CN113433257B

CN113433257B - 保健食品中肉碱对映体拆分和测定方法

Info

Publication number: CN113433257B
Application number: CN202110535082.XA
Authority: CN
Inventors: 张文华; 谢文; 侯建波; 徐敦明; 汪鹏; 张雅琴; 胡晓莉; 黄超群
Original assignee: Hangzhou Customs Technical Center
Current assignee: Hangzhou Customs Technical Center
Priority date: 2021-01-15
Filing date: 2021-05-17
Publication date: 2022-09-16
Anticipated expiration: 2041-05-17
Also published as: CN113433257A; CN112684089A

Abstract

本发明涉及肉碱对映体拆分方法和保健食品中的肉碱含量检测方法，尤其涉及一种保健食品中左旋肉碱和右旋肉碱的含量的测定方法。该方法采用超高效合相色谱法拆分肉碱对映体，并测定了保健食品中左旋肉碱和右旋肉碱对映体的残留量。样品经无水乙醇超声提取，衍生化后，Acquity Trefoil CEL1手性色谱柱分离，以超临界二氧化碳‑1%(v/v)氨水甲醇等助溶剂为流动相进行梯度洗脱，外标法定量。本方法具有快速准确、分离效率高、重复性高、稳定性好等特点，可用于同时测定保健食品中左旋肉碱含量与纯度的分析，为手性药物开发、使用及相关法规的制定提供科学支撑。

Description

保健食品中肉碱对映体拆分和测定方法

技术领域

本发明肉碱对映体拆分方法和保健食品中的肉碱含量检测方法，尤其涉及一种保健食品中左旋肉碱和右旋肉碱的含量的测定方法。

背景技术

肉碱的化学名称为β-羟基-γ-三甲胺基丁酸,其分子中含有1个手性碳原子(见图1),有两个立体异构体：包括右旋肉碱(D-肉碱)对映异构体和左旋肉碱(L-肉碱)对映异构体。其中左旋肉碱(L-Carnitine)，又称卡尼丁或L-肉碱，广泛分布于肝脏器官中，，是一种促使脂肪转化为能量的类氨基酸^[1]，同时也是脂肪酸在线粒体内代谢的必需物质,其缺乏可直接导致能量的合成不足,出现易疲劳、肌无力等症状。目前，市售保健品中所用的左旋肉碱主要来源于工业上的化学合成法，但该方法生产出来的L-肉碱纯度通常达不到要求，导致左旋肉碱保健品中含有D-肉碱^[2]。而D-肉碱不但没有功效，甚至具有毒性。人摄入D-肉碱，肌肉会受到损害，造成肌无力，肌疼痛，肌萎缩等症状^[3]。因此，迫切需要建立一种测定保健食品中L-肉碱的含量与纯度的分析方法。

目前L-肉碱的检测方法主要为分光光度法^[4-5]、高效液相色谱法(HPLC)^[6-7]、高效液相色谱-串联质谱法^[5,8-10]等。但这些报道的方法基本都是笼统的检测L-肉碱含量，而对D- 肉碱和L-肉碱的两种对映体的拆分以及L-肉碱的纯度分析的方法报道较少。翟旭峰^[11]和祝伟霞^[2]等采用反向高效液相色谱法实现了左旋肉碱和右旋肉碱的基线分离，但这些方法通常存在分析时间长、有机试剂消耗量大等问题。近年来超高效合相色谱(UPC²)受到了广泛关注，该技术是将超高效液相色谱(UPLC)与传统超临界流体色谱(SFC)的技术特点相互补充，改进了传统SFC的各项硬件^[12]，利用超临界二氧化碳与少量有机溶剂(乙腈、甲醇、异丙醇等)为流动相，能更精确的通过调节控制微小的色谱柱温度、***背压、流动相的变化来获得所需要的***分辨率，从而精准调控待测物的保留时间和分离度，提高了***的精密度、稳定性和可靠性^[13]。研究表明，UPC²技术更适合于分析传统液相色谱难以处理的结构类似物和同分异构体，已成功用于***类农药^[14]、酚酸类化合物^[15]、色素^[16]、酚类精油^[17]等。目前，UPC²技术应用于肉碱对映体的拆分和含量测定鲜有报道。

发明内容

为了解决上述常规液相色谱法拆分对映体存在的问题，本研究建立了一种超高效合相色谱法拆分肉碱的两种对映体及测定其对映体在保健食品中含量的方法。实验考察两种肉碱对映体标准品衍生产物的稳定性，优化保健食品中肉碱对映体的提取方法、衍生条件以及仪器色谱分离条件等主要参数，并利用所建立的优化方法对肉碱外消旋体标准品和市售保健食品进行分析测定。同时考虑到保健食品样品中右旋肉碱为有毒副产物，含量较低；左旋肉碱为主含量，含量很高，因此设定右旋肉碱的LOQ为10mg/kg，左旋肉碱的LOQ提高至 50mg/kg。该方法具有分析速度快、分离效果好、有机溶剂消耗少，灵敏度高等特点，为保健食品中L-肉碱含量与纯度的测定提供了参考方法。

为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案：

基于超高效合相色谱技术的保健食品中肉碱对映体拆分和测定方法，该方法包括保健食品样品提取，标准溶液制备，衍生步骤，衍生后标准溶液和样品溶液分别进行超高效合相色谱分析，制作标准曲线并通过标准曲线计算样品溶液中L-肉碱、D-肉碱的含量与纯度；标准溶液和样品溶液分别进行超高效合相色谱分析分析条件如下：

色谱柱：Acquity Trefoil CEL1，填料为纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)；

流动相：A为CO₂，B为1％(v/v)氨水甲醇溶液；

梯度洗脱程序：0～7min，流动相90％(v/v)A-10％(v/v)B；7～9min，流动相90-72％ (v/v)A-10％～28％(v/v)B；9～12min，流动相72％(v/v)A-28％(v/v)B；12～13 min，流动相72-90％(v/v)A-28％～10％(v/v)B；13～14min，流动相90％(v/v)A-10％ (v/v)B；

***背压：13.8MPa；流速：1.0mL/min；进样量：5μL；柱温：40℃；检测波长：244nm。

作为优选，样品提取的步骤如下：取20粒保健品片剂、胶囊或颗粒，研细，准确称取1.00g(精确至0.01g)样品，置于25mL容量瓶中，加入适量无水乙醇，超声提取20 min，冷却至室温后加无水乙醇定容，取适量定溶液至离心管中，高速离心5min后，所得上清液待进一步衍生制备样品溶液。

作为优选，标准溶液制备的步骤如下：移取0.5mL L-肉碱、D-肉碱两种对映体的混合工作溶液于10mL离心管中，再进一步衍生，制备成浓度为0.20、0.40、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00mg/L的标准溶液。

作为优选，衍生步骤如下所示：

取0.5mL上清液或混合工作溶液至离心管中，加入0.5mL衍生试剂，涡旋混匀，依次加入 0.5mL催化剂Ⅰ和0.5mL催化剂Ⅱ，涡旋混匀3min，20℃衍生化60min后，加入2.0mL 反应终止液，涡旋混匀1分钟后，离心5000r/min，5min，移取上层水相于100mL圆底烧瓶中，浓缩至近干，向浓缩瓶中加入1mL无水乙醇，涡旋溶解充分，过0.22μm滤膜入进样小瓶；

所述的衍生试剂为0.45g/100mL的L-丙氨酸-β-萘胺-乙腈溶液，所述的催化剂Ⅰ为0.50g /100mL的三乙胺-三氯甲烷溶液，所述的催化剂Ⅱ为0.50g/100mL的氯甲酸丁酯-三氯甲烷溶液，反应终止液为50mmol/L的碳酸氢钠-水溶液。

作为优选，本申请L-肉碱、D-肉碱两种肉碱对映体的回收率范围为86.0％～110％，相对标准偏差(RSD，n＝6)范围为4.3％～7.0％。

进一步，本发明还公开了一种基于超高效合相色谱技术的保健食品中肉碱对映体拆分和测定的试剂盒，该试剂盒包括衍生试剂、催化剂Ⅰ、催化剂Ⅱ和反应终止液；所述的衍生试剂为0.45g/100mL的L-丙氨酸-β-萘胺-乙腈溶液，所述的催化剂Ⅰ为0.50g/100mL的三乙胺-三氯甲烷溶液，所述的催化剂Ⅱ为0.50g/100mL的氯甲酸丁酯-三氯甲烷溶液，反应终止液为50mmol/L的碳酸氢钠-水溶液。

本发明建立了同时测定保健品中左旋肉碱含量与纯度的方法，并对市售保健品和外消旋体肉碱标准品进行了分析测定。该方法具有快速准确、分离效率高、重复性好、稳定性好等特点，为保健食品中左旋肉碱含量与纯度的测定提供了参考方法。

附图说明

图1为肉碱的化学结构式。

图2为已衍生化后的右旋肉碱(D-肉碱)和左旋肉碱(L-肉碱)标准溶液60天内的稳定性考察(无水乙醇溶液)。

图3比较3种色谱柱对两种肉碱对映体分离效果图(1％氨水-甲醇溶液，13.8MPa)。

图4为衍生温度和衍生时间对衍生反应的影响(D-肉碱和L-肉碱)。

图5为不同助溶剂对右旋肉碱(D-肉碱)和左旋肉碱(L-肉碱)分离效果的影响(13.8MPa，40℃)。

图6为不同***背压对右旋肉碱(D-肉碱)和左旋肉碱(L-肉碱)分离效果的影响(1％(v/v)氨水甲醇溶液，40℃)。

图7为不同***色谱柱温度对右旋肉碱(D-肉碱)和左旋肉碱(L-肉碱)分离效果的影响(1％(v/v)氨水甲醇溶液，13.8MPa)。

具体实施方式

实验部分

1.1仪器、材料与试剂

超高效合相色谱仪(美国沃特世公司)；台式离心机(美国Thermo公司)；R215旋转蒸发仪 (瑞士Buchi公司)；AE260电子天平(瑞士Mettler公司)；MS2涡旋混匀器(上海医大仪器厂)；超纯水净化***(英国Elga公司)；微孔过滤膜(0.22μm，有机相)；氮吹仪(日本东京理化公司)。

甲醇、乙腈、无水乙醇(色谱纯，西班牙Scharlau公司)；碳酸氢钠、氨水、三氯甲烷、三乙胺、氯甲酸丁酯(优级纯)；L-丙氨酸-β-萘胺(上海安谱)；水为超纯水；其他实验所用试剂除特殊说明外均为分析纯。

肉碱外消旋体(纯度≥98％，美国SIGMA公司)。

两种对映体：L-肉碱(纯度为99.0％，德国Dr.E公司)、D-肉碱(纯度为99.8％，美国CATO公司)。

标准溶液及试剂配制

1.2.1外消旋体标准溶液肉碱储备液(1.0g/L)：分别准确称取0.01g(精确至0.1mg)上述肉碱外消旋体标准品，用无水乙醇溶解并定容至10mL，配成1.0g/L的标准储备液。

对映体标准溶液

两种肉碱对映体储备液(1.0g/L)：分别准确称取0.01g(精确至0.1mg)左旋肉碱和右旋肉碱标准品，用无水乙醇溶解并定容至10mL，配成1.0g/L的标准储备液。

两种肉碱对映体的混合工作溶液：准确吸取一定量的标准溶液，用无水乙醇逐级稀释至0.40、0.80、2.00、4.00、10.00、20.00、40.00mg/L的混合工作溶液。

衍生剂溶液及终止液的配制

衍生试剂(L-丙氨酸-β萘胺)：称取0.45g L-丙氨酸-β萘胺，用乙腈溶解，并定容至100 mL。催化剂Ⅰ：称取0.50g三乙胺，加三氯甲烷混匀并定容至100mL。催化剂Ⅱ：称取0.50g氯甲酸丁酯，加三氯甲烷混匀并定容至100mL。反应终止液(50mmol/L碳酸氢钠溶液)：称取0.42g碳酸氢钠，加水溶解定容至100mL。

样品前处理

1.3.1样品提取

取20粒保健品片剂、胶囊或颗粒，研细，准确称取1.00g(精确至0.01g)样品，置于25 mL容量瓶中，加入适量无水乙醇，超声提取20min，冷却至室温后加无水乙醇定容，取适量定溶液至离心管中，高速离心5min后，所得上清液待进一步衍生。

1.3.2衍生

取0.5mL上清液至离心管中，加入0.5mL衍生试剂，涡旋混匀，依次加入0.5mL催化剂Ⅰ和0.5mL催化剂Ⅱ，涡旋混匀3min，20℃衍生化60min后，加入2.0mL反应终止液(50mmol/L碳酸氢钠水溶液)，涡旋混匀1min后，离心5000r/min，5min，移取上层水相于100mL圆底烧瓶中，浓缩至近干，向浓缩瓶中加入1mL无水乙醇，涡旋溶解充分，过0.22μm滤膜入进样小瓶。

1.3.3分析条件

色谱柱：Acquity Trefoil CEL1(3.0mm×150mm，2.5μm，填料为纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)，美国Waters公司)；流动相：A为CO₂，B为1％(v/v)氨水甲醇溶液；梯度洗脱程序：0～7min(10％B)，7～9min(10％～28％B)，9～12min(28％B)，12～13min(28％～10％B)，13～14min(10％B)；***背压：13.8MPa；流速：1.0mL/min；进样量： 5μL；柱温：40℃；检测波长：244nm。

标准曲线的制作

移取0.5mL两种肉碱对映体的混合工作溶液于10mL离心管中，再按照“1.3.2”方法衍生，制备成浓度为0.20、0.40、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00mg/L的标准溶液。

结果与讨论

2.1稳定性的考察

分别准确移取7份0.5mL的4mg/L肉碱对映体的混合工作溶液于7个离心管中，经衍生后转移至7个带铝盖密封的进样小瓶中，并用封口膜封好后于-20℃下保存放置，上机检测之前再逐个转移至带划痕的UPC²专用进样小瓶中。将刚衍生化后的肉碱对映体标准溶液以及已衍生化并分别储存1，3，5，7，14，30，60d的肉碱对映体标准溶液的含量作图比较。结果显示，2种肉碱对映体衍生化后-20℃下放置30d之内的含量变化小于10％，放置60 天含量变化大于10％(图2)，表明2种肉碱对映体衍生化后的溶液在30d内比较稳定。

提取方法的优化

文献报道中通常采用乙腈^[6-7]、无水乙醇^[4]、甲醇^[10]对肉碱进行提取。本文考察了这3种试剂的提取效果，选取了3份相同的含左旋肉碱保健品样品，分别采用上述3种不同试剂进行提取，按照“1.3.2”方法衍生，再上机检测。实验结果表明，采用乙腈、无水乙醇、甲醇的提取效率分别为13.4％、98.5％、70.3％。因此，本发明采用无水乙醇进行提取。另外，实验对振荡和超声波提取方式进行了比较，选取了2份相同的含左旋肉碱保健品样品，分别采用振荡和超声波提取方式进行提取，按照“1.3.2”方法衍生，再上机检测。结果显示振荡提取效率为54.5％，超声波提取效率为96.8％，因此本实验选择超声波提取。同时还考察超声提取时间10、20、30、60min的提取效率，选取了4份相同的含左旋肉碱保健品样品，超声提取不同的时间，按照“1.3.2”方法衍生，再上机检测。结果表明采用超声波提取10min， L-肉碱的提取效率为70.0％，延长超声波提取时间至20min，提取效率为91.0％，继续延长超声波提取时间至30min和60min，提取效率分别为91.8％和93.2％，L-肉碱的提取效率并未显著增加，因此本实验确定超声提取20min为最佳提取条件。

衍生条件的优化

国内外文献报道，氯甲酸乙酯^[4]、氯甲酸丁酯^[18]均可用作反应衍生剂，因氯甲酸乙酯沸点低，毒性较强，且不易购买，故选用氯甲酸丁酯做反应衍生剂。采用0.5mL衍生剂，随着肉碱对映体浓度(0.5、1.0、2.0、5.0、10.0mg/L)的增加，衍生产物呈相应的线性增加，说明 0.5mL衍生剂对于高浓度的肉碱对映体反应也是完全的，故采用0.5mL衍生剂。

本发明考察了衍生温度对衍生产物的影响，选择衍生化时间30min，考察了不同衍生温度(4、20、40、60℃)对两种肉碱对映体衍生反应的影响，结果如图4所示。两种肉碱对映体从4℃开始随着衍生温度的升高，衍生产物迅速增加。而当衍生温度超过20℃时，肉碱衍生产物急剧减少。因此本方法选择20℃作为衍生反应温度。

在室温20℃条件下，进一步考察了不同衍生反应时间(10，30，60，90min)对两种肉碱对映体衍生反应的影响，结果如图3所示。随着衍生时间的增加，肉碱对映体衍生产物逐渐增加，当衍生时间超过60min时，衍生产物无明显增加。因此本发明选择60min作为衍生反应时间。本实验比较了两种肉碱对映体衍生反应终止液(即萃取试剂)萃取次数对回收率的影响。向衍生反应溶液中依次加入2.0mL反应终止液(即萃取试剂)进行2次萃取，实验结果显示，相比第1次萃取的衍生产物，第2次萃取的两种肉碱对映体衍生产物增加不明显，因此本文采用2mL衍生反应终止液进行1次萃取。

分离条件的优化

本研究中拆分的两种肉碱对映体，因结构非常相似，不易分离。因此，选择3种相同规格的手性分离色谱柱Acquity Trefoil AMY1(3.0mm×150mm，2.5μm)、Acquity TrefoilCEL1(3.0 mm×150mm，2.5μm)和Acquity Trefoil CEL2(3.0mm×150mm，2.5μm)对两种肉碱对映体的拆分效果进行考察。移取3份线性最高点10mg/L肉碱对映体的混合工作溶液0.5mL于3个离心管中，按照“1.3.3”方法衍生，衍生产物上机检测。结果表明，采用AcquityTrefoil AMY1和Acquity Trefoil CEL2手性色谱柱分离时，两种肉碱对映体未能实现完全分离，且色谱峰形差，而采用Acquity Trefoil CEL1手性色谱柱分离时，分离度良好，色谱峰形良好(图3)。因此本申请选择Acquity Trefoil CEL1手性色谱柱对肉碱对映体进行分离。

流动相中助溶剂的优化

UPC²采用超临界二氧化碳为主要流动相，通常加入少量有机助溶剂调节流动相的极性，以增强对目标物的溶解能力和洗脱能力，不同的助溶剂对目标物的分离度和出峰时间均有重要影响^[12]。为了获得良好的分离效果和峰形，本发明对助溶剂进行了考察。选择Acquity Trefoil CEL1手性色谱柱，在背压13.8MPa、柱温40℃条件下，比较了乙腈、甲醇、异丙醇3种不同极性的助溶剂对肉碱分离效果的影响。结果显示，当使用乙腈、异丙醇和甲醇时，两种肉碱对映体的分离度均不佳、展宽明显，不过甲醇作为助溶剂的分离度略好。由于肉碱含有羟基，属于极性较强的化合物，加入氨水能够明显改善目标化合物的峰形。本文考察了 0.1％(v/v)氨水甲醇溶液、0.5％(v/v)氨水甲醇溶液、1％(v/v)氨水甲醇溶液作为助溶剂的分离效果。如图5所示，随着氨水浓度的增加，两种肉碱对映体的峰形和分离效果得到明显的改善。因此本实验选择1％(v/v)氨水甲醇溶液作为助溶剂。

***背压的选择

超高效合相色谱中，***背压也是影响分离过程的重要因素之一，其主要作用是控制二氧化碳在整个操作过程中处于超临界流体状态。由于二氧化碳的温度超过31℃且压力超过7.38 MPa以上，CO₂才会进入超临界二氧化碳状态。因此本发明以1％(v/v)氨水甲醇溶液作为助溶剂，在柱温40℃条件下考察了背压分别为10.3、13.8、17.2、20.7MPa时，两种肉碱对映体分离效果的影响(图6)。结果显示，随着***背压升高，分析物出峰时间提前。当背压为10.3MPa时，左旋肉碱峰形的展宽明显；升高背压至13.8MPa时，两种肉碱对映体峰形良好，且在11min内实现良好的基线分离；升高背压至17.2MPa时，两种肉碱的分离度降低；继续升高背压至20.7MPa时，***出现超压报警。综合考虑分析速度和分离效果，本发明选择13.8MPa为最佳***背压。

色谱柱温度的选择

色谱柱温度是另一个影响二氧化碳超临界流体的重要因素。随着色谱柱温度的升高，二氧化碳超临界流体的黏度降低，密度减小，溶剂化能力降低，超临界流体可能对目标化合物的溶解及交换能力减弱，使得目标物的保留时间增大。考虑到Acquity TrefoilCEL1手性色谱柱的最高推荐运行温度为40℃，二氧化碳需超过31℃且压力超过7.38MPa以上，CO₂才会进入超临界二氧化碳状态，因此本发明在***背压为13.8MPa的条件下考察了色谱柱温度在31～40℃范围内对目标物分离的影响(图7)。结果表明，随着柱温升高，目标物的保留时间逐渐延长。当柱温为31℃时，两种肉碱对映体的分离度不佳；升高柱温至35℃时，***出现超压报警；继续升高柱温至40℃时，两种肉碱对映体峰形良好，且在11min内实现良好的基线分离。因此，选择最佳色谱柱温度为40℃。

线性范围和定量限

将衍生后左旋肉碱和右旋肉碱的系列混合标准溶液按上述色谱条件进行测定。以标准品的峰面积(Y)为纵坐标，对应质量浓度(X)为横坐标，绘制标准曲线，求得回归方程和相关系数。结果表明，两种肉碱对映体在0.2～20.0mg/L质量浓度范围内呈良好的线性关系，相关系数大于0.999。通过在不含有肉碱的保健品样品中添加标准品，按照本方法进行测定，以信噪比S/N＝10计算定量限(LOQ)，得到右旋肉碱和左旋肉碱的LOQ均为10mg/kg，考虑到保健食品样品中右旋肉碱为有毒副产物，含量较低；左旋肉碱为主含量，含量很高，因此设定右旋肉碱的LOQ为10mg/kg，左旋肉碱的LOQ提高至50mg/kg。。

回收率、准确度和精密度

采用分别在不含有肉碱的固体类保健食品和液体类保健食品中添加标准溶液的方法进行添加回收率测定和方法的精密度测定，左旋肉碱的添加水平分别为50，100，500mg/kg，右旋肉碱的添加水平分别为10，20，100mg/kg，平行测定6次，计算加标回收率及相对标准偏差(RSD)，结果见表1。两种肉碱对映体的回收率范围为86.0％～110％，相对标准偏差 (RSD，n＝6)范围为4.3％～7.0％。该回收率和精密度符合SN/T 0001-2016^[19]的要求，能够满足不同剂型样品的分析要求，可用于日常分析的检测。

表1保健食品样品中2种肉碱对映体的加标回收率和相对标准偏差(n＝6)

2.7方法的应用

2.7.1实际样品的测试

为了考察本方法的有效性和实用性，应用所建立的方法对10份市售保健品中D-肉碱和L-肉碱的含量进行测定，其中片剂保健品5份，胶囊保健品2份，液体保健品3份。结果显示， 10份保健品中均未检出D-肉碱，片剂保健品和胶囊保健品L-肉碱的含量为2.53～27.02 g/100g，液体保健品L-肉碱的含量分别为1.44g/10mL,2.40g/15mL，含量均达到标签值的 96％～102％。欧盟规定左旋肉碱的每日限量为2g^[20]，中国L-肉碱的用量主要参考欧盟的规定，所采购的10份左旋肉碱保健食品中的推荐服用量为0.12～1.8g/日，均符合欧盟和中国规定的要求。

外消旋体标准品的拆分

应用所建立的方法对所采购的肉碱外消旋体标准品进行拆分及测定。结果显示，肉碱外消旋体含有L-肉碱和D-肉碱两种对映体，L–肉碱占比48.8％，D–肉碱占比51.2％。

结论

本文考察了两种肉碱对映体标准品衍生产物的稳定性，优化保健食品中肉碱对映体的前处理方法、衍生条件以及仪器色谱分离条件等主要参数，建立超高效合相色谱法拆分肉碱的两种对映体及测定其对映体在保健食品中含量的方法。同时还利用所建立的优化方法对肉碱外消旋体标准品和市售保健食品进行了分析测定。。研究结果表明，本方法具有分析速度快、分离效果好、灵敏度高、绿色环保等特点，能够满足保健食品中左旋肉碱的快速定量及纯度分析需要。

参考文献：

[1]Vernez L,Hopfgartner G,Wenk M,et al.J Chromatogr.A,2003,984(2):203

[2]Zhu W X,Yang J Z,Liu Y F,et al.Journal of Instrumental Analysis,2008,27(10):1124

祝伟霞，杨冀州，刘亚风，等.分析测试学报，2008,27(10)：1124

[3]Wang G Y,Detection methods of functional components in healthfood.1^st ed.Beijing:China Light Industry Press,2002:109

***.保健食品功效成分检测方法.1版.北京：中国轻工业出版社，2002:109

[4]Zhang H H,Tian H Y,Wang W T,et al.China Dairy Industry,2020,48(9):41

张海红，田洪芸，王文特，等.中国乳品工业，2020,48(9):41

[5]Wang D M,Yang M,Qiu X Y,et al.The Food Industry,2020,41(3):282

王冬梅，杨明，邱肖依，等.食品工业.2020，41(3)：282

[6]Chen D Y,Zhang H,Feng J L,et al.Practical Preventive Medicine,2020,27(12):1457

陈东洋，张昊，冯家力，等.实用预防医学，2020，27(12)：1457

[7]Sun P,et al.HeiLongJiang Medicine Journal,2019,32(5):1012

孙萍，等.黑龙江医药,2019，32(5)：1012

[8]Wang Y,Liu Y,Jiang S,et al.Food Safe Qual Detec Technol,2020,11(17):5920

王艳，刘芸，姜珊，等.食品安全质量检测学报，2020，11(17)：5920

[9]Liu Q Y,Li Y,Yu X Y,et al.Jiangsu Agricultural Sciences,2020,48(17):215

刘启月，李勇，余向阳，等.江苏农业科学，2020，48(17)：215

[10]Zhan Y C,He B,Liu M T,et al.Products Processing,2019,(6):68

詹越城，何斌，刘梦婷，等.农产品加工，2019，(6)：68

[11]Zhai X F,Xiao X C,Li Y X,et al.Chinese Pharmaceutical Journal,2014,12(09):912

翟旭峰，肖小春，李养学，等.中国药学，2014，12(09)：912

[12]Xin X.New Chemical Materials,2016,44(05),264

新型.化工新型材料，2016，44(05)：264

[13]UPC²超高效合相色谱：色谱新品类赋予科学家新的想象力.(2012-05-15)[2021-02-18]. https://www.antpedia.com/index.php？action-viewnews-itemid-212253-php-1

[14]Zhang W H,Xie W,Hou J B,et al.Chinese Journal of Chromatography,2019,37(12):1356

张文华，谢文，侯建波，等.色谱，2019,37(12)：1356

[15]Jiang H,Yang L,Xing X D,et al.J Pharmaceut Biomed Anal,2018,153,117

[16]Yu W S,Liu X,Zhang Y Z,et al.Analytical Letters,2020,53(10):1654

[17]Chang X Q,Sun P,Ma Y,et al.Molecules,2020,25(3):502

[18]Wang Q L,Yu Y，Xu D M,et al.Chinese Journal of Chromatography,2016,34(7)：697

王巧玲，于玥，徐敦明，等.色谱，2016，34(7)：697

[19]SN/T 0001-2016

[20]Regulation(EC)No 1925/2006of the European Parliament and of theCouncil of 20 December 2006 on the addition of vitamins and minerals and ofcertain other substances to foods.(2015-07- 09)[2021-01-02].https://ec.europa.eu/transparency/regdoc/rep/3/2015/EN/3-2015-9156-EN-1- 1.PDF。

Claims

1.基于超高效合相色谱技术的保健食品中肉碱对映体拆分和测定方法，该方法包括保健食品样品提取，标准溶液制备，衍生步骤，衍生后标准溶液和样品溶液分别进行超高效合相色谱分析，制作标准曲线并通过标准曲线计算样品溶液中L-肉碱、D-肉碱的含量与纯度；其特征在于，标准溶液和样品溶液分别进行超高效合相色谱分析分析条件如下：

色谱柱：Acquity Trefoil CEL1，填料为纤维素-三（3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯）；

流动相：A为CO₂，B为1%v/v氨水甲醇溶液；

梯度洗脱程序：0~7 min，流动相90%v/vA-10%v/vB；7~9 min，流动相90-72%v/vA-10%～28%v/v B；9～12 min，流动相72%v/vA-28%v/vB；12～13 min，流动相72-90%v/vA-28%～10%v/v B；13～14 min，流动相90%v/vA-10%v/vB；

***背压：13.8 MPa；流速：1.0 mL/min；进样量：5 µL；柱温：40 ℃；检测波长：244 nm；

所述样品提取的步骤如下：取20粒保健品片剂、胶囊或颗粒，研细，准确称取1.00 g样品，精确至0.01g，置于25 mL容量瓶中，加入适量无水乙醇，超声提取20 min，冷却至室温后加无水乙醇定容，取适量定溶液至离心管中，高速离心5 min后，所得上清液待进一步衍生制备样品溶液；

所述衍生步骤如下所示：

取0.5mL上清液或混合工作溶液至离心管中，加入0.5 mL衍生试剂，涡旋混匀，依次加入0.5 mL催化剂Ⅰ和0.5 mL催化剂Ⅱ，涡旋混匀3 min，20 ℃衍生化60 min后，加入2.0 mL反应终止液，涡旋混匀1分钟后，离心5000 r/min，5 min，移取上层水相于100 mL 圆底烧瓶中，浓缩至近干，向浓缩瓶中加入1 mL 无水乙醇，涡旋溶解充分，过0.22 µm 滤膜入进样小瓶；

所述的衍生试剂为0.45 g/100 mL的L-丙氨酸-β-萘胺-乙腈溶液，所述的催化剂Ⅰ为0.50 g /100mL的三乙胺-三氯甲烷溶液，所述的催化剂Ⅱ为0.50 g /100mL的氯甲酸丁酯-三氯甲烷溶液，反应终止液为50 mmol/L的碳酸氢钠-水溶液。

2.根据权利要求1所述的基于超高效合相色谱技术的保健食品中肉碱对映体拆分和测定方法，其特征在于，标准溶液制备的步骤如下：移取0.5 mL L-肉碱、D-肉碱两种对映体的混合工作溶液于10 mL离心管中，再进一步衍生，制备成浓度为0.20、0.40、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00 mg/L的标准溶液。

3.根据权利要求1所述的基于超高效合相色谱技术的保健食品中肉碱对映体拆分和测定方法，其特征在于，L-肉碱、D-肉碱两种肉碱对映体的回收率范围为86.0% ~ 110%，相对标准偏差的范围为4.3% ~ 7.0%，相对标准偏差RSD，n=6。