CN112684089A - 基于超高效合相色谱技术的保健食品中肉碱对映体拆分和测定方法 - Google Patents

基于超高效合相色谱技术的保健食品中肉碱对映体拆分和测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明保健食品残留的检测方法，尤其涉及一种保健食品中左旋肉碱和右旋肉碱对映体的残留量的测定方法。该方法采用超高效合相色谱法拆分肉碱对映体，并测定了保健食品中左旋肉碱和右旋肉碱对映体的残留量。样品经无水乙醇超声提取，衍生化后，Acquity Trefoil CEL1手性色谱柱分离，以超临界二氧化碳‑1%(v/v)氨水甲醇等助溶剂为流动相进行梯度洗脱，外标法定量。结果表明，两种化合物在0.5~10.0 mg/L范围内线性相关系数大于0.999，定量限为50 mg/kg，回收率在89.2％~110％，相对标准偏差在4.3%~6.9％。本方法具有快速准确、分离效率高、重复性高、稳定性好等特点，可用于同时测定保健食品中左旋肉碱含量与纯度的分析，为手性药物开发、使用及相关法规的制定提供科学支撑。

Description

基于超高效合相色谱技术的保健食品中肉碱对映体拆分和测 定方法
技术领域
本发明保健食品的残留检测方法，尤其涉及一种保健食品中左旋肉碱和右旋肉碱对映体的残留量的测定方法。
背景技术
肉碱的化学名称为β-羟基-γ-三甲胺基丁酸,其分子中含有1个手性碳原子,具有L-型 (左旋)与D-型(右旋)对映异构体。其中左旋肉碱(L-Carnitine)，又称卡尼丁或L-肉碱，广泛存在于大多数哺乳动物组织中，能够促进脂肪酸向线粒体中传输，达到氧化分解脂肪的功效[1]。左旋肉碱缺乏将干扰脂肪酸的代谢而导致能量合成不足，出现易疲劳、肌肉无力、心慌等症状，严重者出现代谢紊乱、昏迷甚至死亡。而D-型肉碱不但没有生理活性，甚至具有毒性，大剂量的情况下对人和动物都有害[2]。目前，市售保健品中所用的左旋肉碱主要是采用生产成本低廉的化学合成法，生产出的肉碱一般是L-肉碱和D-肉碱的混合物，然后用分离的方法将D-肉碱从L-肉碱中分离出去，从而获得L-肉碱，该方法难以做到彻底分离D-肉碱[3]。因此，迫切需要建立一种测定保健食品中L-肉碱的含量与纯度的分析方法。
目前L-肉碱的检测方法主要为分光光度法[4-5]、高效液相色谱法(HPLC)[6-7]、高效液相色谱-串联质谱法[5,8-10]等，但对L-肉碱与D-肉碱对映异构体的拆分并进行含量测定的色谱条件方法报道较少。由于肉碱分子极性较大,色谱柱上很难保留，对映体分离度差，缺少发色基团，导致其在紫外可见光区吸收极弱,灵敏度低,难以在普通液相色谱中直接检测，故分离肉碱对映体须使用手性拆分技术。翟旭峰[11]等采用L-丙氨酸-β-萘胺为衍生化试剂,成功对乙酰肉碱对映体进行拆分，但这些方法通常存在分离效率低、分析时间长、重现性低等问题。近年来超高效合相色谱(UPC2)受到了广泛关注。UPC2技术在传统液相色谱法的基础上，以超临界CO2为主要流动相，它是一种介于气体和液体之间的超临界流体，黏度低，扩散率高，传质快，从而为其提供了比传统液相色谱更快的分离速度和更高的***分辨率。研究表明，UPC2技术更适合于分析传统液相色谱难以处理的同分异构体和结构类似物，已成功用于多种化合物的分离检测，如维生素[12]、邻苯二甲酸酯[13]和紫外吸收剂[14]等。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明的目的是提供一种基于超高效合相色谱技术的保健食品中肉碱对映体拆分和测定方法，该方法通过前处理方法、衍生时间、衍生温度、仪器色谱条件等主要参数进行考察优化，建立了同时测定保健食品中左旋肉碱含量和纯度的方法，并对市售保健品和外消旋体肉碱标准品进行了分析测定。研究结果表明，本方法具有快速准确、分离效率高、重复性高、稳定性好等特点，能够满足保健食品中左旋肉碱的快速定量及纯度分析需要。
为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案：
基于超高效合相色谱技术的保健食品中肉碱对映体拆分和测定方法，该方法包括以下的步骤：
一、样品提取
取保健品片剂、胶囊或颗粒，研细，准确称取1.0g样品，置于50mL容量瓶中，加入适量无水乙醇，超声提取20min，冷却至室温后加无水乙醇定容，取适量定溶液至离心管中，高速离心5min后，所得上清液待进一步衍生制备样品溶液；
二、标准溶液制备
移取0.5mL L-肉碱、D-肉碱两种对映体的混合工作溶液于10mL离心管中，再进一步衍生，制备成浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0mg/L的标准溶液；
步骤一、步骤二中所述的衍生如下所示：
取0.5mL上清液或混合工作溶液至离心管中，加入0.5mL衍生试剂，涡旋混匀，依次加入0.5mL催化剂Ⅰ和0.5mL催化剂Ⅱ，涡旋混匀3min，20℃衍生化60min后，加入2.0 mL反应终止液，涡旋混匀1分钟后，离心5000r/min，5min，移取上层水相于100mL圆底烧瓶中，浓缩至近干，向浓缩瓶中加入1mL无水乙醇，涡旋溶解充分，过0.22μm滤膜入进样小瓶；
所述的衍生试剂为0.45g/100mL的L-丙氨酸-β萘胺-乙腈溶液，所述的催化剂Ⅰ为0.50 g/100mL的三乙胺-三氯甲烷溶液，所述的催化剂Ⅱ为0.50g/100mL的氯甲酸丁酯-三氯甲烷溶液，反应终止液为0.42g/100mL的碳酸氢钠-水溶液；
三、标准溶液和样品溶液分别进行超高效合相色谱分析
分析条件如下：
色谱柱：Acquity Trefoil CEL1，填料为纤维素-三(3,4-二甲基苯基氨基甲酸酯)；
流动相：A为CO2，B为1％(v/v)氨水甲醇溶液；
梯度洗脱程序：0～7min，流动相90％(v/v)A-10％(v/v)B；7～9min，流动相90-72％ (v/v)A-10％～28％(v/v)B；9～12min，流动相72％(v/v)A-28％(v/v)B；12～13min，流动相72-90％(v/v)A-28％～10％(v/v)B；13～14min，流动相90％(v/v)A-10％(v/v) B；
***背压：13.8MPa；流速：1.0mL/min；进样量：5μL；柱温：40℃；检测波长：244 nm；
四、制作标准曲线并通过标准曲线计算样品溶液中L-肉碱、D-肉碱的含量与纯度。
作为优选，本申请L-肉碱、D-肉碱两种肉碱对映体的回收率范围为89.2％～110％，相对标准偏差(RSD，n＝6)范围为4.3％～6.9％。
进一步，本发明还公开了一种基于超高效合相色谱技术的保健食品中肉碱对映体拆分和测定的试剂盒，该试剂盒包括衍生试剂、催化剂Ⅰ、催化剂Ⅱ和反应终止液；所述的衍生试剂为0.45g/100mL的L-丙氨酸-β萘胺-乙腈溶液，所述的催化剂Ⅰ为0.50g/100mL的三乙胺-三氯甲烷溶液，所述的催化剂Ⅱ为0.50g/100mL的氯甲酸丁酯-三氯甲烷溶液，反应终止液为0.42g/100mL的碳酸氢钠-水溶液。
本发明建立了同时测定保健品中左旋肉碱含量与纯度的方法，并对市售保健品和外消旋体肉碱标准品进行了分析测定。该方法具有快速准确、分离效率高、重复性高、稳定性好等特点，为保健食品中左旋肉碱含量与纯度的测定提供了参考方法。
附图说明
图1为两种已衍生酰化后的肉碱对映体标准溶液在无水乙醇中60天内的稳定性考察(D- 肉碱和L-肉碱)。
图2为衍生温度和衍生时间对衍生反应的影响(D-肉碱和L-肉碱)。
图3为不同助溶剂对两种肉碱对映体分离效果的影响(13.8MPa，40℃)。
图4为不同***背压对两种肉碱对映体分离效果的影响(1％(v/v)氨水甲醇溶液，40℃)。
图5为不同***色谱柱温度对两种肉碱对映体分离效果的影响(1％(v/v)氨水甲醇溶液， 13.8MPa)。
具体实施方式
1实验部分
1.1仪器、材料与试剂
超高效合相色谱仪(美国沃特世公司)；台式离心机(美国Thermo公司)；R215旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司)；AE260电子天平(瑞士Mettler公司)；MS2涡旋混匀器(上海医大仪器厂)；超纯水净化***(英国Elga公司)；微孔过滤膜(0.22μm，有机相)；氮吹仪(日本东京理化公司)。
甲醇、乙腈、无水乙醇(色谱纯，西班牙Scharlau公司)；碳酸氢钠、氨水、三氯甲烷、三乙胺、氯甲酸丁酯(优级纯)；L-丙氨酸-β萘胺(上海安谱)；水为超纯水；其他实验所用试剂除特殊说明外均为分析纯。
肉碱外消旋体(纯度≥98％，美国SIGMA公司)。
两种对映体：L-肉碱(纯度为99.0％，德国Dr.E公司)、D-肉碱(纯度为99.8％，美国CATO 公司)。
1.2标准溶液及试剂配制
1.2.1外消旋体标准溶液
肉碱储备液(1.0g/L)：分别准确称取适量的上述肉碱外消旋体标准品，用无水乙醇溶解并定容，配成1.0g/L的标准储备液。
1.2.2对映体标准溶液
两种肉碱对映体储备液(1.0g/L)：分别准确称取适量的左旋肉碱对映体和右旋肉碱对映体标准品，用无水乙醇溶解并定容，配成1.0g/L的标准储备液。
混合标准工作溶液(用于保健食品样品残留实验分析)：准确吸取一定量的标准溶液，用无水乙醇逐级稀释至1.0、2.0、4.0、10.0、20.0mg/L的标准工作溶液。
1.2.3衍生剂溶液及终止液的配制
衍生试剂(L-丙氨酸-β萘胺)：称取0.45g L-丙氨酸-β萘胺，用乙腈溶解，并定容至100 mL。催化剂Ⅰ：称取0.50g三乙胺，加三氯甲烷混匀并定容至100mL。催化剂Ⅱ：称取0.50g氯甲酸丁酯，加三氯甲烷混匀并定容至100mL。反应终止液(50mmol/L碳酸氢钠溶液)：称取0.42g碳酸氢钠，加水溶解定容至100mL。
1.3样品前处理
1.3.1样品提取
取保健品片剂、胶囊或颗粒，研细，准确称取1.0g样品，置于50mL容量瓶中，加入适量无水乙醇，超声提取20min，冷却至室温后加无水乙醇定容，取适量定溶液至离心管中，高速离心5min后，所得上清液待进一步衍生。
1.3.2衍生
取0.5mL上清液至离心管中，加入0.5mL衍生试剂，涡旋混匀，依次加入0.5mL催化剂Ⅰ和0.5mL催化剂Ⅱ，涡旋混匀3min，20℃衍生化60min后，加入2.0mL反应终止液(50mmol/L碳酸氢钠水溶液)，涡旋混匀1分钟后，离心5000r/min，5min，移取上层水相于100mL圆底烧瓶中，浓缩至近干，向浓缩瓶中加入1mL无水乙醇，涡旋溶解充分，过0.22μm滤膜入进样小瓶。
1.4分析条件
色谱柱：Acquity Trefoil CEL1(3.0mm×150mm，2.5μm，填料为纤维素-三(3,4-二甲基苯基氨基甲酸酯)，美国Waters公司)；流动相：A为CO2，B为1％(v/v)氨水甲醇溶液；梯度洗脱程序：0～7min(10％B)，7～9min(10％～28％B)，9～12min(28％B)，12～13min(28％～10％B)，13～14min(10％B)；***背压：13.8MPa；流速：1.0mL/min；进样量： 5μL；柱温：40℃；检测波长：244nm。
1.5标准曲线的制作
移取0.5mL两种肉碱对映体的混合工作溶液于10mL离心管中，再按照“1.3.2”方法衍生，制备成浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0mg/L的标准溶液。
2结果与讨论
2.1稳定性的考察
肉碱对映体经衍生后于-20℃下保存放置。将刚衍生酰化后以及已衍生酰化并分别储存1， 3，5，7，14，30，60d的肉碱对映体的含量作图比较。结果显示，2种肉碱对映体衍生酰化后-20℃下放置30d之内的含量变化小于10％，放置30天以上含量变化大于10％(图1)，表明2种肉碱对映体衍生酰化后的溶液在30d内比较稳定。
2.2提取方法的优化
文献报道中通常采用乙腈[6-7]、无水乙醇[4]、甲醇[10]对肉碱进行提取。本文比较了上述溶剂的提取效率，结果所示，采用乙腈、无水乙醇、甲醇的提取效率分别为13％、98％、70％。因此，本发明采用无水乙醇进行提取。另外，实验对振荡和超声波提取方式进行了比较，结果显示超声波提取效率更佳。同时还考察超声提取时间，结果表明采用超声波提取20min的效果最佳，提取效率达到91％。因此确定超声提取20min为最佳提取条件。
2.3衍生条件的优化
国内外文献报道，氯甲酸乙酯[4]、氯甲酸丁酯[15]均可用作反应衍生剂，因氯甲酸乙酯沸点低，毒性较强，且不易购买，故选用氯甲酸丁酯做反应衍生剂。采用0.5mL衍生剂，随着肉碱对映体浓度(0.5、1.0、2.0、5.0、10.0mg/L)的增加，衍生产物呈相应的线性增加，说明0.5mL衍生剂对于高浓度的肉碱对映体反应也是完全的，故采用0.5mL衍生剂。
本发明考察了衍生温度对衍生产物的影响，选择衍生化时间30min，考察了不同衍生温度(4、20、40、60℃)对两种肉碱对映体衍生反应的影响，结果如图2所示。两种肉碱对映体从4℃开始随着衍生温度的升高，衍生产物迅速增加。而当衍生温度超过20℃时，肉碱衍生产物急剧减少。因此本方法选择20℃作为衍生反应温度。
在室温20℃条件下，进一步考察了不同衍生反应时间(10，30，60，90min)对两种肉碱对映体衍生反应的影响，结果如图2所示。随着衍生时间的增加，肉碱对映体衍生产物逐渐增加，当衍生时间超过60min时，衍生产物无明显增加。因此本发明选择60min作为衍生反应时间。因此本方法通过对影响衍生反应的主要因素进行优化，发现最佳衍生反应条件为20℃下反应60min，两种肉碱对映体衍生反应充分，且衍生产物的稳定性较好。
在其他条件不变的情况下，比较了两种肉碱对映体在衍生反应终止液体积分别为1.0mL、 2.0mL、3.0mL时的回收率。实验结果显示，两种肉碱对映体加入2.0mL衍生反应终止液的回收率均大于95％。因此本文采用加入2mL碳酸氢钠溶液终止衍生反应。
本发明还考察了定容试剂对两种肉碱对映体峰形的影响。结果表明，采用异丙醇-正庚烷 (1:1，v/v)溶液、甲醇、乙腈定容时，色谱图中出现很多杂峰。采用异丙醇、无水乙醇定容时，色谱图中出现杂峰较少，考虑到采用无水乙醇定容的色谱峰峰形更尖锐，因此本发明采用无水乙醇作为定容液。
2.4分离条件的优化
2.4.1色谱柱的优化
本发明中拆分的两种肉碱对映体，因结构非常相似，不易分离。因此，选择3种相同规格的手性分离色谱柱Acquity Trefoil AMY1(3.0mm×150mm，2.5μm)、Acquity TrefoilCEL1(3.0mm×150mm，2.5μm)和Acquity Trefoil CEL2(3.0mm×150mm，2.5μm)对两种肉碱对映体的拆分效果进行考察。结果表明，优化流动相后，采用Acquity Trefoil AMY1和Acquity Trefoil CEL2手性色谱柱分离时，色谱峰响应较低，分离度和峰形较差；采用Acquity Trefoil CEL1手性色谱柱分离时，峰形尖锐且对称性良好。因此后续实验选择Acquity Trefoil CEL1手性色谱柱对肉碱对映体进行分离。
2.4.2流动相中助溶剂的优化
UPC2采用超临界二氧化碳为主要流动相，通常加入少量有机助溶剂调节流动相的极性，以增强对目标物的溶解能力和洗脱能力，助溶剂的选择对目标物的出峰时间、出峰顺序和分离度均有重要影响[12]。为了获得良好的分离效果和峰形，本发明对助溶剂进行了考察。选择 Acquity Trefoil CEL1手性色谱柱，在背压13.8MPa、柱温40℃条件下，比较了乙腈、甲醇、异丙醇3种不同极性的助溶剂对肉碱分离效果的影响。结果显示，当使用乙腈、异丙醇和甲醇时，两种肉碱对映体的分离度均不佳、展宽明显，不过甲醇作为助溶剂的分离度略好。由于肉碱含有羟基，属于极性较强的化合物，加入氨水能够明显改善目标化合物的峰形。本文考察了0.1％(v/v)氨水甲醇溶液、0.5％(v/v)氨水甲醇溶液、1％(v/v)氨水甲醇溶液作为助溶剂的分离效果。如图3所示，随着氨水浓度的增加，两种肉碱对映体的峰形和分离效果得到明显的改善。考虑到色谱峰的分离效果和色谱柱的耐受性，本发明未继续提高氨水浓度进行考察，而选择1％(v/v)氨水甲醇溶液作为助溶剂。
2.4.3***背压的选择
超高效合相色谱中，***背压也是影响分离过程的重要因素之一，其主要作用是控制二氧化碳在整个操作过程中处于超临界流体状态。由于二氧化碳的温度超过31℃且压力超过 7.38MPa以上，CO2才会进入超临界二氧化碳状态。因此本发明以1％(v/v)氨水甲醇溶液作为助溶剂，在柱温40℃条件下考察了背压在10.3～20.7MPa范围内时对两种肉碱对映体分离效果的影响(图4)。结果显示，随着***背压升高，分析物出峰时间提前。当背压为10.3 MPa时，左旋肉碱峰形的展宽明显；升高背压至13.8MPa时，两种肉碱对映体峰形良好，且在11min内实现良好的基线分离；升高背压至17.2MPa时，两种肉碱的分离度降低；继续升高背压至20.7MPa时，***出现高压报警。综合考虑分析速度和分离效果，本发明选择13.8MPa为最佳***背压。
2.4.4色谱柱温度的选择
色谱柱温度是另一个影响二氧化碳超临界流体的重要因素。随着色谱柱温度的升高，二氧化碳超临界流体的黏度降低，密度减小，溶剂化能力降低，超临界流体可能对目标化合物的溶解及交换能力减弱，使得目标物的保留时间增大。考虑到Acquity TrefoilCEL1手性色谱柱的最高推荐运行温度为40℃，二氧化碳需超过31℃且压力超过7.38MPa以上，CO2才会进入超临界二氧化碳状态，因此本发明在***背压为13.8MPa的条件下考察了色谱柱温度在31～40℃范围内对目标物分离的影响(图5)。结果表明，随着柱温升高，目标物的保留时间逐渐延长。当柱温为31℃时，两种肉碱对映体的分离度不佳；升高柱温至35℃时，***出现高压报警；继续升高柱温至40℃时，两种肉碱对映体峰形良好，且在11min内实现良好的基线分离。因此，选择最佳色谱柱温度为40℃。
2.5线性范围、检出限和定量限
将衍生后左旋肉碱对映体和右旋肉碱对映体的系列混合标准溶液按上述色谱条件进行测定。以标准品的峰面积(Y)为纵坐标，对应质量浓度(X)为横坐标，绘制标准曲线，求得回归方程和相关系数。结果表明，两种肉碱对映体在0.5～10.0mg/L质量浓度范围内呈良好的线性关系，相关系数大于0.999。通过在空白的保健品样品中添加标准品，按照本方法进行测定，以信噪比S/N＝10计算定量限(LOQ)，得到两种肉碱对映体的LOQ为50mg/kg。
2.6回收率、准确度和精密度
采用分别在空白的固体类保健食品和液体类保健食品中添加标准溶液的方法进行添加回收率测定和方法的精密度测定，添加水平分别为50，100，500mg/kg，平行测定6次，计算加标回收率及相对标准偏差(RSD)，结果见表1。两种肉碱对映体的回收率范围为89.2％～110％，相对标准偏差(RSD，n＝6)范围为4.3％～6.9％。该回收率和精密度符合SN/T 0001-2016[16]的要求，能够满足不同剂型样品的分析要求，可用于日常分析的检测。
表1保健食品样品中2种肉碱对映体的加标回收率和相对标准偏差(n＝6)
Figure BDA0002899444210000081
2.7方法的应用
2.7.1实际样品的测试
为了考察本方法的有效性和实用性，应用所建立的方法对10种市售保健品中D-肉碱和L- 肉碱的含量进行检测。结果显示，10种保健品中均未检出D-肉碱，L-肉碱的含量为1.44～27.02 g/100g。欧盟规定左旋肉碱的每日限量为2g[17]，中国L-肉碱的用量主要参考欧盟的规定，该 10种左旋肉碱保健食品中的推荐服用量均符合欧盟和中国规定的要求。
2.7.2外消旋体标准品的拆分
应用所建立的方法对所采购的肉碱外消旋体标准品进行拆分及测定。结果显示，肉碱外消旋体含有L-肉碱和D-肉碱两种对映体，L–肉碱占比48.8％，D–肉碱占比51.2％，两种对映体之间的比例与文献[3]报道相符。
3.0结论
本文通过前处理方法、衍生时间、衍生温度、仪器色谱条件等主要参数进行考察优化，建立了同时测定保健食品中左旋肉碱含量和纯度的方法，并对市售保健品和外消旋体肉碱标准品进行了分析测定。研究结果表明，本方法具有快速准确、分离效率高、重复性高、稳定性好等特点，能够满足保健食品中左旋肉碱的快速定量及纯度分析需要。
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Claims (3)

1.基于超高效合相色谱技术的保健食品中肉碱对映体拆分和测定方法，其特征在于，该方法包括以下的步骤：
一、样品提取
取保健品片剂、胶囊或颗粒，研细，准确称取1.0 g样品，置于50 mL容量瓶中，加入适量无水乙醇，超声提取20 min，冷却至室温后加无水乙醇定容，取适量定溶液至离心管中，高速离心5 min后，所得上清液待进一步衍生制备样品溶液；
二、标准溶液制备
移取0.5 mL L-肉碱、D-肉碱两种对映体的混合工作溶液于10 mL离心管中，再进一步衍生，制备成浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/L的标准溶液；
步骤一、步骤二中所述的衍生如下所示：
取0.5mL上清液或混合工作溶液至离心管中，加入0.5 mL衍生试剂，涡旋混匀，依次加入0.5 mL催化剂Ⅰ和0.5 mL催化剂Ⅱ，涡旋混匀3 min，20 ℃衍生化60 min后，加入2.0 mL反应终止液，涡旋混匀1分钟后，离心5000 r/min，5 min，移取上层水相于100 mL 圆底烧瓶中，浓缩至近干，向浓缩瓶中加入1 mL 无水乙醇，涡旋溶解充分，过0.22 µm 滤膜入进样小瓶；
所述的衍生试剂为0.45g/100 mL的L-丙氨酸-β萘胺-乙腈溶液，所述的催化剂Ⅰ为0.50g /100mL的三乙胺-三氯甲烷溶液，所述的催化剂Ⅱ为0.50 g /100mL的氯甲酸丁酯-三氯甲烷溶液，反应终止液为0.42 g/100mL的碳酸氢钠-水溶液；
三、标准溶液和样品溶液分别进行超高效合相色谱分析
分析条件如下：
色谱柱：Acquity Trefoil CEL1，填料为纤维素-三（3,4-二甲基苯基氨基甲酸酯）；
流动相：A为CO2，B为1%（v/v）氨水甲醇溶液；
梯度洗脱程序：0~7 min，流动相90%（v/v）A-10%（v/v）B；7~9 min，流动相90-72%（v/v）A-10%～28%（v/v） B；9～12 min，流动相72%（v/v）A-28%（v/v）B；12～13 min，流动相72-90%（v/v）A-28%～10%（v/v） B；13～14 min，流动相90%（v/v）A-10%（v/v）B；
***背压：13.8 MPa；流速：1.0 mL/min；进样量：5 µL；柱温：40 ℃；检测波长：244 nm；
四、制作标准曲线并通过标准曲线计算样品溶液中L-肉碱、D-肉碱的含量与纯度。
2.根据权利要求1所述的基于超高效合相色谱技术的保健食品中肉碱对映体拆分和测定方法，其特征在于，L-肉碱、D-肉碱两种肉碱对映体的回收率范围为89.2% ~ 110%，相对标准偏差(RSD，n=6)范围为4.3% ~ 6.9%。
3.一种基于超高效合相色谱技术的保健食品中肉碱对映体拆分和测定的试剂盒，该试剂盒包括衍生试剂、催化剂Ⅰ、催化剂Ⅱ和反应终止液；所述的衍生试剂为0.45g/100 mL的L-丙氨酸-β萘胺-乙腈溶液，所述的催化剂Ⅰ为0.50 g /100mL的三乙胺-三氯甲烷溶液，所述的催化剂Ⅱ为0.50 g /100mL的氯甲酸丁酯-三氯甲烷溶液，反应终止液为0.42 g/100mL的碳酸氢钠-水溶液。
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