辛基溴化铵、四庚基溴化铵、四己基溴化铵、四辛基溴化铵、双十烷基二甲基溴化铵或双十二烷基二甲基溴化铵。
进一步地，所述和膜相互作用的分子包括异丙托溴铵和硒糖。
进一步地，所述ECL发光体分散在三氯甲烷中使用；所述溴化铵薄膜溶解在乙醇溶液中；所述和膜相互作用的分子由异丙托溴铵和硒糖溶解在缓冲液中得到。
进一步地，所述缓冲液为HEPES缓冲液、PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液、 CH3COOH/CH3COONa缓冲液或H3BO3/Na2B4O7缓冲液。
进一步地，所述物理参数包括ECL发光体浓度、溴化铵薄膜浓度以及和膜相互作用的分子浓度；所述数值拟合原理是Langmuir等温吸附方程，单位点结合的非线性拟合模型。
进一步地，所述ECL发光体浓度范围为0.1～20mM；所述溴化铵薄膜浓度范围为1～30 mM；所述和膜相互作用的分子溶液浓度范围为0.001～1mM。
进一步地，所述ECL发光仪参数包括ECL光电倍增管偏压为-1000V和-600V，放大级数为3级，扫描速率为0.1V/s，扫描电位为0～-1.7V。
进一步地，所述分析流程包括以下步骤：
步骤1：配置ECL发光体溶液、溴化铵薄膜溶液、异丙托溴铵溶液、硒糖溶液和缓冲液；
步骤2：先取ECL发光体溶液5～20μL滴于玻碳电极上，再加入5～20μL溴化铵薄膜溶液，待溴化铵薄膜溶液均匀成膜后，在三口电解池中加入5～10mL缓冲液，缓冲液浓度为1～25 mM，将电极放入缓冲液中待测；
步骤3：再在三口电解池的缓冲液中加入异丙托溴铵与硒糖，打开ECL发光仪，记录呈现的发光强度与时间的关系图像与发光强度与时间的关系数值，传输到计算机上分析发光体的光强在异丙托溴铵与硒糖浓度变化时相应的光强变化程度。
本发明的有益效果如下：
(1)本发明将富勒烯/锌卟啉作为发光体，覆盖甲基三辛基溴化铵薄膜以模拟生物双层膜***；将统计所得发光强度与发光体和薄膜浓度及缓冲液种类相关联，得到最适发光条件；不同于传统的锌卟啉发光体，富勒烯/锌卟啉发光体具有更强的电化学发光，更易于观测待测物的光强变化；
(2)本发明电化学发光的设备简单，操作简便，可以方便地检测出光强随反应物的浓度变化趋势；
(3)本发明利用电致化学发光检测，可通过调节电势将反应初始条件、速度和历程予以控制，方便地进行原位分析和现场分析；
(4)本发明适用于硒糖与异丙托溴铵的检测。
附图说明
图1为锌卟啉与C70结合示意图；其中，锌卟啉与C70之间为氢键相连；
图2为0.1mM ZnTPP在不同溴化铵薄膜下的发光强度变化示意图；其中，(a)为四辛基溴化铵，(b)为甲基三辛基溴化铵，(c)为双十烷基二甲基溴化铵，(d)为双十二烷基二甲基溴化铵，(e)为四庚基溴化铵，(f)为四己基溴化铵；
图3为C70/ZnTPP复合物在不同缓冲液下发光强度随pH变化的示意图；其中，(a)为HEPES，(b)为PBS，(c)为Tris-HCl，(d)为CH3COOH/CH3COONa，(e)为H3BO3/Na2B4O7；
图4为图2中六种溴化铵在最佳发光强度时的电位图；
图5为C70、ZnTPP、C70@ZnTPP、C70/甲基三辛基溴化铵、ZnTPP/甲基三辛基溴化铵和C70@ZnTPP/甲基三辛基溴化铵分别在空气、氮气和氧气条件下的CV图；
图6为缓冲液中加入硒糖之后，改变硒糖浓度从0～1mM的发光强度变化所拟合成的朗缪尔等温线示意图；其中，回归系数R2＝0.981；
图7为缓冲液中加入异丙托溴铵之后，改变异丙托溴铵浓度从0～1mM的发光强度变化所拟合成的朗缪尔等温线示意图；其中，回归系数R2＝0.985。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步详述。
本发明设计了一个***，主要由四苯基卟啉锌(5,10,15,20-tetraphenyl-21H,23H-porphine zinc，简称ZnTPP)，和富勒烯(C70)两部分组成；通过在ECL仪中进行电化学发光，观测其发光强度的变化，继而可以测定相应的发光体与和膜相互作用的分子的浓度。其中，锌卟啉的化学式如下：C44H28N4Zn
Figure BDA0002843542370000041
本发明一种基于电化学发光的膜吸附过程评价***，包括检测***，ECL发光体，溴化铵薄膜，和膜相互作用的分子，计量方法和分析流程；
本发明中，所述的检测***为ECL发光仪。
本发明中，所述的ECL发光体为富勒烯(C70)/锌卟啉复合物，分散在三氯甲烷中使用，浓度范围为0.1～20mM。
本发明中，所述的溴化铵薄膜为甲基三辛基溴化铵，溶解在乙醇溶液中，浓度范围为1～30 mM。
本发明中，所述的和膜相互作用的分子包括异丙托溴铵和硒糖，溶解在缓冲液中得到，浓度范围为0.001～1mM；所述缓冲液为HEPES缓冲液。其中，硒糖和异丙托溴铵的化学式如下：C9H18O5NSe和C20H30BrNO3
Figure BDA0002843542370000042
本发明中，所述的物理参数包括ECL发光体浓度，溴化铵薄膜浓度以及和膜相互作用的分子浓度；所述的ECL发光仪参数包括ECL光电倍增管(PMT)偏压为-1000V和-600V，放大级数为3级，扫描速率为0.1V/s，扫描电位为0～-1.7V；所述的数值拟合原理是Langmuir等温吸附方程，单位点结合的非线性拟合模型。
本发明的具体实施方式中，在ECL仪中进行，其分析流程包括以下步骤：
步骤1：配置ECL发光体溶液、溴化铵薄膜溶液、异丙托溴铵溶液、硒糖溶液和缓冲液；
步骤2：先取ECL发光体溶液10μL滴于玻碳电极上，再加入10μL溴化铵薄膜溶液，待其均匀成膜后，在三口电解池中加入5mL HEPES缓冲液，其浓度为10mM，将电极放入溶液中待测；
步骤3：在缓冲液中加入异丙托溴铵与硒糖，打开电致化学发光仪，记录ECL发光仪所呈现的图像与数值，传输到计算机上分析其光强在异丙托溴铵与硒糖浓度变化时光强相应的变化程度。
图1为锌卟啉与富勒烯结合示意图，锌卟啉与C70用氢键连接。
下述实施例中，所述的锌卟啉/富勒烯复合物利用液-液界面沉淀法制备。C70/ZnTPP的制作流程为：将ZnTPP与C70共结晶。先将C70粉末和ZnTPP，溶解在甲苯或邻二甲苯中，超声处理45分钟，制备富勒烯C70和锌卟啉的混合溶液。过滤后，将C70/ZnTPP溶液与抗溶剂 (甲醇，乙醇和异丙醇)1：1混合，并在室温下放置过夜以进行沉淀，真空干燥保存备用。
下述实施例中，采用的检测***为ECL发光仪，所述的ECL发光仪参数包括ECL光电倍增管(PMT)偏压为-1000V和-600V，放大级数为3级，扫描速率为0.1V/s，扫描电位为 0～-1.7V。记录下的数据传输到计算机上处理分析，具体分析方法如下：选择感兴趣区域的发光强度，扣除背景并取平均值；再以异丙托溴铵或硒糖浓度为函数自变量，用OriginPro 8.5软件做归一化处理。
实施例1
本实施例提供一种ZnTPP/C70复合物，溴化铵薄膜覆盖后可以在缓冲液中的产生稳定的电化学发光，具体步骤如下：
步骤1：配置10mM pH 7.4的HEPES溶液以及各种溴化铵溶液。
步骤2：将ZnTPP/C70用三氯甲烷分散，使用20μL移液枪吸取10μL溶液滴加到GCE(玻碳电极)表面，再吸取10μL的溴化铵，浓度范围为1～30mM，溶剂是乙醇，滴加到GCE 表面，在红外烘烤灯下慢慢烘烤以均匀成膜。
步骤3：如图2所示，使用不同的溴化铵薄膜，记录下复合物在缓冲液中产生的光强，发现在甲基三辛基溴化铵薄膜中发光强度最强。其中，不同的溴化铵薄膜包括：
Figure BDA0002843542370000061
步骤4：如图3所示，使用不同的缓冲液，记录下复合物在不同缓冲液的缓冲范围内随 pH变化而产生的发光强度变化。从图3可以看出，ZnTPP/C70复合物在pH 8.0的PBS缓冲液中发光强度最高。
步骤5：如图4所示，记录下能使复合物产生稳定发光的不同溴化铵薄膜的电位，发现甲基三辛基溴化铵使复合物产生的发光电位在-1.4V。
步骤6：如图5所示，记录下分别在空气、氮气和氧气中的CV(循环伏安图)。从图5可以看出，在氮气中可以看出一对明显的对称的氧化还原峰，发光体一共显示出3个还原峰分别在-0.5V、-0.7V和-1.2V附近。
实施例2
本实施例提供一种测量ZnTPP/C70在缓冲液中的发光强度受硒糖和异丙托溴铵影响而变化的分析技术，具体步骤如下：
步骤1：配置10mM pH 7.4的HEPES溶液，并用该溶液配置硒糖和异丙托溴铵溶液，浓度范围为0.001～1mM。
步骤2：将ZnTPP/C70用三氯甲烷分散，使用20μL移液枪吸取10μL溶液滴加到GCE 表面，再吸取10μL的甲基三辛基溴化铵，浓度为15mM，溶剂是乙醇，滴加到GCE表面，在红外烘烤灯下慢慢烘烤以均匀成膜。
步骤3：如图6所示，测定原始样的光强，改变加入的硒糖的浓度，记录下不同硒糖浓度时的光强，浓度分别为10-3、5×10-3、10-2、5×10-2、0.1、0.5直至1mM，将得到的坐标点，用朗缪尔等温吸附函数(Langmuir Isotherm)拟合，把发光强度的猝灭率对硒糖浓度作图，得到的相关系数R2＝0.98。硒糖溶液中平衡解离常数KD值为183±19μM，异丙托溴铵溶液中KD值为(179±59)μM。
步骤4：如图7所示，测定原始样的光强，改变加入的异丙托溴铵的浓度，记录下不同异丙托溴铵浓度时的光强，浓度分别为10-3、5×10-3、10-2、5×10-2、0.1、0.5直至1mM。将得到的坐标点，用朗缪尔等温吸附函数(Langmuir Isotherm)拟合，把发光强度的猝灭率对异丙托溴铵浓度作图，得到的相关系数R2＝0.98。异丙托溴铵溶液中KD值为(179±59)μM。

Claims (7)

1.一种基于电化学发光的异丙托溴铵/硒糖检测方法，其特征在于，包括检测***、ECL发光体、溴化铵薄膜、和膜相互作用的分子、计量方法和分析流程；所述计量方法包括物理参数、ECL发光仪参数和数值拟合原理；所述检测***为ECL发光仪；
所述和膜相互作用的分子包括异丙托溴铵和硒糖；
所述物理参数包括ECL发光体浓度、溴化铵薄膜浓度以及和膜相互作用的分子浓度；
所述数值拟合原理是Langmuir等温吸附方程，单位点结合的非线性拟合模型；
所述ECL发光仪参数包括ECL光电倍增管偏压、放大级数、扫描速率、扫描电位；
所述分析流程包括以下步骤：
步骤1：配置ECL发光体溶液、溴化铵薄膜溶液、异丙托溴铵溶液、硒糖溶液和缓冲液；
步骤2：先取ECL发光体溶液5～20μL滴于玻碳电极上，再加入5～20μL溴化铵薄膜溶液，待溴化铵薄膜溶液均匀成膜后，在三口电解池中加入5～10mL缓冲液，缓冲液浓度为1～25mM，将电极放入缓冲液中待测；
步骤3：再在三口电解池的缓冲液中加入异丙托溴铵或硒糖，打开ECL发光仪，记录呈现的发光强度与时间的关系图像与发光强度与时间的关系数值，传输到计算机上分析发光体的光强在异丙托溴铵或硒糖浓度变化时相应的光强变化程度。
2.根据权利要求1所述基于电化学发光的异丙托溴铵/硒糖检测方法，其特征在于，所述ECL发光体为富勒烯(C70)/锌卟啉复合物。
3.根据权利要求1所述基于电化学发光的异丙托溴铵/硒糖检测方法，其特征在于，所述溴化铵薄膜为甲基三辛基溴化铵、四庚基溴化铵、四己基溴化铵、四辛基溴化铵、双十烷基二甲基溴化铵或双十二烷基二甲基溴化铵。
4.根据权利要求1所述基于电化学发光的异丙托溴铵/硒糖检测方法，其特征在于，所述ECL发光体分散在三氯甲烷中使用；所述溴化铵薄膜溶解在乙醇溶液中；所述和膜相互作用的分子由异丙托溴铵和硒糖溶解在缓冲液中得到。
5.根据权利要求4所述基于电化学发光的异丙托溴铵/硒糖检测方法，其特征在于，所述缓冲液为HEPES缓冲液、PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液、CH3COOH/CH3COONa缓冲液或H3BO3/Na2B4O7缓冲液。
6.根据权利要求4所述基于电化学发光的异丙托溴铵/硒糖检测方法，其特征在于，所述ECL发光体浓度范围为0.1～20mM；所述溴化铵薄膜浓度范围为1～30mM；所述和膜相互作用的分子溶液浓度范围为0.001～1mM。
7.根据权利要求1所述基于电化学发光的异丙托溴铵/硒糖检测方法，其特征在于，所述ECL发光仪参数包括ECL光电倍增管偏压为-1000V和-600V，放大级数为3级，扫描速率为0.1V/s，扫描电位为0～-1.7V。
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