CN113278554B - 一种利用混菌生物膜提高乳酸菌耐酸能力的方法 - Google Patents

一种利用混菌生物膜提高乳酸菌耐酸能力的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用混菌生物膜提高乳酸菌耐酸能力的方法，依次包括制备乳酸菌培养基和酵母菌培养基；分别利用乳酸菌培养基和酵母菌培养基对乳酸菌和酵母菌进行培养，得乳酸菌和酵母菌种子液；将乳酸菌和酵母菌种子液按比例接种乳酸菌培养基，混合，培养混菌生物膜；对混菌生物膜进行乳酸菌酸胁迫处理几个步骤。利用乳酸菌与酵母菌共培养下的混菌生物膜保护乳酸菌免受酸胁迫，混菌生物膜中乳酸菌经酸胁迫后存活率明显高于单菌生物膜中乳酸菌的存活率。本发明可用于乳酸菌抗逆能力的提高，保障乳酸菌在酸性条件下的生物量和代谢能力。解决了现有技术中单菌生物膜培养的乳酸菌经酸胁迫处理后存活率低，影响传统发酵食品生产效率的问题。

Description

一种利用混菌生物膜提高乳酸菌耐酸能力的方法
技术领域
本发明涉及一种提高乳酸菌耐酸能力的方法，具体涉及一种利用混菌生物膜提高乳酸菌耐酸能力的方法。
背景技术
嗜盐四联球菌作为一种嗜盐乳酸菌，广泛存在于高盐发酵食品如酱油、果酱等的生产中。嗜盐四联球菌也是发酵生产中的重要菌株之一，是产生挥发性物质的主要微生物，具有促进产品香味成分的生成，改善产品品质和口感等功能。鲁氏酵母菌属于酵母科中的接合酵母属，是传统发酵重要的生产菌，广泛存在于酱油、豆瓣等盐渍食品中。鲁氏酵母在酱油的发酵期发挥重要作用，主要产生乙醇、高级醇等风味物质，鲁氏酵母中的谷氨酰胺酶能转化底物生成谷氨酸而增强酱油的鲜味，对调味品的风味发酵起着积极作用。
在传统发酵食品的生产过程中，原料中大分子物质在微生物作用下的水解和乳酸菌等产酸细菌的繁殖代谢会使得乳酸、醋酸、氨基酸等酸性物质在发酵体系中积累，降低体系中的pH值。一般来说，为了生长和生存，细菌需要pH值在4到8之间。一些酸能够以非解离的形式被动扩散进入细胞，产生自由质子。酸度的提高导致细胞的生长和代谢受到抑制，进而影响嘌呤碱基的完整性，导致细胞内必需酶变，从而影响食品生产的效率。
现有技术中，还未能实现利用乳酸菌和酵母菌配制混菌生物膜来提高乳酸菌耐酸能力的方法。而近年来，有益微生物受到越来越多的关注，乳酸菌生物膜形成能力的研究也越来越多。生物膜的形成不仅可以提高乳酸菌在原料表面的粘附利用繁殖代谢，也可以保护细胞免受多种不利环境因素包括酸的胁迫。此外，有研究表明乳酸菌和酵母菌的共培养能有效提高两种微生物的生物量和代谢能力。因此，需要利用乳酸菌与酵母菌共培养下的混菌生物膜制备出耐酸能力高的乳酸菌以解决上述技术问题。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供一种利用混菌生物膜提高乳酸菌耐酸能力的方法，以解决现有技术中单菌生物膜培养的乳酸菌经酸胁迫处理后存活率低，影响传统发酵食品生产效率的问题。
为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：提供一种利用混菌生物膜提高乳酸菌耐酸能力的方法，包括以下步骤：
S1：制备乳酸菌培养基和酵母菌培养基，乳酸菌培养基包括蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、葡萄糖、山梨醇单油酸酯、磷酸氢二钾、三水乙酸钠、柠檬酸三铵、七水合硫酸镁、四水合硫酸锰和氯化钠；
酵母菌培养基包括酵母粉、蛋白胨、葡萄糖和氯化钠；
S2：分别利用乳酸菌培养基和酵母菌培养基对乳酸菌和酵母菌进行培养，得乳酸菌和酵母菌种子液；
S3：将乳酸菌和酵母菌种子液按比例接种乳酸菌培养基，混合，培养混菌生物膜；
S4：对混菌生物膜进行乳酸菌酸胁迫处理。
本技术方案方法简单、便于操作，可用于乳酸菌抗逆能力的提高。将乳酸菌和酵母菌共培养有效提高两种微生物的生物量和代谢能力，采用酵母菌与乳酸菌共培养下的混菌生物膜保护乳酸菌免受酸胁迫，保障乳酸菌在酸性条件下的生物量和代谢能力，进一步提高食品发酵效率，对传统发酵食品生产具有着重要意义。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，乳酸菌培养基的pH为6.0～6.4，各组分的浓度为：蛋白胨8～12g/L，牛肉膏6～10g/L，酵母粉2～6g/L，葡萄糖18～22g/L，山梨醇单油酸酯0.08～0.12v/v％，磷酸氢二钾1～3g/L，三水乙酸钠3～7g/L，柠檬酸三铵1～3g/L，七水合硫酸镁0.1～0.3g/L，四水合硫酸锰0.1～0.3g/L，氯化钠55～65g/L；酵母菌培养基的pH为5.8～6.2，各组分的浓度为：酵母粉8～12g/L，蛋白胨18～22g/L，葡萄糖18～22g/L，氯化钠55～65g/L。
进一步，乳酸菌培养基的pH优选为6.2，各组分的浓度优选为：蛋白胨10g/L，牛肉膏8g/L，酵母粉4g/L，葡萄糖20g/L，山梨醇单油酸酯0.1v/v％，磷酸氢二钾2g/L，三水乙酸钠5g/L，柠檬酸三铵2g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，四水合硫酸锰0.2g/L，氯化钠60g/L；酵母菌培养基的pH优选为6.0，各组分的浓度优选为：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，氯化钠60g/L。
进一步，S2中种子液的培养包括以下步骤：
分别取-80℃下保藏的乳酸菌和酵母菌，按18～22％的接种量分别接种于4～6mL所述乳酸菌培养基和所述酵母菌培养基中，在温度为25～35℃的状态下静置培养24h，即得。
进一步，S2中种子液的培养优选步骤为：
分别取-80℃下保藏的乳酸菌和酵母菌，按20％的接种量分别接种于5mL乳酸菌培养基和酵母菌培养基中，在温度为30℃的状态下静置培养24h，即得。
进一步，乳酸菌为嗜盐四联球菌Tetragenococcus halophilus CGMCC 3792，酵母菌为鲁氏酵母Zygosaccharomyces rouxii CGMCC 3791。这两种菌种广泛应用于生活调味品中，对调味品的风味调节以及发酵具有重要意义，选用这两种菌种作为混菌膜的培养更具有实际生活应用价值。嗜盐四联球菌保藏于CGMCC-中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.3792，保藏日期为2010年04月29日，分类命名为Tetragenococcus haiophilus SZ-B-2；鲁氏酵母保藏于CGMCC-中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.3791，保藏日期为2010年04月29日，分类命名为Zygosaccharomyces rouxii SZ-1。
进一步，S3中混菌生物膜的培养包括以下步骤：
将乳酸菌种子液、酵母菌种子液和乳酸菌培养基按1:0.4～0.6:90～110的体积比混匀，取3mL混匀液到5mL离心管中静置培养48h，即得。
进一步，S3中混菌生物膜的培养步骤优选为：
将乳酸菌种子液、酵母菌种子液和乳酸菌培养基按1:0.5:100的体积比混匀，取3mL混匀液到5mL离心管中静置培养48h，即得。
进一步，S4中乳酸菌酸胁迫处理包括以下步骤：
移除混菌生物膜上层发酵液，加入乳酸菌培养基中，于30℃下静置胁迫90min；乳酸菌培养基的pH为4.1～4.3。
本发明的有益效果是：本发明利用混菌生物膜提高乳酸菌耐酸能力，优选乳酸菌为嗜盐四联球菌，优选鲁氏酵母作为酵母菌进行制备，采用适当的配比和接种方式制备乳酸菌培养基和酵母菌培养基，乳酸菌和酵母菌种子液，乳酸菌和酵母菌混菌生物膜和经酸胁迫处理后的乳酸菌菌落，方法简单、便于操作，有效提高了乳酸菌的抗逆能力，并且混菌生物膜中乳酸菌经酸胁迫后存活率明显高于单菌生物法膜中乳酸菌的存活率，进一步提高了食品发酵业的工业生产能力和产品品质。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
实施例1：
一种利用混菌生物膜提高乳酸菌耐酸能力的方法，包括以下步骤：
S1：制备乳酸菌培养基和酵母菌培养基。制备乳酸菌培养基：乳酸菌培养基的pH为6.2，各组分的浓度为：蛋白胨10g/L，牛肉膏8g/L，酵母粉4g/L，葡萄糖20g/L，山梨醇单油酸酯0.1v/v％，磷酸氢二钾2g/L，三水乙酸钠5g/L，柠檬酸三铵2g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，四水合硫酸锰0.2g/L，氯化钠60g/L；制备酵母菌培养基：酵母菌培养基的pH为6.0，各组分的浓度为：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，氯化钠60g/L。
S2：分别利用乳酸菌培养基和酵母菌培养基对乳酸菌和酵母菌进行培养，得乳酸菌和酵母菌种子液。分别取-80℃下保藏的乳酸菌和酵母菌按20％的接种量分别接种于5mL乳酸菌培养基和酵母菌培养基中，在温度为30℃的状态下静置培养24h，即得。其中，乳酸菌为嗜盐四联球菌Tetragenococcus halophilus CGMCC 3792；酵母菌为鲁氏酵母Zygosaccharomyces rouxii CGMCC 3791。
S3：将乳酸菌和酵母菌种子液按比例接种乳酸菌培养基，混合，培养混菌生物膜。取S2制备的乳酸菌种子液1mL和酵母菌种子液0.5mL接种于100mL S1中制得的乳酸菌培养基中，混匀。各取3mL混匀液到2组5mL离心管中静置培养48h即得到乳酸菌混菌生物膜。
S4：对混菌生物膜进行乳酸菌酸胁迫处理。移除S3所制得的单菌生物膜上层发酵液，1组混菌生物膜中加入3mL S1所制得的乳酸菌培养基，乳酸菌培养基采用盐酸调节pH为4.15；1组混菌生物膜中加入3mL S1所制得的乳酸菌培养基(即自然pH乳酸菌培养基)，于30℃下静置胁迫90min。
实施例2：
一种利用混菌生物膜提高乳酸菌耐酸能力的方法，包括以下步骤：
S1：制备乳酸菌培养基和酵母菌培养基。制备乳酸菌培养基：乳酸菌培养基的pH为6.0，各组分的浓度为：蛋白胨8g/L，牛肉膏6g/L，酵母粉2g/L，葡萄糖18g/L，山梨醇单油酸酯0.08v/v％，磷酸氢二钾1g/L，三水乙酸钠3g/L，柠檬酸三铵1g/L，七水合硫酸镁0.1g/L，四水合硫酸锰0.1g/L，氯化钠55g/L；制备酵母菌培养基：酵母菌培养基的pH为5.8，各组分的浓度为：酵母粉8g/L，蛋白胨18g/L，葡萄糖18g/L，氯化钠55g/L。
S2：分别利用乳酸菌培养基和酵母菌培养基对乳酸菌和酵母菌进行培养，得乳酸菌和酵母菌种子液。分别取-80℃下保藏的乳酸菌和酵母菌按18％的接种量分别接种于4mL乳酸菌培养基和酵母菌培养基中，在温度为25℃的状态下静置培养24h，即得。其中，乳酸菌为嗜盐四联球菌Tetragenococcus halophilus CGMCC 3792；酵母菌为鲁氏酵母Zygosaccharomyces rouxii CGMCC 3791。
S3：将乳酸菌和酵母菌种子液按比例接种乳酸菌培养基，混合，培养混菌生物膜。取S2制备的乳酸菌种子液1mL和酵母菌种子液0.4mL接种于90mL S1中制得的乳酸菌培养基中，混匀。各取3mL混匀液到2组5mL离心管中静置培养48h即得到乳酸菌混菌生物膜。
S4：对混菌生物膜进行乳酸菌酸胁迫处理。移除S3所制得的单菌生物膜上层发酵液，1组混菌生物膜中加入3mL S1所制得的乳酸菌培养基，乳酸菌培养基采用盐酸调节pH为4.1；1组混菌生物膜中加入3mL S1所制得的乳酸菌培养基(即自然pH乳酸菌培养基)，于30℃下静置胁迫90min。
实施例3：
一种利用混菌生物膜提高乳酸菌耐酸能力的方法，包括以下步骤：
S1：制备乳酸菌培养基和酵母菌培养基。制备乳酸菌培养基：乳酸菌培养基的pH为6.4，各组分的浓度为：蛋白胨12g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉6g/L，葡萄糖22g/L，山梨醇单油酸酯0.12v/v％，磷酸氢二钾3g/L，三水乙酸钠7g/L，柠檬酸三铵3g/L，七水合硫酸镁0.3g/L，四水合硫酸锰0.3g/L，氯化钠65g/L；制备酵母菌培养基：酵母菌培养基的pH为6.2，各组分的浓度为：酵母粉12g/L，蛋白胨22g/L，葡萄糖22g/L，氯化钠65g/L。
S2：分别利用乳酸菌培养基和酵母菌培养基对乳酸菌和酵母菌进行培养，得乳酸菌和酵母菌种子液。分别取-80℃下保藏的乳酸菌和酵母菌按22％的接种量分别接种于6mL乳酸菌培养基和酵母菌培养基中，在温度为35℃的状态下静置培养24h，即得。其中，乳酸菌为嗜盐四联球菌Tetragenococcus halophilus CGMCC 3792；酵母菌为鲁氏酵母Zygosaccharomyces rouxii CGMCC 3791。
S3：将乳酸菌和酵母菌种子液按比例接种乳酸菌培养基，混合，培养混菌生物膜。取S2制备的乳酸菌种子液1mL和酵母菌种子液0.6mL接种于110mL S1中制得的乳酸菌培养基中，混匀。各取3mL混匀液到2组5mL离心管中静置培养48h即得到乳酸菌混菌生物膜。
S4：对混菌生物膜进行乳酸菌酸胁迫处理。移除S3所制得的单菌生物膜上层发酵液，1组混菌生物膜中加入3mL S1所制得的乳酸菌培养基，乳酸菌培养基采用盐酸调节pH为4.3；1组混菌生物膜中加入3mL S1所制得的乳酸菌培养基(即自然pH乳酸菌培养基)，于30℃下静置胁迫90min。
实施例4(对比例)：
一种利用单菌生物膜提高乳酸菌耐酸能力的方法，包括以下步骤：
S1：制备乳酸菌培养基：乳酸菌培养基的pH为6.2，各组分的浓度为：蛋白胨10g/L，牛肉膏8g/L，酵母粉4g/L，葡萄糖20g/L，山梨醇单油酸酯0.1v/v％，磷酸氢二钾2g/L，三水乙酸钠5g/L，柠檬酸三铵2g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，四水合硫酸锰0.2g/L，氯化钠60g/L。
S2：利用乳酸菌培养基对乳酸菌进行培养，得乳酸菌种子液。取-80℃下保藏的乳酸菌按20％的接种量接种于5mL乳酸菌培养基中，在温度为30℃的状态下静置培养24h，即得。其中，乳酸菌为嗜盐四联球菌Tetragenococcus halophilus CGMCC 3792。
S3：培养单菌生物膜。取S2制备的乳酸菌种子液接种于100mL S1中制得的乳酸菌培养基中，混匀。各取3mL混匀液到2组5mL离心管中静置培养48h即得到乳酸菌单菌生物膜。
S4：对单菌生物膜进行乳酸菌酸胁迫处理。移除S3所制得的单菌生物膜上层发酵液，1组单菌生物膜中加入3ml S1所制得的乳酸菌培养基，乳酸菌培养基采用盐酸调节pH为4.15；1组单菌生物膜中加入3mL S1所制得的乳酸菌培养基(即自然pH乳酸菌培养基)，于30℃下静置胁迫90min。
将上述实施例中处理后的乳酸菌分别于8000rpm，4℃条件下离心洗涤3次，收集菌体，再重悬到1mL无菌水中稀释，吸取10μL稀释后的菌悬液接种到含0.005％制霉菌素的乳酸菌固体选择培养基上，30℃静置培养48h后计算乳酸菌菌落数。再计算其存活率，存活率计算过程以经自然pH乳酸菌培养基处理后乳酸菌菌落数为对照的菌落数。存活率计算公式为：
存活率(％)＝酸处理后菌落数(个/mL)/自然pH乳酸菌培养基处理后菌落数(个/mL)×100％
测试结果如下表1所示：
表1乳酸菌酸胁迫处理测试结果表
酸胁迫处理pH值 <![CDATA[静置培养时间(<sup>h</sup>)]]> 存活率(％)
实施例1 4.15 48 17.63
实施例2 4.10 48 13.19
Figure BDA0003080603960000091
由上表可知，现有技术中单菌生物膜培养的乳酸菌经酸胁迫处理后存活率低；而本发明所涉及的混菌生物膜培养的乳酸菌经酸胁迫处理后存活率明显高于普通单菌生物膜培养的乳酸菌存活率，混菌生物膜培养的乳酸菌经酸胁迫处理后的存活率可超单菌生物膜培养的乳酸菌经酸胁迫处理后的存活率两倍以上。本发明利用与酵母菌共培养下的混菌生物膜保护乳酸菌免受酸胁迫，保障乳酸菌在酸性条件下的生物量和代谢能力，进一步提高食品发酵效率，对传统发酵食品生产具有重要意义。
虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护。

Claims (8)

1.一种利用混菌生物膜提高乳酸菌耐酸能力的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：制备乳酸菌培养基和酵母菌培养基，所述乳酸菌培养基包括蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、葡萄糖、山梨醇单油酸酯、磷酸氢二钾、三水乙酸钠、柠檬酸三铵、七水合硫酸镁、四水合硫酸锰和氯化钠；
所述酵母菌培养基包括酵母粉、蛋白胨、葡萄糖和氯化钠；
S2：分别利用乳酸菌培养基和酵母菌培养基对乳酸菌和酵母菌进行培养，得乳酸菌和酵母菌种子液；所述乳酸菌为嗜盐四联球菌Tetragenococcus halophilus CGMCC 3792，所述酵母菌为鲁氏酵母Zygosaccharomyces rouxii CGMCC 3791；
S3：将乳酸菌和酵母菌种子液按比例接种乳酸菌培养基，混合，培养混菌生物膜；
S4：对混菌生物膜进行乳酸菌酸胁迫处理。
2. 根据权利要求1所述的利用混菌生物膜提高乳酸菌耐酸能力的方法，其特征在于：所述乳酸菌培养基的pH为6.0~6.4，各组分的浓度为：蛋白胨8~12 g/L，牛肉膏6~10 g/L，酵母粉2~6 g/L，葡萄糖18~22 g/L，山梨醇单油酸酯0.08~0.12 v/v%，磷酸氢二钾1~3 g/L，三水乙酸钠3~7 g/L，柠檬酸三铵1~3 g/L，七水合硫酸镁0.1~0.3 g/L，四水合硫酸锰0.1~0.3g/L，氯化钠55~65 g/L；所述酵母菌培养基的pH为5.8~6.2，各组分的浓度为：酵母粉8~12g/L，蛋白胨18~22 g/L，葡萄糖18~22 g/L，氯化钠55~65 g/L。
3. 根据权利要求2所述的利用混菌生物膜提高乳酸菌耐酸能力的方法，其特征在于：所述乳酸菌培养基的pH为6.2，各组分的浓度为：蛋白胨10 g/L，牛肉膏8 g/L，酵母粉4g/L，葡萄糖20 g/L，山梨醇单油酸酯0.1 v/v%，磷酸氢二钾2 g/L，三水乙酸钠5 g/L，柠檬酸三铵2 g/L，七水合硫酸镁0.2 g/L，四水合硫酸锰0.2 g/L，氯化钠60 g/L；所述酵母菌培养基的pH为6.0，各组分的浓度为：酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，氯化钠60 g/L。
4.根据权利要求1所述的利用混菌生物膜提高乳酸菌耐酸能力的方法，其特征在于，S2中种子液的培养包括以下步骤：
分别取-80℃下保藏的乳酸菌和酵母菌，按18~22%的接种量分别接种于4~6 mL所述乳酸菌培养基和所述酵母菌培养基中，在温度为25~35℃的状态下静置培养24 h，即得。
5.根据权利要求1或4所述的利用混菌生物膜提高乳酸菌耐酸能力的方法，其特征在于，S2中种子液的培养步骤为：
分别取-80℃下保藏的乳酸菌和酵母菌，按20%的接种量分别接种于5 mL 所述乳酸菌培养基和所述酵母菌培养基中，在温度为30℃的状态下静置培养24 h，即得。
6.根据权利要求1所述的利用混菌生物膜提高乳酸菌耐酸能力的方法，其特征在于，S3中混菌生物膜的培养包括以下步骤：
将乳酸菌种子液、酵母菌种子液和乳酸菌培养基按1:0.4~0.6:90~110的体积比混匀，取3 mL混匀液到5 mL离心管中静置培养48 h，即得。
7.根据权利要求1或6所述的利用混菌生物膜提高乳酸菌耐酸能力的方法，其特征在于，S3中混菌生物膜的培养步骤为：
将乳酸菌种子液、酵母菌种子液和乳酸菌培养基按1:0.5:100的体积比混匀，取3 mL混匀液到5 mL离心管中静置培养48 h，即得。
8.根据权利要求1所述的利用混菌生物膜提高乳酸菌耐酸能力的方法，其特征在于，S4中乳酸菌酸胁迫处理包括以下步骤：
移除混菌生物膜上层发酵液，加入所述乳酸菌培养基中，于30℃下静置胁迫90 min；所述乳酸菌培养基的pH为4.1~4.3。
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