CN114636746A - 一种检测Pb2+的羧基配体诱导的湮灭型比率电化学发光适配体传感方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物传感检测领域，涉及一种检测Pb2+的羧基配体诱导的湮灭型比率电化学发光适配体传感方法。本发明以具有强阴‑阳极信号强度的羧基三联吡啶钌作为发光体，利用Pb2+适配体和其互补DNA的杂交作用以固定羧基三联吡啶钌的共振能量转移受体金纳米粒子，开发了一种检测Pb2+的湮灭型比率电化学发光适配体检测方法，因为结合具有优异湮灭性能的羧基三联吡啶钌和其在阴阳极可区分的共振能量转移受体金纳米粒子，提高了湮灭型比率电化学发光法的可靠性；因为引入特异性识别元件Pb2+的适配体，提高了电化学发光法的选择性，实现对Pb2+的特异性分析；该方法灵敏度高，选择性好，且可靠性高。
Description
技术领域
本发明属于生物传感检测领域，具体涉及一种检测Pb2+的羧基配体诱导的湮灭型比率电化学发光适配体传感方法。
背景技术
土壤中的重金属污染问题已引起各国政府和有关国际组织的高度重视。其中，Pb2+作为农田土壤中常见的重金属离子，具有难分解、毒性大、容易在生物体内富集等特点。它们可以污染农田土壤，降低可耕作土壤肥力，导致农作物产量减少；进而可以通过在植物体内的吸收和积累，影响农产品质量安全，威胁人类健康。目前，Pb2+检测分析方法主要包括原子吸收光谱法、火焰原子吸收光谱法、电感耦合等离子体-质谱法、电感耦合等离子体-发射光谱法、电化学法、荧光法、光电化学法和电化学发光法(ECL)等。这些分析方法在Pb2+的检测中均具有较好的传感价值。
其中，ECL法因其灵敏度高、响应时间短、动态范围宽和选择性好等优点，被广泛应用于Pb2+的检测。在众多的发光体中，三(2,2′-联吡啶)二氯钌(II)(Ru(bpy)3 2+)因其发光效率高、化学稳定性好和在水溶液和有机溶液中溶解度好的优势得到广泛应用。目前，大多数基于Ru(bpy)3 2+的湮没反应高度依赖于需要支持电解质的有机环境。然而，这种有机相的分析环境限制了Ru(bpy)3 2+基湮灭ECL在以水相为核心的ECL生物传感领域中的应用。据报道，水性介质中的Ru(bpy)3 2+可以表现出相对较好的阳极ECL信号，而由于Ru(bpy)3 2+还原形式异常的不稳定，其阴极ECL发射非常弱。尽管单个发光体Ru(bpy)3 2+可以直接发射两个ECL信号，但其阳极和阴极信号强度之间的不匹配性不利于比率传感策略的构建和发展。为了解决这个问题，科研工作者通过引入了Ru(bpy)3 2+阴极共反应剂获得匹配度好的阳极和阴极信号。然而，在一些应用中，引入共反应剂可能会干扰检测环境并影响ECL体系的稳定性，导致测量误差。因此，探索一种不需要任何共反应剂就能产生强ECL发射的湮灭型发光体是满足比率电化学发光传感策略检测Pb2+需求的关键。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明以具有强阴-阳极信号强度的羧基三联吡啶钌作为发光体，利用Pb2+适配体和其互补DNA(cDNA)的杂交作用以固定羧基三联吡啶钌的共振能量转移受体金纳米粒子(AuNPs)，开发了一种检测Pb2+的羧基配体诱导的湮灭型比率电化学发光适配体检测方法，该方法灵敏度高，选择性好，且可靠性好。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种检测Pb2+的羧基配体诱导的湮灭型比率电化学发光适配体检测方法，包括如下步骤：
(1)AuNPs和AuNPs-cDNA的制备；
将HAuCl4·3H2O溶液溶于超纯水中，搅拌溶解得到混合溶液；然后将混合溶液在一定温度下加热至沸腾后，加入柠檬酸钠溶液，得到红色溶液；随后，静置反应一段时间后冷却至室温，得到AuNPs溶液；
制备AuNPs-cDNA的过程中，首先，将末端带有巯基的cDNA溶液和三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP)溶液混合，静置一段时间，得到活化的cDNA溶液；之后，将活化的cDNA 溶液和AuNPs溶液混合，摇晃孵育，孵育后离心收集上清液，即为AuNPs-cDNA溶液；
(2)将玻碳电极(GCE)依次用不同粒径的三氧化二铝粉末打磨，然后依次在乙醇和水中超声，最后在空气中干燥得到预处理后的电极；
(3)将步骤(2)预处理后的电极浸泡在HAuCl4·3H2O溶液中电沉积金粒子(AuPs)，电沉积处理后得到电沉积电极；
(4)在步骤(3)制备的电沉积电极上修饰Pb2+适配体(Apt)溶液，在一定温度条件下继续反应一段时间，得到适配体电极；
(5)在步骤(4)制备的适配体电极上滴加巯基己醇(MCH)溶液，室温条件下进行孵育，得到孵育后的电极；
(6)在步骤(5)孵育后的电极上滴加步骤(1)制备的AuNPs-cDNA溶液；在一定温度条件下反应一段时间，反应后得到传感器，记为AuNPs-cDNA/MCH/Apt/AuPs/GCE；
(7)将步骤(6)得到的传感器置于不同浓度Pb2+标准溶液中绑定一定的时间，一个浓度的Pb2+标准溶液对应一个传感器，浓度和传感器呈一一对应关系；经超纯水冲洗后在室温下自然晾干；此时制得的电极记为Pb2+/AuNPs-cDNA/MCH/Apt/AuPs/GCE-1；以其作为工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极；将所述的三电极体系在含有羧基三联吡啶钌的缓冲溶液中进行测试，检测电化学发光信号；由MPI-EII电化学发光分析仪记录和检测电化学发光信号；通过监测羧基三联吡啶钌的阴极和阳极ECL信号比(I阴/I阳)的变化，建立Pb2+溶液浓度和电化学发光信号的对应关系的标准线性曲线；
(8)待测样品中Pb2+浓度的检测：
将步骤(6)得到的传感器置于Pb2的待测溶液中，超纯水冲洗后在室温下自然晾干，记为Pb2+/AuNPs-cDNA/MCH/Apt/AuPs/GCE-2；以Pb2+/AuNPs-cDNA/MCH/Apt/AuPs/GCE-2作为工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极；将所述的三电极体系在含有羧基三联吡啶钌的缓冲溶液中进行测试，检测电化学发光信号；将监测到的羧基三联吡啶钌的I阴/I阳的变化代入步骤(7)建立的标准线性曲线中，得到待测溶液中Pb2+的浓度，实现对Pb2+的高灵敏检测。
进一步地，步骤(1)中，所述HAuCl4·3H2O溶液的浓度为0.1M，所述一定温度为150℃；所述的柠檬酸钠溶液的浓度为100mg·mL-1，所述HAuCl4·3H2O溶液、超纯水和柠檬酸钠溶液的体积比0.2：25：0.25；所述静置反应一段时间为15～20min；
所述末端带有巯基的cDNA溶液的浓度为100μM；所述三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP) 溶液的浓度为10mM；所述末端带有巯基的cDNA与TCEP溶液的体积比为0.5:1；所述静置一段时间为1h。
所述的活化的cDNA溶液与AuNPs溶液的体积比为150μL：1850μL；所述摇晃孵育时间为12h。
进一步地，步骤(2)中，所述GCE的直径为3mm；所述不同粒径的三氧化二铝粉末的粒径依次为0.3μm和0.05μm。
进一步地，步骤(3)中，所述HAuCl4·3H2O的质量浓度为0.1％；电沉积的电位为-0.2V，电沉积的时间为45s。
进一步地，步骤(4)中，所述Pb2+适配体溶液的浓度为0.8μM，在电极上修饰的用量为 6μL；所述一定温度为4℃，反应时间为12h。
进一步地，步骤(5)中，所述MCH溶液的浓度为1mM；在电极上滴加的用量为6μL；所述孵育的时间为1h。
进一步地，步骤(6)中，所述AuNPs-cDNA溶液的浓度为0.2～5.2nM；滴加用量为6μL；所述一定温度条件为37℃，反应时间为2h。
进一步地，步骤(7)中，所述Pb2+溶液的浓度为1.0×10-12～3.0×10-8M；所述绑定一定的时间为40min；所述缓冲溶液为磷酸缓冲液，浓度为0.1M，pH值为7.5；所述的羧基三联吡啶钌是三(2,2'-联吡啶基)二氯钌(II)六水合物(Ru(bpy)3 2+)、双(2,2'-联吡啶基)(4-羧基-2,2'-联吡啶基)二氯化钌(II)(Ru(cbpy)3 2+)或三(4,4'-二羧酸-2,2'-联吡啶基)二氯化钌(II)(Ru(dcbpy)3 2+)中的一种，所述的羧基三联吡啶钌在缓冲溶液中的浓度为0.5mM。所述测试时所采用的参数为：电压为-1.8V～+1.35V，扫描速率为0.1V/s，光电倍增管高压为700V。
进一步地，步骤(8)中，所述绑定一定的时间为40min；所述缓冲溶液为磷酸缓冲液，浓度为0.1M，pH值为7.5；所述的羧基三联吡啶钌是Ru(bpy)3 2+、Ru(cbpy)3 2+和Ru(dcbpy)3 2+中的一种，所述的羧基三联吡啶钌在缓冲溶液中的浓度为0.5mM。所述测试时所采用的参数为：电压为-1.8V～+1.35V，扫描速率为0.1V/s，光电倍增管高压为700V。
该羧基配体诱导的湮灭型比率电化学发光适配体传感器的工作原理：
经研究发现，水介质中羧基三联吡啶钌在电极表面可以发生电化学氧化和还原反应，产生同时的阳极和阴极ECL发射。机理研究表明羧基三联吡啶钌的高效湮灭ECL发光依赖于作为其辅助配体的羧基。该羧基对羧基三联吡啶钌的自由基离子具有优异的稳定作用，并能有效地促进配体内的转移和金属到配体的电荷转移，从而产生更多的发射激发态。基于双发射信号的羧基三联吡啶钌，通过引入羧基三联吡啶钌在阳极和阴极可区分的能量转移共振受体 AuNPs，构建了一种用于Pb2+分析的湮灭型比率ECL适配体传感器，实现土壤样品中Pb2+的灵敏、可靠分析。
本发明的有益效果：
(1)本发明通过考察羧基三联吡啶钌在PBS缓冲溶液中阴、阳极ECL信号强度，获得了湮灭型羧基三联吡啶钌的电化学和电化学发光性质，并获得了优异的阴、阳极信号，最后实现了羧基三联吡啶钌在阴、阳极信号的可控、同时获取，为湮灭型比率ECL适配体传感器的构建提供了基础。
(2)本发明基于羧基三联吡啶钌的辅助配体羧基对自由基离子优异的稳定作用，以及对配体内转移和金属到配体的电荷转移的促进作用，提高了湮灭型电化学发光传感方法的稳定性。
(2)本发明以AuNPs作为羧基三联吡啶钌在阴、阳极可区分的共振能量转移(RET)受体，获得了可区分的信号强度以完成阴、阳极信号比值的获取，构建了湮灭型比率ECL适配体传感器，提高了电化学发光传感方法的可靠性。
(2)本发明利用Pb2+和其适配体的特异性绑定引发AuNPs-cDNA从电极界面释放，以在阴、阳极得到不同信号放大程度的电化学发光信号，提高了电化学发光传感方法的灵敏度。
(5)本发明引入特异性识别元件Pb2+的适配体，提高了比率电化学发光适配体传感方法的选择性，降低了实际样品中存在的其它离子的潜在干扰，实现对Pb2+的选择性分析。
(6)本发明构建的湮灭型比率电化学发光适配体传感方法用于Pb2+的检测，灵敏度高、可靠性好、选择性好、稳定性好。
(7)本发明构建的湮灭型比率电化学发光适配体传感方法用于土壤样品中Pb2+的检测，得到了满意的回收率，同时该结果与标准方法的结果基本一致，表明了电化学发光适配体传感方法的可靠性。
附图说明
图1中(A)为羧基三联吡啶钌的湮灭型电化学发光机制，其中曲线插图为羧基三联吡啶钌在PBS中的ECL-电位图；(B)为湮灭型比率电化学发光适配体检测Pb2+的机制图，其中插图曲线为传感器在存在Pb2+前后的ECL-电位图。
图2为Ru(bpy)3 2+，Ru(cbpy)3 2+，Ru(dcbpy)3 2+的结构式。
图3为AuNPs的紫外可见吸收光谱和Ru(dcbpy)3 2+的ECL光谱。
图4中(A)为ECL适配体传感器在不同浓度Pb2+对数所对应的ECL信号，Pb2+浓度：从左到右的浓度依次为1.0×10-12M,3.0×10-11M,1.0×10-10M,3.0×10-10M,1.0×10-9M,3.0×10-9 M,1.0×10-8M和3.0×10-8M，和相应的工作曲线图(B)。
图5为ECL适配体传感的选择性能：图中干扰物质为K+,Na+,Ca2+,Mg2+,Fe2+,Fe3+,Cd2 +, Cu2+,Hg2+,Ni2+,Mn2+,Zn2+和以上离子的混合物(Mix)。
图6为ECL适配体传感器的批次内和批次间的重现性能图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和说明书附图，进一步阐明本发明。在本发明中，公开了羧基三联吡啶钌在水介质中的湮灭ECL。羧基三联吡啶钌可以发生电化学氧化和还原反应，产生同时的阳极和阴极ECL发射。基于双发射信号的羧基三联吡啶钌，通过引入羧基三联吡啶钌在阳极和阴极可区分的共振能量转移受体AuNPs，构建了一种用于Pb2+分析的比率ECL适配体传感器。
在本发明中，末端带有巯基的cDNA和Pb2+适配体购买于在生工生物工程(上海)股份有限公司购买。其序列如下：cDNA：5'-SH-AAC CAC ACC AA-3'
适配体：5'-SH-(CH2)6-GGT TGG TGT GGT TGG-3'
实施例1：
按照图1所述的制备工艺：
(1)AuNPs和AuNPs-cDNA的制备
将0.2mL 0.1M HAuCl4·3H2O溶液溶于25mL超纯水中，搅拌溶解得到混合溶液。然后将混合溶液在150℃下加热至沸腾；当溶液完全沸腾后，迅速加入0.25mL 100mg·mL-1柠檬酸钠溶液，得到红色溶液；随后，溶液继续反应15min后冷却至室温，得到AuNPs溶液；所得AuNPs溶液，避光保存于4℃冰箱以备后用；
制备AuNPs-cDNA：首先，将50μL 100μM末端带有巯基的cDNA溶液和100μL 10mM 三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP)溶液混合，静置1h后，得到活化的cDNA溶液；之后，将150μL活化的cDNA溶液和1850μL AuNPs溶液混合，摇晃孵育12h，孵育后离心以去除不溶性杂质，收集上清液即为AuNPs-cDNA溶液，避光保存于4℃冰箱备用。
(2)将GCE依次用0.3μm和0.05μm的三氧化二铝粉末打磨，在乙醇和水中超声后在空气中干燥，所述GCE的直径d＝3mm；
(3)将步骤(2)的电极浸泡在HAuCl4·3H2O中，在-0.2V电位下进行电镀45s，在电极表面形成一层AuPs，得到电沉积电极；
(4)将6μL 0.8μM Pb2+的Apt溶液修饰到步骤(3)制备的电沉积电极表面，4℃下作用12h，得到适配体电极；
(5)在步骤(4)制备的适配体电极上滴加6μL 1mM MCH溶液，室温下孵育1h以封闭非特异性结合位点，得到孵育后的电极；
(6)在步骤(5)孵育后的电极上滴加6μL AuNPs-cDNA溶液，37℃下作用2h；得到传感器，记为AuNPs-cDNA/MCH/Apt/AuPs/GCE；即为ECL适配体传感器；
(7)将步骤(6)得到的传感器置于不同浓度Pb2+标准溶液中，Pb2+的浓度依次为1.0×10-12 M,3.0×10-11M,1.0×10-10M,3.0×10-10M,1.0×10-9M,3.0×10-9M,1.0×10-8M和3.0×10-8M，超纯水冲洗后在室温下自然晾干；此时制得的电极记为Pb2+/AuNPs-cDNA/MCH/Apt/AuPs/GCE-1，以其作为工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极。将所述的三电极体系在含有Ru(dcbpy)3 2+的缓冲溶液中进行测试，Ru(dcbpy)3 2+的浓度为0.5mM；检测电化学发光信号；通过监测Ru(dcbpy)3 2+的I阴/I阳的变化，建立Pb2+溶液浓度和电化学发光信号的对应关系的标准线性曲线；
(8)将步骤(6)得到的传感器置于Pb2的待测溶液中，超纯水冲洗，室温下自然晾干，记为Pb2+/AuNPs-cDNA/MCH/Apt/AuPs/GCE-2；以Pb2+/AuNPs-cDNA/MCH/Apt/AuPs/GCE-2作为工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极。将所述的三电极体系在Ru(dcbpy)3 2+的缓冲溶液中进行测试，Ru(dcbpy)3 2+的浓度为0.5mM；检测电化学发光信号；将监测到的Ru(dcbpy)3 2+的I阴/I阳的变化代入步骤(7)建立的标准线性曲线中，得到待测溶液中Pb2+的浓度，实现对Pb2+的高灵敏检测。
从图2中，可以看出，Ru(bpy)3 2+不含羧基官能团，Ru(cbpy)3 2+含有1个羧基官能团，Ru(dcbpy)3 2+含有6个羧基官能团。
从图3中，可以看出，AuNPs在520nm的紫外可见吸收峰分别与Ru(dcbpy)3 2+在650nm处的阳极的ECL光谱和在700nm处的阴极的ECL光谱具有良好光谱重叠，表明AuNPs可以用作Ru(dcbpy)3 2+相互作用探针。更重要的是，与Ru(dcbpy)3 2+阴极的ECL光谱相比， Ru(dcbpy)3 2+阳极的ECL光谱和AuNPs的紫外吸收峰具有更紧密的光谱重叠，因此，AuNPs 到阳极中Ru(dcbpy)3 2+的RET性能高于阴极的。
从图4(A)中，可以看出，随着Pb2+浓度的增加，阳极和阴极ECL的发射信号均逐渐增加，且阳极发射增加的程度明显高于阴极，这验证了AuNPs对Ru(dcbpy)3 2+的共振能量转移能力不同。I阴/I阳与Pb2+在3.0×10-12-1.0×10-8M之间的对数浓度呈良好的线性关系图4(B)。线性回归方程为I阴/I阳＝-1.469-0.343logCPb 2+，相关系数(R2)为0.998，检测限为1.3×10-13M。
实施例2：
利用实施例1所制备的传感器考察湮灭型比率电化学发光适配体传感器的选择性；
当将ECL适配体传感器置于水溶液中时，获得的I阴/I阳为空白信号；当以不同的离子(K+, Na+,Ca2+,Mg2+,Fe2+,Fe3+,Cd2+,Cu2+,Hg2+,Ni2+,Mn2+,Zn2+,Mix，Pb2+和Pb2++Mix)分别代替空白样时，所获得的I阴/I阳为测试信号；利用测试信号与空白信号差值的绝对值，记为|ΔI阴 /I阳|，考察其选择性能。
图5为该传感器的选择性能：其中blank是指水溶液，定义为空白样；K+,Na+,Ca2+,Mg2+, Fe2+,Fe3+,Cd2+,Cu2+,Hg2+,Ni2+,Mn2+,Zn2+，Mix作为干扰物，Mix为上述12种干扰离子的混合溶液。
实施例3：
利用实施例1所制备的传感器考察湮灭型比率电化学发光适配体传感器的重现性；
将同一批次内平行制备的5个ECL适配体传感器分别置于含有1.0×10-9M的5个Pb2 +溶液中时，记录批次内的I阴/I阳；将不同批次制备的5个ECL适配体传感器分别置于含有1.0×10-9M的5个Pb2+溶液中时，记录批次间的I阴/I阳。
从图6中，可以看出，批次内5个平行适配体传感器的ECL信号的相对标准差(RSD)为2.86％，批次间为2.62％，证明该传感器具有良好的重现性能。
实施例4：
以实施例1所制备的传感器以及检测方法，作为一个实际检测模型，对农田土壤提取液进行检测。
(1)农田土壤的采集和处理
农田土壤采集于湖北省，并按照行业标准(HJ 803-2016)进行处理。将得到的土样风干，细磨至200目尼龙筛。将0.1g土壤样品和6mL硝酸/盐酸盐(HCl/HNO3，v/v，3/1)的混合溶液逐渐加入锥形瓶中，在电加热板上进行热消解。消解后用0.22μm纤维素膜滤除杂质，用1M NaOH将提取液pH值调至7.0。最后，将溶液进一步稀释至所需浓度以备进一步使用。
(2)取部分提取液进行加标配置，使得农田土壤提取液中Pb2+的浓度分别为0，5×10-11 M，5×10-10M和5×10-9M，总共获得4个待测样品。
(3)将实施例1步骤(6)得到的4个电极分别置于4个Pb2+的待测溶液中，超纯水冲洗后在室温下自然晾干，记为Pb2+/AuNPs-cDNA/MCH/Apt/AuPs/GCE-2；此时制得的电极 Pb2+/AuNPs-cDNA/MCH/Apt/AuPs/GCE-2作为工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极。将所述的三电极体系在含有Ru(dcbpy)3 2+的缓冲溶液中进行测试，检测 Ru(dcbpy)3 2+的阴阳极ECL信号，并作比值，该操作重复3次，取其平均值；代入步骤(7) 建立的标准线性曲线中，得到待测溶液中Pb2+的浓度。
(3)通过标准方法(电感耦合等离子体质谱法，ICP-MS)，对发展的电化学发光适配体传感方法的可靠性进行验证；并使用发展的电化学发光适配体传感方法(n＝3)和ICP-MS法测量土壤样品中Pb2+的浓度，结果如表1所示；
表1：土壤样品中Pb2+浓度的检测
从表1中，可以看出，利用适配体传感器检测出Pb2+的背景浓度为2.40×10-12M(表1)。添加不同浓度Pb2+所得的回收率介于93.6％和103％之间，RSD低于5.54％。ICP-MS方法所得的回收率介于78.2％和101％之间，该结果验证适配体传感器的可靠性。更重要的是，ECL 适配体传感器能够检测出2.40×10-12M的Pb2+，而ICP-MS只能检测6.28×10-10M的Pb2+。相对于ICP-MS方法，适配体传感器在实际样品的分析中表现出更高的灵敏度和可比较的可靠性。
说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。
Claims (10)
1.一种检测Pb2+的羧基配体诱导的湮灭型比率电化学发光适配体传感方法，其特征在于，步骤如下：
(1)AuNPs和AuNPs-cDNA的制备；
将HAuCl4·3H2O溶液溶于超纯水中，搅拌溶解得到混合溶液；然后将混合溶液在一定温度下加热至沸腾后，加入柠檬酸钠溶液，得到红色溶液；随后，静置反应一段时间后冷却至室温，得到AuNPs溶液；
制备AuNPs-cDNA的过程中，首先，将末端带有巯基的cDNA溶液和三(2-羰基乙基)磷盐酸盐溶液混合，静置一段时间，得到活化的cDNA溶液；之后，将活化的cDNA溶液和AuNPs溶液混合，摇晃孵育，孵育后离心收集上清液，即为AuNPs-cDNA溶液；
(2)将玻碳电极依次用不同粒径的三氧化二铝粉末打磨，然后依次在乙醇和水中超声，最后在空气中干燥得到预处理后的电极；
(3)将步骤(2)预处理后的电极浸泡在HAuCl4·3H2O溶液中电沉积金粒子，电沉积处理后得到电沉积电极；
(4)在步骤(3)制备的电沉积电极上修饰Pb2+适配体溶液，在一定温度条件下继续反应一段时间，得到适配体电极；
(5)在步骤(4)制备的适配体电极上滴加巯基己醇溶液，室温条件下进行孵育，得到孵育后的电极；
(6)在步骤(5)孵育后的电极上滴加步骤(1)制备的AuNPs-cDNA溶液；在一定温度条件下反应一段时间，反应后得到传感器，记为AuNPs-cDNA/MCH/Apt/AuPs/GCE；
(7)将步骤(6)得到的传感器置于不同浓度Pb2+标准溶液中绑定一定的时间，一个浓度的Pb2+标准溶液对应一个传感器，浓度和传感器呈一一对应关系；经超纯水冲洗后在室温下自然晾干；此时制得的电极记为Pb2+/AuNPs-cDNA/MCH/Apt/AuPs/GCE-1；以其作为工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极；将所述的三电极体系在含有羧基三联吡啶钌的缓冲溶液中进行测试，检测电化学发光信号；由MPI-EII电化学发光分析仪记录和检测电化学发光信号；通过监测羧基三联吡啶钌的阴极和阳极ECL信号比的变化，建立Pb2+溶液浓度和电化学发光信号的对应关系的标准线性曲线；
(8)待测样品中Pb2+浓度的检测：
将步骤(6)得到的传感器置于Pb2的待测溶液中，超纯水冲洗后在室温下自然晾干，记为Pb2+/AuNPs-cDNA/MCH/Apt/AuPs/GCE-2；以Pb2+/AuNPs-cDNA/MCH/Apt/AuPs/GCE-2作为工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极；将所述的三电极体系在含有羧基三联吡啶钌的缓冲溶液中进行测试，检测电化学发光信号；将监测到的羧基三联吡啶钌的I阴/I阳的变化代入步骤(7)建立的标准线性曲线中，得到待测溶液中Pb2+的浓度，实现对Pb2+的高灵敏检测。
2.根据权利要求1所述的检测Pb2+的羧基配体诱导的湮灭型比率电化学发光适配体传感方法，其特征在于，步骤(1)中，所述HAuCl4·3H2O溶液的浓度为0.1M，所述一定温度为150℃；所述的柠檬酸钠溶液的浓度为100mg·mL-1，所述HAuCl4·3H2O溶液、超纯水和柠檬酸钠溶液的体积比0.2：25：0.25；所述静置反应一段时间为15～20min；
所述末端带有巯基的cDNA溶液的浓度为100μM；所述三(2-羰基乙基)磷盐酸盐溶液的浓度为10mM；所述末端带有巯基的cDNA与三(2-羰基乙基)磷盐酸盐溶液的体积比为0.5:1；所述静置一段时间为1h。
所述的活化的cDNA溶液与AuNPs溶液的体积比为150μL：1850μL；所述摇晃孵育时间为12h。
3.根据权利要求1所述的检测Pb2+的羧基配体诱导的湮灭型比率电化学发光适配体传感方法，其特征在于，步骤(2)中，所述玻碳电极的直径为3mm；所述不同粒径的三氧化二铝粉末的粒径依次为0.3μm和0.05μm。
4.根据权利要求1所述的检测Pb2+的羧基配体诱导的湮灭型比率电化学发光适配体传感方法，其特征在于，步骤(3)中，所述HAuCl4·3H2O的质量浓度为0.1％；电沉积的电位为-0.2V，电沉积的时间为45s。
5.根据权利要求1所述的检测Pb2+的羧基配体诱导的湮灭型比率电化学发光适配体传感方法，其特征在于，步骤(4)中，所述Pb2+适配体溶液的浓度为0.8μM，在电极上修饰的用量为6μL；所述一定温度为4℃，反应时间为12h。
6.根据权利要求1所述的检测Pb2+的羧基配体诱导的湮灭型比率电化学发光适配体传感方法，其特征在于，步骤(5)中，所述MCH溶液的浓度为1mM；在电极上滴加的用量为6μL；所述孵育的时间为1h。
7.根据权利要求1所述的检测Pb2+的羧基配体诱导的湮灭型比率电化学发光适配体传感方法，其特征在于，步骤(6)中，所述AuNPs-cDNA溶液的浓度为0.2～5.2nM；滴加用量为6μL；所述一定温度条件为37℃，反应时间为2h。
8.根据权利要求1所述的检测Pb2+的羧基配体诱导的湮灭型比率电化学发光适配体传感方法，其特征在于，步骤(7)中，所述Pb2+溶液的浓度为1.0×10-12～3.0×10-8M；所述绑定一定的时间为40min；
所述缓冲溶液为磷酸缓冲液，浓度为0.1M，pH值为7.5；所述的羧基三联吡啶钌为三(2,2'-联吡啶基)二氯钌(II)六水合物、双(2,2'-联吡啶基)(4-羧基-2,2'-联吡啶基)二氯化钌(II)或三(4,4'-二羧酸-2,2'-联吡啶基)二氯化钌(II)中的一种，所述的羧基三联吡啶钌在缓冲溶液中的浓度为0.5mM；
所述测试时所采用的参数为：电压为-1.8V～+1.35V，扫描速率为0.1V/s，光电倍增管高压为700V。
9.根据权利要求1所述的检测Pb2+的羧基配体诱导的湮灭型比率电化学发光适配体传感方法，其特征在于，步骤(8)中，所述绑定一定的时间为40min；所述缓冲溶液为磷酸缓冲液，浓度为0.1M，pH值为7.5。
10.根据权利要求1所述的检测Pb2+的羧基配体诱导的湮灭型比率电化学发光适配体传感方法，其特征在于，步骤(8)中，所述的羧基三联吡啶钌为三(2,2'-联吡啶基)二氯钌(II)六水合物、双(2,2'-联吡啶基)(4-羧基-2,2'-联吡啶基)二氯化钌(II)或三(4,4'-二羧酸-2,2'-联吡啶基)二氯化钌(II)中的一种，所述的羧基三联吡啶钌在缓冲溶液中的浓度为0.5mM；所述测试时所采用的参数为：电压为-1.8V～+1.35V，扫描速率为0.1V/s，光电倍增管高压为700V。
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