CN112695029B - 一种高产岩藻多糖降解酶的基因工程菌株及其制备方法 - Google Patents

一种高产岩藻多糖降解酶的基因工程菌株及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物发酵领域，特别涉及一种高产岩藻多糖降解酶的基因工程菌株及其制备方法。该高产岩藻多糖降解酶的基因工程菌株中转入的16S rDNA的序列如SEQ ID NO：1所示。本发明菌株具有生长速度快、产酶活力高、酶的稳定性好、对不同来源底物的适应性强等优点，因此具有良好的应用前景。

Description

一种高产岩藻多糖降解酶的基因工程菌株及其制备方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域，特别涉及一种高产岩藻多糖降解酶的基因工程菌株及其制备方法。
背景技术
岩藻聚糖硫酸酯(Fucoidan)是广泛存在于岩藻中的一种高分子质量的硫酸杂多糖，主要由L-岩藻糖及硫酸酯基团组成；另外还含有半乳糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、糖醛酸等。研究发现岩藻聚糖硫酸酯具有多种生理活性，包括抗凝血、抗肿瘤、抗炎、抗血栓、提高免疫力、抗感染等活性，因此，其成为当今天然海洋活性物质的主攻方向之一。由于岩藻聚糖硫酸酯的分子质量巨大，从几万到几十万都有，严重影响了它的吸收效率；同时岩藻聚糖硫酸酯通常具有一定的粘性，也大大阻碍了其作为药物的应用。而将大分子质量的岩藻聚糖硫酸酯降解为小分子质量的低聚糖，不仅可以解决上述应用难题，而且在某些情况还可以增强其生理活性；同时将大分子质量的Fu-coidan转变为小分子质量低聚糖也是目前构效研究的重要手段，因此，无论从结构研究的角度还是发挥其活性的应用角度，对藻聚糖硫酸酯进行降解都是至关重要的。
目前，降解Fucoidan的方法主要有化学降解法、物理降解法和酶降解法。化学降解法是非特异性降解，反应条件苛刻，水解较难控制，而且产物转化率低，功能性低。物理降解法虽然操作简单可控性好，但其降解效率普遍较低，很难得到符合一定分子质量范围的产品。最好的方法就是酶解法，可以特异性、选择性地切断岩藻聚糖链上的糖苷键，反应过程容易控制，易于得到所需分子质量范围的低聚糖产品，且产物含量高，功能性强。目前，国内外关于岩藻聚糖硫酸酯酶的研究已有一些报道，Bakunina等从岩藻中筛选出1株产酶菌，其产酶活力可达1920U；sakai等从海水中筛选出1株产酶菌株，经16s rRNA鉴定该菌株属于交替单胞菌科(Alteromonadaceae)；Kim等从岩藻中筛选出产酶细菌，经鉴定该菌属于鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)，经过验证，其产生的酶为内切酶。
总之目前还没有商品化的酶出现，可能是由于这些微生物的产酶能力尚未达到商业化的要求，因此，提高发酵酶活已经成为目前研究领域的重点。例如，河北大学生命科学学院赵丽坤等人利用紫外线-氯化锂(UV-LiCl)和紫外线-亚硝基胍(UV-NTG)对其进行复合诱变处理获得了一株相对出发菌株含量提高65％左右的高产菌株。沈阳药科大学生物技术与生物制药实验室采用NTG、DES、紫外线等诱变因子对岩藻多糖降解菌的原始菌株进行了多次诱变处理，产量有了明显提高。CN201110003059.2公开了一种岩藻多糖降解酶生产菌及其制备方法，其通过反复的诱变和筛选得到一株名为FT26-9的高产菌株，其应用于工业生产可提高发酵单位40％左右。但由于其诱变大多采用了具有致癌作用的剧毒有机试剂，且诱变工艺复杂，对人体健康和环境保护带来不利影响，上述技术方案有待进一步提高。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种高产岩藻多糖降解酶的基因工程菌株及其制备方法。该菌株具有生长速度快、产酶活力高、酶的稳定性好、对不同来源底物的适应性强等优点。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种16s rDNA，其序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还提供了该16S rDNA在制备高产岩藻多糖降解酶菌株中的应用。
本发明还提供了一种质粒，包括上述16S rDNA。
作为优选，质粒的载体为PSKH质粒。
本发明还提供了一种基因工程菌株，包括上述16S rDNA，或者包括上述质粒。
本发明还提供了该基因工程菌株的发酵方法，包括如下步骤：
(1)、平板培养：将菌接种于平板培养基上，培养温度为26～30℃，培养时间为6～7d；
(2)、斜面培养：将步骤(1)平板培养的菌株接种到斜面培养基上，培养温度为26～30℃，培养时间为6～7d；
(3)、种子培养：将步骤(2)斜面培养的菌株接种到种子培养基中，装液量为8vt％～20vt％，培养温度为26～30℃，180～220rpm转速下培养30～45h；
(4)、发酵培养：将步骤(3)所得种子培养液接种到发酵培养基中，接种量为2％～10％(v/v)，装液量为14vt％～26vt％，培养温度为26～30℃，180～240rpm转速下培养8～10d。
作为优选，平板培养基包含如下质量百分数的组分：碳源0.5％～1.5％、氮源0.1％～0.3％、无机盐0.5％～1.0％、琼脂1.2％～1.8％、其余为水，pH7.2～7.4；
平板培养基中，碳源为葡萄糖和可溶性淀粉中的一种或两种的混合；氮源为乙酸铵和硫酸铵中的一种或两种的混合；无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐中的一种或几种的混合。
作为优选，斜面培养基包含如下质量百分数的组分：碳源0.5％～1.5％、氮源0.1％～0.3％、无机盐0.5％～1.0％、琼脂1.2％～1.8％、其余为水，pH7.2～7.4；
斜面培养基中，碳源为葡萄糖和可溶性淀粉中的一种或两种的混合；氮源为乙酸铵和硫酸铵中的一种或两种的混合；无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐中的一种或几种的混合。
作为优选，种子培养基包含如下质量百分数的组分：碳源2.0％～3.0％、氮源2.0％～4.0％、微量元素0.0001％～0.0004％，淀粉酶3～5u/g淀粉，其余为水，pH 7.0～7.2；
种子培养基中，碳源为玉米淀粉和葡萄糖中的一种或两种的混合；氮源为花生饼粉、黄豆饼粉、玉米浆、酵母粉和酵母膏中的一种或几种的混合；微量元素为氯化钴。
作为优选，发酵培养基包含如下质量百分数的组分：碳源5.0％～15.0％、氮源2.0％～4.0％、微量元素0.0001％～0.0004％，淀粉酶3～5u/g淀粉，其余为水，pH 7.0～7.2；
发酵培养基中，碳源为玉米淀粉、葡萄糖和麦芽糖中的一种或几种的混合；氮源为花生饼粉、黄豆饼粉、玉米浆、酵母粉中的一种或几种的混合；的微量元素为氯化钴。
本发明提供了一种高产岩藻多糖降解酶的基因工程菌株及其制备方法。该16srDNA的序列如SEQ ID NO：1所示。本发明有益效果如下：
本发明采用低能氮离子注入-氯化锂复合诱变和紫外线-氯化锂复合诱变相结合，最终筛选获得一株岩藻多糖降解酶高产菌株，可较大幅度提高发酵产物中岩藻多糖降解酶活力，且遗传稳定性好，菌株连续传代5次后酶活并无明显变化。在500毫升发酵瓶中，以葡萄糖为速效碳源，玉米淀粉为迟效碳源，发酵产岩藻多糖降解酶酶活达到304U/mL，相比原始出发菌株提高了23.4％。本技术发明完全符合工业化岩藻多糖降解酶生产菌株的诱变和筛选需要，并可应用于工业化发酵生产，具有重大的社会意义和经济价值。
本发明通过融合PCR技术将16SDNA片段重复克隆，酶活提高一倍，证明该基因片段为活性片段，起到关键性作用。
本发明所述菌株的发酵培养基配料简单，都是实验室中非常普遍容易获得的，发酵效果显著，使岩藻多糖降解酶的生产成本大大降低，可应用于大规模工业化生产制备岩藻多糖降解酶，具有重大的经济应用价值。
具体实施方式
本发明公开了一种高产岩藻多糖降解酶的基因工程菌株及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的高产岩藻多糖降解酶的基因工程菌株及其制备方法中所用试剂或耗材均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：
本实施例说明将岩藻多糖降解菌做出发菌株进行诱变的方法。
以实验室保存的岩藻多糖降解菌FE001为出发菌株，进行诱变，具体步骤如下：
(a)、单孢子悬浮液制备：取26～30℃恒温培养6～7d的岩藻多糖降解菌新鲜斜面加无菌水10mL，刮洗下孢子倾于带有一定玻璃珠的250mL三角瓶内震荡摇匀20min(250rpm)，打散孢子链，三层脱脂纱布过滤，滤液用血球计数板计数，调整孢子浓度106个/毫升。
(b)、低能氮离子注入-氯化锂复合诱变：取0.1mL的步骤(a)中孢子悬液均匀涂布于无菌空平皿上，镜检无细胞重叠者进行低能氮离子注入。本实验低能氮离子注入机为多功能注入机。分别在10KeV、14KeV、16KeV、18KeV的能量下对岩藻多糖降解菌进行离子注入。注入剂量分别为40×1014ions/cm2、80×1014ions/cm2、120×1014ions/cm2、160×1014ions/cm2、200×1014ions/cm2、240×1014ions/cm2。靶室真空度为10-3Pa，以20S脉冲式注入，间隔15s，靶室内放置不接受注入的对照样。确定诱变能量16KeV，诱变剂量160×1014ions/cm2为最佳低能氮离子注入诱变条件。离子注入完毕后，取出平皿，在无菌环境下用1ml无菌水洗脱，涂布到氯化锂平板培养基上，在26～30℃下倒置培养6～7d。
(c)、紫外线-氯化锂复合诱变：取5mL步骤(a)中孢子悬液移入含有磁力转子的无菌空平板中，至于磁力搅拌器上。先开启20W紫外灯预热20min，再调整培养皿高度于紫外灯下30cm处，打开平皿盖，分别照射30s、45s、60s、75s、90s，诱变结束后取菌悬液涂布于氯化锂平板培养基上，于26～30℃条件下倒置避光恒温培养6～7d。确定60s为紫外诱变最佳时间，此时正突变率最高，达到18.1％。
(d)、诱变菌株的筛选：
初筛：将步骤(b)和步骤(c)诱变得到的单菌落接至斜面培养基上，在26～30℃下培养6～7d后，铲取二分之一的菌体于离心管中，用0.5mL丙酮浸泡12～15h，然后加入0.25mL乙酸乙酯，快速混匀，3000rpm离心10min，取上清液，取上清液测定各菌株浸取液中岩藻多糖降解酶B1a效价，留取50％的高效价菌株上摇瓶发酵进行复筛。
复筛：将初筛筛选到的菌株经斜面培养后接入种子培养基中于26～30℃、180～220rmp摇床转速下扩大培养30～45h，以2～10％(v/v)的接种量接入发酵培养基，在26～30℃、180～240rpm摇床转速下培养8～10d下摇床，取3mL发酵液于离心管中，3500rpm高速离心10min，弃上清液，加入甲醇至9mL，在快速混匀器上震荡30min；3500rpm高速离心10min，取上清液测定发酵液中岩藻多糖降解酶B1a效价。取发酵液岩藻多糖降解酶B1a效价最高的菌株作为下次诱变的出发菌株，重复步骤(a)～(d)，如下所示：
(a)、单孢子悬浮液制备：取26～30℃恒温培养6～7d的岩藻多糖降解菌新鲜斜面加无菌水10mL，刮洗下孢子倾于带有一定玻璃珠的250mL三角瓶内震荡摇匀20min(250rpm)，打散孢子链，三层脱脂纱布过滤，滤液用血球计数板计数，调整孢子浓度106个/毫升。
(b)、低能氮离子注入-氯化锂复合诱变：取0.1mL的步骤(a)中孢子悬液均匀涂布于无菌空平皿上，镜检无细胞重叠者进行低能氮离子注入。本实验低能氮离子注入机为多功能注入机。分别在10KeV、14KeV、16KeV、18KeV的能量下对岩藻多糖降解菌进行离子注入。注入剂量分别为40×1014ions/cm2、80×1014ions/cm2、120×1014ions/cm2、160×1014ions/cm2、200×1014ions/cm2、240×1014ions/cm2。靶室真空度为10-3Pa，以20S脉冲式注入，间隔15s，靶室内放置不接受注入的对照样。实验结果确定诱变能量16KeV，诱变剂量160×1014ions/cm2为最佳低能氮离子注入诱变条件。离子注入完毕后，取出平皿，在无菌环境下用1ml无菌水洗脱，涂布到氯化锂平板培养基上，在26～30℃下倒置培养6～7d。
(c)、紫外线-氯化锂复合诱变：取5mL步骤(a)中孢子悬液移入含有磁力转子的无菌空平板中，至于磁力搅拌器上。先开启20W紫外灯预热20min，再调整培养皿高度于紫外灯下30cm处，打开平皿盖，分别照射30s、45s、60s、75s、90s，诱变结束后取菌悬液涂布于氯化锂平板培养基上，于26～30℃条件下倒置避光恒温培养6～7d。实验结果确定60s为紫外诱变最佳时间，此时正突变率最高，达到18.1％。
(d)、诱变菌株的筛选：
初筛：将步骤(b)和步骤(c)诱变得到的单菌落接至斜面培养基上，在26～30℃下培养6～7d后，铲取二分之一的菌体于离心管中，用0.5mL丙酮浸泡12～15h，然后加入0.25mL乙酸乙酯，快速混匀，3000rpm离心10min，取上清液，取上清液测定各菌株浸取液中岩藻多糖降解酶B1a效价，留取50％的高效价菌株上摇瓶发酵进行复筛。
最后筛选出岩藻多糖降解酶素B1a产量高的目标菌株streptomyces avermitilisAVE07-N2-16515。
本发明菌株的形态学及生理生化学特征如下：
菌落颜色：灰白色。
需氧方式：好氧生长。
菌落大小：2～5mm。
适宜生长温度：27.5～28.5℃。
适宜生长pH：7.2～7.4。
菌体形态：圆形菌落，无光泽。
革兰氏染色：阳性。
其16S rDNA序列为：
GCAGCTACAGATAGACATGATCGTCGAGCAGAGTGGATTAAGAGCTGTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACCGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTTTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATTTTAGTTGCCATCATTTAGTTGGGCACTTTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGAGCTGCAAGACCGCGAGGTGGAGCTAATCTCATAAAACCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCGAGAAGTCGGTGGGGTAACCAAGTGGAGCCAACGTACCTAAAGAGCTGCG。
步骤(b)和步骤(c)中所用的氯化锂平板培养基为：可溶性淀粉1.0％，(NH4)2SO40.25％，NaCl 0.05％，MgSO4·7H2O 0.12％，K2HPO4·3H2O 0.3％，CaCO3 0.3％，氯化锂1.0moL·L-1，琼脂粉1.5％，pH7.2～7.4，蒸馏水配制。
步骤(a)及(d)中所用的斜面培养基为：可溶性淀粉1.0％，(NH4)2SO4 0.25％，NaCl0.05％，MgSO4·7H2O 0.12％，K2HPO4·3H2O 0.3％，CaCO3 0.3％，琼脂粉1.5％，pH7.2～7.4，蒸馏水配制。
步骤(d)中所用的种子培养基为：玉米淀粉1.5％，葡萄糖1.0％，花生饼粉1.0％，黄豆饼粉0.8％，酵母粉0.5％，CoCl2·6H2O 0.0003％，淀粉酶4u/g淀粉，pH7.0～7.2，自来水配制。
步骤(d)中所用的发酵培养基为：玉米淀粉6％，葡萄糖2％，花生饼粉1.4％，黄豆饼粉1.2％，酵母粉0.3％，CoCl2·6H2O 0.0003％，淀粉酶4u/g淀粉，pH7.0～7.2，自来水配制。
实施例2：
本实施例说明突变株的传代稳定性。
在以葡萄糖为速效碳源、玉米淀粉为迟效碳源的发酵培养基中，检测突变株AVE07-N2-16515的传代稳定性，菌株传代发酵试验结果如表1所示：
表1高产突变菌株AVE07-N2-16515菌株遗传稳定性试验
Figure GDA0002965852370000091
从实验结果可以看出，经过5次传代，突变菌株AVE07-N2-16515菌株的岩藻多糖降解酶B1a效价较稳定，具有较好的传代稳定性，可作为进一步研究和开发的生产菌株。
实施例3：
本实施例说明岩藻多糖降解酶高产菌株AVE07-N2-16515发酵生产岩藻多糖降解酶的工艺。
本实施例所用的培养基配方：
平板培养基：可溶性淀粉1.0％，(NH4)2SO4 0.25％，NaCl 0.05％，MgSO4·7H2O0.12％，K2HPO4·3H2O 0.3％，CaCO3 0.3％，琼脂粉1.5％，pH7.2～7.4，蒸馏水配制。
斜面培养基：可溶性淀粉1.0％，(NH4)2SO4 0.25％，NaCl 0.05％，MgSO4·7H2O0.12％，K2HPO4·3H2O 0.3％，CaCO3 0.3％，琼脂粉1.5％，pH7.2～7.4，蒸馏水配制。
种子培养基：玉米淀粉1.5％，葡萄糖1.0％，花生饼粉1.0％，黄豆饼粉0.8％，酵母粉0.5％，CoCl2·6H2O 0.0003％，淀粉酶4u/g淀粉，pH 7.0～7.2，自来水配制。
发酵培养基：玉米淀粉6％，葡萄糖2％，花生饼粉1.4％，黄豆饼粉1.2％，酵母粉0.3％，CoCl2·6H2O 0.0003％，淀粉酶4u/g淀粉，pH 7.0～7.2，自来水配制。
将AVE07-N2-16515菌株接种于平板培养基上，培养温度为28℃，培养时间为7d；将平板培养的AVE07-N2-16515菌株接种到斜面培养基上，28℃培养7d后，取斜面培养物接种至种子培养基中，250mL培养瓶中装液量为30mL，培养温度为28℃，200rpm转速下培养32h；将种子培养液接种到发酵培养基中，初始pH为7.2，接种量为6％(v/v)，250mL培养瓶中装液量为50mL，培养温度为28.5℃，220rpm转速下培养9d(216h)，发酵产岩藻多糖降解酶酶活为303U/mL，相对于原始出发菌株提高了22.9％。
实施例4：
本实施例说明岩藻多糖降解酶高产菌株AVE07-N2-16515发酵生产岩藻多糖降解酶的工艺。
本实施例所用的培养基配方：
平板培养基：可溶性淀粉1.0％，(NH4)2SO4 0.25％，NaCl 0.05％，MgSO4·7H2O0.12％，K2HPO4·3H2O 0.3％，CaCO3 0.3％，琼脂粉1.5％，pH7.2～7.4，蒸馏水配制。
斜面培养基：可溶性淀粉1.0％，(NH4)2SO4 0.25％，NaCl 0.05％，MgSO4·7H2O0.12％，K2HPO4·3H2O 0.3％，CaCO3 0.3％，琼脂粉1.5％，pH7.2～7.4，蒸馏水配制。
种子培养基：玉米淀粉1.5％，葡萄糖1.0％，花生饼粉1.0％，黄豆饼粉0.8％，酵母粉0.5％，CoCl2·6H2O 0.0003％，淀粉酶4u/g淀粉，pH 7.0～7.2，自来水配制。
发酵培养基：玉米淀粉8％，花生饼粉1.4％，黄豆饼粉1.2％，酵母粉0.3％，CoCl2·6H2O 0.0003％，淀粉酶4u/g淀粉，pH7.0～7.2，自来水配制。
将AVE07-N2-16515菌株接种于平板培养基上，培养温度为28℃，培养时间为7d；将平板培养的AVE07-N2-16515菌株接种到斜面培养基上，28℃培养7d后，取斜面培养物接种至种子培养基中，250mL培养瓶中装液量为30mL，培养温度为28℃，200rpm转速下培养32h；将种子培养液接种到发酵培养基中，初始pH为7.2，接种量为6％(v/v)，250mL培养瓶中装液量为50mL，培养温度为28.5℃，220rpm转速下培养9d(216h)，发酵产岩藻多糖降解酶B1a效价为298U/mL，相对于原始出发菌株提高了21.0％。
实施例5：
本实施例说明岩藻多糖降解酶高产菌株AVE07-N2-16515发酵生产岩藻多糖降解酶的工艺。
本实施例所用的培养基配方：
平板培养基：可溶性淀粉1.0％，(NH4)2SO4 0.25％，NaCl 0.05％，MgSO4·7H2O0.12％，K2HPO4·3H2O 0.3％，CaCO3 0.3％，琼脂粉1.5％，pH7.2～7.4，蒸馏水配制。
斜面培养基：可溶性淀粉1.0％，(NH4)2SO4 0.25％，NaCl 0.05％，MgSO4·7H2O0.12％，K2HPO4·3H2O 0.3％，CaCO3 0.3％，琼脂粉1.5％，pH7.2～7.4，蒸馏水配制。
种子培养基：玉米淀粉1.5％，葡萄糖1.0％，花生饼粉1.0％，黄豆饼粉0.8％，酵母粉0.5％，CoCl2·6H2O 0.0003％，淀粉酶4u/g淀粉，pH7.0～7.2，自来水配制。
发酵培养基：葡萄糖8％，花生饼粉1.4％，黄豆饼粉1.2％，酵母粉0.3％，CoCl2·6H2O 0.0003％，淀粉酶4u/g淀粉，pH7.0～7.2，自来水配制。
将AVE07-N2-16515菌株接种于平板培养基上，培养温度为28℃，培养时间为7d；将平板培养的AVE07-N2-16515菌株接种到斜面培养基上，28℃培养7d后，取斜面培养物接种至种子培养基中，250mL培养瓶中装液量为30mL，培养温度为28℃，200rpm转速下培养32h；将种子培养液接种到发酵培养基中，初始pH为7.2，接种量为6％(v/v)，250mL培养瓶中装液量为50mL，培养温度为28.5℃，220rpm转速下培养9d(216h)，发酵产岩藻多糖降解酶为300U/mL，相对于原始出发菌株提高了21.7％。
实施例6：
本实施例说明岩藻多糖降解酶高产菌株AVE07-N2-16515发酵生产岩藻多糖降解酶的工艺。
本实施例所用的培养基配方：
平板培养基：可溶性淀粉1.0％，(NH4)2SO4 0.25％，NaCl 0.05％，MgSO4·7H2O0.12％，K2HPO4·3H2O 0.3％，CaCO3 0.3％，琼脂粉1.5％，pH7.2～7.4，蒸馏水配制。
斜面培养基：可溶性淀粉1.0％，(NH4)2SO4 0.25％，NaCl 0.05％，MgSO4·7H2O0.12％，K2HPO4·3H2O 0.3％，CaCO3 0.3％，琼脂粉1.5％，pH7.2～7.4，蒸馏水配制。
种子培养基：玉米淀粉1.5％，葡萄糖1.0％，花生饼粉1.0％，黄豆饼粉0.8％，酵母粉0.5％，CoCl2·6H2O 0.0003％，淀粉酶4u/g淀粉，pH7.0～7.2，自来水配制。
发酵培养基：麦芽糖8％，花生饼粉1.4％，黄豆饼粉1.2％，酵母粉0.3％，CoCl2·6H2O 0.0003％，淀粉酶4u/g淀粉，pH7.0～7.2，自来水配制。
将AVE07-N2-16515菌株接种于平板培养基上，培养温度为28℃，培养时间为7d；将平板培养的AVE07-N2-16515菌株接种到斜面培养基上，28℃培养7d后，取斜面培养物接种至种子培养基中，250mL培养瓶中装液量为30mL，培养温度为28℃，200rpm转速下培养32h；将种子培养液接种到发酵培养基中，初始pH为7.2，接种量为6％(v/v)，250mL培养瓶中装液量为50mL，培养温度为28.5℃，220rpm转速下培养9d(216h)，发酵产岩藻多糖降解酶活力为289U/mL，相对于原始出发菌株提高了17.3％。
实施例7：
本实施例说明岩藻多糖降解酶发酵生产岩藻多糖降解酶的工艺。
本实施例所用的培养基配方：
平板培养基：可溶性淀粉1.0％，(NH4)2SO4 0.25％，NaCl 0.05％，MgSO4·7H2O0.12％，K2HPO4·3H2O 0.3％，CaCO3 0.3％，琼脂粉1.5％，pH7.2～7.4，蒸馏水配制。
斜面培养基：可溶性淀粉1.0％，(NH4)2SO4 0.25％，NaCl 0.05％，MgSO4·7H2O0.12％，K2HPO4·3H2O 0.3％，CaCO3 0.3％，琼脂粉1.5％，pH7.2～7.4，蒸馏水配制。
种子培养基：玉米淀粉1.5％，葡萄糖1.0％，花生饼粉1.0％，黄豆饼粉0.8％，酵母粉0.5％，CoCl2·6H2O 0.0003％，淀粉酶4u/g淀粉，pH7.0～7.2，自来水配制。
发酵培养基：玉米淀粉6％，葡萄糖2％，花生饼粉1.4％，黄豆饼粉1.2％，酵母粉0.3％，CoCl2·6H2O 0.0003％，淀粉酶4u/g淀粉，pH7.0～7.2，自来水配制。
将AVE07-N2-16515菌株接种于平板培养基上，培养温度为28℃，培养时间为7d；将平板培养的AVE07-N2-16515菌株接种到斜面培养基上，28℃培养7d后，取斜面培养物接种至种子培养基中，250mL培养瓶中装液量为30mL，培养温度为28℃，200rpm转速下培养32h；将种子培养液接种到装有3L发酵培养基的5L发酵罐中，接种量为10％(v/v)，发酵温度28.5℃，搅拌转速100rpm。发酵培养216h后检测岩藻多糖降解酶活力达到304U/mL。
实施例8:
通过融合PCR技术将目的基因16SDNA片段的上下游同源臂融合并克隆到PSKH质粒上，将重组质粒转化大肠杆菌S17λpir中，再接合转移到枯草芽孢杆菌菌株内，经pDS132质粒上sacB基因的反向筛选得到突变株。
突变株所用的培养基配方：
平板培养基：可溶性淀粉1.0％，(NH4)2SO4 0.25％，NaCl 0.05％，MgSO4·7H2O0.12％，K2HPO4·3H2O 0.3％，CaCO3 0.3％，琼脂粉1.5％，pH7.2～7.4，蒸馏水配制。
斜面培养基：可溶性淀粉1.0％，(NH4)2SO4 0.25％，NaCl 0.05％，MgSO4·7H2O0.12％，K2HPO4·3H2O 0.3％，CaCO3 0.3％，琼脂粉1.5％，pH7.2～7.4，蒸馏水配制。
种子培养基：玉米淀粉1.5％，葡萄糖1.0％，花生饼粉1.0％，黄豆饼粉0.8％，酵母粉0.5％，CoCl2·6H2O 0.0003％，淀粉酶4u/g淀粉，pH7.0～7.2，自来水配制。
发酵培养基：玉米淀粉6％，葡萄糖2％，花生饼粉1.4％，黄豆饼粉1.2％，酵母粉0.3％，CoCl2·6H2O 0.0003％，淀粉酶4u/g淀粉，pH7.0～7.2，自来水配制。
将AVE07-N2-16515菌株接种于平板培养基上，培养温度为28℃，培养时间为7d；将平板培养的AVE07-N2-16515菌株接种到斜面培养基上，28℃培养7d后，取斜面培养物接种至种子培养基中，250mL培养瓶中装液量为30mL，培养温度为28℃，200rpm转速下培养32h；将种子培养液接种到装有3L发酵培养基的5L发酵罐中，接种量为10％(v/v)，发酵温度28.5℃，搅拌转速100rpm。发酵培养216h后检测岩藻多糖降解酶活力达到610U/mL。
与实施例相比工艺条件完全一致，通过融合PCR技术将目的基因16SDNA片段重复克隆，酶活提高一倍，从而可以得出该基因片段为活性片段，起到关键性作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 北京雷力海洋生物新产业股份有限公司
<120> 一种高产岩藻多糖降解酶的基因工程菌株及其制备方法
<130> MP2013239
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1453
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcagctacag atagacatga tcgtcgagca gagtggatta agagctgtgc tcttatgaag 60
ttagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg taacctgccc ataagactgg gataactccg 120
ggaaaccggg gctaataccg gataacattt tgaaccgcat ggttcgaaat tgaaaggcgg 180
cttcggctgt cacttatgga tggacccgcg tcgcattagc tagttggtga ggtaacggct 240
caccaaggca acgatgcgta gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac 300
acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg 360
acggagcaac gccgcgtgag tgatgaaggc tttcgggtcg taaaactctg ttgttaggga 420
agaacaagtg ctagttgaat aagctggcac cttgacggta cctaaccaga aagccacggc 480
taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttatccg gaattattgg 540
gcgtaaagcg cgcgcaggtg gtttcttaag tctgatgtga aagcccacgg ctcaaccgtg 600
gagggtcatt ggaaactggg agacttgagt gcagaagagg aaagtggaat tccatgtgta 660
gcggtgaaat gcgtagagat atggaggaac accagtggcg aaggcgactt tctggtctgt 720
aactgacact gaggcgcgaa agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca 780
cgccgtaaac gatgagtgct aagtgttaga gggtttccgc cctttagtgc tgaagttaac 840
gcattaagca ctccgcctgg ggagtacggc cgcaaggctg aaactcaaag gaattgacgg 900
gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca 960
ggtcttgaca tcctttgaca accctagaga tagggcttct ccttcgggag cagagtgaca 1020
ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag 1080
cgcaaccctt gattttagtt gccatcattt agttgggcac tttaaggtga ctgccggtga 1140
caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca 1200
cacgtgctac aatggacggt acaaagagct gcaagaccgc gaggtggagc taatctcata 1260
aaaccgttct cagttcggat tgtaggctgc aactcgccta catgaagctg gaatcgctag 1320
taatcgcgga tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc 1380
acaccacgag agtttgtaac accgagaagt cggtggggta accaagtgga gccaacgtac 1440
ctaaagagct gcg 1453

Claims (10)

1.一种16s rDNA，其特征在于，其序列如SEQ ID NO：1所示。
2.权利要求1所述16S rDNA在制备高产岩藻多糖降解酶菌株中的应用。
3.一种质粒，其特征在于，包括权利要求1所述16S rDNA。
4.根据权利要求3所述的质粒，其特征在于，所述质粒的载体为PSKH质粒。
5.一种基因工程菌株，其特征在于，包括权利要求1所述16S rDNA，或者包括权利要求3或4所述的质粒。
6.权利要求5所述基因工程菌株的发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)、平板培养：将菌接种于平板培养基上，培养温度为26～30℃，培养时间为6～7d；
(2)、斜面培养：将步骤(1)平板培养的菌株接种到斜面培养基上，培养温度为26～30℃，培养时间为6～7d；
(3)、种子培养：将步骤(2)斜面培养的菌株接种到种子培养基中，装液量为8vt％～20vt％，培养温度为26～30℃，180～220rpm转速下培养30～45h；
(4)、发酵培养：将步骤(3)所得种子培养液接种到发酵培养基中，接种量为2％～10％(v/v)，装液量为14vt％～26vt％，培养温度为26～30℃，180～240rpm转速下培养8～10d。
7.根据权利要求6所述的发酵方法，其特征在于，所述平板培养基包含如下质量百分数的组分：碳源0.5％～1.5％、氮源0.1％～0.3％、无机盐0.5％～1.0％、琼脂1.2％～1.8％、其余为水，pH7.2～7.4；
平板培养基中，所述碳源为葡萄糖和可溶性淀粉中的一种或两种的混合；所述氮源为乙酸铵和硫酸铵中的一种或两种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐中的一种或几种的混合。
8.根据权利要求6所述的发酵方法，其特征在于，所述斜面培养基包含如下质量百分数的组分：碳源0.5％～1.5％、氮源0.1％～0.3％、无机盐0.5％～1.0％、琼脂1.2％～1.8％、其余为水，pH7.2～7.4；
斜面培养基中，所述碳源为葡萄糖和可溶性淀粉中的一种或两种的混合；所述氮源为乙酸铵和硫酸铵中的一种或两种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐中的一种或几种的混合。
9.根据权利要求6所述的发酵方法，其特征在于，所述种子培养基包含如下质量百分数的组分：碳源2.0％～3.0％、氮源2.0％～4.0％、微量元素0.0001％～0.0004％，淀粉酶3～5u/g淀粉，其余为水，pH 7.0～7.2；
种子培养基中，所述碳源为玉米淀粉和葡萄糖中的一种或两种的混合；所述氮源为花生饼粉、黄豆饼粉、玉米浆、酵母粉和酵母膏中的一种或几种的混合；所述微量元素为氯化钴。
10.根据权利要求6至9中任一项所述的发酵方法，其特征在于，所述发酵培养基包含如下质量百分数的组分：碳源5.0％～15.0％、氮源2.0％～4.0％、微量元素0.0001％～0.0004％，淀粉酶3～5u/g淀粉，其余为水，pH 7.0～7.2；
发酵培养基中，所述碳源为玉米淀粉、葡萄糖和麦芽糖中的一种或几种的混合；所述氮源为花生饼粉、黄豆饼粉、玉米浆、酵母粉中的一种或几种的混合；所述的微量元素为氯化钴。
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