CN110004119B - ε-酮酯还原酶突变体及其催化合成(R)-α-硫辛酸前体的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及ε‑酮酯还原酶经过分子工程改造后催化性能提高的突变体，含有该酶突变体基因的重组表达质粒和重组表达转化体，重组酶的制备方法，以及该重组酶或重组细胞用于催化制备硫辛酸合成前体(R)‑8‑氯‑6‑羟基辛酸乙酯的方法。与现有技术相比，本发明公开的ε‑酮酯还原酶CpAR2突变体具有热稳定性好、催化活力高的优点，在催化制备(R)‑8‑氯‑6‑羟基辛酸乙酯的反应中展现出底物浓度高、催化剂用量少等显著优势，具有很高的工业应用潜力。
Description
技术领域
本发明属于生化工程技术领域，具体涉及一种ε-酮酯还原酶突变体及其基因序列，含有该突变体基因序列的重组表达质粒和重组表达转化体，共表达ε-酮酯还原酶突变体与葡萄糖脱氢酶的冻干细胞，以及所述ε-酮酯还原酶突变体与共表达ε-酮酯还原酶突变体和葡萄糖脱氢酶的冻干细胞在催化制备(R)-α-硫辛酸前体(R)-8-氯-6-羟基辛酸乙酯中的应用。
背景技术
α-硫辛酸是一种B族维生素，也是一种安全有效的抗氧化剂，可以高效清除容易致病和加速老化的自由基，其抗氧化作用远远强于维生素C和维生素E，并且在体内可以实现维生素C、维生素E、谷胱甘肽、辅酶Q10等抗氧化剂的还原再生，因此是抗氧化作用网络的中心，被医学界称为“万能抗氧化剂”。除此之外，在临床上α-硫辛酸还常被用于治疗糖尿病周围神经病变和糖尿病肾病。α-硫辛酸作为一种手性化合物，具有两种构型，但是只有天然形式的(R)-构型才具有生理活性。由于其(S)-构型无明显毒副作用，且单一(R)-异构体的价格是(R,S)-混旋体的5倍，所以市售大部分产品仍为混旋体。尽管如此，为了减轻人体代谢(S)-异构体垃圾的负担，高效地制备光学纯的(R)-构型单一对映体α-硫辛酸具有重要的应用价值和广阔的市场前景。
人们已经研究开发了很多化学和生物法合成(R)-α-硫辛酸的途径，并不断地追求路线较短、原料易得且操作简便的新工艺。目前(R)-α-硫辛酸的合成方法主要有两类，一是对化学合成的外消旋α-硫辛酸或其前体进行拆分，该途径的理论收率仅50％；二是通过羰基还原酶催化ε-酮酯底物8-氯-6-羰基辛酸乙酯(简称ECOO)的不对称还原反应，生成(R)-α-硫辛酸合成的关键前体(R)-8-氯-6-羟基辛酸乙酯(以下简称(R)-ECHO)，提前将手性中心引入，获得的(R)-ECHO通过与氯化亚砜、二硫化钠进行两步常规的化学反应，即可合成得到(R)-α-硫辛酸，该途径具有100％的理论产率。第二个方法反应条件温和、副产物少，由于省去了常规拆分途径中反复重结晶步骤，大幅度提高了(R)-α-硫辛酸的合成总得率，具有很好的应用前景。本申请发明人课题组针对ECOO这一特定工业底物，进行了ε-酮酯还原酶的基因资源智能挖掘和大规模筛选，从实验室自建的先导酶库中成功地发掘获得起源于***滑假丝酵母(Candida parapsilosis，其专利保藏号为CGMCC 9630)的ε-酮酯还原酶，能有效地催化ECOO的不对称还原反应，成功构建了一条高效制备(R)-α-硫辛酸关键手性前体的酶法合成路线和工艺(Adv.Synth.Catal.,2015,357(8),1697)。公开号为CN 106164260A的发明专利中公开了重组羰基还原酶CpKR及其突变体CpKRG86E和CpKRG86E/A163S，将重组羰基还原酶CpAR突变体和葡萄糖脱氢酶BmGDH进行基因串联单质粒共表达，直接使用重组共表达的大肠杆菌细胞作为羰基不对称还原生物催化剂，实现了廉价葡萄糖驱动的辅酶循环再生和ε-酮酯底物的完全转化。在优选的实施例中，30g L-1的重组共表达大肠杆菌细胞E.coli BL21/pET28a-CpKRG86E/A163S-BmGDH在12h内催化330g L-1(1.5mol/L)底物的完全转化，催化剂的比生产率为9.8g产品/g催化剂；1 L规模反应体系中，10g L-1的重组共表达大肠杆菌细胞在8h内催化220g L-1(1.0mol/L)底物的完全转化，催化剂的比生产率为19.8g产品/g催化剂。尽管如此，重组羰基还原酶CpAR及其突变体在其工业应用过程中所面临的一个重要挑战是酶的热稳定性不足，限制了其反应的温度范围，增加了控温的能源成本；并且由于工业操作过程中酶的失活问题导致实际应用中所需使用的催化剂量较多，不但增加了用酶的成本，而且由于大量蛋白质的存在，对产品进行溶剂萃取时产生较严重的乳化问题，显著增加了反应后续处理的难度和成本，限制了产品的分离收率和品质提升。因此，在重组羰基还原酶CpAR的基础上，进一步开发具有良好热稳定性的高活力ε-酮酯还原酶突变体，减少催化剂用量，是当前(R)-硫辛酸的酶法工业化生产应用亟待解决的技术瓶颈问题，对推进羰基还原酶的产业化应用也具有重要意义。
发明内容
本发明针对现有ε-酮酯还原酶在应用过程中存在的催化活性不够高、稳定性不佳的问题，提供了一系列催化活性提高、热稳定性改善的ε-酮酯还原酶突变体，含有该酶突变体基因的重组表达质粒和重组表达转化体，重组共表达ε-酮酯还原酶突变体与BmGDH的重组细胞，以及重组细胞在催化制备手性ε-羟基辛酸酯(R)-ECHO中的应用方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明的技术方案之一：提供ε-酮酯还原酶突变体。
一种ε-酮酯还原酶突变体，为如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第131位的丝氨酸、第252位的谷氨酰胺经过一个或两个氨基酸取代后形成的新氨基酸序列构成的，同时具备ε-酮酯还原酶活性的衍生蛋白质。
如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的蛋白质即是公开号为CN 106164260A的发明专利中所述羰基还原酶突变体CpKRG86E。所述羰基还原酶突变体CpKRG86E可由SEQ ID No.1所示核酸序列编码。所述羰基还原酶突变体CpKRG86E是由羰基还原酶CpKR突变得到，羰基还原酶CpKR来自于一种***滑假丝酵母菌(Candida parapsilosis)，该菌株初始命名为ECU6481，自华东理工大学奉贤校区土样中分离得到，并经分类实验和16S rDNA分析鉴定为***滑假丝酵母菌。该菌株已于2014年9月1日专利保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC 9630，在公开号为CN 106164260A的发明专利中已经公开。
本发明中，以公开号为CN 106164260A的发明专利中所述羰基还原酶突变体CpKRG86E作为母本，进行进一步结构改造，经过一个或几个氨基酸的替换，得到ε-酮酯还原酶热稳定性改善同时活性显著提高的突变体。
为方便表述，本发明中，将公开号为CN 106164260A的发明专利中所述羰基还原酶突变体CpKRG86E命名为ε-酮酯还原酶CpAR2。
本发明通过易错PCR的方法，以SEQ ID No.2所示氨基酸序列作为模板建立突变体库，并对易错突变库中的4000个克隆子进行了筛选。基于第一轮易错随机突变库的活力和热稳定性的并行筛选结果，本发明发现在SEQ ID No.2所示氨基酸序列的基础上将第131位的丝氨酸替换成亮氨酸后，具有明显较高的ε-酮酯还原酶活性。以第一轮活力提高的突变体为模板，进行新一轮的随机突变，发现对第252位的谷氨酰胺进行单点替换成异亮氨酸后，其热稳定性得到了改善。根据同源建模以及分子对接的结果分析，131位的丝氨酸是位于活性中心loop上的一个重要氨基酸，与底物的酯基距离较近(在
范围内)，所以对其进行点饱和突变，即突变为其它19种氨基酸，然后将效果较优的突变点与252位异亮氨酸突变进行组合，从中筛选ε-酮酯还原酶热稳定性改善、同时活性提高的CpAR2突变体。
本发明中，所述母本ε-酮酯还原酶CpAR2的活力为120U/mg，
为43.5℃，其中
的定义为酶在不同温度下保温15min后活力损失一半所对应的温度。
其中所述突变体蛋白质催化性能较佳的有：
(1)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第131位丝氨酸突变为亮氨酸(CpAR2S131L)，其对ECOO的活力为171U/mg，
为46.5℃；
(2)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第131位丝氨酸突变为苯丙氨酸(CpAR2S131F)，其对ECOO的活力为218U/mg，
为46.3℃；
(3)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第131位丝氨酸突变为酪氨酸(CpAR2S131Y)，其对ECOO的活力为237U/mg，
为46.8℃；
(4)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第131位丝氨酸突变为酪氨酸，同时第252位谷氨酰胺替换为异亮氨酸(CpAR2S131Y/Q252I)，其对ECOO的活力为214U/mg，
为47.8℃；
(5)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第131位丝氨酸突变为亮氨酸，同时第252位谷氨酰胺替换为异亮氨酸(CpAR2S131L/Q252I)，其对ECOO的活力为197U/mg，
为48.8℃；
(6)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第131位丝氨酸替换为苯丙氨酸，同时第252位谷氨酰胺替换为异亮氨酸(CpAR2S131F/Q252I)，其对ECOO的活力为182U/mg，
为47.8℃；
蛋白质CpAR2的第131位和第252位的氨基酸残基分别为丝氨酸和谷氨酰胺，因此本发明所述蛋白质的第131位和第252位的氨基酸残基不同于CpAR2的相应位点的氨基酸残基。突变蛋白质CpAR2S131Y对ECOO的活力比CpAR2提高了一倍，且热稳定性有小幅度提高。突变蛋白质CpAR2S131L/Q252I的
比CpAR2提高了5.3℃，活力为CpAR2的1.6倍。
将最好的突变体组合起来，得到最佳的双突变体CpAR2S131Y/Q252I，活力达到214U/mg，
较母本提高了4.3℃。
本发明的技术方案之二：提供一种分离的核酸。
一种分离的核酸，所述核酸是编码如技术方案一所述ε-酮酯还原酶的核酸，是编码如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第131位的丝氨酸、第252位的谷氨酰胺经过一个或两个氨基酸取代后且ε-酮酯还原酶活性提高和热稳定性改善的衍生蛋白质的核酸。
本发明所述核酸的制备方法可以为本领域常规制备方法，所述制备方法较佳的可以为：人工全序列合成；或从编码表达所述蛋白氨基酸序列的重组表达质粒或重组转化体中分离获得；或通过基因克隆技术获得编码CpAR2突变体基因的核酸分子。
所述通过基因克隆技术获得编码CpAR2突变体基因的核酸分子的方法可以为：以正向引物(CpAR2_Nde I_F)
5’-GGAATTCCATATGACAGTATTTGTCTCAGGTGC-3’，反向引物(CpAR2_EcoR I_R)5’-CCGGAATTCTTACTTGGCATCGAGAAGTTGTTT-3’，利用PCR技术对CpAR2突变体的基因DNA序列进行扩增。
PCR体系(50μL)：模板质粒0.5～20ng，PrimeSTAR25μL，正反向引物各1.25μL(10μM)，ddH2O补足至50μL。
PCR反应程序：(1)98℃预变性3min；(2)98℃变性10s；(3)55℃退火5s；(4)72℃延伸6min；步骤(2)～(4)共进行30个循环，最后72℃延伸5min，4℃保存产物。
本发明的技术方案之三：提供一种包含本发明所述ε-酮酯还原酶突变体的核酸序列的重组表达质粒。
一种包含本发明所述ε-酮酯还原酶突变体的核酸序列的重组表达质粒，其可通过本领域常规方法制备，即可以将本发明所述的ε-酮酯还原酶突变体的核酸序列连接于各种市售常规质粒载体上构建而成。所述质粒优选pET系列质粒，更优选质粒pET-28a(+)。可通过下述方法制得本发明所述的重组表达质粒：将通过PCR扩增所得的核酸产物与表达载体pET-28a分别用限制性内切酶EcoR I和Nde I双酶切，形成互补的粘性末端，经T4 DNA连接酶连接，形成含有本发明所述ε-酮酯还原酶突变体基因的重组表达质粒。
本发明的技术方案之四：提供一种包含本发明所述ε-酮酯还原酶突变体基因或重组表达质粒的重组表达转化体。
其可通过将本发明所述的重组表达质粒转化至合适的宿主细胞中制得所述重组表达转化体。所述宿主细胞可以是本领域的各种常规宿主细胞，前提是能使所述重组表达质粒稳定地自行复制，且其所携带的ε-酮酯还原酶突变体基因可被有效表达。本发明优选宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。其中所述的重组质粒转化方法为本领域常规方法，如热激法，电转法等，较佳的为热激法，热激法较佳的实施方式为：将质粒溶液与感受态细胞混合，42℃，热激90秒，然后冰浴3min，随后37℃复苏1h，涂布含卡那霉素的LB琼脂培养基平板，培养得到目标重组表达转化体。
本发明的技术方案之五：提供一种重组ε-酮酯还原酶突变体的制备方法，其包括如下步骤：培养本发明所述的重组表达转化体，获得重组ε-酮酯还原酶突变体。其中，培养所述重组表达转化体所用的培养基可选自本领域的常规培养基，前提是使重组表达转化体生长并产生本发明所述的ε-酮酯还原酶突变体。培养所述重组表达转化体的具体操作均可按本领域常规操作进行。将上述技术方案构建的含有ε-酮酯还原酶突变体基因的重组大肠杆菌，接种至含50μg mL-1硫酸卡那霉素的LB培养基(蛋白胨10g L-1，酵母膏5g L-1，NaCl10gL-1，pH7.0)中，37℃振荡培养过夜，按1％(v/v)的接种量接入装有100mL LB培养基的500mL三角烧瓶中，置于37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD600达到0.5～1.0(较佳的为0.6)，加入终浓度为0.2mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂，16℃诱导24h后，培养液离心，收集细胞，将所得的细胞悬浮于15mL的Tris-HCl缓冲液(20mM,pH7.4)中，在冰浴中超声破碎，离心收集上清液，即得到重组ε-酮酯还原酶突变体的粗酶液。
本发明获得的ε-酮酯还原酶突变体在N端含有组氨酸标签，故采用镍柱进行蛋白纯化。以下为缓冲液配方：A液：Tris-HCl缓冲液(20mM,pH7.4)，含有0.5M NaCl和10mM咪唑；B液：Tris-HCl缓冲液(20mM,pH7.4)，含有0.5M NaCl、500mM咪唑；C液：Tris-HCl缓冲液(25mM,pH7.4)，含有0.15M NaCl和1mM二硫苏糖醇。将表达的ε-酮酯还原酶突变体的粗酶液上样到镍柱上，首先用A液洗脱杂蛋白，随后用A与B比例为7:3的混合液洗脱目标蛋白，收集纯化的蛋白质，超滤浓缩后，加C液置换除去高浓度NaCl和咪唑，于-80℃保存备用。
本发明的技术方案之六：提供一种ε-酮酯还原酶突变体与葡萄糖脱氢酶BmGDH共表达的重组表达转化体的制备方法，其包括如下步骤：
设计引物对如SEQ ID No.3所示氨基酸序列的BmGDH的基因进行扩增，通过限制性内切酶Sal I和Xho I对BmGDH扩增产物以及技术方案三所述重组表达质粒进行双酶切，凝胶电泳分离纯化目标产物片段，用T4 DNA连接酶进行连接获得所述ε-酮酯还原酶突变体与BmGDH共表达的重组表达转化体；
或者：设计引物对技术方案二所述核酸序列以及如SEQ ID No.3所示氨基酸序列的BmGDH的基因进行扩增，分别使用限制性内切酶进行双酶切，然后顺序连接到质粒载体上，获得所述ε-酮酯还原酶突变体与BmGDH共表达的重组表达转化体。
可以先通过本领域常规技术手段构建SEQ ID No.2编码的ε-酮酯还原酶CpAR2与葡萄糖脱氢酶BmGDH的共表达质粒pET28a-CpAR2-BmGDH，再通过限制性内切酶NdeI和EcoRI将CpAR2母本片段切掉，再用T4 DNA Ligase将之与经同样酶切位点酶切过的突变体片段进行连接，转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，即可得到ε-酮酯还原酶CpAR2突变体与BmGDH共表达的重组共表达转化体。培养本发明的重组共表达转化体，获得ε-酮酯还原酶突变体与BmGDH共表达的重组细胞。其中，培养所述重组共表达转化体所用的培养基可选自本领域的常规培养基，前提是可使重组共表达转化体生长并同时表达本发明所述的ε-酮酯还原酶突变体以及BmGDH。其他转化体培养的具体操作均可按本领域常规操作进行。将上述技术方案构建的重组大肠杆菌，以1％接种量接种至含50μg mL-1硫酸卡那霉素的LB培养基试管中，于37℃培养过夜，以1％接种量接种至盛有50mL LB培养基的250mL小摇瓶中，37℃培养，待OD600长至1.0左右，将小摇瓶中的所有菌液接种至盛有600mL TB培养基(蛋白胨12g L-1，酵母粉24g L-1，甘油4mL L-1，磷酸钾缓冲液100mM，pH7.0)的带挡板3-L大摇瓶中，37℃进行扩大培养，待OD600达到0.6～0.8，加入终浓度为0.2mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂，16℃诱导24h后，12000×g离心10min收集细胞，将收集的菌体平铺在盘子里，放入-80℃冰箱冷冻过夜，再用冻干机进行冷冻干燥，即可得到双酶共表达重组大肠杆菌的冻干细胞。
本发明的技术方案之七：基于技术方案六提供的制备方法，提供ε-酮酯还原酶突变体与BmGDH共表达的重组表达转化体，或共表达ε-酮酯还原酶突变体与葡萄糖脱氢酶的冻干细胞。
本发明的技术方案之八：提供所述ε-酮酯还原酶突变体，或ε-酮酯还原酶突变体与葡萄糖脱氢酶BmGDH共表达的重组表达转化体，或共表达ε-酮酯还原酶突变体与葡萄糖脱氢酶BmGDH的冻干细胞应用于催化底物ECOO的不对称还原反应制备光学纯的(R)-ECHO的应用。
典型的酶促ECOO不对称还原反应的条件如下：Tris-HCl缓冲液(pH7.0,100mM)，含有助溶剂乙醇(5％,v/v)，底物ECOO的浓度为0.1～2.0mol/L，葡萄糖与底物ECOO的摩尔浓度比为1.0～1.5，外加终浓度为0～0.1mM的辅酶NADP+，加入20～2000U L-1的ε-酮酯还原酶突变体与适量的葡萄糖脱氢酶，或ε-酮酯还原酶突变体与BmGDH共表达的重组表达转化体，或共表达ε-酮酯还原酶突变体与葡萄糖脱氢酶的冻干细胞，于40℃下磁力搅拌反应，反应过程中通过自动电位滴定仪滴加K2CO3碱液(1mol/L)来控制反应液的pH恒定在7.0左右，定时取样，用等体积的乙酸乙酯萃取后，进行转化率及产物光学纯度(ee)分析。在此基础上，具体的反应条件如反应温度、反应pH、助溶剂用量、催化剂用量等可按本领域此类反应的常规条件进行优化、选择。
所述ε-酮酯还原酶突变体及葡萄糖脱氢酶可以是以ε-酮酯还原酶突变体与BmGDH共表达的重组表达转化体或ε-酮酯还原酶突变体与葡萄糖脱氢酶共表达的冻干细胞的形式加入。
使用本发明优选的生物催化剂CpAR2S131Y/Q252I-BmGDH重组共表达冻干细胞，催化剂用量仅为2g L-1的情况下，4h内即可将110g L-1的ε-酮酯底物完全转化为(R)-α-硫辛酸的合成前体(R)-8-氯-6-羟基辛酸乙酯(99％ee)，比生产率(产物/催化剂)达48g产品/g催化剂。
与现有技术相比，本发明的积极进步效果在于：
针对目前ε-酮酯还原酶用于(R)-ECHO的生物催化合成所面临的酶稳定性较差，反应温度受限，并且催化剂用量大的挑战性问题，以具有高选择性的ε-酮酯还原酶CpAR2作为蛋白质工程改造的起点，通过易错PCR随机突变、单点饱和突变以及组合突变，提高了ε-酮酯还原酶CpAR2的热稳定性和催化活力。使用本发明公开的ε-酮酯还原酶CpAR2突变体催化底物ECOO的不对称还原，具有催化剂活性高、热失活较少，从而催化剂用量减少的显著优势。相对于其它制备方法，使用本发明方法制备所得的ε-酮酯还原酶具有催化剂用量少、对环境友好、操作简便、易于工业放大等优势，具有很好的工业应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1ε-酮酯还原酶CpAR2随机突变库的构建及筛选
将公开号为CN 106164260A的发明专利中所述羰基还原酶突变体CpKRG86E命名为ε-酮酯还原酶CpAR2。所述羰基还原酶突变体CpKRG86E可由SEQ ID No.1所示核酸序列编码。所述羰基还原酶突变体CpKRG86E是由羰基还原酶CpKR突变得到，羰基还原酶CpKR来自于一种***滑假丝酵母菌(Candida parapsilosis)，该菌株初始命名为ECU 6481，自华东理工大学奉贤校区土样中分离得到，并经分类实验和16S rDNA分析鉴定为***滑假丝酵母菌。该菌株已于2014年9月1日专利保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC9630，在公开号为CN 106164260A的发明专利中已经公开。
以pET28a-CpAR2为模板，设计正反向引物：
正向引物CpAR2_Nde I_F
(5’-GGAATTCCATATGACAGTATTTGTCTCAGGTGC-3’)
反向引物CpAR2_EcoR I_R
(5’-CCGGAATTCTTACTTGGCATCGAGAAGTTGTTT-3’)
利用聚合酶链式反应(PCR)技术，通过rTaq酶对目的核苷酸片段进行易错PCR扩增。将获得的具有一定碱基错配几率的CpAR2基因DNA片段分别用限制性内切酶EcoR I和Nde I双酶切，随后与同样经过限制性内切酶EcoR I和Nde I双酶切的质粒pET28a进行连接，获得ε-酮酯还原酶CpAR2的随机突变重组质粒库。将重组质粒库转化到大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中，均匀涂布于含有50μg mL-1卡那霉素的LB培养基琼脂平板。37℃过夜培养后，得到ε-酮酯还原酶CpAR2的易错PCR随机突变库。
用灭菌牙签挑取突变库的单克隆，接种至每孔含有200μL LB培养基的96孔深孔板中，37℃、220rpm培养过夜，然后接种20μL至每孔含有400μL LB培养基的96孔深孔板中，37℃培养1.5～2.0h，在OD600达到1～2后，加入50μL含有IPTG(终浓度为0.2mM)的LB培养基，16℃诱导24h后，2400×g离心10min收集细胞，倒掉上清液，细胞沉淀在-80℃冷冻，然后在室温解冻，随后每孔加入200μL裂解液(含750mg/L溶菌酶和10mg/L DNase I),于振荡器上剧烈振荡悬浮细胞，然后置于37℃、220rpm摇床，保温振荡反应2h，2400×g离心10min。每孔吸取50μL上清酶液至96孔酶标板中，再加入150μL反应液(100mM Tris-HCl缓冲液，pH7.0，含0.2mM NADPH，2mM底物ECOO)，置于酶标仪中检测340nm下吸光值的变化ΔA，计算NADPH的消耗量。挑取ΔA明显高于母本的突变体，镍柱纯化后进行复筛。经过2轮易错PCR随机突变库的筛选后，将活力高、热稳定性好的正突变体委托上海赛音生物技术有限公司进行序列测定，根据该核苷酸序列所推测的氨基酸序列，结果表明活性提高的突变体中第131位丝氨酸突变为亮氨酸，在此基础上热稳定性改善的突变体中第252位谷氨酰胺突变为异亮氨酸，这两个突变体分别命名为CpAR2S131L和CpAR2S131L/Q252I。
实施例2 131位丝氨酸的定点饱和突变
采用MEGAWHOP(Megaprimer PCR of Whole Plasmid)方法进行操作。PCR设计引物如表1。
表1 131位定点饱和突变的全质粒扩增PCR引物
以重组表达质粒pET28a-CpAR2为模板，进行全质粒PCR定点突变。
所述定点突变的PCR扩增反应体系(50μL)为：重组质粒模板1ng，一对突变引物各0.25μM，0.2mM dNTPs和25μL PrimeSTAR HS DNA Polymerase(1.25U/25μL)(TAKARA，JAPAN)，加灭菌蒸馏水至50μL。PCR反应程序：(1)98℃预变性3min；(2)98℃变性10sec，(3)55℃退火5s，(4)72℃延伸6min，步骤(2)～(4)共进行30个循环，最后72℃延伸5min，4℃保存产物。扩增得到的PCR产物在37℃经内切酶Dpn I消化2h后转化E.coli BL21感受态细胞，并均匀涂布于含有50μg mL-1卡那霉素的LB培养基琼脂平板。37℃过夜培养后，挑选单克隆，委托上海赛音生物技术有限公司进行序列测定，结果表明131位丝氨酸成功地突变为除了亮氨酸以外的其他15种氨基酸。
对定点突变体进行活力测定，结果见表2，将CpAR2的131位的丝氨酸残基分别替换为酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和亮氨酸等其他9个氨基酸时，突变体的活性都得到了提高。
表2 CpAR2及突变体纯酶对ECOO的活力
实施例3 CpAR2的定点突变
在实施例1中获得的热稳定性得到改善的突变体CpAR2S131L/Q252I的基础上，分别采用实施例2中所述的引物对S131Y_For、S131Y_Rev和S131F_For、S131F_Rev作为引物，以重组表达质粒pET28a-CpAR2S131L/Q252I作为模板，进行全质粒PCR定点突变，将其中的131位氨基酸残基分别定点突变为酪氨酸和苯丙氨酸。
所述定点突变的PCR扩增反应体系(50μL)为：重组质粒模板1ng，一对突变引物各0.25μM，0.2mM dNTPs和25μL PrimeSTAR HS DNA Polymerase(1.25U/25μL)(TAKARA，JAPAN)，加灭菌蒸馏水至50μL。PCR反应程序：(1)98℃预变性3min；(2)98℃变性10sec，(3)55℃退火5s，(4)72℃延伸6min，步骤(2)～(4)共进行30个循环，最后72℃延伸5min，4℃保存产物。扩增得到的PCR产物在37℃经内切酶Dpn I消化2h后转化E.coli BL21感受态细胞，并均匀涂布于含有50μg mL-1卡那霉素的LB培养基琼脂平板。37℃过夜培养后，挑选单克隆，委托上海赛音生物技术有限公司进行序列测定，获得目标突变体。
实施例4 CpAR2突变体的制备纯化及纯酶活力测定
将实施例1-3构建的含有ε-酮酯还原酶突变体基因的重组大肠杆菌，接种至含50μg mL-1硫酸卡那霉素的LB培养基(蛋白胨10g L-1，酵母膏5g L-1，NaCl10g L-1，pH7.0)中，按1％(v/v)的接种量接入装有100mL LB培养基的500mL三角瓶中，置于37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD600达到0.6左右时，加入终浓度为0.2mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂，16℃诱导24h后，将培养液离心，收集细胞，将所得的细胞悬浮于15mL的Tris-HCl缓冲液((20mM,pH7.4)中，在冰浴中超声破碎，离心收集上清液，即得到重组ε-酮酯还原酶突变体的粗酶液。
使用Ni亲和层析柱纯化CpAR2突变体蛋白，具体方法如下：
(1)用5～10个柱体积的A液(20mM Tris-HCl缓冲液,pH7.4，含有0.5M NaCl和10mM咪唑)平衡Ni层析柱；
(2)将所得的粗酶液上样到Ni层析柱；
(3)用5～10个柱体积的5％B液(20mM Tris-HCl缓冲液,pH7.4，含有0.5M NaCl、35mM咪唑)洗脱，冲去非特异性结合的杂蛋白；
(4)用5～10个柱体积的30％B液(20mM Tris-HCl缓冲液,pH7.4，含有0.5M NaCl、157mM咪唑)洗脱，洗脱特异性结合的目的蛋白；
(5)用10kDa的超滤管，2400×g离心浓缩目的蛋白洗脱液，浓缩至1mL左右，加20mLC液(25mM Tris-HCl缓冲液,pH7.4，含有0.15M NaCl和1mM DTT)，2400×g离心，置换除去高浓度的NaCl和咪唑，置换3次，-80℃冻存备用。
纯化后的蛋白用SDS-PAGE蛋白电泳分析，目的蛋白的分子量大小约为37kDa。
分别测定了CpAR2各突变体纯酶针对底物ECOO的活力，反应体系：200mM Tris-HCl(pH7.0)、8mM底物ECOO，0.1mM辅酶NADPH，及适量的ε-酮酯还原酶CpAR2突变体，30℃反应。通过分光光度计或酶标仪检测辅酶NADPH在特征吸收峰340nm波长处的吸光度变化来计算ε-酮酯还原酶突变体的活力。一个酶活单位(U)的定义为在上述反应条件下，每分钟催化还原1.0μmol的ECOO所需要的酶量。活力测定结果如表3所示，表中所列的几个突变体的活力均得到了一定的提高。其中突变体CpAR2S131Y的活力最高，为母本的两倍。
表3 CpAR2及突变体纯酶对ECOO的活力
实施例5 CpAR2突变体的热稳定性表征
为表征CpAR2突变体的热稳定性，测定了CpAR2及其突变体的
值、半衰期half-life和Tm值。
半衰期half-life是将一定浓度的纯酶液(通常1.0mg/mL)置于40℃水浴锅中保温，间歇取样测定残余活力。将残余活力数值取对数后与保温时间进行线性拟合。按照Eq.1和Eq.2，计算不同温度下酶的失活速率常数(kD)，从而计算得到半衰期(t1/2)：
一级失活方程：
失活半衰期：
Tm值是将酶液适当稀释至0.3mg/mL，使圆二色谱的响应值在合适的范围内，优化温度升高范围(最终确定为25～60℃)，使在升温后期蛋白质大部分发生解链，再经过软件处理，可以直接得到蛋白解链一半时的温度。
测定结果如表4所示。
表4 CpAR2及突变体的热稳定性表征结果
综合热稳定性表征的结果，所述CpAR2突变体不仅活力得到了提高，而且热稳定性也得到了一定程度的改善，其中热稳定性表现最佳的为CpAR2S131L/Q252I，
较母本提高了5.3℃。
实施例6 CpAR2S131Y/Q252I催化ECOO的不对称还原反应
9.5mL Tris-HCl(pH 7.0,100mM)，0.5mL DMSO(助溶剂,5％v/v)，110g L-1底物(0.5mol/L)，135g L-1葡萄糖(0.75mol/L，1.5equiv.)，20kU L-1CpAR2S131Y/Q252I，20kU L-1BmGDH，外加终浓度为0.1mM的辅酶NADP+，于35℃下磁力搅拌开始反应，反应过程中通过自动电位滴定仪滴加K2CO3碱液(1mol/L)来控制反应液的pH在7.0左右，定时取样，用等体积的乙酸乙酯萃取后，用GC分析底物的转化率，在6h内底物完全转化为(R)-α-硫辛酸的合成前体(R)-8-氯-6-羟基辛酸乙酯(99％ee)。
气相分析条件：使用的色谱柱为GC/HP-5MS柱，进样口温度280℃，检测器温度280℃，柱温160℃恒温，底物出峰时间3.36min，产物出峰时间3.85min。
干燥的乙酸乙酯萃取液0.2mL，置于5mL具塞试管中，挥发除去溶剂，然后滴入2滴乙酸酐和2滴吡啶，置于沸水浴中反应1h，稍冷，加适量乙酸乙酯稀释。乙酰化后分析产物的光学纯度(ee)。气相分析条件：使用的色谱柱为GC/CP-Chirasil-Dex-CB柱，进样口温度280℃，检测器温度280℃，柱温160℃，R-构型产物出峰时间13.31min，S-构型产物出峰时间13.73min。
实施例7 CpAR2S131Y/Q252I催化ECOO的不对称还原反应
9.5mL Tris-HCl(pH7.0,100mM)，0.5mL DMSO(助溶剂,5％v/v)，440g L-1底物(2.0mol/L)，540g L-1葡萄糖(3.0mol/L，1.5equiv.)，200kU L-1CpAR2S131Y/Q252I，200kU L-1BmGDH，外加终浓度为0.1mM的辅酶NADP+，于40℃下磁力搅拌开始反应，反应过程中通过自动电位滴定仪滴加K2CO3碱液(1mol/L)来控制反应液的pH在7.0左右，定时取样，用等体积的乙酸乙酯萃取后，用GC分析底物的转化率，在5h内底物完全转化为(R)-α-硫辛酸的合成前体(R)-8-氯-6-羟基辛酸乙酯(99％ee)。
实施例8 CpAR2S131Y/Q252I与BmGDH共表达冻干细胞的制备
设计引物：
BmGDH-Sal I-F：
ACGCGTCGACAAGGAGATATA ATGTATAAAGATTTAGAAGG
BmGDH-Xho I-R：
CCGCTCGAGTTATCCGCGTCCTGCTTGGAAT
利用引物BmGDH-Sal I-F和BmGDH-Xho I-R对如序列表SEQ ID No.3所示的葡萄糖脱氢酶BmGDH的基因进行序列扩增，利用限制性内切酶Sal I和Xho I对扩增得到的DNA片段以及实施例3所述获得的质粒pET28a-CpAR2S131Y/Q252I分别进行双酶切，对酶切液进行琼脂糖凝胶电泳处理，回收目的片段，利用T4 DNA连接酶对酶切获得的BmGDH的DNA片段和质粒pET28a-CpAR2S131Y/Q252I片段进行连接，4℃连接过夜，得到重组表达质粒pET28a-CpAR2S131Y/Q252I-BmGDH，转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，得到重组ε-酮酯还原酶CpAR2S131Y/Q252I与BmGDH共表达的转化体。以1％接种量接种至含50μg mL-1硫酸卡那霉素的LB培养基试管中，于37℃培养过夜，以1％接种量接种至盛有50mL LB培养基(含50μg mL-1硫酸卡那霉素)的250mL小摇瓶中，37℃培养，待OD600达到1.0左右，将小摇瓶中的所有菌液接种至盛有600mL TB培养基(蛋白胨12g L-1，酵母粉24g L-1，甘油4mL L-1，磷酸钾缓冲液，50μg mL-1硫酸卡那霉素，pH7.0)的带挡板3-L大摇瓶中，37℃、200rpm扩大培养，待OD600达到0.6～0.8，加入终浓度为0.2mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂，16℃诱导24h后，12000×g离心10min收集细胞，将收集的菌体平摊在盘子里，放入-80℃冰箱冷冻过夜，再用冻干机进行冷冻干燥2～3天，即可得到冻干的双酶共表达大肠杆菌重组细胞，经检测，重组ε-酮酯还原酶CpAR2S131Y/Q252I的活力为32.1U/mg干细胞，BmGDH的活力为3.5U/mg干细胞。
实施例9 CpAR2S131Y/Q252I与BmGDH共表达冻干细胞的制备
设计引物：
BmGDH-Nde I-F：
GCAATTCCATATGTATAAAGATTTAGAAGGAAAAGTAG
BmGDH-EcoRI-R：
CCGGAATTCTTATCCGCGTCCTGCTTGGAATGATG
CpAR2-Sal I-F：
ACGCGTCGACAAGGAGATATAATGACAGTATTTGTCTCAGG
CpAR2-Xho I-R：
CCGCTCGAGTTACTTGGCATCGAGAAGTTGTTTAA
利用引物对CpAR2-Sal I-F、CpAR2-Xho I-R和BmGDH-Nde I-F、BmGDH-EcoRI-R对如实施例3获得的质粒pET28a-CpAR2S131Y/Q252I以及如序列表SEQ ID No.3所示的BmGDH核酸序列进行扩增，分别使用限制性内切酶Sal I和Xho I对获得的扩增CpAR2S131Y/Q252I的DNA片段以及pET28a质粒进行双酶切，对酶切液进行琼脂糖凝胶电泳处理，回收目的片段，利用T4DNA连接酶对酶切获得的CpAR2S131Y/Q252I的DNA片段和质粒pET28a片段进行连接，4℃连接过夜，转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取阳性克隆子，抽提质粒，再次使用限制性内切酶Nde I和EcoR I进行双酶切，然后与同样使用限制性内切酶Nde I和EcoR I进行双酶切的BmGDH扩增产物进行连接，4℃连接过夜，得到重组表达质粒pET28a-BmGDH-CpAR2S131Y/Q252I，转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，得到重组ε-酮酯还原酶CpAR2S131Y/Q252I与BmGDH共表达的转化体。以1％接种量接种至含50μg mL-1硫酸卡那霉素的LB培养基试管中，于37℃培养过夜，以1％接种量接种至盛有50mL LB培养基(含50μg mL-1硫酸卡那霉素)的250mL小摇瓶中，37℃培养，待OD600达到1.0左右，将小摇瓶中的所有菌液接种至盛有600mL TB培养基(蛋白胨12g L-1，酵母粉24g L-1，甘油4mL L-1，磷酸钾缓冲液，50μg mL-1硫酸卡那霉素，pH7.0)的带挡板3-L大摇瓶中，37℃、200rpm扩大培养，待OD600达到0.6～0.8，加入终浓度为0.2mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂，16℃诱导24h后，12000×g离心10min收集细胞，将收集的菌体平摊在盘子里，放入-80℃冰箱冷冻过夜，再用冻干机进行冷冻干燥2～3天，即可得到冻干的双酶共表达大肠杆菌重组细胞，经检测，重组ε-酮酯还原酶CpAR2S131Y/Q252I的活力为15.5U/mg干细胞，BmGDH的活力为6.5U/mg干细胞。
实施例10 CpAR2S131Y/Q252I与BmGDH共表达冻干细胞催化ECOO的不对称还原反应
9.5mL Tris-HCl(pH7.0,100mM)，0.5mL DMSO(助溶剂,5％v/v)，110g L-1底物(0.5mol/L)，135g L-1葡萄糖(0.75mol/L，1.5equiv.)，外加终浓度为0.1mM的辅酶NADP+和2g L-1如实施例8所述的CpAR2S131Y/Q252I-BmGDH冻干细胞，于35℃下磁力搅拌开始反应，反应过程中通过自动电位滴定仪滴加K2CO3碱液(1mol/L)来控制反应液的pH在7.0左右，定时取样，用等体积的乙酸乙酯萃取后，用GC分析底物的转化率，在4h内底物完全转化为(R)-α-硫辛酸的合成前体(R)-8-氯-6-羟基辛酸乙酯(99％ee)。反应结束后，反应液用等体积乙酸乙酯萃取3次，分离有机相，加入无水硫酸钠干燥过夜，旋转蒸发除去溶剂，获得0.96g(R)-ECHO，分离得率87％，比生产率为48.0g产品/g催化剂。
实施例11 CpAR2S131Y/Q252I与BmGDH共表达冻干细胞催化ECOO的不对称还原反应
9.5mL Tris-HCl(pH7.0,100mM)，0.5mL DMSO(助溶剂,5％v/v)，440g L-1底物(2.0mol/L)，540g L-1葡萄糖(3.0mol/L，1.5equiv.)，外加终浓度为0.1mM的辅酶NADP+和10L-1如实施例8所述的CpAR2S131Y/Q252I-BmGDH冻干细胞，于30℃下磁力搅拌开始反应，反应过程中通过自动电位滴定仪滴加K2CO3碱液(1mol/L)来控制反应液的pH在7.0左右，定时取样，用等体积的乙酸乙酯萃取后，用GC分析底物的转化率，在7h内底物完全转化为(R)-α-硫辛酸的合成前体(R)-8-氯-6-羟基辛酸乙酯(99％ee)。反应结束后，反应液用等体积乙酸乙酯萃取3次，分离有机相，加入无水硫酸钠干燥过夜，旋转蒸发除去溶剂，获得3.81g(R)-ECHO，分离得率86％，比生产率为38.1g产品/g催化剂。
实施例12 CpAR2S131Y/Q252I与BmGDH共表达冻干细胞催化ECOO的不对称还原反应
9.5mL Tris-HCl(pH7.0,100mM)，0.5mL DMSO(助溶剂,5％v/v)，220g L-1底物(1.0mol/L)，270g L-1葡萄糖(1.5mol/L，1.5equiv.)，外加终浓度为0.1mM的辅酶NADP+和5L-1如实施例8所述的CpAR2S131Y/Q252I-BmGDH冻干细胞，于40℃下磁力搅拌开始反应，反应过程中通过自动电位滴定仪滴加K2CO3碱液(1mol/L)来控制反应液的pH在7.0左右，定时取样，用等体积的乙酸乙酯萃取后，用GC分析底物的转化率，在7h内底物完全转化为(R)-α-硫辛酸的合成前体(R)-8-氯-6-羟基辛酸乙酯(99％ee)。反应结束后，反应液用等体积乙酸乙酯萃取3次，分离有机相，加入无水硫酸钠干燥过夜，旋转蒸发除去溶剂，获得1.84g(R)-ECHO，分离得率83％，比生产率为36.8g产品/g催化剂。
对比例1 CpAR2与BmGDH共表达冻干细胞催化ECOO的不对称还原反应
参照实施例8的条件，9.5mL Tris-HCl(pH7.0,100mM)，0.5mL DMSO(助溶剂,5％v/v)，110g L-1底物(0.5mol/L)，135g L-1葡萄糖(0.75mol/L，1.5equiv.)，外加终浓度为0.1mM的辅酶NADP+和2g L-1 CpAR2-BmGDH冻干细胞(参照公开发明专利CN 106164260A，重组ε-酮酯还原酶CpAR2和BmGDH的活力分别为17.7U/mg干细胞和3.5U/mg干细胞)，于35℃下磁力搅拌开始反应，反应过程中通过自动电位滴定仪滴加K2CO3碱液(1mol/L)来控制反应液的pH在7.0左右，定时取样，用等体积的乙酸乙酯萃取后，用GC分析底物的转化率。由于母本CpAR2的热稳定性相对较差，反应后期失活，转化22h，最终转化率仅有68％。
对比例2 CpAR2与BmGDH共表达冻干细胞催化ECOO的不对称还原反应
参照实施例8的条件，9.5mL Tris-HCl(pH7.0,100mM)，0.5mL DMSO(助溶剂,5％v/v)，110g L-1底物(0.5mol/L)，135g L-1葡萄糖(0.75mol/L，1.5equiv.)，外加终浓度为0.1mM的辅酶NADP+和5g L-1 CpAR2-BmGDH冻干细胞(参照公开发明专利CN 106164260A，重组ε-酮酯还原酶CpAR2和BmGDH的活力分别为17.7U/mg干细胞和3.5U/mg干细胞)，于35℃下磁力搅拌开始反应，反应过程中通过自动电位滴定仪滴加K2CO3碱液(1mol/L)来控制反应液的pH在7.0左右，定时取样，用等体积的乙酸乙酯萃取后，用GC分析底物的转化率。转化8h，转化率达到99％，分离获得产物0.92g，比生产率仅为18.4g产品/g催化剂。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华东理工大学；苏州百福安酶技术有限公司
<120> ε-酮酯还原酶突变体及其催化合成(R)-α-硫辛酸前体的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1002
<212> DNA
<213> ***滑假丝酵母菌(Candida parapsilosis)
<400> 1
atgacagtat ttgtctcagg tgcaacaggc ttcattgctc agcacgtagt taaggaactc 60
ttgagacaag gttttcaagt gattggttca gttagaacaa aaacaaaggg tgactatttg 120
tcgaagttaa tcagttcaaa gagtttttct tacgtggtgg tacctgatat cgcgtcaaaa 180
ggtgcctttg atcaggtttt acaagacaac gaaaatattg agagttttat tcacacagca 240
agtccagttg atttcgaagt tagtgatata caaactggtc ttttggatcc agcaatagag 300
ggaaccaaaa acgtgttgga agcaattgac aagtttggca gcaatgtaaa gagcatcgtt 360
gttacgtcgt caacatcggc tgttcgtgat tcaagcggca acagaccttc gaatagtaca 420
ttagaagaat ccgcttggaa tgaaatcacc attgagcaag gcttgaaaag cacgaggttg 480
ggttatgctg cagccaaaac ttttgctgag aaggaagttt ggaagtttgc taatgcacac 540
acgggtttca atgtgacaac cgtcaatcca acttttgtat ttggccctca agcgtacgag 600
gtaaaacata aagagaagct aaatgagtca gcagagatca tcaacaaagt tttgaacttg 660
agtccagatg acgctatccc tagacttacc ggattataca ttgatgtcag agatgtggca 720
aaagctcatg ttgctgctgt taaccaccca aatcagttca atgggcaaag gttgttactc 780
attgactcgg catggaccaa tgaacttctt gctgttatta ttaacaaaca ttttccaaat 840
gctgacattc caaaaggaag tattgagaaa agtgatgaag aattgaagaa agcaaatctg 900
aaatgggaca atgccaaaac taaaaagctt ttgggttttg agtttattcc acttgaaaaa 960
tcggtagttg acgcagttaa acaacttctc gatgccaagt aa 1002
<210> 2
<211> 333
<212> PRT
<213> ***滑假丝酵母菌(Candida parapsilosis)
<400> 2
Met Thr Val Phe Val Ser Gly Ala Thr Gly Phe Ile Ala Gln His Val
1 5 10 15
Val Lys Glu Leu Leu Arg Gln Gly Phe Gln Val Ile Gly Ser Val Arg
20 25 30
Thr Lys Thr Lys Gly Asp Tyr Leu Ser Lys Leu Ile Ser Ser Lys Ser
35 40 45
Phe Ser Tyr Val Val Val Pro Asp Ile Ala Ser Lys Gly Ala Phe Asp
50 55 60
Gln Val Leu Gln Asp Asn Glu Asn Ile Glu Ser Phe Ile His Thr Ala
65 70 75 80
Ser Pro Val Asp Phe Glu Val Ser Asp Ile Gln Thr Gly Leu Leu Asp
85 90 95
Pro Ala Ile Glu Gly Thr Lys Asn Val Leu Glu Ala Ile Asp Lys Phe
100 105 110
Gly Ser Asn Val Lys Ser Ile Val Val Thr Ser Ser Thr Ser Ala Val
115 120 125
Arg Asp Ser Ser Gly Asn Arg Pro Ser Asn Ser Thr Leu Glu Glu Ser
130 135 140
Ala Trp Asn Glu Ile Thr Ile Glu Gln Gly Leu Lys Ser Thr Arg Leu
145 150 155 160
Gly Tyr Ala Ala Ala Lys Thr Phe Ala Glu Lys Glu Val Trp Lys Phe
165 170 175
Ala Asn Ala His Thr Gly Phe Asn Val Thr Thr Val Asn Pro Thr Phe
180 185 190
Val Phe Gly Pro Gln Ala Tyr Glu Val Lys His Lys Glu Lys Leu Asn
195 200 205
Glu Ser Ala Glu Ile Ile Asn Lys Val Leu Asn Leu Ser Pro Asp Asp
210 215 220
Ala Ile Pro Arg Leu Thr Gly Leu Tyr Ile Asp Val Arg Asp Val Ala
225 230 235 240
Lys Ala His Val Ala Ala Val Asn His Pro Asn Gln Phe Asn Gly Gln
245 250 255
Arg Leu Leu Leu Ile Asp Ser Ala Trp Thr Asn Glu Leu Leu Ala Val
260 265 270
Ile Ile Asn Lys His Phe Pro Asn Ala Asp Ile Pro Lys Gly Ser Ile
275 280 285
Glu Lys Ser Asp Glu Glu Leu Lys Lys Ala Asn Leu Lys Trp Asp Asn
290 295 300
Ala Lys Thr Lys Lys Leu Leu Gly Phe Glu Phe Ile Pro Leu Glu Lys
305 310 315 320
Ser Val Val Asp Ala Val Lys Gln Leu Leu Asp Ala Lys
325 330
<210> 3
<211> 261
<212> PRT
<213> 巨大芽孢杆菌 (Bacillus megaterium)
<400> 3
Met Tyr Lys Asp Leu Glu Gly Lys Val Val Val Ile Thr Gly Ser Ser
1 5 10 15
Thr Gly Leu Gly Lys Ser Met Ala Ile Arg Phe Ala Thr Glu Lys Ala
20 25 30
Lys Val Val Val Asn Tyr Arg Ser Lys Glu Asp Glu Ala Asn Ser Val
35 40 45
Leu Glu Glu Ile Lys Arg Val Gly Gly Glu Ala Ile Ala Val Lys Gly
50 55 60
Asp Val Thr Val Glu Ser Asp Val Ile Asn Leu Val Gln Ser Ala Ile
65 70 75 80
Lys Glu Phe Gly Lys Leu Asp Val Met Ile Asn Asn Ala Gly Leu Glu
85 90 95
Asn Pro Val Ser Ser His Glu Met Ser Leu Ser Asp Trp Asn Lys Val
100 105 110
Ile Asp Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ser Arg Glu Ala Ile
115 120 125
Lys Tyr Phe Val Glu Asn Asp Ile Lys Gly Thr Val Ile Asn Met Ser
130 135 140
Ser Val His Glu Lys Ile Pro Trp Pro Leu Phe Val His Tyr Ala Ala
145 150 155 160
Ser Lys Gly Gly Met Lys Leu Met Thr Glu Thr Leu Ala Leu Glu Tyr
165 170 175
Ala Pro Lys Gly Ile Arg Val Asn Asn Ile Gly Pro Gly Ala Ile Asn
180 185 190
Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asp Pro Glu Gln Arg Ala Asp
195 200 205
Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Tyr Ile Gly Glu Pro Glu Glu Ile
210 215 220
Ala Ala Val Ala Ala Trp Leu Ala Ser Ser Glu Ala Ser Tyr Val Thr
225 230 235 240
Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Leu Tyr Pro Ser Phe
245 250 255
Gln Ala Gly Arg Gly
260
Claims (9)
1.一种ε-酮酯还原酶突变体，其特征在于，所述ε-酮酯还原酶突变体蛋白质的氨基酸序列选择如下序列之一：
(1) 将如SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的第131位丝氨酸替换为亮氨酸；
(2) 将如SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的第131位丝氨酸替换为苯丙氨酸；
(3) 将如SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的第131位丝氨酸替换为酪氨酸；
(4) 将如SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的第131位丝氨酸替换为酪氨酸，同时第252位谷氨酰胺替换为异亮氨酸；
(5) 将如SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的第131位丝氨酸替换为亮氨酸，同时第252位谷氨酰胺替换为异亮氨酸；
(6) 将如SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的第131位丝氨酸替换为苯丙氨酸，同时第252位谷氨酰胺替换为异亮氨酸。
2.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸是编码如权利要求1所述ε-酮酯还原酶突变体的核酸。
3.一种重组表达载体，其特征在于，包含如权利要求2所述的核酸。
4.一种重组表达转化体，其特征在于，包含如权利要求3所述的重组表达载体。
5.一种如权利要求1所述ε-酮酯还原酶突变体的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：培养如权利要求4所述的重组表达转化体，获得重组表达的ε-酮酯还原酶突变体。
6.一种如权利要求1所述ε-酮酯还原酶突变体与葡萄糖脱氢酶共表达的重组表达转化体。
7.一种如权利要求1所述ε-酮酯还原酶突变体或如权利要求4所述重组表达转化体催化8-氯-6-羰基辛酸乙酯不对称还原制备(R)-8-氯-6-羟基辛酸乙酯的应用，其特征在于，包括以下步骤：使用如权利要求1所述的ε-酮酯还原酶突变体或如权利要求4所述重组表达转化体作为催化剂，催化8-氯-6-羰基辛酸乙酯的不对称还原，然后采用常规化工分离方法，从反应液中提取、精制反应生成的光学纯手性ε-羟基酯(R)-ECHO。
8.一种如权利要求6所述ε-酮酯还原酶突变体与葡萄糖脱氢酶共表达的重组表达转化体催化8-氯-6-羰基辛酸乙酯不对称还原制备(R)-8-氯-6-羟基辛酸乙酯的应用，其特征在于，包括以下步骤：使用如权利要求6所述ε-酮酯还原酶突变体与葡萄糖脱氢酶共表达的重组表达转化体作为催化剂，催化8-氯-6-羰基辛酸乙酯的不对称还原，然后采用常规化工分离方法，从反应液中提取、精制反应生成的光学纯手性ε-羟基酯(R)-ECHO。
9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述ε-酮酯还原酶突变体的用量为20 ~ 200kU L−1，8-氯-6-羰基辛酸乙酯的浓度为0.5 ~ 2.0 M，反应温度为30 ~ 40°C。
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| CN110004119A (zh) | 2019-07-12 |
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