CN112725297B - 一种硫醚单加氧酶及其在制备手性拉唑药物中的应用 - Google Patents
一种硫醚单加氧酶及其在制备手性拉唑药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种硫醚单加氧酶，硫醚单加氧酶突变体；编码所述硫醚单加氧酶或硫醚单加氧酶突变体的核酸，含有该核酸的重组表达载体，含有该重组表达载体的重组表达转化体；重组硫醚单加氧酶催化剂，以及所述重组硫醚单加氧酶催化剂在制备手性拉唑药物中的应用。与其他制备光学纯拉唑类药物的生物催化剂相比，本发明提供的硫醚单加氧酶及其突变体具有蛋白表达量高、催化活性高、催化底物范围广、立体选择性高、热稳定性好的优点，在工业应用中显示出广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，尤其是涉及一种硫醚单加氧酶，硫醚单加氧酶突变体，编码所述硫醚单加氧酶或硫醚单加氧酶突变体的核酸，含有该核酸的重组表达载体，含有该重组表达载体的重组表达转化体，重组硫醚单加氧酶催化剂，以及重组硫醚单加氧酶催化剂在制备手性拉唑药物中的应用。
背景技术
质子泵抑制剂(Proton pump inhibitors，PPIs)是一类广泛用于治疗胃酸性消化疾病的首选药物。PPIs即H+/K+-ATP酶抑制剂，具有抑酸作用强，特异性高，持续时间长久等特点。PPIs由取代的吡啶基甲基磺酰基苯并咪唑或咪唑并吡啶衍生物组成，这些结构均由奥美拉唑的原始结构演变而来。胃壁细胞内质子泵驱动细胞内H+与小管内K+交换，而PPIs类抗分泌药物通过与胃壁细胞中ATPase的半胱氨酸残基共价结合来抑制胃质子泵，以此达到抑制胃酸分泌的目的。与以往临床应用的抑制胃酸药物-H2受体拮抗剂相比较，PPIs阻断了胃酸分泌的最后通道，其作用位点不同且具有夜间抑酸作用好、起效快，抑酸作用强且时间长、服用方便等优点，所以能抑制基础胃酸的分泌及组胺、乙酰胆碱、胃泌素和食物刺激引起的酸分泌。目前全球已上市的PPIs主要有奥美拉唑(1988年在瑞典上市)，兰索拉唑(1995年在日本上市)，泮托拉唑(1997年在德国上市)，雷贝拉唑(1999年在美国上市)以及艾司奥美拉唑(2001年在美国上市)等。兰索拉唑是继奥美拉唑后的第二个质子泵抑制剂，二者在分子结构上的差别主要在于兰索拉唑在吡啶环4-位引入了三氟乙氧基基团，使其具有更强的亲脂性。兰索拉唑可作用于质子泵H+/K+-ATP酶的3个部位，在酸性条件下可迅速透过壁细胞膜转变为次磺酸和次磺酰衍生物而发挥药效，较奥美拉唑的生物利用率提高了30％。
通常，与外消旋的PPIs相比，光学纯的手性PPIs具有更强的抑酸强度，更长的抑酸时间以及更高的生物利用率。右旋兰索拉唑是兰索拉唑的(R)-型异构体，由日本武田制药公司研发并于2009年被美国FDA批准上市。此次上市剂型是缓释胶囊，内置两层肠溶包衣单位，可使药物在给药后1-2小时和4-5小时后分别出现两个血药浓度峰值，作用时间超过兰索拉唑，且给药时间不受食物和用餐时间的影响。临床Ⅲ期试验显示，该药能为日间或夜间伴胃灼热症状的胃食管反流病患者提供长达24小时的抑酸作用和持续的症状缓解效果。
虽然化学法合成质子泵抑制剂已取得一定的进展并实现了工业化生产，但是化学合成法普遍存在立体选择性差、手性催化剂昂贵、副产物多等问题。化学合成中使用了大量的过氧酸、H2O2、有机催化剂和有机溶剂等物质，对工作人员的身体及周边环境的危害都不容忽视。由于化学反应条件相对苛刻，对生产设备的要求也很高，也大大增加了生产投入。
质子泵抑制剂的生物法合成具有立体选择性好，反应条件温和，反应体系绿色环保等优点，是化学合成法的有益补充，随着生物技术的快速发展，生物合成法有望成为未来手性亚砜药物生产的主要方法。目前质子泵抑制剂的生物法合成途径中主要以前手性硫醚为底物，利用整细胞、游离酶等作为催化剂催化其不对称氧化，得到光学纯的质子泵抑制剂。吉田(Yoshida)等人从650株细菌、真菌、酵母及霉菌微生物筛选到了一株霉菌Cunninghamella echinulata MK40，可以催化7.5mM雷贝拉唑硫醚转化，反应144小时后转化率为92％，产物为(S)-雷贝拉唑，而以奥美拉唑硫醚和兰索拉唑硫醚作为底物时，转化率分别仅为45％和0.6％。赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus sp.B71的生长细胞可以催化0.1g/L奥美拉唑硫醚生成埃索美拉唑，但转化率仅为70％。该生长细胞也可以催化泮托拉唑硫醚，但转化率仅为8％，对艾普拉唑硫醚和兰索拉唑硫醚均无催化活性。WO2011/071982中公开了Codexis公司通过定向进化改造来源于Acinetobacter calcoaceticus NCIMB9871的环己酮单加氧酶，得到的突变体酶可以高效催化奥美拉唑硫醚合成艾司奥美拉唑，尽管如此，该突变体酶对兰索拉唑硫醚的活性极低，即使在较低的产物上载量情况下转化率仍不足2％，且产物的光学纯度很低。
虽然目前已有生物催化剂可以催化兰索拉唑硫醚的氧化，但是氧化活性极低，立体选择性较差，底物上载量低，很难满足工业生产的要求。
发明内容
针对生物法产生手性亚砜药物存在的生物催化剂缺乏、催化活性低、立体选择性差及底物上载量低等问题，本发明提供一种硫醚单加氧酶，硫醚单加氧酶突变体，编码所述硫醚单加氧酶或硫醚单加氧酶突变体的核酸，含有该核酸的重组表达载体，含有该重组表达载体的重组表达转化体，重组硫醚单加氧酶催化剂，以及重组硫醚单加氧酶催化剂在制备手性拉唑药物中的应用。
本发明提供的硫醚单加氧酶表达量高、催化活性高、催化底物谱广。硫醚单加氧酶突变体具有更高活性和稳定性。
基于本发明的硫醚单加氧酶或硫醚单加氧酶突变体可催化硫醚不对称氧化反应合成单一构型的手性拉唑类药物。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明的第一个目的是提供一种分离的硫醚单加氧酶，所述硫醚单加氧酶由如序列表SEQ ID No.3所示的氨基酸序列所编码。
本发明的第二个目的是提供一种硫醚单加氧酶突变体，其是由如序列表SEQ IDNo.3所示的氨基酸序列中经过氨基酸取代、缺失或***一个或几个氨基酸残基衍生的序列所编码。
优选地，所述硫醚单加氧酶突变体，是将如序列表SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中的第50位Arg、第101位Leu、第153位Asn、第171位Gly、第212位Leu、第266位Gly、第273位Ala、第313位Leu、第325位Ile、第342位Glu、第406位Tyr、第451位Ser或第506位Ala中的一个或多个氨基酸残基替换为其他氨基酸残基所形成的新氨基酸序列的衍生蛋白质。所述衍生蛋白质对兰索拉唑硫醚的氧化活性显著提升，在热稳定性方面也有所提高。
在本发明的一些实施方式中，具体的，所述硫醚单加氧酶突变体是如下序列中的一种：
(1)所述SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中第153位的氨基酸Asn替换为Val；
(2)所述SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中第266位的氨基酸Gly替换为Asp；
(3)所述SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中第313位的氨基酸Leu替换为Pro；
(4)所述SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中第406位的氨基酸Tyr替换为His；
(5)所述SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中第506位的氨基酸Ala替换为Phe；
(6)所述SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中第266位的氨基酸Gly替换为Asp，第406位的氨基酸Tyr替换为His；
(7)所述SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中第50位的氨基酸Arg替换为His，第273位的氨基酸Ala替换为Lys；
(8)所述SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中第266位的氨基酸Gly替换为Asp，第313位的氨基酸Leu替换为Pro；
(9)所述SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中第212位的氨基酸Leu替换为Met，第313位的氨基酸Leu替换为Pro，第451位的氨基酸Ser替换为Gln；
(10)所述SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中第171位的氨基酸Gly替换为Met，第451位的氨基酸Ser替换为Gln，第506位的氨基酸Ala替换为Phe；
(11)所述SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中第153位的氨基酸Asn替换为Val，第342位的氨基酸Glu替换为Ile，第406位的氨基酸Tyr替换为His；
(12)所述SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中第153位的氨基酸Asn替换为Val，第266位的氨基酸Gly替换为Asp，第451位的氨基酸Ser替换为Gln；
(13)所述SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中第313位的氨基酸Leu替换为Pro，第325位的氨基酸Ile替换为Lys，第406位的氨基酸Tyr替换为His；
(14)所述SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中第50位的氨基酸Arg替换为His，第313位的氨基酸Leu替换为Pro，第451位的氨基酸Ser替换为Gln；
(15)所述SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中第342位的氨基酸Glu替换为Ile，第406位的氨基酸Tyr替换为His，第506位的氨基酸Ala替换为Phe。
以上硫醚单加氧酶的突变体可通过以下技术方案来获得：
以氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的硫醚单加氧酶CbSMO作为母本，通过随机突变的方法，结合高通量初筛和进一步摇瓶培养复筛，鉴别获得多个对拉唑硫醚底物氧化活性显著提升的硫醚单加氧酶突变体。
本发明的第三个目的是提供一种分离的核酸，所述的核酸编码所述硫醚单加氧酶或任意一个硫醚单加氧酶突变体。
进一步地，编码所述硫醚单加氧酶的核酸的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
编码任意一个硫醚单加氧酶突变体的核酸的核苷酸序列为由所述SEQ ID No.1所示的核酸序列经过碱基取代、缺失或***3个或3的倍数个碱基衍生的核酸序列。
进一步地，本发明对所述SEQ ID No.1所示的核苷酸序列进行了密码子优化，优化后的序列如SEQ ID No.2所示。
本发明的第四个目的是提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含本发明第三个目的所述的核酸。
在本发明的一个实施方式中，所述的重组表达载体为含有硫醚单加氧酶基因的pET28a。
本发明的第五个目的是提供一种重组表达转化体，所述的重组表达转化体包含所述重组表达载体。
在本发明的一个实施方式中，所述重组表达转化体，是含有所述重组表达载体，且表达硫醚单加氧酶的大肠杆菌。
在本发明的一个实施方式中，所述的大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)。
本发明的第六个目的是提供所述重组表达转化体的构建方法，包括如下步骤：
(1)构建重组表达载体：将硫醚单加氧酶(CbSMO)基因***pET28a质粒上的Nde I/Hind III酶切位点中，得到重组表达载体pET28a-CbSMO；
(2)将重组表达载体pET28a-CbSMO转化入大肠杆菌表达宿主中，筛选阳性转化子得到所述的重组表达转化体。
本发明的第七个目的是提供一种重组硫醚单加氧酶催化剂，所述重组硫醚单加氧酶催化剂是以下形式中的任意一种：
(1)培养本发明所述的重组表达转化体，分离含有所述硫醚单加氧酶或硫醚单加氧酶突变体的转化体细胞；
(2)培养本发明所述的重组表达转化体，分离含有所述硫醚单加氧酶或硫醚单加氧酶突变体的粗酶液；
(3)培养本发明所述的重组表达转化体，分离含有所述硫醚单加氧酶或硫醚单加氧酶突变体的粗酶液，冷冻干燥得到的粗酶粉。
(4)分离的硫醚单加氧酶；
(5)硫醚单加氧酶突变体。
其中，为获得重组硫醚单加氧酶催化剂，所述重组表达转化体的培养方法和条件为本领域常规的方法和条件。例如，一个可实施方式中，所述重组表达转化体的培养方法包括如下步骤：培养本发明的重组表达转化体，获得重组硫醚单加氧酶突变体。对于重组大肠杆菌，优选培养基为LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 6.5～7.0。优选的培养方法为：将如上所述构建的重组大肠杆菌，接种至含有卡那霉素(Kanamycin)的LB培养基中，37℃、180rpm振荡培养过夜。按1-2％(v/v)的接种量接入装有100mL LB培养基(含卡那霉素)的500mL三角烧瓶中，置于37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD600达到0.6-0.8时，加入终浓度为0.1～0.5mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂，16～30℃诱导16～24h后，将培养液离心，收集沉淀，然后用生理盐水洗涤两次，获得重组表达转化体细胞。将收获的重组细胞进行冷冻干燥，即可获得含有所述硫醚单加氧酶或其突变体的冻干细胞。将收获的重组细胞悬浮于5～10倍体积(v/w)的缓冲液中，超声破碎，离心收集上清液，即可获得所述重组硫醚单加氧酶或其突变体的粗酶液。收集的粗酶液置于-80℃下冷冻，然后使用真空冷冻干燥机低温干燥，即可得到粗酶粉。将所获得的粗酶粉保存在4℃冰箱内，可以方便地使用。
本发明的第八个目的是提供所述重组硫醚单加氧酶催化剂的应用。具体而言，所述重组硫醚单加氧酶催化剂在催化前手性拉唑硫醚底物不对称氧化中的应用。
在本发明的一个实施方式中，所述硫醚单加氧酶催化剂以氧气为氧化剂，催化前手性拉唑硫醚底物氧化为相应的手性亚砜。所述的氧气直接来源于空气。
在本发明的一个实施方式中，所述硫醚单加氧酶催化剂催化前手性拉唑硫醚底物氧化为相应的手性亚砜的反应过程中，辅酶NADPH氧化为NADP+，使用脱氢酶催化NADP+还原再生为NADPH。
所述脱氢酶是作为辅助硫醚单加氧酶催化剂催化前手性拉唑硫醚底物氧化为相应的手性亚砜的反应过程中的辅酶循环的酶。
在本发明的一个实施方式中，所述脱氢酶是甲酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶或醇脱氢酶中的任意一种。
在本发明的一个实施方式中，所述的脱氢酶是以下脱氢酶中的任意一种：
(1)甲酸脱氢酶FDH(Enzyme Microb Tech 2010,46:557–561)；
(2)葡萄糖脱氢酶GDH(ChemBioChem 2020,21:2680–2688)；
(3)醇脱氢酶ADH(J Am Chem Soc 1986,108:162-169)。
在本发明的一个实施方式中，所述前手性拉唑硫醚底物选自以下任一个化学结构式所示的化合物：
与现有技术相比，本发明的技术效果主要体现在以下方面：
本发明提供了一种硫醚单加氧酶，硫醚单加氧酶突变体，编码所述硫醚单加氧酶或硫醚单加氧酶突变体的核酸，含有该核酸的重组表达载体，含有该重组表达载体的重组表达转化体，重组硫醚单加氧酶催化剂，以及重组硫醚单加氧酶催化剂在制备手性拉唑药物中的应用。
所述硫醚单加氧酶以及硫醚单加氧酶突变体表达量高，可以高效催化拉唑硫醚类底物生成构型单一的手性亚砜化合物。所述硫醚单加氧酶还可以催化13种拉唑硫醚化合物的氧化。
其中，所述硫醚单加氧酶以及硫醚单加氧酶突变体催化拉唑硫醚类底物氧化反应的方法和条件为本领域常规的方法和条件。反应体系包括磷酸钾缓冲液(100mmol/L，pH8.0)，所述硫醚单加氧酶以及硫醚单加氧酶突变体10～100U/L，所述脱氢酶20～200U/L，甲醇、NADP+终浓度分别为1～10％(v/v)，0.1～0.5mmol/L，拉唑硫醚类底物的浓度为1～20g/L，辅底物异丙醇(对应脱氢酶为醇脱氢酶)的浓度为1-10％(v/v)，辅底物甲酸钠(对应脱氢酶为甲酸脱氢酶)或葡萄糖(对应脱氢酶为葡萄糖脱氢酶)的浓度为100～200mmol/L。反应在20～35℃，振荡混合或机械搅拌混合条件下进行、必要时，可通入空气，保证反应过程氧气供应。反应过程中间歇取样，监测反应转化率，至转化率达到99％以上或转化率不再继续增长时停止反应。产物的ee值可达到99％以上，并且产物亚砜不会进一步氧化为副产物砜，满足工业应用的需求。
与其他制备光学纯拉唑类药物的生物催化剂相比，本发明提供的硫醚单加氧酶及其突变体具有蛋白表达量高、催化活性高、催化底物范围广、立体选择性高、热稳定性好的优点，在工业应用中显示出广泛的应用前景。
附图说明
图1为本发明中硫醚单加氧酶催化前手性拉唑硫醚化合物不对称氧化生成手性拉唑亚砜的反应过程示意图。
具体实施方式
下面将结合具体实施例，对本发明中的技术方案和技术效果进行清楚、完整地描述，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。
下述实施例中涉及的数据库、培养基和检测方法如下：
核酸/蛋白数据库网站NCBI/Protein BLAST：
https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastp&PAGE_TYPE＝
BlastSearch&LINK_LOC＝blasthome
LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L(固体培养基加入2％琼脂粉)。
手性HPLC分析方法如下：
仪器：岛津HPLC 2010A；色谱柱型号：Chiralpak IA；流动相：正庚烷:乙醇＝70:30(v/v)；流速：0.5mL·min-1；柱温：40℃；进样量：10μL；检测器：紫外检测器；检测波长：300nm。
实施例1：硫醚单加氧酶的获得
本实施例提供了一种来源于巴塞尔贪铜菌(Cupriavidus basilensis)的硫醚单加氧酶，是发明人通过基因数据库挖掘获得的。
具体的，以CN 108570425公布的单加氧酶BoTEMO的氨基酸序列作为先导序列，在NCBI数据库中应用Protein BLAST工具搜索同源序列。获得近10000条与BoTEMO氨基酸序列一致性在20％-90％的同源序列，通过去冗余处理后克隆本发明人所属实验室已有基因组的相关序列，最终通过功能筛选获得一种来源于巴塞尔贪铜菌(Cupriavidus basilensis)的单加氧酶，该单加氧酶的基因序列如SEQ ID No.1所示。本发明中将该单加氧酶命名为CbSMO(Cupriavidus basilensis Sulfide Monooxygenase)。
所述硫醚单加氧酶CbSMO由如序列表SEQ ID No.3所示的氨基酸序列组成。
实施例2：重组表达载体的构建
对编码所述CbSMO的基因序列进行密码子优化，密码子优化后得到序列如序列表SEQ ID No.2所编码的硫醚单加氧酶基因。通过一步克隆将编码CbSMO基因***到pET28a质粒上的酶切位点Nde I/Hind III中，获得重组表达载体pET28a-CbSMO。
其中PCR反应条件为：95℃5min；98℃10s，55℃5s，72℃35s(25个循环)；72℃10min，之后以1％琼脂糖凝胶电泳验证并回收PCR扩增产物。
一步克隆具体方法为：将目的片段(0.03pmol)和经Nde I/Hind III酶切线性化载体(0.01pmol)混合于同一PCR管中，加入5μL购自诺唯赞公司的酶ClonExpress Mix(2x)，加ddH2O补齐至10μL，在50℃反应15min。具体引物序列如下：
Primer 1(SEQ ID No.4):
CCGCGCGGCAGCCATATGCTGGCGGGTAAC
Primer 2(SEQ ID No.5):
CGAGTGCGGCCGCAAGCTTTTAGCCGTGCGCGCTTTC
其中上游引物下划线所示序列为Nde I的酶切位点，下游引物下划线所示序列为Hind III的酶切位点。
实施例3：重组表达转化子的构建
使用本领域人员熟悉的热激法将重组表达载体pET28a-CbSMO转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，即得重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-CbSMO重组表达转化子。
热激法的基本操作如下：
(1)取一管已制备好的E.coli BL21(DE3)感受态细胞置于冰浴中；
(2)在感受态细胞悬浮液加入1/5体积的重组表达载体溶液，轻轻混匀，冰浴30min；
(3)将冰浴后混合液置于42℃中脉冲热激90s，迅速转移至冰浴中2min，加入800μLLB培养基，转入37℃培养40min；
(4)吸取适量已转化的感受态细胞悬浮液涂布于含有100μg/mL卡那霉素的LB平板上，37℃条件下倒置培养12～16h即可长出重组表达转化子。
(5)挑取单菌落进行下一步实验。
阳性克隆的检验：
(1)于无菌条件下随机挑取转化平板上的10个单克隆于装有LB液体培养基(含卡那霉素)的Eppendorf管中，于37℃，180rpm震荡培养至培养基浑浊；
(2)无菌条件下分别吸取2μL菌液作为模板，以Easy Taq Mix体系，pET28a通用T7引物进行扩增；
(3)琼脂糖核酸凝胶电泳检测，于1820bp处出现条带，即证明此克隆为阳性克隆，重组表达转化子E.coli BL21(DE3)/pET28a-CbSMO构建成功。
空白对照：以无菌水代替上述2μL菌液作为模板进行扩增，通过琼脂糖核酸凝胶电泳检测发现只有在250bp左右的位置出现条带。
实施例4：重组表达转化体的蛋白表达分析
本发明所述重组表达转化体的培养方法和培养条件没有特殊的限制，可以根据宿主细胞类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择，只要能使重组表达转化体生长并产生本发明所述的硫醚单加氧酶即可。
使用本领域人员熟悉的大肠杆菌培养体系进行重组表达转化体的培养与蛋白表达。
将如上所述构建的重组表达转化体，接种至含有卡那霉素(Kanamycin)的LB培养基中，37℃、180rpm振荡培养过夜。按1％(v/v)的接种量接入装有100mL LB培养基(含卡那霉素)的500mL三角烧瓶中，置于37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD600达到0.6时，加入终浓度为0.2mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂，16℃诱导24h后，将培养液离心，收集沉淀，然后用生理盐水洗涤两次，获得重组表达转化体细胞。
用10mL KPB缓冲液(100mM,pH 8.0)重悬上述1g重组表达转化体细胞，冰水浴下用超声破碎仪以400w功率下，工作4s，间歇6s，工作15min，随后于4℃，12000rpm离心破碎液并收集上清。沉淀用10mL KPB缓冲液(100mM,pH 8.0)重悬。取80μL破碎上清和沉淀重悬液于1.5mL Eppendorf管中，与20μL 5×SDS PAGE Loading Buffer混合后，沸水浴或95℃金属浴加热5min，样品立即进行SDS-PAGE分析。
SDS-PAGE结果显示，本发明所构建的重组表达转化体表达的目的蛋白含量可占总蛋白的50％以上，且90％的目的蛋白为可溶性表达。
实施例5：硫醚单加氧酶的蛋白纯化
以常规的镍柱亲和层析柱纯化目的蛋白，纯化过程中使用到的缓冲液为：
(1)平衡缓冲液：500mM NaCl，10mM咪唑，2mMβ-巯基乙醇，50mM Tris，HCl调节pH至7.5；(2)洗脱缓冲液：500mM NaCl，300mM咪唑，2mMβ-巯基乙醇，50mM Tris，HCl调节pH至7.5；(3)置换缓冲液：500mM NaCl，1mM二硫苏糖醇，25mM Tris，HCl调节pH至7.5。
纯化步骤如下：
(1)菌体用平衡缓冲液重新悬浮后进行超声破碎，破碎后的粗酶液用低温高速离心机在4℃离心，12000rpm离心30min，离心后的上清液暂时保存在4℃条件下。
(2)用10倍柱体积的平衡缓冲液预先平衡镍柱；
(3)将上述离心后的上清加到上述平衡后的镍柱；
(4)用10倍柱体积的平衡缓冲液和洗脱缓冲液的混合液(含20％洗脱缓冲液)洗去杂蛋白；
(5)用10倍柱体积的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白并收集；
(6)用30kDa的超滤管浓缩上述收集到的蛋白洗脱液，当浓缩至1mL时加入10mL置换缓冲液重复超滤浓缩；
(7)重复上述步骤3次以充分除去酶液中的咪唑，完成缓冲液的置换；
(8)用液氮速冻上述获得的酶液后于-80℃冰箱保存。
实施例6：硫醚单加氧酶CbSMO的活力测定
测定CbSMO对一系列拉唑硫醚底物的活力，测定步骤如下：0.5mL反应体系(0.1MKPB缓冲液，pH 8.0)中加入0.2mM拉唑硫醚底物，0.2mM NADPH，30℃保温2分钟后加入实施例5纯化得到的适量纯酶液，迅速混匀，在30℃,1000rpm条件下反应5～10min，用0.5mL乙酸乙酯终止并萃取，离心上清用0.22μm孔径的滤膜过滤后进行液相分析，测定底物的转化率及产物的ee值。
底物转化率及ee值的具体分析条件如下：
仪器：岛津HPLC 2010A；色谱柱型号：Chiralpak IA；流动相：正庚烷:乙醇＝70:30(v/v)；流速：0.5mL·min-1；柱温：40℃；进样量：10μL；检测器：紫外检测器；检测波长：300nm。
CbSMO的酶活单位定义为：上述条件下，每分钟催化1μmol拉唑硫醚底物转化生成拉唑亚砜所需的酶量。
测得CbPMO对一系列拉唑硫醚底物的比活力及产物ee值结果如表1所示。
表1.CbSMO纯酶活力测定
其中，S1为兰索拉唑硫醚；S2为雷贝拉唑硫醚
a“+”:50～100U/g；“++”:100～500U/g；“+++”:>500U/g
实施例7：随机突变筛选对兰索拉唑硫醚底物活力提高的CbSMO突变体
由于CbSMO与已经报道有蛋白晶体结构的单加氧酶的序列一致性很低，均低于28％，因此很难根据蛋白结构等信息用理性或者半理性的方法来进行改造，本发明采用随机突变的策略来改善该酶对兰索拉唑硫醚的催化活性。
根据CbSMO的开放阅读框，设计上游、下游引物如下：
上游引物，如SEQ ID No.4所示。
下游引物，如SEQ ID No.5所示。
其中上游引物下划线所示序列为Nde I的酶切位点，下游引物下划线所示序列为Hind III的酶切位点。
以重组质粒pET28a-CbSMO为模板，用rTaq DNA聚合酶进行易错PCR，构建随机突变库。PCR体系(50μL):rTaq DNA聚合酶1μL，10×PCR buffer(Mg2+Plus)5.0μL，dNTP Mixture(各2.0mM)4.0μL，终浓度为50μM的MnCl2，pET28a-CbSMO质粒30ng，上下游引物(10μM)各1.5μL，加无菌水补足至50μL。PCR反应程序：(1)95℃预变性3min；(2)95℃变性30s；(3)60℃退火30s；(4)72℃延伸100s；步骤(2)～(4)共进行30个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存产物。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析验证后切胶纯化回收，对回收后的目的基因DNA片段与空载质粒pET28a分别用限制性内切酶Nde I和Hind III在37℃双酶切5h。双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分析验证后切胶纯化回收，用T4 DNA连接酶将得到的线性化pET28a质粒与纯化后的目的基因片段置于16℃连接过夜。将连接产物按照实施例2的操作转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，并均匀涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上，置于37℃培养箱中静置培养约12h。
使用美谷分子仪器(上海)有限公司(Molecular Devices)的单克隆自动挑选仪Qpix 450将转化平板上的转化体挑入96孔的深孔板中，于37℃，800rpm摇床中培养过夜。使用帝肯(TECAN)全自动化液体处理工作站(Freedom EVO)从一级板孔中吸取50μL菌液接入相应的二级板孔中，于37℃，800rpm摇床中培养4h后，加入终浓度为0.1mM的IPTG，16℃培养20h。然后于4℃、3500×g离心10min，倒掉上层培养基，每个孔中加入200μL细胞裂解液(750mg溶菌酶和10mg DNA酶溶解于1L去离子水中)，振荡混匀，再于25℃，800rpm摇床中裂解2h。在96孔板中对表达的蛋白进行高通量筛选，将对兰索拉唑硫醚活性较高的突变体进行纯化表征，对相应的基因进行测序。
所述CbSMO突变体的高通量活力筛选测定方法：将含1mM底物兰索拉唑硫醚，1mM辅酶NADPH的磷酸钾缓冲液(100mM，pH 8.0)分装到96孔板中，预热至30℃，然后分别加入适量的CbSMO突变体，30℃振荡反应，在酶标仪上检测340nm处NADPH的吸光度变化，记录1分钟内吸光度的变化值，计算相应的酶活力。
实施例8：CbSMO有益突变体的组合突变
在实施例7突变的基础上，采用DNAshuffling的方法随机组合易错PCR得到的优势突变体。第一步先将这些优势突变体分别提取重组质粒，以等摩尔混合后作为模板，PCR扩增突变体基因，PCR反应程序：(1)95℃预变性5min；(2)95℃变性1min；(3)55℃退火30s；(4)72℃延伸1min；步骤(2)～(4)共进行20个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存产物。混合质粒PCR扩增后的产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，用胶回收试剂盒纯化回收与目的片段大小相同的条带，目的片段浓缩回收后的浓度尽可能不低于200ng/μL。第二步是基因片段的碎片化，DNase I碎片化体系(200μL)：90μL回收的混合目的基因(240ng/μL)，4μL Dnase I(2U/μL)，20μL 10×Dnase I Reaction Buffer，86μL ddH2O。37℃水浴反应4min，取出立即加入100μL EDTA(500mM,pH 8.0)，75℃保温处理10min，使DNase I完全失活终止反应。冷却后加入60μL DNA上样缓冲液。2％(w/v)琼脂糖进行DNA凝胶电泳分离，胶回收试剂盒(生工微量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒)回收大小为50～250bp的DNA片段。所述的上样缓冲液配方：0.25％(w/v)二甲基青，0.1M乙二胺四乙酸(EDTA,pH 8.0)，30％(v/v)甘油。第三步是重聚PCR，PCR扩增程序：(1)95℃2min；(2)94℃30s；(3)65℃30s；(4)60℃30s；(5)55℃30s；(6)50℃30s；(7)45℃30s；(8)72℃1min，步骤(2)～(8)共进行45个循环；最后72℃延伸5min，4℃保存产物。最后一步是有引物PCR，所用上下游引物如序列表SEQ ID No.4和5所示，PCR扩增程序和第一步相同，PCR扩增后得到的产物用胶回收试剂盒回收，然后用Nde I和HindIII双酶切并与双酶切pET28a质粒连接后转化入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，获得DNAshuffling突变体库。
通过3轮易错PCR和1轮DNAshuffling的建库高通量筛选，得到了对兰索拉唑硫醚活性显著提高的突变体，进而对这些突变体的纯酶比活、底物选择性及半衰期进行了表征，优选对兰索拉唑硫醚活性显著增高的系列突变体，且这些突变体的热稳定性都较良好，这些突变体的序列以及这些突变体对兰索拉唑硫醚的活性和半衰期列于表2中。在表2中，序列标号分别对应于表2后面的一系列序列。在活性列中，与母本CbSMO(序列表中SEQ IDNo.3所示氨基酸序列组成的蛋白质)相比，“+”表示突变体蛋白对兰索拉唑硫醚的活性提高了0.1～1倍；“++”表示突变体蛋白对兰索拉唑硫醚的活性提高了1～5倍；“+++”表示突变体蛋白对兰索拉唑硫醚的活性提高了5～10倍。在热稳定性列中，与母本CbSMO(序列表中SEQID No.3所示氨基酸序列组成的蛋白质)相比，“+”表示突变体蛋白的半衰期提高了1～2h；“++”表示突变体蛋白的半衰期提高了2～5h；“+++”表示突变体蛋白的半衰期提高了5～10h。
表2硫醚单加氧酶突变体序列、活力提高倍数、半衰期提高时长
对应序列标号的硫醚单加氧酶突变体的氨基酸序列分别如下：
(1)所述SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中第153位的氨基酸Asn替换为Val；
(2)所述SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中第266位的氨基酸Gly替换为Asp；
(3)所述SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中第313位的氨基酸Leu替换为Pro；
(4)所述SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中第406位的氨基酸Tyr替换为His；
(5)所述SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中第506位的氨基酸Ala替换为Phe；
(6)所述SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中第266位的氨基酸Gly替换为Asp，第406位的氨基酸Tyr替换为His；
(7)所述SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中第50位的氨基酸Arg替换为His，第273位的氨基酸Ala替换为Lys；
(8)所述SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中第266位的氨基酸Gly替换为Asp，第313位的氨基酸Leu替换为Pro；
(9)所述SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中第212位的氨基酸Leu替换为Met，第313位的氨基酸Leu替换为Pro，第451位的氨基酸Ser替换为Gln；
(10)所述SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中第171位的氨基酸Gly替换为Met，第451位的氨基酸Ser替换为Gln，第506位的氨基酸Ala替换为Phe；
(11)所述SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中第153位的氨基酸Asn替换为Val，第342位的氨基酸Glu替换为Ile，第406位的氨基酸Tyr替换为His；
(12)所述SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中第153位的氨基酸Asn替换为Val，第266位的氨基酸Gly替换为Asp，第451位的氨基酸Ser替换为Gln；
(13)所述SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中第313位的氨基酸Leu替换为Pro，第325位的氨基酸Ile替换为Lys，第406位的氨基酸Tyr替换为His；
(14)所述SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中第50位的氨基酸Arg替换为His，第313位的氨基酸Leu替换为Pro，第451位的氨基酸Ser替换为Gln；
(15)所述SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中第342位的氨基酸Glu替换为Ile，第406位的氨基酸Tyr替换为His，第506位的氨基酸Ala替换为Phe。
实施例9：硫醚单加氧酶CbSMOWT粗酶液的制备
将如上所述构建的重组大肠杆菌，接种至含有卡那霉素(Kanamycin)的LB培养基中，37℃、180rpm振荡培养过夜。按1％(v/v)的接种量接入装有100mL LB培养基(含卡那霉素)的500mL三角烧瓶中，置于37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD600达到0.6时，加入终浓度为0.2mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂，16℃诱导24h后，将培养液离心，收集沉淀，然后用生理盐水洗涤两次，获得重组表达转化体细胞。将收获的重组细胞悬浮于10倍体积(v/w)的缓冲液中，超声破碎，离心收集上清液，即可获得所述重组硫醚单加氧酶CbSMOWT的粗酶液。
实施例10：硫醚单加氧酶CbSMOWT粗酶粉的制备
收集实施例9获得的硫醚单加氧酶的粗酶液置于-80℃下冷冻，然后使用真空冷冻干燥机低温干燥，即可得到硫醚单加氧酶突变体CbSMOWT粗酶粉，对兰索拉唑硫醚的活力比为12U/g。将所获得的粗酶粉保存在4℃冰箱内，可以方便地使用。
实施例11：硫醚单加氧酶突变体CbSMOM1粗酶粉的制备
将含有硫醚单加氧酶突变体CbSMOM1基因的重组大肠杆菌，接种至含有卡那霉素(Kanamycin)的LB培养基中，37℃、180rpm振荡培养过夜。按1％(v/v)的接种量接入装有100mL LB培养基(含卡那霉素)的500mL三角烧瓶中，置于37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD600达到0.6时，加入终浓度为0.2mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂，16℃诱导24h后，将培养液离心，收集沉淀，然后用生理盐水洗涤两次，获得重组表达转化体细胞。将收获的重组细胞悬浮于10倍体积(v/w)的缓冲液中，超声破碎，离心收集上清液，置于-80℃下冷冻，然后使用真空冷冻干燥机低温干燥，即可得到硫醚单加氧酶突变体CbSMOM1粗酶粉，对兰索拉唑硫醚的活力比为20U/g。将所获得的粗酶粉保存在4℃冰箱内，可以方便地使用。
实施例12：硫醚单加氧酶突变体CbSMOM8粗酶粉的制备
将含有硫醚单加氧酶突变体CbSMOM8基因的重组大肠杆菌，接种至含有卡那霉素(Kanamycin)的LB培养基中，37℃、180rpm振荡培养过夜。按1％(v/v)的接种量接入装有100mL LB培养基(含卡那霉素)的500mL三角烧瓶中，置于37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD600达到0.6时，加入终浓度为0.2mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂，16℃诱导24h后，将培养液离心，收集沉淀，然后用生理盐水洗涤两次，获得重组表达转化体细胞。将收获的重组细胞悬浮于10倍体积(v/w)的缓冲液中，超声破碎，离心收集上清液，置于-80℃下冷冻，然后使用真空冷冻干燥机低温干燥，即可得到硫醚单加氧酶突变体CbSMOM8粗酶粉，对兰索拉唑硫醚的活力比为82U/g。将所获得的粗酶粉保存在4℃冰箱内，可以方便地使用。
实施例13：甲酸脱氢酶辅助CbSMOWT催化兰索拉唑硫醚不对称氧化
在10mL反应体系中(磷酸钾缓冲液，100mmol/L，pH 8.0)，加入CbSMOWT粗酶粉1U(如实施例10所述方法制备的粗酶粉)和甲酸脱氢酶FDH 2U，继续向上述体系中加入兰索拉唑硫醚、甲醇、甲酸钠和NADP+至终浓度分别为5g/L、5％(v/v)、100mmol/L和0.2mmol/L。在25℃，220rpm条件下振荡反应。间歇取样0.5mL反应液加入0.5mL乙酸乙酯进行萃取，取0.3mL萃取液加入无水硫酸钠干燥后，挥发除去乙酸乙酯，然后加入0.3mL乙醇溶解，按如实施例6所述HPLC分析方法测定底物转化率和产物ee值。反应4.2h底物转化率大于99％，产物的ee值大于99％(R)。
实施例14：醇脱氢酶辅助CbSMOWT催化兰索拉唑硫醚不对称氧化
在10mL反应体系中(磷酸钾缓冲液，100mmol/L，pH 8.0)，加入CbSMOWT粗酶粉1U(如实施例10所述方法制备的粗酶粉)和醇脱氢酶ADH 2U，继续向上述体系中加入兰索拉唑硫醚、异丙醇和NADP+至终浓度分别为5g/L、5％(v/v)和0.2mmol/L。在25℃，220rpm条件下振荡反应。间歇取样0.5mL反应液加入0.5mL乙酸乙酯进行萃取，取0.3mL萃取液加入无水硫酸钠干燥后，挥发除去乙酸乙酯，然后加入0.3mL乙醇溶解，按如实施例6所述HPLC分析方法测定底物转化率和产物ee值。反应5.2h底物转化率大于99％，产物的ee值大于99％(R)。
实施例15：葡萄糖脱氢酶辅助CbSMOWT催化兰索拉唑硫醚不对称氧化
在10mL反应体系中(磷酸钾缓冲液，100mmol/L，pH 8.0)，加入CbSMOWT粗酶粉1U(如实施例10所述方法制备的粗酶粉)和葡萄糖脱氢酶GDH 2U，继续向上述体系中加入兰索拉唑硫醚、甲醇、葡萄糖和NADP+至终浓度分别为5g/L、5％(v/v)、100mmol/L和0.2mmol/L。在25℃，220rpm条件下振荡反应。间歇取样0.5mL反应液加入0.5mL乙酸乙酯进行萃取，取0.3mL萃取液加入无水硫酸钠干燥后，挥发除去乙酸乙酯，然后加入0.3mL乙醇溶解，按如实施例6所述HPLC分析方法测定底物转化率和产物ee值。反应5.6h底物转化率大于99％，产物的ee值大于99％(R)。
实施例16：CbSMOWT催化兰索拉唑硫醚不对称氧化
在1L发酵罐中配制0.5L反应液。反应体系中(磷酸钾缓冲液，100mmol/L，pH 8.0)含CbSMOWT粗酶粉10U(如实施例10所述方法制备的粗酶粉)和甲酸脱氢酶FDH 20U，继续向上述体系中加入兰索拉唑硫醚、甲醇、甲酸钠和NADP+至终浓度分别为5g/L、5％(v/v)、100mmol/L和0.2mmol/L。在25℃，150rpm、通空气速率为0.4vvm的条件下搅拌反应。间歇取样0.5mL反应液加入0.5mL乙酸乙酯进行萃取，取0.3mL萃取液加入无水硫酸钠干燥后，挥发除去乙酸乙酯，然后加入0.3mL乙醇溶解，按如实施例6所述HPLC分析方法测定底物转化率和产物ee值。反应25h底物转化率大于99％，产物的ee值大于99％(R)。
实施例17：CbSMOWT催化雷贝拉唑硫醚不对称氧化
在10mL反应体系中(磷酸钾缓冲液，100mmol/L，pH 8.0)，加入CbSMOWT粗酶粉1U(如实施例10所述方法制备的粗酶粉)和甲酸脱氢酶FDH 2U，继续向上述体系中加入雷贝拉唑硫醚、甲醇、甲酸钠和NADP+至终浓度分别为5g/L、5％(v/v)、100mmol/L和0.2mmol/L。在25℃，220rpm条件下振荡反应。间歇取样0.5mL反应液加入0.5mL乙酸乙酯进行萃取，取0.3mL萃取液加入无水硫酸钠干燥后，挥发除去乙酸乙酯，然后加入0.3mL乙醇溶解，按如实施例6所述HPLC分析方法测定底物转化率和产物ee值。反应3h底物转化率大于99％，产物的ee值大于99％(R)。
实施例18：CbSMOWT催化雷贝拉唑硫醚不对称氧化
在1L发酵罐中配制0.5L反应液。反应体系中(磷酸钾缓冲液，100mmol/L，pH 8.0)含CbSMOWT粗酶粉10U(如实施例10所述方法制备的粗酶粉)甲酸脱氢酶FDH 20U，继续向上述体系中加入雷贝拉唑硫醚、甲醇、甲酸钠和NADP+至终浓度分别为5g/L、5％(v/v)、100mmol/L和0.2mmol/L。在25℃，150rpm、通空气速率为0.4vvm的条件下搅拌反应。间歇取样0.5mL反应液加入0.5mL乙酸乙酯进行萃取，取0.3mL萃取液加入无水硫酸钠干燥后，挥发除去乙酸乙酯，然后加入0.3mL乙醇溶解，按如实施例5所述HPLC分析方法测定底物转化率和产物ee值。反应18h底物转化率大于99％，产物的ee值大于99％(R)。
实施例19：CbSMOM1催化兰索拉唑硫醚不对称氧化
在10mL反应体系中(磷酸钾缓冲液，100mmol/L，pH 8.0)，加入CbSMOM1粗酶粉1U(如实施例11所述方法制备的粗酶粉)和甲酸脱氢酶FDH 2U，继续向上述体系中加入兰索拉唑硫醚、甲醇、甲酸钠和NADP+至终浓度分别为15g/L、5％(v/v)、200mmol/L和0.4mmol/L。在30℃，220rpm条件下振荡反应。间歇取样0.5mL反应液加入0.5mL乙酸乙酯进行萃取，取0.3mL萃取液加入无水硫酸钠干燥后，挥发除去乙酸乙酯，然后加入0.3mL乙醇溶解，按如实施例6所述HPLC分析方法测定底物转化率和产物ee值。反应12h底物转化率大于99％，产物的ee值大于99％(R)。
实施例20：CbSMOM1催化雷贝拉唑硫醚不对称氧化
在10mL反应体系中(磷酸钾缓冲液，100mmol/L，pH 8.0)，加入CbSMOM1粗酶粉1U(如实施例11所述方法制备的粗酶粉)和甲酸脱氢酶FDH 2U，继续向上述体系中加入雷贝拉唑硫醚、甲醇、甲酸钠和NADP+至终浓度分别为15g/L、5％(v/v)、200mmol/L和0.4mmol/L。在30℃，220rpm条件下振荡反应。间歇取样0.5mL反应液加入0.5mL乙酸乙酯进行萃取，取0.3mL萃取液加入无水硫酸钠干燥后，挥发除去乙酸乙酯，然后加入0.3mL乙醇溶解，按如实施例5所述HPLC分析方法测定底物转化率和产物ee值。反应8h底物转化率大于99％，产物的ee值大于99％(R)。
实施例21：CbSMOM8催化兰索拉唑硫醚不对称氧化
在1L发酵罐中配制0.5L反应液。反应体系中(磷酸钾缓冲液，100mmol/L，pH 8.0)，含CbSMOM8粗酶粉20U(如实施例12所述方法制备的粗酶粉)和甲酸脱氢酶FDH 40U，继续向上述体系中加入兰索拉唑硫醚、甲醇、甲酸钠和NADP+至终浓度分别为20g/L、5％(v/v)、200mmol/L和0.5mmol/L。在35℃，150rpm、通空气速率为0.8vvm的条件下搅拌反应。间歇取样0.5mL反应液加入0.5mL乙酸乙酯进行萃取，取0.3mL萃取液加入无水硫酸钠干燥后，挥发除去乙酸乙酯，然后加入0.3mL乙醇溶解，按如实施例6所述HPLC分析方法测定底物转化率和产物ee值。反应32h底物转化率大于99％，产物的ee值大于99％(R)。
实施例22：CbSMOM8不对称催化氧化雷贝拉唑硫醚
在1L发酵罐中配制0.5L反应液。反应体系中(磷酸钾缓冲液，100mmol/L，pH 8.0)，含CbSMOM8粗酶粉20U(如实施例12所述方法制备的粗酶粉)和甲酸脱氢酶FDH 40U，继续向上述体系中加入雷贝拉唑硫醚、甲醇、甲酸钠和NADP+至终浓度分别为20g/L、5％(v/v)、200mmol/L和0.5mmol/L。在35℃，150rpm、通空气速度为0.8vvm的条件下搅拌反应。间歇取样0.5mL反应液加入0.5mL乙酸乙酯进行萃取，取0.3mL萃取液加入无水硫酸钠干燥后，挥发除去乙酸乙酯，然后加入0.3mL乙醇溶解，按如实施例6所述HPLC分析方法测定底物转化率和产物ee值。反应24h底物转化率大于99％，产物的ee值大于99％(R)。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华东理工大学,苏州百福安酶技术有限公司
<120> 一种硫醚单加氧酶及其在制备手性拉唑药物中的应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1569
<212> DNA
<213> 巴塞尔贪铜菌(Cupriavidus basilensis)
<400> 1
atgctagcag gcaacgcaga caaggcgcat cccccggcgc ggcaggcgcc gcatgagcag 60
gtccaccatt tcgatgtgct ggtcgtgggc gccgggctgt ccggcatctg cgcggcctac 120
cacctgcaga ccagttgccc gggcaagcgc tacgccatcc tggagggccg cgacgccgtc 180
ggcggcacct gggacctgtt ccgctatccc ggcgtgcgct ccgactcgga catgtacacg 240
ctcggcttca gcttccggcc gtggcgcagc gacaagtcga tcgccgccgg cgacgccatc 300
ctcgaataca tccgcgacac ggccaggacc ttcgacatcg agcgccacat ccgcttcggc 360
caccgcgcca cgcgcgcgtc gtggtcgtcc gagacggcgc gctggacggt ggacgccgcc 420
gtgggcccgc agggcgagcc ggcgcgcttc acctgcaatt tcctctacct gtgcagcggc 480
tactacgact acgcggacgg ctacatgccg ggctggccgg gcatggagcg cttcggcggc 540
cgcgtggtgc atccccagca ctggcccgag gacctcgtct acgacgacca gcgcgtggtg 600
gtgatcggca gcggcgccac cgccgtgacg ctgctcccgg agatggccaa gcgcgccgcg 660
cacgtgacca tgctgcagcg ctcgccgacc tacatcgtcg cgcgcccgtc cagcgacgcg 720
gtgtccgcct ggctgcggcg caagctgccg gccggcatgg cgcaccgggt cacgcgctgg 780
aagaacgtgc tgttcggcat gtatttctac catctcgcgc gcaggaagcc ggagctggtc 840
aagcgcaaga tcctcgaggc cgcgcgcgcg cagctcggcc cggactacga cgtcgacaag 900
catttctcgc cagcctacaa gccgtgggac cagcgcctgt gcctggtgcc ggactcggac 960
ctgttcaagt cgatccgggc gggcagggcg tcggtggtga ccgaccatat cgaatccttc 1020
accgagaccg gcctgcagct gcgctccggg cagaagctcg acgcggacgt gatcgtcacc 1080
gccaccggcc tgcagttgaa ggtggcgggc ggcatgcgga tcgaggtgga cggcgtgccc 1140
gccgatccgg cgcaggcctt catgtacaag ggcatgatgt acagcgacgt gcccaacctg 1200
gcggtggcga tgggctacgt caatgcgtcg tggacgctga aggcggagtt gtcgtcgatg 1260
tacgtctgcc ggctcatcaa ccacatggag gccaacggcc atgactggtg cgcgccgcgg 1320
cgcggccacg ccgccggcga cgacgagcct tcgctgtcgc tgacctcggg ctacgtgcag 1380
cgcgccagcg gcatcctgcc ccggcagggc agcaagcgtc cgtggcgggt ccaccagaac 1440
tacctgttcg acctgatggc gctcaagttc ggcaaagtgg aggatgatgc gatggaattc 1500
ggccgggccg gcccggccgc gccgcgcgcg ccggcgcccg cccgggcggc ggaatcggcg 1560
cacggttga 1569
<210> 2
<211> 1569
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgctggcgg gtaacgcgga taaagcgcac ccgccggcgc gtcaggcgcc gcacgagcaa 60
gttcaccact tcgatgttct ggtggtgggt gcgggtctga gcggcatctg cgcggcgtac 120
cacctgcaga ccagctgccc gggtaaacgt tatgcgattc tggaaggtcg tgatgcggtg 180
ggtggcacct gggacctgtt tcgttacccg ggtgttcgta gcgacagcga tatgtatacc 240
ctgggcttca gctttcgtcc gtggcgtagc gataagagca tcgcggcggg tgacgcgatc 300
ctggagtaca ttcgtgatac cgcgcgtacc ttcgacatcg aacgtcacat tcgttttggt 360
catcgtgcga cccgtgcgag ctggagcagc gagaccgcgc gttggaccgt tgatgcggcg 420
gttggtccgc aaggtgaacc ggcgcgtttc acctgcaact ttctgtacct gtgcagcggt 480
tactatgatt atgcggatgg ttatatgccg ggttggccgg gtatggagcg ttttggtggc 540
cgtgtggttc acccgcagca ctggccggaa gatctggttt acgacgatca acgtgtggtt 600
gtgatcggta gcggtgcgac cgcggtgacc ctgctgccgg agatggcgaa acgtgcggcg 660
cacgttacca tgctgcaacg tagcccgacc tatattgttg cgcgtccgag cagcgatgcg 720
gttagcgcgt ggctgcgtcg taagctgccg gcgggtatgg cgcaccgtgt gacccgttgg 780
aaaaacgttc tgttcggcat gtacttttat cacctggcgc gtcgtaagcc ggagctggtg 840
aagcgtaaaa ttctggaagc ggcgcgtgcg cagctgggtc cggactacga tgttgacaag 900
cacttcagcc cggcgtataa accgtgggat caacgtctgt gcctggtgcc ggatagcgac 960
ctgttcaaaa gcatccgtgc gggtcgtgcg agcgttgtga ccgaccacat tgagagcttt 1020
accgaaaccg gtctgcagct gcgtagcggc caaaagctgg atgcggacgt tatcgtgacc 1080
gcgaccggtc tgcagctgaa agtggcgggt ggcatgcgta ttgaagttga tggtgtgccg 1140
gcggacccgg cgcaagcgtt tatgtacaag ggcatgatgt atagcgatgt tccgaacctg 1200
gcggtggcga tgggttacgt taacgcgagc tggaccctga aagcggagct gagcagcatg 1260
tatgtttgcc gtctgatcaa ccacatggag gcgaacggtc atgactggtg cgcgccgcgt 1320
cgtggtcatg cggcgggtga cgatgagccg agcctgagcc tgaccagcgg ttatgtgcag 1380
cgtgcgagcg gtattctgcc gcgtcaaggt agcaagcgtc cgtggcgtgt gcaccagaac 1440
tacctgttcg acctgatggc gctgaagttt ggtaaagttg aggacgatgc gatggaattt 1500
ggtcgtgcgg gcccggcggc gccgcgtgcg ccggcgccgg cgcgtgcggc ggaaagcgcg 1560
cacggctaa 1569
<210> 3
<211> 522
<212> PRT
<213> 巴塞尔贪铜菌(Cupriavidus basilensis)
<400> 3
Met Leu Ala Gly Asn Ala Asp Lys Ala His Pro Pro Ala Arg Gln Ala
1 5 10 15
Pro His Glu Gln Val His His Phe Asp Val Leu Val Val Gly Ala Gly
20 25 30
Leu Ser Gly Ile Cys Ala Ala Tyr His Leu Gln Thr Ser Cys Pro Gly
35 40 45
Lys Arg Tyr Ala Ile Leu Glu Gly Arg Asp Ala Val Gly Gly Thr Trp
50 55 60
Asp Leu Phe Arg Tyr Pro Gly Val Arg Ser Asp Ser Asp Met Tyr Thr
65 70 75 80
Leu Gly Phe Ser Phe Arg Pro Trp Arg Ser Asp Lys Ser Ile Ala Ala
85 90 95
Gly Asp Ala Ile Leu Glu Tyr Ile Arg Asp Thr Ala Arg Thr Phe Asp
100 105 110
Ile Glu Arg His Ile Arg Phe Gly His Arg Ala Thr Arg Ala Ser Trp
115 120 125
Ser Ser Glu Thr Ala Arg Trp Thr Val Asp Ala Ala Val Gly Pro Gln
130 135 140
Gly Glu Pro Ala Arg Phe Thr Cys Asn Phe Leu Tyr Leu Cys Ser Gly
145 150 155 160
Tyr Tyr Asp Tyr Ala Asp Gly Tyr Met Pro Gly Trp Pro Gly Met Glu
165 170 175
Arg Phe Gly Gly Arg Val Val His Pro Gln His Trp Pro Glu Asp Leu
180 185 190
Val Tyr Asp Asp Gln Arg Val Val Val Ile Gly Ser Gly Ala Thr Ala
195 200 205
Val Thr Leu Leu Pro Glu Met Ala Lys Arg Ala Ala His Val Thr Met
210 215 220
Leu Gln Arg Ser Pro Thr Tyr Ile Val Ala Arg Pro Ser Ser Asp Ala
225 230 235 240
Val Ser Ala Trp Leu Arg Arg Lys Leu Pro Ala Gly Met Ala His Arg
245 250 255
Val Thr Arg Trp Lys Asn Val Leu Phe Gly Met Tyr Phe Tyr His Leu
260 265 270
Ala Arg Arg Lys Pro Glu Leu Val Lys Arg Lys Ile Leu Glu Ala Ala
275 280 285
Arg Ala Gln Leu Gly Pro Asp Tyr Asp Val Asp Lys His Phe Ser Pro
290 295 300
Ala Tyr Lys Pro Trp Asp Gln Arg Leu Cys Leu Val Pro Asp Ser Asp
305 310 315 320
Leu Phe Lys Ser Ile Arg Ala Gly Arg Ala Ser Val Val Thr Asp His
325 330 335
Ile Glu Ser Phe Thr Glu Thr Gly Leu Gln Leu Arg Ser Gly Gln Lys
340 345 350
Leu Asp Ala Asp Val Ile Val Thr Ala Thr Gly Leu Gln Leu Lys Val
355 360 365
Ala Gly Gly Met Arg Ile Glu Val Asp Gly Val Pro Ala Asp Pro Ala
370 375 380
Gln Ala Phe Met Tyr Lys Gly Met Met Tyr Ser Asp Val Pro Asn Leu
385 390 395 400
Ala Val Ala Met Gly Tyr Val Asn Ala Ser Trp Thr Leu Lys Ala Glu
405 410 415
Leu Ser Ser Met Tyr Val Cys Arg Leu Ile Asn His Met Glu Ala Asn
420 425 430
Gly His Asp Trp Cys Ala Pro Arg Arg Gly His Ala Ala Gly Asp Asp
435 440 445
Glu Pro Ser Leu Ser Leu Thr Ser Gly Tyr Val Gln Arg Ala Ser Gly
450 455 460
Ile Leu Pro Arg Gln Gly Ser Lys Arg Pro Trp Arg Val His Gln Asn
465 470 475 480
Tyr Leu Phe Asp Leu Met Ala Leu Lys Phe Gly Lys Val Glu Asp Asp
485 490 495
Ala Met Glu Phe Gly Arg Ala Gly Pro Ala Ala Pro Arg Ala Pro Ala
500 505 510
Pro Ala Arg Ala Ala Glu Ser Ala His Gly
515 520
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccgcgcggca gccatatgct ggcgggtaac 30
<210> 5
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgagtgcggc cgcaagcttt tagccgtgcg cgctttc 37
Claims (10)
1.一种硫醚单加氧酶突变体，其特征在于，所述硫醚单加氧酶突变体的序列是如下中的一种：
(1)所述SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中第153位的氨基酸Asn替换为Val；
(2)所述SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中第266位的氨基酸Gly替换为Asp；
(3)所述SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中第313位的氨基酸Leu替换为Pro；
(4)所述SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中第406位的氨基酸Tyr替换为His；
(5)所述SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中第506位的氨基酸Ala替换为Phe；
(6)所述SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中第266位的氨基酸Gly替换为Asp，第406位的氨基酸Tyr替换为His；
(7)所述SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中第50位的氨基酸Arg替换为His，第273位的氨基酸Ala替换为Lys；
(8)所述SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中第266位的氨基酸Gly替换为Asp，第313位的氨基酸Leu替换为Pro；
(9)所述SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中第212位的氨基酸Leu替换为Met，第313位的氨基酸Leu替换为Pro，第451位的氨基酸Ser替换为Gln；
(10)所述SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中第171位的氨基酸Gly替换为Met，第451位的氨基酸Ser替换为Gln，第506位的氨基酸Ala替换为Phe；
(11)所述SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中第153位的氨基酸Asn替换为Val，第342位的氨基酸Glu替换为Ile，第406位的氨基酸Tyr替换为His；
(12)所述SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中第153位的氨基酸Asn替换为Val，第266位的氨基酸Gly替换为Asp，第451位的氨基酸Ser替换为Gln；
(13)所述SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中第313位的氨基酸Leu替换为Pro，第325位的氨基酸Ile替换为Lys，第406位的氨基酸Tyr替换为His；
(14)所述SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中第50位的氨基酸Arg替换为His，第313位的氨基酸Leu替换为Pro，第451位的氨基酸Ser替换为Gln；
(15)所述SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中第342位的氨基酸Glu替换为Ile，第406位的氨基酸Tyr替换为His，第506位的氨基酸Ala替换为Phe。
2.一种分离的核酸，其特征在于，所述的核酸编码如权利要求1所述硫醚单加氧酶突变体。
3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含如权利要求2所述的核酸。
4.一种重组表达转化体，其特征在于，所述的重组表达转化体包含如权利要求3所述的重组表达载体。
5.一种重组硫醚单加氧酶催化剂，其特征在于，所述重组硫醚单加氧酶催化剂是以下形式中的任意一种：
(1)培养权利要求4所述的重组表达转化体，分离含有所述硫醚单加氧酶突变体的转化体细胞；
(2)培养权利要求4所述的重组表达转化体，分离含有所述硫醚单加氧酶突变体的粗酶液；
(3)培养权利要求4所述的重组表达转化体，分离含有所述硫醚单加氧酶突变体的粗酶液，冷冻干燥得到的粗酶粉。
6.如权利要求1所述硫醚单加氧酶突变体或如权利要求5所述重组硫醚单加氧酶催化剂在催化前手性拉唑硫醚底物不对称氧化中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，权利要求1所述硫醚单加氧酶突变体或如权利要求5所述重组硫醚单加氧酶催化剂以氧气为氧化剂，催化前手性拉唑硫醚底物氧化为相应的手性亚砜。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述前手性拉唑硫醚底物选自以下任一个化学结构式所示的化合物：
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，反应过程中，辅酶NADPH氧化为NADP+，使用脱氢酶催化NADP+还原再生为NADPH。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的脱氢酶是甲酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶或醇脱氢酶中的任意一种。
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| CN202110125333.7A Active CN112725297B (zh) | 2021-01-29 | 2021-01-29 | 一种硫醚单加氧酶及其在制备手性拉唑药物中的应用 |
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| NAD(P)/FAD-dependent oxidoreductase [Cupriavidus basilensis];无;NCBI GenBank;第1页 * |
| 无.NAD(P)/FAD-dependent oxidoreductase [Cupriavidus basilensis].NCBI GenBank.2017,第1页. * |
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