CN108728421B - 一种羰基还原酶突变体及其用途 - Google Patents

一种羰基还原酶突变体及其用途 Download PDF

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    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01184—Carbonyl reductase (NADPH) (1.1.1.184)

Abstract

本发明以半理性设计的方法对羰基还原酶ChKRED12进行分子改良，获得了酶学性能大幅度改变的突变体。其中，突变体M191S的立体选择性提高且活力提高4倍；组合突变体Q151F/M191L和Q151Y/M191L的立体选择性反转且活性提高了3倍左右。构型反转的突变体可催化获得与母本催化相反构型的手性产物，丰富了生物催化工具箱。

Description

一种羰基还原酶突变体及其用途
技术领域
本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体内容涉及耐热性提高的羰基还原酶突变体及其用途。
背景技术
羰基还原酶(EC 1.1.1.184)，是氧化还原酶家族的一员，该酶依赖于辅酶NADH或NADPH，能够特异性催化酮(醛)、醇之间的转化。手性醇是合成手性药物的重要中间体，羰基还原酶可以高效地催化潜手性酮的还原，是制备手性醇的重要方法之一。羰基还原酶在制药工业、精细化工产业和信息工业中的应用十分广泛。
酶的催化效率和立体选择性是丈量其应用价值的重要指标，是决定生物催化过程能否实现工业化应用的关键。在实验室阶段研究的羰基还原酶通常立体选择性较好，但酶的催化活性往往不能满足工业化生产的要求。另一方面，从自然界中筛选的羰基还原酶大多数催化过程遵循Prelog规则，只能得到一种构型的手性醇。需要催化过程遵循anti-Prelog的另外一种构型往往不容易获得，因而无法满足医药、精细化学品和农用化学品等领域对该类手性醇的巨大需求。
蛋白质工程改造是提高酶活力和改变酶立体选择性的有利工具。其中，半理性设计方法的研究越来越多，该方法需对酶的分子结构和功能有一定了解，将目标位点缩小到一定水平，构建“小而精”的高质量突变体文库，从而更容易获得正向突变结果。目前，半理性设计的方法已成为蛋白质分子改造的主流方法，并广泛应用于改造酶的催化活性和立体选择性等方面。
发明内容
本发明利用半理性设计策略对来源于金黄杆菌CA49(Chryseobacteriumsp.CA49)的羰基还原酶ChKRED12(SEQ ID NO.2，NCBI登录号为：KC342012)进行分子改良，将一个或者多个氨基酸进行替换，从而获得活力和/或立体选择性改变的突变体。
所述羰基还原酶突变体是以SEQ ID NO.2为出发序列，将第151位的谷氨酰胺突变为苯丙氨酸或酪氨酸、第191位的甲硫氨酸突变为丝氨酸或亮氨酸或其任意组合得到的突变体或在此基础上增加中性突变位点得到的突变体。
根据本领域公共知识，构建的能表达上述突变体的载体、基因工程菌等也属于本发明的保护范围。
为了达到以上目的，本发明通过同源建模和酶-底物分子对接结果分析，选取母本羰基还原酶ChKRED12活性中心可能的关键氨基酸残基建立单点饱和突变文库，通过高通量筛选体系筛选突变体。
首轮分子进化获得了立体选择性反转的突变体Q151F和Q151Y，以及催化活性和立体选择性提高的突变体M191S。进一步对151和191位点进行整合，获得了立体选择性反转且活性提高的组合突变体Q151F/M191L和Q151Y/M191L。
本发明的具体方案为：
(1)同源建模和酶-底物分子对接分析：
以ChKRED12氨基酸序列同源性为标准，在蛋白质结构数据库中搜索合适的同源建模模板，经分析筛选，选择了来源于Synechococcus elongatus PCC 7942的3-羰基-酯酰载体蛋白还原酶(相似度47％)作为模板进行同源建模。然后利用AutoDockVina将(S)-2-甲氧基-3-羰基苯丙酸乙酯底物分子与ChKRED12模型进行分子对接。基于分子对接模型，我们对(S)-2-甲氧基-3-羰基苯丙酸乙酯底物周围
Figure BDA0001699164810000021
之内的氨基酸残基进行了分析，发现191位点的甲硫氨酸(Met)位于活性口袋的进口位置，预测该位点氨基酸残基的空间位阻作用对底物进出活性中心具有重要的影响；151位点的谷氨酰胺(Gln)与(S)-构型底物的羰基氧和乙氧基的氧会形成两个氢键，所以该氨基酸残基对酶与底物分子的结合构象具有重要作用，是酶分子识别底物构型的关键位点。因此，以氨基酸残基与底物间的相互作用及其对酶活性口袋的几何构型的影响为参考，选择ChKRED12底物结合口袋氨基酸残基Q151和M191作为突变位点。
(2)单点饱和文库的构建和筛选：
采用单点突变试剂盒和简并性密码子NNK对其位点构建饱和文库，PCR产物消化后电击转入大肠杆菌DH10B，将突变库克隆收集后提取质粒，转入大肠杆菌表达菌株BL21-DE3，挑选单克隆于96孔板中表达蛋白。而后将菌体离心，加入溶菌酶破碎细胞，并离心，取部分上清液(粗酶液)以2-甲氧基-3-羰基苯丙酸乙酯(1a)为底物，反应适当时间测定酶活。比较野生型和突变体的活性，将突变体活性接近或高于野生型的菌株转接到200mL的TB培养基中培养，制备粗酶液进行重复筛选，HPLC测定突变体催化活性和立体选择性的变化，将筛选得到的催化活性和立体选择性改变的菌株，送上海英骏生物技术有限公司测序，获得突变体DNA序列信息。详细方案见实施例1、2。
经上述单点饱和文库构建和筛选，获得了1个催化活性大幅度提高的突变体：M191S；同时获得了2个立体选择性反转的突变体，分别为Q151F和Q151Y，其特征如下：
M191S:第191位的甲硫氨酸突变为丝氨酸(DNA序列由ATG变为TCC)。
Q151F:第151位的谷氨酰胺突变为苯丙氨酸(DNA序列由CAG变为TTC)。
Q151Y:第151位的谷氨酰胺突变为酪氨酸(DNA序列由CAG变为TAC)。
(3)151位点和191位点的整合：
通过上述(1)饱和突变文库筛选获得2个立体选择性反转的突变体Q151F和Q151Y为模板，进一步对191位点构建饱和突变文库，筛选获得组合突变体。经上述饱和文库构建和筛选，获得了2个立体选择性反转且催化活性提高的突变体，分别为Q151F/M191L和Q151Y/M191L，其特征如下：
Q151F/M191L:第151位的谷氨酰胺突变为苯丙氨酸(DNA序列由CAG变为TTC)、第191位的甲硫氨酸突变为亮氨酸(DNA序列由ATG变为ACC)。
Q151Y/M191L:第151位的谷氨酰胺突变为酪氨酸(DNA序列由CAG变为TAC)、第191位的甲硫氨酸突变为亮氨酸(DNA序列由ATG变为ACC)。
这些突变体的催化活性和立体选择性与野生型相比均有不同程度提高。其中，M191S的催化活性提高四倍，且立体选择性也提高到ee值>99％，dr值>99/1；突变体Q151Y和Q151F催化底物的立体选择性反转且活性没有降低；组合突变体Q151F/M191L和Q151Y/M191L的立体选择性反转且活性提高了三倍左右。
本发明有益效果：
(1)上述所有催化活性提高的突变体与母本相比，酶的反应速度更快，能缩短反应周期，提高催化底物的时空效率，降低生产成本。
(2)突变体Q151F、Q151Y、Q151F/M191L以及Q151Y/M191L的立体选择性反转，反应遵循anti-Prelog规则，可催化获得与母本催化不同构型的产物。本发明所涉及的酮底物(实施例3.3)首次通过生物催化的方法获得反构型醇产物，丰富了生物催化工具箱。
具体实施方法
以下结合实施实例对本发明做进一步说明，需要指出的是，本实施例仅用于解释本发明，而非对本发明范围的限制。
实施例1单点饱和突变文库的构建
利用
Figure BDA0001699164810000041
site-directed mutagenesis试剂盒对羰基还原酶ChKRED12基因(见SEQ ID NO.1)分别进行单点饱和突变。
所用引物为：
M191-SM：T7：5′-CCGGGTTTTATCAAAACGGATNNKACCCAGGAGTTT-3′
T7ter：5′-AAACTCCTGGGTMNNATCCGTTTTGATAAAACCCGG-3′
Q151-SM：T7：5′-ACTGCGGGTNNKACCAATTATAGCGCAGCGA-3′
T7ter：5′-TCGCTGCGCTATAATTGGTMNNACCCGCAGT-3′
反应条件为：98℃预变性3min，98℃变性10s，55℃退火45s和72℃延伸2min，共25个循环，电泳后以胶回收试剂盒回收基因片段。将回收片段用DpnI消化后，电击法转入大肠杆菌DH10B，得到克隆的突变体库。
实施例2羰基还原酶ChKRED12突变文库的筛选
将实施例1中突变库克隆收集后提取质粒，转入大肠杆菌表达菌株BL21-DE3，涂布含有卡那霉素(50μg/mL)的LB平板，培养12h。挑取单克隆于96孔板，每孔含有200μL TB培养基(含有50μg/mL卡那霉素，0.5mM IPTG)，37℃，180rpm，震荡培养18h。96孔板复制器复制各单克隆于LB固体培养基平板，37℃培养12h后，4℃冰箱保存。将菌体诱导表达后的96孔板在4℃、4000rpm下离心10min，弃去上清，各孔加入200μL的溶菌缓冲液重悬细胞(溶菌缓冲液的配置：0.1M、pH 8.0的磷酸钾缓冲液，10mg/mL溶菌酶，1μg/mL DNase I，10mM MgCl2)。将加有溶菌液的96孔板在37℃放置2h后，在4℃、4000rpm下离心10min，取上清。用排枪轻轻吸出96孔板各孔中的上清液，按相应位置分别加入50μL上清液于96孔板中。将装有50μL上清液的96孔板加入150μL反应液(1mM的NADH，0.1M、pH 8.0的磷酸钾缓冲液和0.02倍体积的含有1mM的2-甲氧基-3-羰基苯丙酸乙酯的二甲基亚砜溶液)，30℃反应60min后，在340nm下测定NADH的吸光度。通过吸光度的变化测定野生型和突变体的催化活性。与野生型相比，将催化活性没有明显降低的突变体接种到200mL的TB培养基中扩大培养，制备粗酶液进行重复筛选，同时挑取单克隆送上海生物生工技术有限公司测序。
实施例3粗酶液酶活力的测定
3.1粗酶液的制备
挑取单克隆至LB(含卡那霉素50μg/mL)培养基中，37℃过夜培养，以1％的接种量转接至TB(含卡那霉素50μg/mL)培养基中，37℃培养3h，加入0.5mM IPTG诱导后，37℃继续培养18h。菌液离心集菌，细胞均质机破碎，离心取上清为粗酶液。
3.2粗酶活力的测定
粗酶活力测定反应条件：3mg/mL的粗酶液(总蛋白浓度)，1mM的NADP+，0.1M、pH8.0的磷酸钾缓冲液，0.1mL二甲基亚砜，10mM的底物2-甲氧基-3-羰基苯丙酸乙酯(1a)，5％(w/v)葡萄糖，2mg/mL葡萄糖脱氢酶。40℃、150rpm反应60min。反应结束后，等体积乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥后，水浴氮气吹干，异丙醇复溶，HPLC检测反应转化率和ee值，1HNMR测定dr值。
表1饱和突变文库SM191的筛选
Figure BDA0001699164810000051
表2饱和突变文库SM151的筛选
Figure BDA0001699164810000052
本轮突变获得的突变体M191S与母本相比，非対映选择性提高，dr值>99/1，且催化活性提高了4倍左右，生成(2S,3S)-构型的产物(见表1)。突变体Q151F、Q151Y与母本相比，突变体的対映选择性完全反转，生成(2R,3R)-构型的产物。单点饱和突变文库筛选结果见表1、2。
3.3催化底物
羰基还原酶ChKRED12突变体能够催化的底物及产物的HPLC检测条件，见表3。
表3底物及测定条件
Figure BDA0001699164810000061
实施例4两个位点的整合
以突变体Q151F和Q151Y基因为模板，利用试剂盒
Figure BDA0001699164810000062
site-directedmutagenesis分别对其191位进行单点饱和突变，饱和突变文库的构建和筛选方法见实施例1、2。突变子的蛋白表达和粗酶液的制备方法见实施例3。
本轮突变获得的2个突变体Q151F/M191L和Q151Y/M191L，与母本相比，立体选择性完全反转且催化活性提高了3倍左右，生成(2R,3R)-构型的产物，结果见表4。
表4 M191和Q151组合突变体的筛选
Figure BDA0001699164810000071
实施例5野生型ChKRED12和突变体M191S的粗酶液催化底物1a
粗酶液的制备与实施例3相同。反应体系为：磷酸钾缓冲液(0.1M，pH 8.0)、野生型ChKRED12浓度3g/L(粗酶液)、底物1a浓度20g/L、NADP+浓度0.6g/L、葡萄糖脱氢酶2g/L和葡萄糖10％(w/v)。反应温度40℃，反应时间为16h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应，样品处理方法及检测方法与实施例3相同。结果表明，野生型ChKRED12在16h内，催化20g/L底物的转化率为47％，得到(2S,3S)-构型醇，产物的ee值大于99％，dr值为97/3。
相同条件下，以突变体M191S粗酶液作生物催化剂，结果表明，16h内20g/L底物能转化完全(>99％)，得到(2S,3S)-构型醇，产物的ee值大于99％，dr值>99/1。因此，突变体M191S的催化效率和选择性有大幅度提高。
实施例6突变体M191S粗酶液催化20g/L底物2a
反应体系与实施例5相同，转化时间16h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应，样品处理方法及检测方法与实施例3相同。结果表明，16h内，20g/L底物2a能转化完全(>99％)，得到(2S,3S)-构型醇，产物的ee值大于99％，dr值>99/1。
实施例7野生型ChKRED12和突变体M191S的粗酶液催化20g/L底物3a
反应体系与实施例5相同，转化时间16h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应，样品处理方法及检测方法与实施例3相同。结果表明，野生型ChKRED12在16h内催化20g/L底物3a的转化率为7％，得到(2S,3S)-构型醇，产物的ee值大于99％，dr值为97/3。
相同条件下，突变体M191S在16h内，对20g/L底物的转化率为56％，得到(2S,3S)-构型醇，产物的ee值大于99％，dr值>99/1。突变体M191S大幅度提高了对该底物的转化率以及选择性。
实施例8野生型ChKRED12和突变体M191S的粗酶液催化20g/L底物4a
反应体系与实施例5相同，转化时间16h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应，样品处理方法及检测方法与实施例3相同。结果表明，野生型ChKRED12在16h内对20g/L底物4a的转化率为29％，得到(2S,3S)-构型醇，产物的ee值大于99％，dr值为95/5。
相同条件下，突变体M191S在16h内，催化20g/L该底物的转化率为83％，得到(2S,3S)-构型醇，产物的ee值大于99％，dr值>99/1。
实施例9突变体M191S粗酶液催化20g/L底物5a
反应体系与实施例5相同，转化时间16h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应，样品处理方法及检测方法与实施例3相同。结果表明，16h内，对20g/L底物5a的转化率为81％，得到(2S,3S)-构型醇，产物的ee值大于99％，dr值>99/1。
实施例10野生型ChKRED12和突变体M191S的粗酶液催化20g/L底物6a
反应体系与实施例5相同，转化时间16h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应，样品处理方法及检测方法与实施例3相同。结果表明，野生型ChKRED12在16h内，对20g/L底物6a的转化率为27％，得到(2S,3S)-构型醇，产物的ee值大于99％，dr值为97/3。
相同条件下，突变体M191S在16h内，催化20g/L该底物的转化率为95％，得到(2S,3S)-构型醇，产物的ee值大于99％，dr值>99/1。
实施例11突变体M191S粗酶液催化20g/L底物7a
反应体系与实施例5相同，转化时间16h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应，样品处理方法及检测方法与实施例3相同。结果表明16h内，突变体M191S催化20g/L底物7a的转化率为92％，得到(2S,3S)-构型醇，产物的ee值大于99％，dr值>99/1。
实施例12野生型ChKRED12和突变体M191S的粗酶液催化20g/L底物8a
反应体系与实施例5相同，转化时间16h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应，样品处理方法及检测方法与实施例3相同。结果表明，野生型ChKRED12在16h内，催化20g/L底物8a的转化率为41％，得到(2S,3S)-构型醇，产物的ee值大于99％，dr值为95/5。
相同条件下，突变体M191S在16h内，催化20g/L该底物的转化率为86％，得到(2S,3S)-构型醇，产物的ee值大于99％，dr值>99/1。
实施例13野生型ChKRED12和突变体M191S的粗酶液催化20g/L底物9a
反应体系与实施例5相同，转化时间16h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应，样品处理方法及检测方法与实施例3相同。结果表明，野生型ChKRED12在16h内，催化20g/L底物9a的转化率为38％，得到(2S,3S)-构型醇，产物的ee值大于99％，dr值为95/5。
相同条件下，突变体M191S在16h内，催化20g/L该底物的转化率为72％，得到(2S,3S)-构型醇，产物的ee值大于99％，dr值>99/1。
实施例14野生型ChKRED12和突变体M191S的粗酶液催化20g/L底物10a
反应体系与实施例5相同，转化时间16h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应，样品处理方法及检测方法与实施例3相同。结果表明，野生型ChKRED12在16h内，催化20g/L底物10a的转化率为51％，得到(2S,3S)-构型醇，产物的ee值大于99％，dr值为88/12。
相同条件下，突变体M191S在16h内，催化20g/L该底物的转化率为91％，得到(2S,3S)-构型醇，产物的ee值大于99％，dr值>99/1。
实施例15突变体Q151F粗酶液催化4g/L底物1a
反应体系：磷酸钾缓冲液(0.1M，pH 8.0)、羰基还原酶ChKRED12浓度5g/L(粗酶液)、底物1a浓度4g/L、NADP+浓度0.6g/L、葡萄糖脱氢酶2g/L和葡萄糖10％(w/v)。反应温度40℃，反应时间为12h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应，样品处理方法及检测方法与实施例3相同。结果表明，12h内，4g/L底物就能转化完全，得到(2R,3R)-构型醇，产物的ee值大于99％，dr值为98/2。
实施例16突变体Q151Y粗酶液催化4g/L底物1a
反应体系与实施例15相同，转化时间12h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应，样品处理方法及检测方法与实施例3相同。结果表明，12h内，4g/L底物1a就能转化完全，得到(2R,3R)-构型醇，产物的ee值大于99％，dr值为98/2。
实施例17突变体Q151F粗酶液催化4g/L底物2a
反应体系与实施例15相同，转化时间12h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应，样品处理方法及检测方法与实施例3相同。结果表明，12h内，4g/L底物2a的转化率为90％，得到(2R,3R)-构型醇，产物的ee值大于99％，dr值为98/2。
实施例18突变体Q151Y粗酶液催化4g/L底物2a
反应体系与实施例15相同，转化时间12h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应，样品处理方法及检测方法与实施例3相同。结果表明，突变体Q151Y在12h内催化4g/L底物2a的转化率为74％，得到(2R,3R)-构型醇，产物的ee值大于99％，dr值为98/2。
实施例19突变体Q151F粗酶液催化4g/L底物8a
反应体系与实施例15相同，转化时间12h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应，样品处理方法及检测方法与实施例3相同。结果表明，突变体Q151F在12h内催化4g/L底物8a的转化率为81％，得到(2R,3R)-构型醇，产物的ee值为98％，dr值为94/6。
实施例20突变体Q151Y粗酶液催化4g/L底物8a
反应体系与实施例15相同，转化时间12h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应，样品处理方法及检测方法与实施例3相同。结果表明，突变体Q151Y在12h内催化4g/L底物8a的转化率为99％，得到(2R,3R)-构型醇，产物的ee值为95％，dr值为94/6。
实施例21突变体Q151F粗酶液催化4g/L底物9a
反应体系与实施例15相同，转化时间12h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应，样品处理方法及检测方法与实施例3相同。结果表明，12h内，4g/L底物的转化率为86％，得到(2R,3R)-构型醇，产物的ee值为98％，dr值为95/5。
实施例22突变体Q151Y粗酶液催化4g/L底物9a
反应体系与实施例15相同，转化时间12h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应，样品处理方法及检测方法与实施例3相同。结果表明，12h内，4g/L底物的转化率为94％，得到(2R,3R)-构型醇，产物的ee值为95％，dr值为94/6。
实施例23突变体Q151Y/M191L粗酶液催化20g/L底物1a
反应体系与实施例5相同，转化时间16h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应，样品处理方法及检测方法与实施例3相同。结果表明，16h内催化20g/L底物1a的转化率为71％，得到(2R,3R)-构型醇，产物的ee值大于99％，dr值为98/2。
序列表
<110> 中国科学院成都生物研究所
中国科学院成都生物研究所
<120> 一种羰基还原酶突变体及其用途一种羰基还原酶突变体及其用途
<130> 一种羰基还原酶突变体及其用途一种羰基还原酶突变体及其用途
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 744
<212> DNA
<213> Chryseobacterium
<400> 1
gaattcatga aatgcgcgat aattaccggc ggaagccgtg gcattggccg tgcgatttgc 60
attaagctgg cggaggaaaa gaattatcat attctgatta actatacctc aaatgagact 120
gccgctcgtg aaaccctggc gaaggtggaa gagttaggcg caacaggcga aattctgaaa 180
tttgatgtgg gtaacgcgga agagacgaaa gcggtgctga ccgaatggca ggatgcgaat 240
agcagcgccg tggtggaggt gatcgtgaat aatgcgggca ttacccgtga tggcctgttt 300
atgtggatgc cgagcgaaga ttggaatagc gtcattaata ccagcctgaa tggcttcttc 360
aacgtgacga acttctttat ccagaaatta ctgcgtaaca aatatggccg tattatcaat 420
atggtgagcg tgagcggtgt aaagggcact gcgggtcaga ccaattatag cgcagcgaaa 480
ggcgcgctgg tgggggcgac caaagctctg gcgcaggaag tcgcgaaacg taatatcact 540
gtgaatgcgg tggctccggg ttttatcaaa acggatatga cccaggagtt taatgaagat 600
gaactgaaag gcatgattcc ggcgaaccgt ttcggggaag ctgaggaggt ggcggattta 660
gtggcgtttc tggcgagcaa gaaagcgagc tacataacgg gcgaagtgat caacataaat 720
gggggcattt attcttaaaa gctt 744
<210> 1
<211> 243
<212> PRT
<213> Chryseobacterium
<400> 1
Met Lys Cys Ala Ile Ile Thr Gly Gly Ser Arg Gly Ile Gly Arg Ala
1 5 10 15
Ile Cys Ile Lys Leu Ala Glu Glu Lys Asn Tyr His Ile Leu Ile Asn
20 25 30
Tyr Thr Ser Asn Glu Thr Ala Ala Arg Glu Thr Leu Ala Lys Val Glu
35 40 45
Glu Leu Gly Ala Thr Gly Glu Ile Leu Lys Phe Asp Val Gly Asn Ala
50 55 60
Glu Glu Thr Lys Ala Val Leu Thr Glu Trp Gln Asp Ala Asn Ser Ser
65 70 75 80
Ala Val Val Glu Val Ile Val Asn Asn Ala Gly Ile Thr Arg Asp Gly
85 90 95
Leu Phe Met Trp Met Pro Ser Glu Asp Trp Asn Ser Val Ile Asn Thr
100 105 110
Ser Leu Asn Gly Phe Phe Asn Val Thr Asn Phe Phe Ile Gln Lys Leu
115 120 125
Leu Arg Asn Lys Tyr Gly Arg Ile Ile Asn Met Val Ser Val Ser Gly
130 135 140
Val Lys Gly Thr Ala Gly Gln Thr Asn Tyr Ser Ala Ala Lys Gly Ala
145 150 155 160
Leu Val Gly Ala Thr Lys Ala Leu Ala Gln Glu Val Ala Lys Arg Asn
165 170 175
Ile Thr Val Asn Ala Val Ala Pro Gly Phe Ile Lys Thr Asp Met Thr
180 185 190
Gln Glu Phe Asn Glu Asp Glu Leu Lys Gly Met Ile Pro Ala Asn Arg
195 200 205
Phe Gly Glu Ala Glu Glu Val Ala Asp Leu Val Ala Phe Leu Ala Ser
210 215 220
Lys Lys Ala Ser Tyr Ile Thr Gly Glu Val Ile Asn Ile Asn Gly Gly
225 230 235 240
Ile Tyr Ser

Claims (2)

1.一种羰基还原酶突变体，其特征在于以羰基还原酶ChKRED12的氨基酸序列SEQ IDNO.2为出发序列，在第191位和第151位至少有一个位点发生突变所得到的突变体，具体选自以下5种突变体：第191位的甲硫氨酸突变为丝氨酸；第151位的谷氨酰胺突变为苯丙氨酸或酪氨酸；第151位的谷氨酰胺突变为苯丙氨酸且第191位的甲硫氨酸突变为亮氨酸；第151位的谷氨酰胺突变为酪氨酸且第191位的甲硫氨酸突变为亮氨酸。
2.权利要求1所述的羰基还原酶突变体在催化羰基化合物中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109355265B (zh) * 2018-11-25 2021-07-20 华南理工大学 一种羰基还原酶突变体mut-AcCR(I147V/G152L)及其应用与编码基因
CN109852592B (zh) * 2019-01-14 2022-05-31 中国科学院成都生物研究所 耐热性提高的羰基还原酶突变体
CN109837254B (zh) * 2019-03-28 2022-05-31 中国科学院成都生物研究所 一种热稳定性提高的羰基还原酶突变体
CN109852593B (zh) * 2019-03-28 2020-10-20 洛阳华荣生物技术有限公司 一种重组酮还原酶及在制备r-3-羟基丁酸及其盐中的应用
CN110004119B (zh) * 2019-04-18 2020-10-20 华东理工大学 ε-酮酯还原酶突变体及其催化合成(R)-α-硫辛酸前体的应用
CN111172124B (zh) 2020-02-26 2022-07-22 复旦大学 一种羰基还原酶突变体及其在制备(r)-4-氯-3-羟基-丁酸酯中的应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101914509A (zh) * 2010-08-03 2010-12-15 中国农业科学院生物技术研究所 有机磷降解酶突变体及其编码基因和应用
CN102277338A (zh) * 2011-08-02 2011-12-14 中国药科大学 双羰基还原酶突变体及其应用
CN104830924A (zh) * 2015-05-20 2015-08-12 中国科学院成都生物研究所 羰基还原酶生物催化生产噻吩基手性醇类化合物
CN107254454A (zh) * 2017-05-16 2017-10-17 中国科学院成都生物研究所 一种羰基还原酶突变体及其应用
CN108753851A (zh) * 2018-05-28 2018-11-06 中国科学院成都生物研究所 羰基还原酶生物催化生产手性1,2-二醇类化合物
CN110016467A (zh) * 2016-07-18 2019-07-16 中国科学院成都生物研究所 羰基还原酶ChKRED20突变体及其用途

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101914509A (zh) * 2010-08-03 2010-12-15 中国农业科学院生物技术研究所 有机磷降解酶突变体及其编码基因和应用
CN102277338A (zh) * 2011-08-02 2011-12-14 中国药科大学 双羰基还原酶突变体及其应用
CN104830924A (zh) * 2015-05-20 2015-08-12 中国科学院成都生物研究所 羰基还原酶生物催化生产噻吩基手性醇类化合物
CN110016467A (zh) * 2016-07-18 2019-07-16 中国科学院成都生物研究所 羰基还原酶ChKRED20突变体及其用途
CN107254454A (zh) * 2017-05-16 2017-10-17 中国科学院成都生物研究所 一种羰基还原酶突变体及其应用
CN108753851A (zh) * 2018-05-28 2018-11-06 中国科学院成都生物研究所 羰基还原酶生物催化生产手性1,2-二醇类化合物

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Stereoselective Bioreduction of Ethyl 3-Oxo-3-(2-Thienyl) Propanoate Using the Short-Chain Dehydrogenase/Reductase ChKRED12;Zhi-Qiang Ren等;《J. Microbiol. Biotechnol.》;20191128;第1769-1776页 *
生物催化不对称还原制备（R）-1-[3,5-二（三氟甲基）苯基]乙醇研究进展;刘艳等;《应用与环境生物学报》;20200831;第820-826页 *

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