CN112695061A - 一种l-谷氨酸全营养流加高密度发酵的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于氨基酸发酵技术领域，公开了一种温度敏感型谷氨酸棒杆菌发酵生产L‑谷氨酸的全营养流加高密度发酵方法，包括：将温度敏感型谷氨酸棒杆菌接种到发酵液中，在其生长到对数期时，向发酵液中持续流加全营养培养基，所述全营养培养基包括钾盐、镁盐等无机盐离子和其他温度敏感型谷氨酸棒杆菌生长所需的各种生长因子。本发明在菌体的对数生长期开始流加全营养培养基，流加的全营养培养基能够及时弥补菌体因生长和生产而消耗的营养物质，使菌体始终处于最适发酵环境中，提高发酵液中菌体密度；同时，在发酵后期，全营养培养基的流加也能提高菌体活力，保证菌体的生产性能，从而L‑谷氨酸的产量。
Description
技术领域
本发明属于氨基酸发酵技术领域，涉及一种L-谷氨酸全营养流加高密度发酵的方法，具体涉及一种温度敏感型谷氨酸棒杆菌发酵生产L-谷氨酸的全营养流加高密度发酵方法。
背景技术
目前,我国的味精行业迅速发展，产量高居世界首位，年需求量达到了119万吨，同时，随着各类小食品、食品加工业冷藏盐渍食品和方便食品的不断增加，味精产品销路旺盛，市场潜力巨大，进而带动了谷氨酸行业的发展，据统计,全国谷氨酸产量近300万吨，并且生产规模有进一步增大的趋势。
温度敏感型谷氨酸棒杆菌是一种L-谷氨酸生产的新兴菌株，其具有在高温下能够使菌体细胞膜结构发生变化，从而增加细胞膜的通透性，使得L-谷氨酸得以分泌的特点，因此温度敏感型谷氨酸棒杆菌即使在高生物素条件下依旧能够进行L-谷氨酸发酵生产。目前，利用温度敏感型谷氨酸棒杆菌进行L-谷氨酸发酵的方法，主要是发酵前期将温度控制在28℃~33℃，使菌体快速增长；当发酵液中菌体OD600达到20~24时，将温度在30 min内提高至37℃~40℃，之后菌体进行适度的剩余生长，此时菌体开始在发酵液中大量积累L-谷氨酸。然而按照现有的生产方法进行生产时，初期温度敏感型谷氨酸棒杆菌生长速度较为缓慢OD600到达20~24的时间较长，后续剩余生长较少，菌体量小，影响L-谷氨酸产量，同时在发酵后期菌体活力会出现明显下降，进一步影响菌体生产L-谷氨酸的性能。
发明内容
针对上诉所提到的技术问题，本发明提供了一种L-谷氨酸全营养流加高密度发酵的方法。
一种L-谷氨酸全营养流加高密度发酵的方法，该方法包括：
（1）菌体活化：将保藏在-80℃冰箱中的温度敏感型谷氨酸棒杆菌接种到斜面上传代活化，传代两次。所述斜面培养基为蛋白胨5 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母粉4 g/L，玉米浆干粉25 mL/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.2 g/L，NaCl1 g/L，琼脂粉25 g/L，甲硫氨酸0.2 g/L，pH=6.8~7.0；
（2）种子培养：将活化好的菌株用无菌水洗脱，洗脱后全部接种到配置好的种子发酵液中进行种子培养。所述的种子培养基为：葡萄糖 40 g/L，玉米浆干粉 10 g/L，KH2PO42.g/L，MgSO4·7H2O0.8 g/L，MnSO45 mg/L，FeSO45 mg/L，苏氨酸1 g/L，VH10 mg/L。所述种子培养条件为：温度维持在32℃左右，溶氧控制在20~40%，pH通过氨水控制在7.0左右。
（3）发酵培养：当种子培养基中的菌体量（OD600）达到40以上时，按20%的接种量接种到发酵培养基中，当菌体达到对数生长期时，开始流加体积分数为40~80%的全营养培养基。所述的发酵培养基为葡萄糖60 g/L，玉米浆30 g/L，酵母膏5 g/L，豆粕水解液 20 mL/L，KH2PO42.5 g/L，MgSO4·7H2O1.2 g/L，KCL1 g/L，MnSO410 mg/L，FeSO410 mg/L，苏氨酸1g/L，甜菜碱1 g/L，VH3 mg/L，VB10.5 mg/L。
优选的，上述一种L-谷氨酸全营养流加高密度发酵的方法，所述的全营养培养基为：玉米浆干粉30 g/L，豆粕水解液30 mL/L，KH2PO42.5 g/L，MgSO4·7H2O1.2 g/L，KCL1 g/L，MnSO410 mg/L，FeSO410 mg/L，甲硫氨酸0.5 g/L，VH3 mg/L，VB10.5 mg/L。
优选的，上述一种L-谷氨酸全营养流加高密度发酵的方法，所述的对数生长期为菌体量（OD600）值为12~18左右。
优选的，上述一种L-谷氨酸全营养流加高密度发酵的方法，所述的全营养培养基流加方式为恒速流加。
优选的，上述一种L-谷氨酸全营养流加高密度发酵的方法，所述的流加时间为在发酵结束前4-8 h时停止流加全营养培养基。
优选的，上述一种L-谷氨酸全营养流加高密度发酵的方法，所述的发酵条件为：发酵初始温度为32℃，当发酵液中菌体量（OD600）达到28时，将温度在30 min内升至37.5℃，1h后升温至38℃；通过控制转速和通风将溶氧控制在20~40%；通过氨水控制pH在7.0左右。
优选的，上述一种L-谷氨酸全营养流加高密度发酵的方法，所述菌株为温度敏感型谷氨酸棒杆菌
有益效果：
上述L-谷氨酸全营养流加高密度发酵的方法，通过发酵前期的全营养流加及时弥补菌体生长所消耗的营养物质，使得菌体一直处于最适的发酵环境中，加快菌体的生长速度，增大菌体量，同时由于温度的转变，菌体需要进行一定的适度生长，流加的全营养培养基能够为菌体提供足够的营养物质，使菌体量进一步提高和更快进入产酸阶段，实现高密度发酵；随着发酵的进行，菌体在发酵后期活力逐渐下降，代谢出现异常，进而导致杂酸的产生，此时的全营养流加能够缓解菌体衰老的速度，稳定代谢流，提高L-谷氨酸产量。综上所述，上述的L-谷氨酸全营养流加高密度发酵的方法有效的解决了温度敏感型谷氨酸棒杆菌在进行L-谷氨酸发酵时，前期菌体生长缓慢，转型时间长，剩余生长少以及发酵后期菌体活力下降导致的L-谷氨酸产量下降，杂酸含量升高的问题。
具体实施方式
下面将具体实施方法对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
（1）菌体活化：将保藏在-80℃冰箱中的温度敏感型谷氨酸棒杆菌（GKG-047,保藏编号CGMCC No.5481）接种到斜面上传代活化，传代两次。
所述斜面培养基为蛋白胨5 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母粉4 g/L，玉米浆干粉25 mL/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.2 g/L，NaCl1 g/L，琼脂粉25 g/L，甲硫氨酸0.2 g/L，pH=6.8~7.0；
（2）种子培养：将活化好的菌株用无菌水洗脱，洗脱后全部接种到配置好的种子发酵液中进行种子培养。
所述的种子培养基为：葡萄糖 40 g/L，玉米浆干粉 10 g/L，KH2PO42. g/L，MgSO4·7H2O0.8 g/L，MnSO45 mg/L，FeSO45 mg/L，苏氨酸1 g/L，VH10 mg/L。
所述种子培养条件为：温度维持在32℃左右，溶氧控制在20~40%，pH通过氨水控制在7.0左右。
（3）发酵培养：当种子培养基中的菌体量（OD600）达到40以上时，按20%的接种量接种到5 L发酵罐的发酵培养基中，当菌体达到15时，开始流加体积分数为60%的全营养培养基，流加至发酵结束前4~8 h停止。
所述的发酵培养基为葡萄糖60 g/L，玉米浆30 g/L，酵母膏5 g/L，豆粕水解液 20mL/L，KH2PO42.5 g/L，MgSO4·7H2O1.2 g/L，KCL1 g/L，MnSO410 mg/L，FeSO410 mg/L，苏氨酸1g/L，甜菜碱1 g/L，VH3 mg/L，VB10.5 mg/L。
所述的全营养培养基为：玉米浆干粉30 g/L，豆粕水解液30 mL/L，KH2PO42.5 g/L，MgSO4·7H2O1.2 g/L，KCL1 g/L，MnSO410 mg/L，FeSO410 mg/L，甲硫氨酸0.5 g/L，VH3 mg/L，VB10.5 mg/L。
所述的发酵条件为：发酵初始温度为32℃，当发酵液中菌体量（OD600）达到28时，将温度在30 min内升至37.5℃，1 h后升温至38℃；通过控制转速和通风将溶氧控制在20~40%；通过氨水控制pH在7.0左右。
上述豆粕水解液制备方法为：20％豆粕溶液在90℃下预热处理10min后，在水解工艺为温度40℃、pH3、酸性蛋白酶添加量20000U/g（以干豆粕计），水解时间3h时，灭酶。
实施例2
参照实施例1，不同之处在于当菌体达到12时，开始流加体积分数为60%的全营养培养基。
实施例3
参照实施例1，不同之处在于当菌体达到18时，开始流加体积分数为60%的全营养培养基。
实施例4
参照实施例1，不同之处在于流加的全营养培养基的体积分数为40%的全营养培养基。
实施例5
参照实施例1，不同之处在于流加的全营养培养基的体积分数为80%的全营养培养基。
实施例6
参照实施例1，不同之处在于不采用全营养流加策略。
表1实施例生物量、L-谷氨酸产量和糖酸转化率对比指标
| 最大菌体量(OD<sub>600</sub>) | 最终菌体量（OD<sub>600</sub>） | L-谷氨酸产量（g/L） | 耗糖量（g/L） | 糖酸转化率高（%） | |
| 实施例1 | 36.2 | 34 | 261 | 360.3 | 72.5 |
| 实施例2 | 32.1 | 29.5 | 225 | 316 | 71.2 |
| 实施例3 | 34.3 | 32.1 | 239 | 333.8 | 71.6 |
| 实施例4 | 34.1 | 30.8 | 237 | 328.7 | 72.1 |
| 实施例5 | 35.6 | 32.9 | 249 | 344.4 | 72.3 |
| 实施例6 | 30 | 26 | 209 | 282.4 | 71 |
由表1可知，通过对实施例1、实施例2和实施例3进行单因素试验来探究最优流加时间时发现，实施例1，即当菌体量（OD600）达到15时，开始流加全营养培养基效果最好。流加时间太早，发酵液中的营养物质消耗的不多，后续补充的营养物质会造成高渗透压和富营养环境，不利于菌体的生长；流加时间太晚，菌体后续的生长潜力不足，转型时间延长，菌体产酸。为了探究流加的全营养培养基的最适体积百分比，通过实施例1、实施例4和实施例5的对比发现，当全营养培养基的流加体积百分比为60%时，对菌体增长和L-谷氨酸生产效果最好。流加的体积百分比太大时，过于充沛的营养物质会带来底物抑制和高渗透压环境，不利于菌体的生长代谢；流加的体积百分比太低时，流加的全营养培养基不足以弥补菌体生长和生产所消耗的营养物质，进而影响菌体增长和产酸。通过对实施例1和实施例6的对比发现，采用全营养流加策略的最大菌体量为36.2，最终菌体量为34，下降幅度为6.1%，L-谷氨酸产量达到了261 g/L，糖酸转化率为72.5%，相较于不采用全营养流加的常规发酵方法有了很大的提高。因此，全营养培养基的流加在加快菌体增长，延缓菌体衰老和增大L-谷氨酸产量方面有明显的积极作用。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方式对本案作了详尽的说明，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所作的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种L-谷氨酸全营养流加高密度发酵的方法，其特征在于，所述方法包括：
菌体活化：将保藏在-80℃冰箱中的温度敏感型谷氨酸棒杆菌接种到斜面培养基上传代活化，传代两次；
种子培养：将活化好的菌株用无菌水洗脱，洗脱后全部接种到配置好的种子培养基中进行种子培养；所述种子培养条件为：温度维持在32℃左右，溶氧控制在20~40%，pH通过氨水控制在7.0左右；
发酵培养：当种子培养基中的菌体量OD600达到40以上时，按20%的接种量接种到发酵培养基中，当菌体达到对数生长期时，开始流加体积分数为40~80%的全营养培养基。
2.根据权利要求1所述的一种L-谷氨酸全营养流加高密度发酵的方法，其特征在于：所述的全营养培养基为：玉米浆干粉30 g/L，豆粕水解液20 mL/L，KH2PO42.5 g/L，MgSO4·7H2O1.2 g/L，KCl 1 g/L，MnSO410 mg/L，FeSO410 mg/L，甲硫氨酸0.5 g/L，VH3 mg/L，VB10.5mg/L。
3.根据权利要求1所述的一种L-谷氨酸全营养流加高密度发酵的方法，其特征在于：所述的对数生长期的菌体量OD600值为12~18左右。
4.根据权利要求1所述的一种L-谷氨酸全营养流加高密度发酵的方法，其特征在于：所述的全营养培养基的流加方式为恒速流加。
5.根据权利要求1所述的一种L-谷氨酸全营养流加高密度发酵的方法，其特征在于：所述的流加时间为在发酵结束前4-8h停止流加全营养培养基。
6.根据权利要求1所述的一种L-谷氨酸全营养流加高密度发酵的方法，其特征在于：所述的发酵条件为：发酵初始温度为32℃，当发酵液中菌体量OD600达到28时，将温度在30 min内升至37.5℃，1h后升温至38℃；通过控制转速和通风将溶氧控制在20~40%；通过氨水控制pH在7.0左右。
7.根据权利要求1所述的一种L-谷氨酸全营养流加高密度发酵的方法，其特征在于：所述菌株为温度敏感型谷氨酸棒杆菌。
8.根据权利要求1所述的一种L-谷氨酸全营养流加高密度发酵的方法，其特征在于：所述斜面培养基为蛋白胨5 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母粉4 g/L，玉米浆干粉25 mL/L，KH2PO41g/L，MgSO40.2 g/L，NaCl 1 g/L，琼脂粉25 g/L，甲硫氨酸0.2 g/L，pH=6.8~7.0。
9.根据权利要求1所述的一种L-谷氨酸全营养流加高密度发酵的方法，其特征在于：所述的种子培养基为：葡萄糖 40 g/L，玉米浆干粉 10 g/L，KH2PO42. g/L，MgSO4·7H2O0.8g/L，MnSO45 mg/L，FeSO45 mg/L，苏氨酸1 g/L，VH10 mg/L。
10.根据权利要求1所述的一种L-谷氨酸全营养流加高密度发酵的方法，其特征在于：所述的发酵培养基为：葡萄糖60 g/L，玉米浆30 g/L，酵母膏5 g/L，豆粕水解液 20 mL/L，KH2PO42.5 g/L，MgSO4·7H2O1.2 g/L，KCl 1 g/L，MnSO410 mg/L，FeSO410 mg/L，苏氨酸 1g/L，甜菜碱1 g/L，VH3 mg/L，VB10.5 mg/L。
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