CN109486710B - 一种循环利用废水连续发酵培养微生物的方法及其所用具有自凝絮和自沉降特性的细菌 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种循环利用废水连续发酵培养微生物的方法及其所用具有自凝絮和自沉降特性的细菌，所述具有自凝絮和自沉降特性的细菌属于嗜盐性细菌，在不低于0.08M盐浓度条件下能发生自凝絮和自沉降。本发明利用洗涤自沉降的细菌菌体产生的废水继续发酵培养微生物，不仅可以减少由于离心、废水处理和灭菌产生的能耗，还可以提高产率。本发明的细菌可成为下一代工业微生物的平台菌，本发明的循环利用废水连续发酵培养方法能用于大规模生物发酵。

Description

一种循环利用废水连续发酵培养微生物的方法及其所用具有 自凝絮和自沉降特性的细菌

技术领域

本发明属于生物技术应用领域，具体涉及一种盐循环利用废水连续发酵培养微生物的方法及其所用具有自凝絮和自沉降特性的细菌。

背景技术

工业中的大规模生物发酵受制于目前的发酵工艺，相比于石油化工，成本始终过高。成本过高的原因一方面是产物的产率较低；一方面是由于生产工艺过程中的大量能耗，其中灭菌、搅拌以及复杂的下游处理占较大比例，并且还会产生较多废水，污染环境。

目前，本申请人已经基于盐单胞菌开发了一套无灭菌的开放式连续发酵工艺，其不需要灭菌，大大降低了生产过程中的工艺能耗。但是由于其下游工艺中的离心产生的能耗以及较低的产率，成本依然很高，并且生产过程中会产生含盐废水，污染环境，仍然限制着工业中的大规模生物发酵。

发明内容

为解决现有技术中存在的一个或多个问题，本发明的一个方面是提供一种循环利用废水连续发酵培养微生物的方法，包括：

S1：将具有自凝絮和自沉降特性的细菌接种到初始发酵培养基中进行发酵培养；

S2：经过第一发酵培养后，从第一发酵产物中分离第一自沉降的细菌菌体，将洗涤所述第一自沉降的细菌菌体产生的废水加入分离后剩余的第一上清，继续第二发酵培养；

S3：经过第二发酵培养后，从第二发酵产物中分离第二自沉降的细菌菌体，将洗涤所述第二自沉降的细菌菌体产生的废水加入分离后剩余的第二上清，继续下一发酵培养；

S4：重复所述步骤S3连续N次，N为自然数；

S5：合并各步骤洗涤后的细菌菌体为收获的微生物。

本发明提供的循环利用废水连续发酵培养微生物的方法中步骤S2和/或步骤S3中所述分离为从静置分层的发酵产物的下层获取自沉降的细菌菌体；其中所述静置分层的时间可为10-30min。

上述具有自凝絮和自沉降特性的细菌为嗜盐性细菌，优选为盐单胞菌属(Halomonas sp.)。

上述自凝絮和自沉降特性是指细菌在不低于0.08M盐浓度条件下能发生自凝絮和自沉降。该细菌的自凝絮和自沉降特性是可逆的，在盐浓度低于0.08M的条件下时，自凝絮和自沉降现象可逐渐消失。

上述具有自凝絮和自沉降特性的细菌为盐单胞菌属细菌经敲除etf-α和etf-β基因后的细菌。

上述具有自凝絮和自沉降特性的细菌的16S rDNA序列为SEQ ID NO:12或SEQIDNO:13所示的序列。

上述具有自凝絮和自沉降特性的细菌为盐单胞菌(Halomonascampaniensis)LSKO，保藏号为CGMCC No.16437。

本发明提供的循环利用废水连续发酵培养微生物的方法中，发酵培养的体系中盐浓度不低于0.08mol/L；和/或

发酵培养在搅拌和通气条件下进行，其中所述搅拌的初始转速为200-250RPM，培养5-8小时后，转速稳定在700-800RPM；所述通气的速率为1vvm；所述发酵培养的温度为20℃-45℃；所述发酵培养的体系的初始pH值为5.0-11.0；所述发酵培养的体系的初始溶氧为5％-100％；和/或

步骤S1中所述具有自凝絮和自沉降特性的细菌在初始发酵培养基中的OD600为2-4；和/或

步骤S2中所述第一发酵培养的时间为44-52h；和/或

步骤S3中所述第二发酵培养的时间为20-28h；和/或

步骤S2中所述继续第二发酵培养时和步骤S3中所述继续下一发酵培养时，培养体系中自凝絮和自沉降细菌的OD600均为25-30；和/或

其中1升所述初始发酵培养基由氯化钠20g-200g、葡萄糖5g-100g、酵母粉0g-50g、氯化铵0.5g-20g、尿素0g-20g、硫酸镁0.1g-5g、磷酸二氢钾0.5g-10g、十二水合磷酸氢二钠1g-20g、1mL-30mL微量元素I和0.1mL-10mL微量元素II和自来水组成，用自来水定容至1升；

其中1升所述微量元素I按照如下方法制备：将柠檬酸铁铵2g-10g、二水合氯化钙1g-5g和0.5mol/L盐酸水溶液混合，用0.5mol/L盐酸水溶液补足至1升，得到所述微量元素I；

其中1升微量元素II按照如下方法制备：将七水合硫酸锌50mg-200mg、四水合氯化锰10mg-50mg、硼酸100mg-500mg、六水合氯化钴50mg-400mg、五水合硫酸铜3mg-30mg、六水合氯化镍5mg-50mg、二水合钼酸钠10mg-50mg和0.5mol/L盐酸水溶液混合，用0.5mol/L盐酸水溶液补足至1升，得到所述微量元素II。

本发明的另一方面是提供一种具有自凝絮和自沉降特性的细菌，所述细菌属于嗜盐性细菌，且在不低于0.08M盐浓度条件下能发生自凝絮和自沉降。

本发明提供的具有自凝絮和自沉降特性的细菌属于盐单胞菌属。

上述具有自凝絮和自沉降特性的细菌为盐单胞菌属细菌经敲除etf-α和etf-β基因后的细菌。

上述具有自凝絮和自沉降特性的细菌的16S rDNA序列为SEQ ID NO:12或SEQIDNO:13所示的序列。

上述具有自凝絮和自沉降特性的细菌为盐单胞菌LSKO，保藏号为CGMCCNo.16437。

本发明的另一方面还提供一种具有自凝絮和自沉降特性的细菌的改造方法，包括将盐单胞菌属细菌的etf-α和etf-β基因敲除。

基于以上技术方案，本发明基于具有自凝絮和自沉降特性的细菌首次提出一种循环利用废水连续发酵培养微生物的方法以及用于该方法的具有自凝絮和自沉降特性的细菌。本发明具有以下有益效果：

1)由于本发明的具有自凝絮和自沉降特性的细菌在不低于0.08M盐浓度条件下能发生自凝絮和自沉降，因此在连续发酵培养过程中无需采用离心分离发酵产物，只需要静置分层即可实现自沉降的细菌菌体与上清的分离，分离的菌体用于下游处理和产物的提取，洗涤分离的细菌菌体产生的含盐废水加入到上清中，上清中由于还含有部分未分离的悬浮菌株，可用作下一轮继续发酵培养，因此可以消除生产过程中由于离心而产生的能耗以及省去后续繁琐的发酵培养体系的灭菌和接种步骤，并且整个发酵培养过程中可以循环利用废水，节约了大量的水资源和成本。

2)本发明提供的循环利用废水连续发酵培养微生物的方法，在用于生产聚-3-羟基丁酸酯(Poly-3-hydroxybutyrate，简称PHB)时，与传统生产PHB的发酵工艺相比，本发明提供的循环利用废水连续发酵工艺在细胞干重上从传统产率的0.45g/L/h提升到0.82g/L/h；生产的PHB从传统产率的0.18g/L/h提升到0.33g/L/h，均得到很大提高。

3)本发明通过基因工程技术手段从盐单胞菌LS21和盐单胞菌TD01出发，得到了本发明的具有自凝絮和自沉降特性的细菌菌株，该菌株能够在高盐高碱的环境下生长，并且在不低于0.08M盐浓度的条件下能发生自凝絮和自沉降。将具有该特性的菌株用于本发明的循环利用废水连续发酵培养微生物的方法中，扩宽的此类细菌的用途，可用于工业中大规模生物发酵的连续工艺，本发明提供的菌株有望成为下一代工业微生物的平台菌。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是本发明菌株盐单胞菌LSKO与出发菌株盐单胞菌LS21的菌株形态对比图；

图2是本发明菌株盐单胞菌LSKO随着培养时间的延长自凝絮和自沉降变化状态图；

图3是不同氯化钠浓度下的本发明菌株盐单胞菌LSKO的自凝絮和自沉降试验结果图。

具体实施方式

本发明针对现有工业大规模生物发酵中下游工艺离心产生的能耗以及较低的产率和生产过程中废水的排放污染环境等诸多问题，提供一种循环利用废水连续发酵培养物生物的方法，该方法基于具有自凝絮和自沉降特性的细菌，其在适宜的盐浓度下即可发生自凝絮和自沉降，这样在发酵培养过程中无需经过离心，便可以实现下层自沉降的细菌菌体和上清的分离，分离之后的细菌菌体经过洗涤之后用作下游处理和材料提取，洗涤产生的含盐废水加入分离的上清中，可以继续下一轮微生物的发酵培养。因此，整个发酵培养过程可以实现无需离心、循环利用废水的连续发酵培养，从而实现工业大规模生物发酵培养微生物的目标。

因此，本发明在筛选或获取在适宜环境下具有自凝絮和自沉降特性的细菌基础上，进一步利用该细菌提供一种循环利用废水连续发酵培养微生物的方法。

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

下文的公开提供了许多不同的实施方式或例子用来实现本发明的不同方面。本发明提供了各种特定的工艺和材料的例子，但是本领域普通技术人员可以意识到其他工艺的应用和/或其他材料的使用。

以下以具体实施例详述本发明。实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的公开内容不限于下述的实施例。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1：具有自凝絮和自沉降特性的细菌及其鉴定

本实施例详细介绍通过基因改造的方式获取具有自凝絮和自沉降特性的细菌的方法。

1.本发明人以盐单胞菌LS21(由本申请人于2012年9月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCCNo.6593，分类命名为盐单胞菌(Halomonas sp.))作为出发菌株(已在专利文献CN102925382A中公开)，通过以下基因组编辑手段得到基因工程菌株，并验证了其具有自凝絮和自沉降特性：

1.1.敲除质粒pRE112-etf的构建

以下表1所示的pLS1-F(SEQ ID NO:1)和pLS1-R(SEQ ID NO:2)为引物，pRE112-6I-SceI(获自Fu X,TanD,Ai***laG,WuQ,ChenJ,Chen G.(2014).DevelopmentofHalomonas TD01as a host for open production ofchemicals.MetabolicEngineering,23:78–91.)为模板，用Q5酶按照下表2所示的PCR体系和以下PCR程序：先95℃预变性5分钟；再95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸3分钟，30次循环；然后72℃后延伸10分钟，进行PCR反应，扩增得到基因敲除质粒骨架Backbone，其核苷酸序列为SEQ ID NO:7所示的序列，序列长度为5228bp。

以下表1所示的pLS2-F(SEQ ID NO:3)和pLS2-R(SEQ ID NO:4)为引物，以盐单胞菌LS21基因组为模板，用pfu酶按照下表4所示的PCR体系和以下PCR程序：先95℃预变性5分钟；再95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，30次循环；然后72℃后延伸10分钟，进行PCR反应，扩增得到盐单胞菌LS21的etf-α和etf-β基因同源臂HA-1，其核苷酸序列为SEQID NO:8所示的序列，序列长度为586bp。以下表1所示的pLS3-F(SEQ ID NO:5)和pLS3-R(SEQ ID NO:6)为引物，以盐单胞菌LS21基因组为模板，用Q5酶按照下表2所示的PCR体系和以下PCR程序：先95℃预变性5分钟；再95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，30次循环；然后72℃后延伸10分钟，进行PCR反应，扩增得到盐单胞菌LS21的etf-α和etf-β基因同源臂HA-2，其核苷酸序列为SEQ ID NO:9所示的序列，序列长度为493bp。

根据Gibson assembly方法(Gibson DG,YoungL,ChuangRY,VenterJC,HutchisonCA,Smith HO.(2009).Enzymatic assembly of DNA molecules up toseveralhundred kilobases.Nature Methods,6(5):343–345.)，将上述质粒骨架Backbone，同源臂HA-1和HA-2进行连接，得到基因敲除质粒，命名为pRE112-etf。

表1：引物及其序列

表2：PCR体系(50μL体系)

1.2.盐单胞菌LS21的etf-α和etf-β基因的敲除

根据Fu X,TanD,Ai***laG,WuQ,ChenJ,ChenG.(2014).DevelopmentofHalomonas TD01as a host for open production ofchemicals.MetabolicEngineering,23:78–91.中的相关基因敲除方法，利用上述1.1构建的基因敲除质粒pRE112-etf对盐单胞菌LS21进行敲除etf-α和etf-β基因，得到重组菌。

1.3.分子鉴定

对上述1.2得到的重组菌基因组上etf位置进行测序，结果以基因组上etf位置删除864bp的重组菌为阳性重组菌，即为etf-α和etf-β基因敲除的菌株，将该阳性重组菌命名为盐单胞菌(Halomonascampaniensis)LSKO(以下称盐单胞菌LSKO或LSKO)。

使用上表1所示的16S-F(SEQ ID NO:10)和16S-R(SEQ ID NO:11)引物检测上述菌株盐单胞菌LSKO的16S rDNA序列，得到盐单胞菌LSKO的16S rDNA序列为SEQ ID NO:12所示的序列。

上述盐单胞菌LSKO菌株已于2018年9月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCCNo.16437，分类命名为坎帕尼亚盐单胞菌(Halomonascampaniensis)。

1.4.形态鉴定

取15％甘油管冷冻保藏的LSKO菌液，将菌液浓度稀释至104cfu/mL，取100μL涂布于LB平板(组分同盐单胞菌LS21形态鉴定培养基)，37℃培养箱培养48小时，利用扫描电子显微镜观察菌株形态，如图1所示，菌株盐单胞菌LSKO与出发菌株盐单胞菌LS21在菌株形态上基本无区别，即显微镜下观察菌体呈短杆状。

1.5.自凝絮和自沉降特性试验

对LSKO菌株进行革兰氏染色鉴定，结果为革兰氏阴性菌。同时对LSKO菌株的表面Zeta电位(用来表征表面电荷的数据)进行测定，如下表3所示，结果显示，相对于出发菌株盐单胞菌LS21，菌株LSKO的表面电荷降低，由于表面电荷降低，互斥力减少，致使LSKO菌株更容易吸附在一起发生自凝絮。并且随着培养时间延长，凝絮效果越来越明显，如图2所示，示出了LSKO菌株随着培养时间的自凝絮情况，结果显示随着培养时间的延长，发生自凝絮的菌株越来越多，产生的自凝絮菌体团块直径越来越大。

表3：不同盐浓度下盐单胞菌LSKO菌株与LS21菌株的Zeta电位比较

本发明人还对盐单胞菌LSKO的自凝絮和自沉降与溶液中的盐浓度之间的关系进行了试验。其中自凝絮和自沉降是指细胞在自凝絮后，会由于重力作用沉降，沉降度％＝(菌液总OD600-沉降后上清OD600)/菌液总OD600(Zhao,Ning等."FlocculatingZymomonasmobilis is a promising host to be engineered for fuel ethanolproduction fromlignocellulosicbiomass."BiotechnologyJournal 9.3(2014):362-371.)。

首先用40g/L氯化钠溶液洗涤两遍用LB培养基培养48小时的盐单胞菌LSKO菌体，获得的菌液等量加入4个试管中重悬，静置5分钟后，如图3中A幅所示，观察到4个试管中均出现自凝絮和自沉降现象；对图3中A幅中的4个试管分别进行离心，得到的沉淀菌体分别用0.02M的氯化钠溶液进行洗涤两遍，重悬，静置5分钟后，如图3中B幅所示，观察到4个试管中均没有自凝絮和自沉降现象的发生；对图3中B幅中的4个试管分别进行离心，得到的沉淀菌体分别用等体积的浓度分别为0.02M、0.04M、0.08M和0.1M的氯化钠溶液洗涤两遍，重悬，静置5分钟后，如图3中C幅所示，观察到在0.02M和0.04M氯化钠溶液的试管中没有发生自凝絮和自沉降现象，而在0.08M和0.1M氯化钠溶液试管中，自凝絮和自沉降现象稳定存在，也验证了菌体发生的自凝絮和自沉降是可逆的。结合上表3数据，菌株LSKO自凝絮和自沉降时的Zeta电位应不高于17.3±0.8mV，当高于上述电位时，菌株LSKO的自凝絮和自沉降现象消失。

本发明人设计另一试管实验，首先用0.1M氯化钠溶液洗涤两遍用LB培养基培养48小时的LSKO菌体，获得菌液，将菌液的OD600调节成4，然后取6ml菌液置于直径为1cm的试管中，用Votex混合均匀后静置。结果显示，试管中菌液能够在20秒内实现95％的自沉降度，沉降效果高于现有技术中报道的Zymomonasmobilis的沉降效果(Zhao,Ning等."Flocculating Zymomonasmobilis is a promising host to be engineered forfuelethanol production from lignocellulosic biomass."Biotechnology Journal9.3(2014):362-371.)。

本发明人设计另一发酵罐试验，在盐浓度为0.1M的发酵罐中培养菌株LSKO 48小时后，测定培养菌液OD600并停止搅拌和通气。结果显示，发酵罐中发酵菌液能够在1分钟内实现80％的自沉降度，这在之前是没有任何文献报道的。基于以上试验结果，菌株LSKO具有非常优异的自凝絮和自沉降效果。

2.本发明人以盐单胞菌TD01(由本申请人于2010年11月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCCNo.4353。菌株名称为TD01，分类命名为盐单胞菌(Halomonas sp.))作为出发菌株(已在专利文献CN102120973A中公开)，通过以上获取盐单胞菌LSKO的方法获得阳性重组菌株，命名为盐单胞菌(Halomonasbluephagenesis)TDKO。

使用上表1所示的16S-F(SEQ ID NO:10)和16S-R(SEQ ID NO:11)引物检测上述菌株盐单胞菌TDKO的16S rDNA序列，得到盐单胞菌TDKO的16S rDNA序列为SEQ ID NO:13所示的序列。

采用以上相同方法，本发明人验证了菌株盐单胞菌TDKO的自凝絮和自沉降特性，获得与菌株盐单胞菌LSKO相似的结果，即在适宜的盐浓度下可以实现良好的自凝絮和自沉降效果，并且这种自凝絮和自沉降的特性也是可逆的，在此不再一一赘述。

依据实施例1方法获得的其它具有自凝絮和自沉降特性的菌株也属于本申请。利用本领域技术人员已知的其他方法，例如物理诱变、化学诱变方法等获得的其它具有自凝絮和自沉降特性的菌株也属于本申请。

实施例2：使用循环利用废水连续发酵培养方法培养微生物生产聚-3-羟基丁酸酯 (PHB)

为了验证本发明的循环利用废水连续发酵培养微生物的方法的可行性和有效性，在该实施例中，以上述实施例1获得的具有自凝絮和自沉降特性的盐单胞菌LSKO为例，用于以下的循环利用废水连续发酵培养微生物的方法中，本实施例还进一步用发酵培养的微生物生产PHB。

循环利用废水连续发酵培养微生物的过程如下：

S1：将具有自凝絮和自沉降特性的细菌(该实施例使用盐单胞菌LSKO)接种到初始发酵培养基中进行发酵培养；

S2：经过第一发酵培养后，从第一发酵产物中分离第一自沉降的细菌菌体，将洗涤所述第一自沉降的细菌菌体产生的废水加入剩余的第一上清，继续第二发酵培养；

S3：经过第二发酵培养后，从第二发酵产物中分离第二自沉降的细菌菌体，将洗涤所述第二自沉降的细菌菌体产生的废水加入剩余的第二上清，继续下一发酵培养；

S4：重复所述步骤S3连续N次，N为自然数(0、1、2、……)；

S5：合并各步骤洗涤后的细菌菌体为收获的微生物。

进一步，利用S5收获的微生物盐单胞菌LSKO菌体生产PHB。

盐单胞菌LSKO的发酵培养过程是在搅拌和通气条件下进行的，初始发酵培养的搅拌转速为200-250RPM，培养大概5-8小时后搅拌转速稳定在700-800RPM；培养过程中的通气速率为1vvm。另外，整个发酵培养过程稳定在20℃-45℃温度条件下，培养体系的pH值为5.0-11.0，可以在培养过程中补充酸碱来维持该pH条件。培养过程中培养体系中氯化钠的浓度维持在0.08mol/L或以上，该实施例选择稳定在0.08mol/L左右。

上述步骤S1中，将盐单胞菌LSKO在发酵罐中发酵培养，发酵罐中事先盛放有初始发酵培养基(培养基的成分将在下面描述)，其初始溶氧为5％-100％，盐单胞菌LSKO的初始接种量为OD600为2-4。

上述1升初始发酵培养基由氯化钠20g-200g、葡萄糖5g-100g、酵母粉0g-50g、氯化铵0.5g-20g、尿素0g-20g、硫酸镁0.1g-5g、磷酸二氢钾0.5g-10g、十二水合磷酸氢二钠1g-20g、1mL-30mL微量元素I和0.1mL-10mL微量元素II和自来水组成，用自来水定容至1升；

其中1升所述微量元素I按照如下方法制备：将柠檬酸铁铵2g-10g、二水合氯化钙1g-5g和0.5mol/L盐酸水溶液混合，用0.5mol/L盐酸水溶液补足至1升，得到所述微量元素I；1升微量元素II按照如下方法制备：将七水合硫酸锌50mg-200mg、四水合氯化锰10mg-50mg、硼酸100mg-500mg、六水合氯化钴50mg-400mg、五水合硫酸铜3mg-30mg、六水合氯化镍5mg-50mg、二水合钼酸钠10mg-50mg和0.5mol/L盐酸水溶液混合，用0.5mol/L盐酸水溶液补足至1升，得到所述微量元素II。

上述步骤S2和S3中，当盐单胞菌LSKO在初始发酵培养基中经过48小时培养的第一轮发酵结束后，停止搅拌和通气，静置大约5分钟后就会观察到有大量的菌体自凝絮和自沉降，持续静置大约30分钟就可以观察到发酵产物已经明显分层，下层自沉降的菌体可以通过打开发酵罐底部的阀门从发酵罐中取出，留下上清液(含有部分未分离的悬浮菌体)在发酵罐中，从而实现不经过离心便可以从发酵产物中分离出自沉降的菌体。分离的菌体经洗涤后用作PHB的提取，洗涤菌体产生的含盐废水加入发酵罐中留下的上清液中用于补充发酵液继续进行第二轮发酵培养。第二轮发酵培养开始时，发酵罐中的盐单胞菌LSKO的OD600大约为25-30，菌体的浓度高于起始发酵培养时接种的菌体的浓度，因此上述步骤S3中，第二轮的发酵培养只需要大约24小时就可以达到和第一轮培养相似的产量，培养24小时后，重复上述静置分层后从发酵罐底部分离自沉降的盐单胞菌LSKO菌体操作以及后续的下一轮发酵培养操作，从而实现连续发酵培养过程，并且整个发酵过程中可以循环利用废水，且无需离心，分离菌体过程耗时也较短，也无需后续步骤的灭菌和接种。

本实施例上述连续发酵培养微生物过程共持续了4轮。使用每轮获取的盐单胞菌LSKO菌体生产PHB(生产PHB方法参见Jiang,X.R.,Yao,Z.H.,&Chen,G.Q.(2017).Controlling cell volume for efficient PHB production byHalomonas.Metabolicengineering,44,30-37.)。

下表4列出了基于盐单胞菌LSKO的连续发酵培养方法获得的微生物以生产PHB的产率与使用传统工艺(参见文献Jiang,X.R.,Yao,Z.H.,&Chen,G.Q.(2017).Controllingcell volume for efficient PHB production by Halomonas.Metabolicengineering,44,30-37.)获得的产率的对比，结果表明使用循环利用废水连续发酵培养方法的产率得到了明显的提高：表4数据显示，细胞干重(CDW)从传统工艺0.45g/L/h提升到0.82g/L/h；PHB从传统工艺0.18g/L/h提升到0.33g/L/h，表明基于盐单胞菌LSKO的循环利用废水连续发酵培养方法确实能够提高产率。并且在整个发酵培养、生产PHB过程中可以循环利用产生的废水，且省去了离心分离菌体和后续灭菌、接种的操作，不仅仅节约了资源，还降低了能耗，使生产成本显著降低。

表4：循环利用废水连续发酵培养方法生产PHB与传统方法生产PHB产率对比

注：上表4中产率计算方法为：分别将最终收获细胞干重和PHB的产量(单位g/L)除以生产工艺耗时，即得到产率(单位g/L/h)。

本实施例循环利用废水连续发酵培养微生物的方法同样适用于其它已有的或改造的具有自凝絮和自沉降特性的微生物，同样能完成循环利用废水、连续大规模发酵培养微生物的过程。所培养的微生物不限于为能生产PHB的微生物。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 清华大学

<120> 一种循环利用废水连续发酵培养微生物的方法及其所用具有自凝絮和自沉降特性的细菌

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aattgctgct gagagcagtc ttcatgcagt tcacttacac cg 42

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aacccaagga ggcctcatta cgggccctat cacttattca g 41

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

taatgaggcc tccttgggtt 20

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcgctgctgt tccaccat 18

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gatcacggca tgttagcaat ctt 23

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gactgctctc agcagcaatt 20

<210> 7

<211> 5228

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aattgctgct gagagcagtc ttcatgcagt tcacttacac cgcttctcaa cccggtacgc 60

accagaaaat cattgatatg gccatgaatg gcgtttgaat tgtgattaaa aaggcaactt 120

tatgcccatg caacagaaac tataaaaaat acagagaatg aaaagaaaca gatagatttt 180

ttagttcttt aggcccgtag tctgcaaatc cttttatgat tttctatcaa acaaaagagg 240

aaaatagacc agttgcaatc caaacgagag tctaatagaa tgaggtcgaa aagtaaatcg 300

cgcgggtttg ttactgataa agcaggcaag acctaaaatg tgtaaagggc aaagtgtata 360

ctttggcgtc accccttaca tattttaggt ctttttttat tgtgcgtaac taacttgcca 420

tcttcaaaca ggagggctgg aagaagcaga ccgctaacac agtacataaa aaaggagaca 480

tgaacgatga acatcaaaaa gtttgcaaaa caagcaacag tattaacctt tactaccgca 540

ctgctggcag gaggcgcaac tcaagcgttt gcgaaagaaa cgaaccaaaa gccatataag 600

gaaacatacg gcatttccca tattacacgc catgatatgc tgcaaatccc tgaacagcaa 660

aaaaatgaaa aatatcaagt tcctgagttc gattcgtcca caattaaaaa tatctcttct 720

gcaaaaggcc tggacgtttg ggacagctgg ccattacaaa acgctgacgg cactgtcgca 780

aactatcacg gctaccacat cgtctttgca ttagccggag atcctaaaaa tgcggatgac 840

acatcgattt acatgttcta tcaaaaagtc ggcgaaactt ctattgacag ctggaaaaac 900

gctggccgcg tctttaaaga cagcgacaaa ttcgatgcaa atgattctat cctaaaagac 960

caaacacaag aatggtcagg ttcagccaca tttacatctg acggaaaaat ccgtttattc 1020

tacactgatt tctccggtaa acattacggc aaacaaacac tgacaactgc acaagttaac 1080

gtatcagcat cagacagctc tttgaacatc aacggtgtag aggattataa atcaatcttt 1140

gacggtgacg gaaaaacgta tcaaaatgta caattaccct gttatcccta ccaccacgat 1200

ctcggcgtcg cccgccatga tcgcgttggc ggccagcatc acggccttca ggcccgagcc 1260

gcacaccttg ttgatggtca tggccggcac catcgccggc aggccggcct tgatcgcggc 1320

ctggcgtgcg gggttctggc ccgaaccggc ggtcagcacc tggcccatga tgacttcgct 1380

cacctgctcc ggcttgacgc cggcgcgctc cagcgcggcc ttgatgacca cggcacccag 1440

tagggataac agggtaatgg taccattacc ctgttatccc tagtgttgac ggtcacgccc 1500

ttggtcgcca cttcctgcgc cagtgccatg gtgaagccat gcaggccggc cttggcggtg 1560

gagtagttgg tctggccgaa ctggcccttc tgcccgttca ccgacgagat gttgacgatg 1620

cggccccagc cacggtcggc catgccgtcg atcacctgct tggtgacgtt gaacagcgag 1680

gtcaggttgg tgtcgatcac cgcatcccag tcggcgcggg tcatcttgcg gaacataggg 1740

ataacagggt aatgtgcaca ttaccctgtt atccctaaac tgcacatggc cctcgtcgac 1800

aaagacgtcg aggatgcccg tgtcggcaaa gtccagcagc gtggtcagca gcgtgacgct 1860

ggcggccggg tgctcgccgc gcgcggccag caccgccagc gcggtcgaga caatggtgcc 1920

gcccacgcag aagccgagca cgttgatctt gtcctggccg ctgatgtcgc gcgcgacttc 1980

gatggcgcgg atggccgcgt gctcgatgta gtcgtcccag gtgctgctag ggataacagg 2040

gtaatcatat gaactatata aaagcaggca aatggctaac cgtattccta accttttgaa 2100

ttcgatcgct agtttgtttt gactccatcc attagggctt ctaaaacgcc ttctaaggcc 2160

atgtcagccg ttaagtgttc ctgtgtcact gaaaattgct ttgagaggct ctaagggctt 2220

ctcagtgcgt tacatccctg gcttgttgtc cacaaccgtt aaaccttaaa agctttaaaa 2280

gccttatata ttcttttttt tcttataaaa cttaaaacct tagaggctat ttaagttgct 2340

gatttatatt aattttattg ttcaaacatg agagcttagt acgtgaaaca tgagagctta 2400

gtacgttagc catgagagct tagtacgtta gccatgaggg tttagttcgt taaacatgag 2460

agcttagtac gttaaacatg agagcttagt acgtgaaaca tgagagctta gtacgtacta 2520

tcaacaggtt gaactgctgg atcgatcctt tttgtccggt gttgggttga aggtgaagcc 2580

ggtcggggcc gcagcggggg ccggcttttc agccttgccc ccctgcttcg gccgccgtgg 2640

ctccggcgtc ttgggtgccg gcgcgggttc cgcagccttg gcctgcggtg cgggcacatc 2700

ggcgggcttg gccttgatgt gccgcctggc gtgcgagcgg aacgtctcgt aggagaactt 2760

gaccttcccc gtttcccgca tgtgctccca aatggtgacg agcgcatagc cggacgctaa 2820

cgccgcctcg acatccgccc tcaccgccag gaacgcaacc gcagcctcat cacgccggcg 2880

cttcttggcc gcgcgggatt caacccactc ggccagctcg tcggtgtagc tctttggcat 2940

cgtctctcgc ctgtcccctc agttcagtaa tttcctgcat ttgcctgttt ccagtcggta 3000

gatattccac aaaacagcag ggaagcagcg cttttccgct gcataaccct gcttcggggt 3060

cattatagcg attttttcgg tatatccatc ctttttcgca cgatatacag gattttgcca 3120

aagggttcgt gtagactttc cttggtgtat ccaacggcgt cagccgggca ggataggtga 3180

agtaggccca cccgcgagcg ggtgttcctt cttcactgtc ccttattcgc acctggcggt 3240

gctcaacggg aatcctgctc tgcgaggctg gccggctacc gccggcgtaa cagatgaggg 3300

caagcggatg gctgatgaaa ccaagccaac caggaagggc agcccaccta tcaaggtgta 3360

ctgccttcca gacgaacgaa gagcgattga ggaaaaggcg gcggcggccg gcatgagcct 3420

gtcggcctac ctgctggccg tcggccaggg ctacaaaatc acgggcgtcg tggactatga 3480

gcacgtccgc gagctggccc gcatcaatgg cgacctgggc cgcctgggcg gcctgctgaa 3540

actctggctc accgacgacc cgcgcacggc gcggttcggt gatgccacga tcctcgccct 3600

gctggcgaag atcgaagaga agcaggacga gcttggcaag gtcatgatgg gcgtggtccg 3660

cccgagggca gagccatgac ttttttagcc gctaaaacgg ccggggggtg cgcgtgattg 3720

ccaagcacgt ccccatgcgc tccatcaaga agagcgactt cgcggagctg gtgaagtaca 3780

tcaccgacga gcaaggcaag accgagcgcc tgggtcacgt gcgcgtcacg aactgcgagg 3840

caaacaccct gcccgctgtc atggccgagg tgatggcgac ccagcacggc aacacccgtt 3900

ccgaggccga caagacctat cacctgctgg ttagcttccg cgcgggagag aagcccgacg 3960

cggagacgtt gcgcgcgatt gaggaccgca tctgcgctgg gcttggcttc gccgagcatc 4020

agcgcgtcag tgccgtgcat cacgacaccg acaacctgca catccatatc gccatcaaca 4080

agattcaccc gacccgaaac accatccatg agccgtatcg ggcctaccgc gccctcgctg 4140

acctctgcgc gacgctcgaa cgggactacg ggcttgagcg tgacaatcac gaaacgcggc 4200

agcgcgtttc cgagaaccgc gcgaacgaca tggagcggca cgcgggcgtg gaaagcctgg 4260

tcggctggat cgggccctaa atacctgtga cggaagatca cttcgcagaa taaataaatc 4320

ctggtgtccc tgttgatacc gggaagccct gggccaactt ttggcgaaaa tgagacgttg 4380

atcggcacgt aagaggttcc aactttcacc ataatgaaat aagatcacta ccgggcgtat 4440

tttttgagtt atcgagattt tcaggagcta aggaagctaa aatggagaaa aaaatcactg 4500

gatataccac cgttgatata tcccaatggc atcgtaaaga acattttgag gcatttcagt 4560

cagttgctca atgtacctat aaccagaccg ttcagctgga tattacggcc tttttaaaga 4620

ccgtaaagaa aaataagcac aagttttatc cggcctttat tcacattctt gcccgcctga 4680

tgaatgctca tccggaattc cgtatggcaa tgaaagacgg tgagctggtg atatgggata 4740

gtgttcaccc ttgttacacc gttttccatg agcaaactga aacgttttca tcgctctgga 4800

gtgaatacca cgacgatttc cggcagtttc tacacatata ttcgcaagat gtggcgtgtt 4860

acggtgaaaa cctggcctat ttccctaaag ggtttattga gaatatgttt ttcgtctcag 4920

ccaatccctg ggtgagtttc accagttttg atttaaacgt ggccaatatg gacaacttct 4980

tcgcccccgt tttcaccatg ggcaaatatt atacgcaagg cgacaaggtg ctgatgccgc 5040

tggcgattca ggttcatcat gccgtctgtg atggcttcca tgtcggcaga atgcttaatg 5100

aattacaaca gtactgcgat gagtggcagg gcggggcgta atttttttaa ggcagttatt 5160

ggtgccctta aacgcctggt gctacgcctg aataagtgat agggcccgta atgaggcctc 5220

cttgggtt 5228

<210> 8

<211> 586

<212> DNA

<213> 盐单胞菌(Halomonas sp.)

<400> 8

taatgaggcc tccttgggtt ggcgctgcac tacccgtggc gccgctggaa gcctggatat 60

ccagcgccct ctgccgcggg ttgccctggc actggccgag tgcgctgagc cggtggatga 120

gacgcggcat gcggccgagc gccagacctt ggcagcgcca attcccacca ctctatcgcg 180

cattgaagat ctggggcagg tggcagtgga tcccgctggc gtggcgttgg ccgaggctga 240

attcatcctc tctggtggca atggtgttaa acagtgggac gccttccacc atgctgcgaa 300

agtactaggc gctaccgaag gggcctcgcg tgtcgcggtg gatgacggct ttatggctcg 360

tgatcggcag gtaggtgcaa ccggcacctg ggtaaccgcc cgagtctata tggcggtggg 420

tatttcaggc gcgatccagc acctacaggg cattcagcgc tgcgacaagg tggtggcaat 480

caatctcgat ccggggtgcg acatgatcaa acgcgcagac ctggcggtga taggcgacag 540

cacgcaaatt cttgctgcgt tagtggcgat ggtggaacag cagcga 586

<210> 9

<211> 493

<212> DNA

<213> 盐单胞菌(Halomonas sp.)

<400> 9

gatcacggca tgttagcaat cttaaagccc gccctctgtt ggcgggcttc ttgttatcta 60

ttgtttaatc tctgagtctt tattttcgaa gcctttacgt tttaagtctt tacgttctct 120

gtcgttatct tcttctatgt tgttatgacc tacttgccag taaagcctgg ataaagccgc 180

aggcgctgtc tttccaggtg taaacccatc caggcgtgta gtactagtac cgtgatgacg 240

atggccccgc ccagtagcgt tgatgccgtc ggcgtctcgc ctagtagcca ccaaacccat 300

agtgtgccca atgcggtttc caccaggtaa aacagtgcca cctcggtaga cggcaggtaa 360

cgggtggcgc tattgatcag caccgtggcc aggggcatct gcactagccc catcagtgcc 420

agcacgccat aacgctcggc atcaagcgcc agcggcgagg ccatgggcag agcaattgct 480

gctgagagca gtc 493

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agagtttgat catggctcag 20

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tacggctacc ttgttacgac tt 22

<210> 12

<211> 1530

<212> DNA

<213> 盐单胞菌(Halomonas sp.)

<400> 12

tgaagagttt gatcatggct cagattgaac gctggcggca ggcctaacac atgcaagtcg 60

agcggtaaca ggggtagctt gctacccgct gacgagcggc ggacgggtga gtaatgcata 120

ggaatctgcc cgatagtggg ggataacctg gggaaaccca ggctaatacc gcatacgtcc 180

tacgggagaa agggggctcc ggctcccgct attggatgag cctatgtcgg attagctagt 240

tggtgaggta atggctcacc aaggcaacga tccgtagctg gtctgagagg atgatcagcc 300

acatcgggac tgagacacgg cccgaactcc tacgggaggc agcagtgggg aatattggac 360

aatgggcgaa agcctgatcc agccatgccg cgtgtgtgaa gaaggccttc gggttgtaaa 420

gcactttcag cgaggaagaa cgcctagtgg ttaataccca ttaggaaaga catcactcgc 480

agaagaagca ccggctaact ccgtgccagc agccgcggta atacggaggg tgcaagcgtt 540

aatcggaatt actgggcgta aagcgcgcgt aggtggcttg ataagccggt tgtgaaagcc 600

ccgggctcaa cctgggaacg gcatccggaa ctgtcaagct agagtgcagg agaggaaggt 660

agaattcccg gtgtagcggt gaaatgcgta gagatcggga ggaataccag tggcgaaggc 720

ggccttctgg actgacactg acactgaggt gcgaaagcgt gggtagcaaa caggattaga 780

taccctggta gtccacgccg taaacgatgt cgaccagccg ttgggtgcct agcgcacttt 840

gtggcgaagt taacgcgata agtcgaccgc ctggggagta cggccgcaag gttaaaactc 900

aaatgaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gatgcaacgc 960

gaagaacctt acctactctt gacatcctgc gaacttgtga gagatcactt ggtgccttcg 1020

ggaacgcaga gacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg tgttgtgaaa tgttgggtta 1080

agtcccgtaa cgagcgcaac ccttgtcctt atttgccagc gggtaatgcc gggaactcta 1140

aggagactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggacga cgtcaagtca tcatggccct 1200

tacgagtagg gctacacacg tgctacaatg gccggtacaa agggttgcga gctcgcgaga 1260

gtcagctaat cccgaaaagc cggtctcagt ccggatcgga gtctgcaact cgactccgtg 1320

aagtcggaat cgctagtaat cgtgaatcag aatgtcacgg tgaatacgtt cccgggcctt 1380

gtacacaccg cccgtcacac catgggagtg gactgcacca gaagtggtta gcttaacctt 1440

cgggaaagcg atcaccacgg tgtggttcat gactggggtg aagtcgtaac aaggtagccg 1500

taggggaacc tgcggctgga tcacctcctt 1530

<210> 13

<211> 1528

<212> DNA

<213> 盐单胞菌(Halomonas sp.)

<400> 13

tgaagagttt gatcatggct cagattgaac gctggcggca ggcctaacac atgcaagtcg 60

agcggtaaca ggggtagctt gctacccgct gacgagcggc ggacgggtga gtaatgcata 120

ggaatctgcc cggtagtggg ggataacctg gggaaaccca ggctaatacc gcatacgtcc 180

tacgggagaa agggggctcc ggctcccgct attggatgag cctatgtcgg attagctagt 240

tggtgaggta atggctcacc aaggcaacga tccgtagctg gtctgagagg atgatcagcc 300

acatcgggac tgagacacgg cccgaactcc tacgggaggc agcagtgggg aatattggac 360

aatgggggca accctgatcc agccatgccg cgtgtgtgaa gaaggccttc gggttgtaaa 420

gcactttcag cgaggaagaa cgcctagtgg ttaataccca ttaggaaaga catcactcgc 480

agaagaagca ccggctaact ccgtgccagc agccgcggta atacggaggg tgcaagcgtt 540

aatcggaatt actgggcgta aagcgcgcgt aggtggcttg ataagccggt tgtgaaagcc 600

ccgggctcaa cctgggaacg gcatccggaa ctgtcaagct agagtgcagg agaggaaggt 660

agaattcccg gtgtagcggt gaaatgcgta gagatcggga ggaataccag tggcgaaggc 720

ggccttctgg actgacactg acactgaggt gcgaaagcgt gggtagcaaa caggattaga 780

taccctggta gtccacgccg taaacgatgt cgaccagccg ttgggtgcct agcgcacttt 840

gtggcgaagt taacgcgata agtcgaccgc ctggggagta cggccgcaag gttaaaactc 900

aaatgaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gatgcaacgc 960

gaagaacctt acctactctt gacatcctgc gaacttgtga gagatcactt ggtgccttcg 1020

ggaacgcaga gacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg tgttgtgaaa tgttgggtta 1080

agtcccgtaa cgagcgcaac ccttgtcctt atttgccagc gggtaatgcc gggaactcta 1140

aggagactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggacga cgtcaagtca tcatggccct 1200

tacgagtagg gctacacacg tgctacaatg gccggtacaa agggttgcga gctcgcgaga 1260

gtcagctaat cccgaaaagc cggtctcagt ccggatcgga gtctgcaact cgactccgtg 1320

aagtcggaat cgctagtaat cgtgaatcag aatgtcacgg tgaatacgtt cccgggcctt 1380

gtacacaccg cccgtcacac catgggagtg gactgcacca gaagtggtta gcctaacgca 1440

agagggcgat caccacggtg tggttcatga ctggggtgaa gtcgtaacaa ggtagccgta 1500

ggggaacctg cggctggatc acctcctt 1528

Claims (6)

1.一种循环利用废水连续发酵培养微生物的方法，其特征在于，

包括：

S1：将具有自凝絮和自沉降特性的细菌接种到初始发酵培养基中进行发酵培养；

S2：经过第一发酵培养后，从第一发酵产物中分离第一自沉降的细菌菌体，将洗涤所述第一自沉降的细菌菌体产生的废水加入分离后剩余的第一上清，继续第二发酵培养；

S3：经过第二发酵培养后，从第二发酵产物中分离第二自沉降的细菌菌体，将洗涤所述第二自沉降的细菌菌体产生的废水加入分离后剩余的第二上清，继续下一发酵培养；

S4：重复所述步骤S3连续N次，N为自然数；

S5：合并各步骤洗涤后的细菌菌体为收获的微生物,

所述具有自凝絮和自沉降特性的细菌为盐单胞菌(Halomonascampaniensis)LSKO，保藏号为CGMCCNo.16437。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

步骤S2和/或步骤S3中所述分离为从静置分层的发酵产物的下层获取自沉降的细菌菌体。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述静置分层的时间为10-30min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述自凝絮和自沉降特性是指细菌在不低于0.08M盐浓度条件下能发生自凝絮和自沉降。

5.权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，

所述发酵培养的体系中盐浓度不低于0.08mol/L；和/或

步骤S1中所述具有自凝絮和自沉降特性的细菌在初始发酵培养基中的OD600为2-4；和/或

步骤S2中所述第一发酵培养的时间为44-52h；和/或

步骤S3中所述第二发酵培养的时间为20-28h。

6.一种具有自凝絮和自沉降特性的细菌，其特征在于，

所述细菌在不低于0.08M盐浓度条件下能发生自凝絮和自沉降；所述细菌为盐单胞菌(Halomonascampaniensis)LSKO，保藏号为CGMCC No.16437。

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