CN112098484B - 基于电化学发光法检测啶虫脒的传感器以及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测啶虫脒的方法，具体属于电化学发光检测领域。该操作流程包括：(1)MoS₂QDs‑PATP@PTCA和NH₂‑UiO‑66的复合材料制备；(2)电化学发光传感器的制备；(3)利用电化学发光法检测啶虫脒。其中以NH₂‑UiO‑66‑pDNA/apt/MoS₂QDs‑PATP@PTCA/GCE修饰的玻碳电极作为工作电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂电极作为辅助电极，组成传统的三电极体系。该方法的检测范围为1.0×10^‑7mol/L～1.0×10^‑18mol/L，最低检测限为6.4×10^‑19mol/L。本发明检测啶虫脒的成本低、灵敏度高、特异性强、操作简单。

Description

基于电化学发光法检测啶虫脒的传感器以及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种检测啶虫脒的电化学发光方法，具体涉及一种将苝四羧酸(PTCA)固定硫化钼量子点(MoS₂QDs-PATP)，然后将MoS₂QDs-PATP@PTCA作为能量共振转移中的供体,NH₂-UiO-66作为能量共振转移中的受体。将供体与受体之间通过两条DNA链连接(apt、pDNA)，共同修饰在玻碳电极(GCE)上，具有特异性识别作用的适配体(apt)为识别元素，然后以NH₂-UiO-66-pDNA/apt/MoS₂QDs-PATP@PTCA/GCE为工作电极，定量检测水中的啶虫脒的电化学发光分析方法。

背景技术

啶虫脒是一种新型烟碱类杀虫剂，广泛用于农产品的害虫防治，同时也对动物的神经***和生殖***具有潜在毒性，长期食用残留啶虫脒的果蔬，会影响人类神经元的发育，对人类健康构成威胁。所以，进行蔬菜中啶虫脒残留量的测定具有重要意义。

目前检测啶虫脒的主要方法有高效液相色谱法、超高效液相色谱-串联质谱法、DNA分子探针、固相萃取-HPLC法、电凝法川、气相色谱法等。然而这些方法操作复杂、耗时、成本高、同时检测的灵敏度也不高。因此，有必要建立一种简单、快速、准确的方法来进行啶虫脒的检测。电化学发光(ECL)是一种电化学分析方法，具有灵敏度高、背景低、易控制和检测时间短等优点。它兼备了电化学及化学发光方法的优点。电化学发光无需引入外部光源，相比于光致发光方法可有效地避免背景光源的干扰，提高信噪比从而提高检测灵敏度。共振能量转移是一种新兴的分子光谱分析方法，具体是指电子激发能在适当的能量供体和能量受体对之间的传递。而电致化学发光-共振能量转移(ECL-RET)结合了两者的优点，是一个很具有发展潜力的新领域。它既不需要激发光源，背景噪音较小，也避免了散射光的影响，已广泛地应用于生物传感器的构建。

发明内容

本发明的目的在于针对啶虫脒检测现有技术的不足，提供一种电化学发光传感器检测的方法。本发明基于MoS₂QDs-PATP@PTCA与NH₂-UiO-66之间存在的共振能量转移机制以及啶虫脒对其机制的抑制作用，以NH₂-UiO-66-pDNA/apt/MoS₂QDs-PATP@PTCA/GCE为工作电极，构建了定量检测实际水样中的啶虫脒的电化学发光分析方法。由于MoS₂QDs-PATP@PTCA(供体)的电化学发光发射光谱与NH₂-UiO-66(受体)的紫外可见吸收光谱之间存在较大的重叠面积，所以两者之间存在共振能量转移机制，基于啶虫脒对其机制的抑制作用，导致修饰电极的荧光增强，并且增加的光强与啶虫脒的浓度具有线性关系。本发明不仅具有电化学发光分析的灵敏度高、特异性强、线性范围宽和仪器简单等优点，同时对于水样中的啶虫脒的检测具有重要的现实意义。

本发明采用的方案是将NH₂-UiO-66-pDNA/apt/MoS₂QDs-PATP@PTCA/GCE修饰电极作为工作电极，铂电极作为辅助电极，Ag/AgCl作为参比电极，组成三电极体系进行检测，具体步骤如下：

(1)MoS₂QDs-PATP@PTCA复合材料的制备：

将Na₂MoO₄·2H₂O溶于一定量的去离子水中，用HCl调节至pH 6.5。超声处理后，加入半胱氨酸和一定量去离子水(Na₂MoO₄·2H₂O和半胱氨酸的质量比为1:2)。将上述混合物转移到聚四氟乙烯高压釜中，200℃反应36h，自然冷却至室温后，离心并取上层清液并于4℃保存，得到MoS₂QDs溶液。将4-氨基苯硫酚(PATP)溶于一定量的乙醇溶液中，再将其注入MoS₂QDs溶液中，在黑暗条件下搅拌一定时间(4-氨基苯硫酚和Na₂MoO₄·2H₂O的质量比为1:2)。用乙醇洗涤、离心、分离，并将最终得到的MoS₂QDs-PATP分散在乙醇中。

将苝四羧酸二酐(PTCDA)溶于NaOH中，搅拌得到黄绿色溶液后，滴入HCl直至完全沉淀，离心并用去离子水洗涤三次，干燥得到暗红色粉末，即PTCA。

取上述制备的PTCA加入MoS₂QDs-PATP溶液中，搅拌、离心、洗涤、干燥得到淡红色粉末MoS₂QDs-PATP@PTCA。

MoS₂QDs-PATP和PTCA的质量比1:1～3:1；作为优选：加入MoS₂QDs-PATP溶液的体积为15.0mL，浓度为1mg/mL，PTCA的加入量为5.0mg。

(2)NH₂-UiO-66-pDNA的制备：

将一定量的ZrCl₄和对苯二甲酸溶解在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，搅拌均匀后加入乙酸，然后将该溶液转移到Teflon衬里的不锈钢高压釜中。高压釜密封并在自生压力下放在120℃的烘箱中加热24h。自然冷却后，将所得物质离心并用无水乙醇洗涤纯化四次，然后将NH₂-UiO-66产物干燥。

将pDNA(DNA序列为：5’-COOH GCG ATC AAG AAC CGC TGC AGA CAA ATT ACA-3’)的Tris-HCl溶液加入含有NH₂-UiO-66的离心管中，振荡反应后，离心，取沉淀溶于Tris-HCl(pH7.5)中，将得到的胶体溶液超声处理，并在室温下震荡，得到NH₂-UiO-66-pDNA，最后储存在4℃下备用。

(3)修饰电极NH₂-UiO-66-pDNA/apt/MoS₂QDs-PATP@PTCA/GCE的制备：

将玻碳电极抛光，依次用硝酸和无水乙醇、去离子水分别超声，自然晾干待用，用微量进样器移MoS₂QDs-PATP@PTCA的DMF溶液滴于洁净的玻碳电极表面，室温干燥，得到MoS₂QDs-PATP@PTCA/GCE修饰电极，接着将适配体(适配体在5端修饰了羧基。该适配体订购于生工生物工程(上海)股份有限公司，且DNA序列为：5’-COOH TGT AAT TTG TCT GCA GCGGTT CTT GAT CGC TGA CAC CAT ATT ATG AAG A-3’)、NH₂-UiO-66-pDNA的Tris-HCl溶液滴加到MoS₂QDs-PATP@PTCA/GCE的表面，得到NH₂-UiO-66-pDNA/apt/MoS₂QDs-PATP@PTCA/GCE。最后，将NH₂-UiO-66-pDNA/apt/MoS₂QDs-PATP@PTCA/GCE修饰电极在4℃的冰箱中放置6h，即得到ECL传感器。

MoS₂QDs-PATP@PTCA溶液、适配体溶液、NH₂-UiO-66溶液的体积比为：1:1～2:1～2。作为优选：MoS₂QDs-PATP@PTCA的滴涂量为2.0μL，浓度为1.0mg/mL；NH₂-UiO-66的滴涂量为2.0μL，浓度为2.0mg/mL。适配体滴涂量为2.0μL，浓度为2.0μmol/L。

PTCA的作用是为了更好的固定MoS₂QDs，而PATP的作用是通过配体交换修饰MoS₂QDs，使得其表面拥有大量氨基，不仅可以增大PTCA的光强，而且可以使得MoS2QDs与更多的适配体通过酰胺键连接。

(4)含过硫酸钾(K₂S₂O₈)的磷酸盐(PB)缓冲溶液的配制：

用pH 7.5的0.1mol/L PB缓冲溶液配制含0.05mol/L K₂S₂O₈的PB缓冲溶液。

(5)不同浓度啶虫脒标准溶液的配制

准确称取一定量的啶虫脒，用去离子水配制1.0×10^-6mol/L溶液，得到一系列不同浓度的啶虫脒标准溶液，浓度范围为1.0×10^-7mol/L～1.0×10^-18mol/L。

(6)标准曲线的绘制

将修饰电极NH₂-UiO-66-pDNA/apt/MoS₂QDs-PATP@PTCA/GCE作为工作电极，铂电极作为辅助电极，Ag/AgCl作为参比电极，组成三电极体系，将三电极体系置于上述含一系列不同浓度啶虫脒溶液中浸泡60min，在-1.6～0V的电化学窗口范围内，光电倍增管高压800V，扫速0.1V/s，进行循环伏安扫描，记录电位-发光强度曲线(E-ECL)，建立加入啶虫脒前后的发光强度差值与啶虫脒浓度对数值的线性关系，得到相应的线性回归方程；

(6)样品检测

实际样品先经过前处理，按照与上述步骤(5)同样的电化学发光测试条件进行测试，记录发光强度，所得发光强度用步骤(5)所得标准曲线所对应的线性回归方程计算出待测样品中啶虫脒的浓度。

本发明的显著优点是开发了一种检测啶虫脒的电化学发光传感器及其制备方法，与普通的电化学发光传感器相比，具有以下三方面的显著优点：MoS₂QDs-PATP极大提高了PTCA的光强；NH₂-UiO-66负载探针DNA后，使得传感器的信号有显著变化；利用啶虫脒对共振能量转移***的抑制作用来灵敏检测啶虫脒。

本发明涉及的材料对环境友好、易制备的材料。且本发明中首次提出了将MoS₂QDs通过与PATP配体交换得到氨基化的MoS₂QDs，使得量子点表面拥有大量氨基，从而实现与适配体的连接，进而更好的搭建了供体与受体之间的桥梁，使得传感器的检测范围相对更广，检测限更低，灵敏度更高。

附图说明

图1是该发明中的传感器的制备以及对啶虫脒的检测的简要流程图。

图2是加入啶虫脒前后发光强度的差值和啶虫脒浓度对数的标准曲线。

图3是PTCA(A)、MoS₂QDs-PATP(B)、MoS₂QDs-PATP@PTCA(C)和NH₂-UiO-66(D)的透射电镜图。

具体实施例

本发明下面结合实施例作进一步详述：

实施例：

(1)MoS₂QDs-PATP@PTCA复合材料的制备：

将0.25g的Na₂MoO₄·2H₂O溶于20mL水中，用0.1M HCl调节至pH 6.5。超声处理10min后，加入0.5g半胱氨酸和40mL去离子水。将上述混合物转移到100mL的聚四氟乙烯高压釜中，200℃反应36h，自然冷却至室温后，以10000rpm离心20min，取上层清液并于4℃保存。将125mg的4-氨基苯硫酚(PATP)溶于10mL的乙醇溶液中，再将其注入10mL的荧光二硫化钼量子点(MoS₂QDs)溶液中，在黑暗条件下搅拌6h。用乙醇洗涤、离心、分离，并将最终得到的MoS₂QDs-PATP分散在乙醇中(1mg/mL)。

将0.1g苝四羧酸二酐(PTCDA)溶于10mL 0.1M NaOH中，在80℃下搅拌2h，得到黄绿色溶液后，滴入1.0M HCl直至完全沉淀，离心并用去离子水洗涤三次，60℃干燥得到暗红色粉末，即苝四羧酸(PTCA)。

取上述制备的5mg的PTCA加入15mL的MoS₂QDs-PATP溶液中，搅拌6h，离心、洗涤、干燥得到淡红色粉末MoS₂QDs-PATP@PTCA。

(2)NH₂-UiO-66-pDNA的制备：

将0.1142g的ZrCl₄(0.2mmol)和0.0888g的对苯二甲酸(0.2mmol)溶解在50mL的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，搅拌均匀后加入8.82mL乙酸，然后将该溶液转移到100mL的Teflon衬里的不锈钢高压釜中。高压釜密封并在自生压力下放在120℃的烘箱中加热24h。自然冷却后，将所得物质离心并用无水乙醇洗涤纯化四次，然后将NH₂-UiO-66产物在60℃下干燥。

将100μLpDNA(pDNA订购于生工生物工程(上海)股份有限公司，且DNA序列为：5’-COOH GCG ATC AAG AAC CGC TGC AGA CAA ATT ACA-3’)的Tris-HCl溶液(pH为7.5)加入含有1mg NH₂-UiO-66的离心管中，振荡反应16h后，以10000rpm的转速离心10min，取沉淀溶于100μLTris-HCl(pH7.5)中，将得到的胶体溶液超声处理10min，并在室温下震荡1h，得到NH₂-UiO-66-pDNA，最后储存在4℃下备用。

(3)修饰电极NH₂-UiO-66-pDNA/apt/MoS₂QDs-PATP@PTCA/GCE的制备：

将玻碳电极抛光，依次用硝酸和无水乙醇、去离子水分别超声，自然晾干待用，用微量进样器移2.0μL 1.0mg/mL MoS₂QDs-PATP@PTCA的DMF溶液滴于洁净的玻碳电极表面，室温干燥，得到MoS₂QDs-PATP@PTCA/GCE修饰电极；接着，将2.0μL 2.0μmol/L的apt(该适配体订购于生工生物工程(上海)股份有限公司，适配体在5端修饰了羧基，DNA序列为：5’-COOH TGT AAT TTG TCT GCA GCG GTT CTT GAT CGC TGA CAC CAT ATT ATG AAG A-3’)滴加到MoS₂QDs-PATP@PTCA/GCE的表面，得到apt/MoS₂QDs-PATP@PTCA/GCE；然后将2.0μL2.0mg/mL NH₂-UiO-66-pDNA的Tris-HCl溶液滴加到apt/MoS₂QDs-PATP@PTCA/GCE，得到NH₂-UiO-66-pDNA/apt/MoS₂QDs-PATP@PTCA/GCE修饰电极。最后，将NH₂-UiO-66-pDNA/apt/MoS₂QDs-PATP@PTCA/GCE修饰电极在4℃的冰箱中放置6h，即得到ECL传感器。

(4)标准曲线的绘制

将修饰电极NH₂-UiO-66-pDNA/apt/MoS₂QDs-PATP@PTCA/GCE作为工作电极，铂电极作为辅助电极，Ag/AgCl作为参比电极，组成三电极体系，将三电极体系置于上述含一系列不同浓度啶虫脒的标准溶液中浸泡60min，并以含有0.05mol/L的K₂S₂O₈的pH＝7.5的0.1mol/L PB缓冲液作为空白溶液检测发光强度。将三电极体系置于一系列啶虫脒浓度(1.0×10^-7mol/L、1.0×10^-8mol/L、1.0×10^-9mol/L、1.0×10^-10mol/L、1.0×10^-11mol/L、1.0×10^-12mol/L、1.0×10^-13mol/L、1.0×10^-14mol/L、1.0×10^-15、1.0×10^-16mol/L、1.0×10^{- 17}mol/L和1.0×10^-18mol/L)含有0.05mol/L的K₂S₂O₈的pH 7.5的0.1mol/L PB的缓冲溶液中，在-1.6～0V的电化学窗口范围内，光电倍增管高压800V，放大倍数为2，扫速0.1V/s，进行循环伏安扫描，记录电位-发光强度曲线(E-ECL)，建立加入啶虫脒前后的发光强度差值与啶虫脒浓度对数值的线性关系，得到相应的线性回归方程为：

△I_ECL＝19293.07+1046.65Log C(mol/L)，相关系数(R²)为0.9991。线性回归方程的检测范围为1.0×10^-7～1.0×10^-18mol/L，最低检测限为6.4×10^-19mol/L。

(3)样品的检测

取一定量处理后的废水(处理后废水中含有K⁺、Na⁺、Mg²⁺、Li⁺、Ca²⁺等离子以及啶虫脒)加入到含有0.05mol/L的K₂S₂O₈的pH 7.5的0.1mol/L PB的缓冲溶液中，用于电化学发光检测，所得发光强度按上述步骤(2)所对应的线性回归方程计算出待检测样品中啶虫脒的浓度，其结果列于表1中。

比较例1：

以MoS₂QDs-PATP@PTCA/GCE修饰电极作为传感器。

将玻碳电极抛光，依次用硝酸和无水乙醇、去离子水分别超声，自然晾干待用。用微量进样器移取2.0μL1.0 mg/mL MoS₂QDs-PATP@PTCA材料的DMF溶液滴于洁净的玻碳电极表面，室温干燥，得到MoS₂QDs-PATP@PTCA/GCE修饰电极，作为传感器。

比较例2：

以NH₂-UiO-66/GCE修饰电极作为传感器

将玻碳电极抛光，依次用硝酸和无水乙醇、去离子水分别超声，自然晾干待用。用微量进样器移取2.0μL2.0 mg/mL NH₂-UiO-66滴于洁净的玻碳电极表面，室温干燥，得到NH₂-UiO-66/GCE修饰电极，作为电化学发光测试的工作电极。

对比例1、对比例2制备的修饰电极为工作电极，采用实施例1相同的方法进行检测，由于不存在适配体，所以无法选择性特异性捆绑目标分子啶虫脒，也难以发生能量共振转移，所以单独用MoS₂QDs-PATP@PTCA或是NH₂-UiO-66修饰的玻碳电极无法检测啶虫脒。

比较例3

比较例3与实施例1相比，区别在于：其中不加入4-氨基苯硫酚(PATP)，得到NH₂-UiO-66-pDNA/apt/MoS₂QDs@PTCA/GCE作为工作电极。

比较例3不修饰4-氨基苯硫酚(PATP)，也是难以检测到啶虫脒的，这是由于如果不修饰4-氨基苯硫酚(PATP)，MoS₂QDs表面就没有氨基，就不能很好地与带羧基的适配体很好的连接，进而影响了供体与受体之间的连接，当检测啶虫脒时，啶虫脒不能够将适配体从传感器中拉下来，从而不能够抑制共振能量转移，无法定量检测啶虫脒。

表1水样中啶虫脒的测定结果

如表1所示，NH₂-UiO-66-pDNA/apt/MoS₂QDs-PATP@PTCA作为工作电极，样品平行检测3次，相对标准偏差小于5％，加标回收率范围为98％～102％。本发明用于检测废水中的啶虫脒是可行的，且灵敏度高。

以上实施例仅用于本发明说明使用，并非对本发明的限制，有关领域的技术人员可在不脱离本发明的范围内，还可以作出相应的各种变化，因此所有等同替换或等效变型的方式形成的技术方案均属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种基于电化学发光法检测啶虫脒的传感器，其特征在于：所述传感器为NH₂-UiO-66-pDNA/apt/MoS₂QDs-PATP@PTCA/GCE，将其作为电化学发光测试的工作电极，铂电极作为辅助电极，Ag/AgCl作为参比电极，组成三电极体系进行电化学发光法检测啶虫脒；

NH₂-UiO-66-pDNA/apt/MoS₂QDs-PATP@PTCA/GCE传感器中MoS₂QDs-PATP@PTCA复合材料的制备方法为：

将Na₂MoO₄•2H₂O溶于去离子水中，用HCl调节pH至6.5，超声处理后，加入半胱氨酸和去离子水，将混合物转移到高压釜中反应，自然冷却至室温后，离心并取上层清液并于低温保存，得到MoS₂QDs溶液；将4-氨基苯硫酚溶于乙醇溶液中，再将其注入MoS₂QDs 溶液中，在黑暗条件下搅拌一定时间，用乙醇洗涤、离心、分离，并将最终得到的MoS₂QDs-PATP分散在乙醇中；

将苝四羧酸二酐溶于NaOH中，搅拌得到黄绿色溶液后，滴入HCl直至完全沉淀，离心并用去离子水洗涤三次，干燥得到暗红色粉末，即PTCA；

取制备的PTCA加入MoS₂QDs-PATP溶液中，搅拌、离心、洗涤、干燥得到淡红色粉末MoS₂QDs-PATP@PTCA。

2.根据权利要求1所述基于电化学发光法检测啶虫脒的传感器的制备方法，其特征在于，制备步骤包括：

（1）MoS₂QDs-PATP@PTCA复合材料的制备；

（2）NH₂-UiO-66-pDNA的制备；

（3）NH₂-UiO-66-pDNA/apt/MoS₂QDs-PATP@PTCA/GCE传感器的制备：

用微量进样器移MoS₂QDs-PATP@PTCA的DMF溶液滴于洁净的玻碳电极表面，室温干燥，得到MoS₂QDs-PATP@PTCA/GCE修饰电极，接着，将apt、NH₂-UiO-66-pDNA的Tris-HCl溶液滴加到MoS₂QDs-PATP@PTCA/GCE的表面，得到NH₂-UiO-66-pDNA/apt/MoS₂QDs-PATP@PTCA/GCE；最后，将NH₂-UiO-66-pDNA/apt/MoS₂QDs-PATP@PTCA/GCE修饰电极在低温环境下放置，即得到ECL传感器。

3.根据权利要求2所述基于电化学发光法检测啶虫脒的传感器的制备方法，其特征在于，NH₂-UiO-66-pDNA的制备为：

将pDNA的Tris-HCl溶液加入含有NH₂-UiO-66的离心管中，振荡反应后离心，取沉淀物溶于Tris-HCl中，将得到的胶体溶液超声处理，并在室温下震荡，得到NH₂-UiO-66-pDNA。

4.根据权利要求2所述基于电化学发光法检测啶虫脒的传感器的制备方法，其特征在于：apt适配体的DNA序列为：5’-COOH TGT AAT TTG TCT GCA GCG GTT CTT GAT CGC TGACAC CAT ATT ATG AAG A -3’。

5.根据权利要求1所述基于电化学发光法检测啶虫脒的传感器的制备方法，其特征在于：MoS₂QDs-PATP和PTCA的质量比1:1~3:1。

6.根据权利要求1所述的传感器或权利要求2-5任一项所述方法制备的传感器在电化学发光法检测啶虫脒中的应用，其特征在于，

（1）含过硫酸钾的磷酸盐缓冲溶液的配制，作为空白溶液；

（2）含不同浓度啶虫脒标准溶液的配制：

准确称取一定量的啶虫脒，用去离子水配制1.0×10^-6mol/L溶液，制备一系列不同浓度的啶虫脒标准溶液，啶虫脒标准溶液的浓度范围为1.0×10^-7mol/L~1.0×10^-18mol/L；

（3）标准曲线的绘制

将修饰电极NH₂-UiO-66-pDNA/apt/MoS₂QDs-PATP@PTCA/GCE作为工作电极，铂电极作为辅助电极，Ag/AgCl作为参比电极，组成三电极体系，将三电极体系置于上述含一系列不同浓度啶虫脒标准溶液中浸泡一定时间，并以含K₂S₂O₈的PBS作为空白溶液检测发光强度；在-1.6~0 V的电化学窗口范围内，光电倍增管高压800V，放大级数为2，扫速0.1V/s，进行循环伏安扫描，记录电位-发光强度曲线(E-ECL)，建立加入啶虫脒前后的发光强度差值与啶虫脒浓度对数值的线性关系，得到相应的线性回归方程；

（4）实际样品检测

实际样品检测先作前处理再调节pH，按照上述步骤(3)中的线性回归方程进行计算。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的磷酸盐缓冲溶液中含0.05mol/LK₂S₂O₈，PB缓冲溶液的pH为7.5，其浓度为0.1mol/L；

修饰电极NH₂-UiO-66-pDNA/apt/MoS₂QDs-PATP@PTCA/GCE在不同浓度啶虫脒标准溶液中浸泡时间为60 min。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：最低检测限为6.4×10^-19mol/L。

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