CN115895936B

CN115895936B - 一种枯草芽孢杆菌2-22及其应用

Info

Publication number: CN115895936B
Application number: CN202210946134.7A
Authority: CN
Inventors: 高同国; 李红亚; 郭晓军; 朱宝成; 白钰
Original assignee: Heibei Agricultural University
Current assignee: Heibei Agricultural University
Priority date: 2022-08-08
Filing date: 2022-08-08
Publication date: 2023-06-16
Anticipated expiration: 2042-08-08
Also published as: CN115895936A

Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌2‑22及其应用，涉及农业微生物菌剂及其应用技术领域。保藏编号为CGMCC：NO.24835。本发明菌株具有固氮酶活性，能同时高产吲哚乙酸和赤霉素，盆栽实验和大田实验均证实枯草芽孢杆菌2‑22对农作物、蔬菜作物具有促生作用；而且，本发明中枯草芽孢杆菌2‑22来源于土壤，安全环保、易培养，使用后无污染、无残留、对人畜无害，符合绿色农业的发展要求。

Description

一种枯草芽孢杆菌2-22及其应用

技术领域

本发明涉及农业微生物菌剂及其应用技术领域，更具体的说是涉及一种枯草芽孢杆菌2-22及其应用。

背景技术

生物固氮是自然生态***中氮的主要来源。生物固氮包括共生、联合和自生固氮3种类型，自身固氮菌可以将空气中的氮转化为植物可以吸收利用的氨，自生固氮对于满足植物的高氮需求和平衡氮素损失极其重要。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是自生固氮菌的一种，并且枯草芽孢杆菌也是目前应用最为广泛的植物促生菌之一，可以产生多种植物激素，如植物生长素(吲哚乙酸)、细胞***素、赤霉素等。芽孢杆菌可以产生芽孢，具有耐旱、耐盐碱、耐辐射等优点，而且产品易生产、储存时间长，因此广泛应用于农药和肥料领域，为实现环保、无污染和高效农业生产提供了有效的方法和解决途径。因此筛选具有固氮酶活性，又能高产吲哚乙酸和赤霉素的菌株用作微生物肥料对于环境保护、农业可持续发展等均具有重要意义。

CN114015625A公开了一种蜡样芽孢杆菌P30，吲哚乙酸浓度为61.57～100.75mg/L，赤霉素含量为19.60～57.20mg/L，但目前并没有关于具有固氮酶活性并且同时能高产吲哚乙酸和赤霉素的枯草芽孢杆菌的相关报道。

因此，能否提供一种具体的枯草芽孢杆菌克服上述技术障碍是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌2-22及其应用。可以同时具有固氮酶活性、高产吲哚乙酸和赤霉素，因此可应用于制备微生物肥料中，促进植物的生长发育。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)2-22，保藏编号为CGMCC：NO.24835。

本发明还提供了一种微生物菌剂，包括枯草芽孢杆菌2-22，保藏编号为CGMCC：NO.24835。

本发明还提供了一种微生物发酵液，使用枯草芽孢杆菌2-22进行发酵，保藏编号为CGMCC：NO.24835。

本发明还提供了一种微生物菌肥，包括枯草芽孢杆菌2-22，保藏编号为CGMCC：NO.24835。

本发明还提供了上述枯草芽孢杆菌2-22，或上述菌剂，或上述发酵液，或上述菌肥在农业、工业生产中的应用。

优选的：应用于黄瓜、白菜、小麦。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种枯草芽孢杆菌2-22及其应用，取得的技术效果具有固氮酶活性，并且能同时高产吲哚乙酸和赤霉素，盆栽实验和大田实验均证实枯草芽孢杆菌2-22对农作物、蔬菜作物具有促生作用；而且，本发明中枯草芽孢杆菌2-22来源于土壤，安全环保、易培养，使用后无污染、无残留、对人畜无害，符合绿色农业的发展要求。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明提供的吲哚乙酸含量、吸光度的标准曲线图。

图2附图为本发明提供的HPLC法测定赤霉素GA₃含量与吸收峰面积的标准曲线图。

图3附图为本发明提供的枯草芽孢杆菌2-22菌株的菌落图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例公开了一种枯草芽孢杆菌2-22及其应用。

实施例中，所用实验材料：

LB培养基：蛋白胨10g，酵母浸出物5g，氯化钠10g，琼脂20g，添加蒸馏水定容至1L，混匀后分装于三角瓶中，121℃灭菌30min。

阿须贝氏无氮培养基：甘露醇10g，KH₂PO₄0.2g，MgSO₄·7H₂O0.2g，NaCl0.2g，CaSO₄·2H₂O0.1g，CaCO₃5g，添加蒸馏水定容至1L，混匀后分装于三角瓶中，121℃灭菌30min，其中，作为固体培养基时需加入20g琼脂。

枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)2-22保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC：NO.24835，保藏日期为2022年5月6日；本发明所用其它原料、试剂均购自市场。

未提及的实验材料、实验方法为常规实验方法，在此不再赘述。

实施例1

菌株2-22的分离、筛选

菌株2-22分离土壤采集自河北省保定市莲池区玉米田土壤，具体分离、筛选过程为：

称取10g土壤置于装有90mL含玻璃珠的灭菌生理盐水中，使用涡旋振荡器充分震荡后，将其置于80℃热水中30min，取出后冷却至室温，吸取1mL上清液，采用梯度稀释方法将土壤悬液稀释10²、10³、10⁴或10⁵倍，取各梯度稀释液0.1mL分别涂布于阿须贝氏无氮培养基上，随后将涂布平板置于30℃恒温培养箱中，倒置培养5天，每天观察培养基上菌落生长情况，采用三区划线得到单菌落，并将其保存于阿须贝氏无氮培养基斜面上，待用；

通过测定分离到的各菌株固氮酶活性，以及各菌株发酵后吲哚乙酸含量和赤霉素含量，筛选具有固氮酶活性，高产吲哚乙酸和赤霉素的细菌。

菌株获得：

首先采用乙炔还原法对各菌株的固氮酶活性进行测定获得具备固氮酶活性的菌株。

试验组将保存的各菌株用阿须贝氏固体培养基活化，用接种环挑取菌体接种到装有5mL阿须贝氏固体培养基的10mL试管中，用橡胶塞密封。以未接种菌体的相同试管为对照组。两组均置于30℃培养48h后，向试管中注入试管1/10体积的乙炔气体，继续培养24h，从试管中抽取0.5mL气体注入气相色谱仪(浙江福立分析仪器有限公司FL9790)中，测定乙炔、乙烯的含量。按下列公式计算固氮酶活性大小：

C＝(h_x×c×V)/(24.9×h_s×t)，其中，h_x为样品峰面积值；h_s为标准C₂H₄峰面积值；c为标准C₂H₄浓度(nmol/mL)；V为培养容器体积(mL)；t为样品培养时间(h)；C为产生的C₂H₄浓度[nmol/(mL·h)]。

其次，采用高效液相色谱(HPLC)法测定发酵液上清中赤霉素和细胞***素含量。

将具有固氮酶活性的菌株接种于LB培养基中，置于30℃、180r/min振荡培养48h后得到发酵液，将发酵液于8000r/min离心10min得到发酵液上清，上清液过0.45μm的微孔滤膜，滤液直接进行赤霉素和吲哚乙酸的测定。

吲哚乙酸产生菌的获得：

首先采用定性方法对分离得到的菌株进行初筛，取滤液1mL加入Salkowski比色液2mL，静止25min，颜色变红者表明能够分泌吲哚乙酸。然后再用定量筛选方式做进一步的筛选，使用分析纯的吲哚乙酸做标准曲线，如图1所示；取1mL发酵上清液加入2mLSalkowski比色液，静止25min，使用分光光度计测定其在530nm下的吸光度值。

赤霉素产生菌的获得：

将得到的产吲哚乙酸的菌株进行产赤霉素情况测定。赤霉素种类较多，筛选方法主要对菌株产生赤霉素GA₃的能力进行测定。使用高效液相色谱法(HPLC)对分析纯的赤霉素GA₃做标准曲线，如图2所示。

通过以上测定筛选出一株具有固氮酶活性且高产吲哚乙酸和赤霉素的菌株，命名为2-22。

通过上述测定方法得到该菌株固氮酶活性达到1350nmol/(mL·h)，吲哚乙酸含量达到152.45mg/L，赤霉素含量达到70.82mg/L。

通过测定细菌16SrDNA序列和菌株生理生化特性对细菌进行鉴定。

将上述方法筛选分离出的菌株，经北京六合华大基因科技有限公司测序，根据16SrDNA的测序结果(GTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTACCGCCCTATTCGAACGGTACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTTATGTTTGAACCATGCGGTTCAAACAACCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCCATCTGTCCGCTCGACTTG，如SEQ ID NO.1所示)，在http://www.ncbi.nlm.nih.gov在线查询分析，利用Blast软件在GenBank中与其它的16SrDNA序列进行同源性比较，根据该菌株的生理生化特征(糖、醇类发酵实验、甲基红实验、V-P测定实验、淀粉水解实验、产氨实验、吲哚实验、硝酸盐还原实验、卵磷脂酶、接触酶、明胶液化实验、丙二酸利用实验均为阳性；荧光色素、柠檬酸利用为阴性；耐受7％浓度氯化钠，如表1)，鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，该菌株的菌落图如图3所示；将该菌株于2022年5月6日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCCNo.24835。

表1 2-22菌株生理生化特征

实验类型	实验结果	实验类型	实验结果
				厌氧性实验	兼性厌氧	接触酶	+
运动性	+	荧光色素	-
				丙二酸利用	+	产氨实验	+
柠檬酸利用	-	吲哚实验	+
				糖、醇类发酵	+	硝酸盐还原	+
甲基红实验	+	2％氯化钠	+
				V-P测定	+	5％氯化钠	+
淀粉水解	+	7％氯化钠	+
				明胶液化	+	10％氯化钠	-
卵磷脂酶	+

注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。

实施例2

枯草芽孢杆菌2-22发酵液对小麦生长的影响

挑选颗粒饱满的小麦种子，用70％的乙醇进行表面消毒，以无菌水冲洗至少6次最后一次冲洗的无菌水涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，检查小麦表面消毒是否彻底。将消毒的小麦种子播种于花盆土壤中，每盆种6颗，表面覆盖约lcm土壤。试验设2个处理，实验组每个植株接种2-22菌液(约10⁸个/mL)1mL，对照组使用等量的清水，每个处理10个重复。花盆放置于温室，设置培养条件为光照16h/8h、温度25℃/18℃。待小麦出苗后，每隔5天浇一次水，14天后取出并冲洗掉小麦根上的土壤，测定植物株高和根长。

如表2所示；

表2枯草芽孢杆菌2-22对小麦生长的影响

	小麦根长/株(cm)	小麦株高/株(cm)
			对照组	22.6±1.8	24.1±1.2
2-22	26.5±1.6	29.6±1.5

结果表明，与未接菌的对照组相比，枯草芽孢杆菌能明显促进了小麦的生长。

实施例3

枯草芽孢杆菌2-22发酵液在黄瓜上的应用

黄瓜种子表面消毒后，将种子种植在土壤中，土壤基本理化性质为有机质6.05％，碱解氮141.20mg/kg，速效磷102.17mg/kg，速效钾287.32mg/kg，pH7.45。实验设置2个处理，30个重复，分别为：不接菌处理(对照组)和接菌处理(实验组)，接菌处理的接种量为5mL/株(发酵液稀释50倍)。播种1周后调查出苗率，30天后测量株高、茎粗、根长、单株总叶面积、根干物质和地上干物质，如表3所示；

表3枯草芽孢杆菌2-22对黄瓜幼苗生长的影响

结果表明，与未接菌的对照组相比，枯草芽孢杆菌2-22能明显促进了黄瓜幼苗的生长，增加了幼苗的生物量。

实施例4

枯草芽孢杆菌2-22发酵液在白菜上的应用

将活化的单菌落(来源实施例2中平板培养获得)采用NB液体培养基(蛋白胨10g，NaCl5g，牛肉膏3g，蒸馏水1L，pH为6.8～7.2)，37℃培养72h，得到发酵液，接种于盆栽沙土(每盆含2.5kg沙土)中，每盆沙土中接入20mL发酵液。

选取白菜进行盆栽实验。30天后与未接种的对照相比，白菜干重平均增加22％，植株内氮素平均增加21％，因此可以将菌株2-22用于制备促进蔬菜等作物生长的生物固氮菌肥中。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims

1.一种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）2-22，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌2-22的保藏编号为CGMCC：NO.24835。

2.一种微生物菌剂，其特征在于，包括枯草芽孢杆菌2-22，所述枯草芽孢杆菌2-22的保藏编号为CGMCC：NO.24835。

3.一种微生物发酵液，其特征在于，使用枯草芽孢杆菌2-22进行发酵，所述微生物发酵液含有枯草芽孢杆菌2-22，所述枯草芽孢杆菌2-22的保藏编号为CGMCC：NO.24835。

4.权利要求3所述发酵液在促黄瓜、白菜、小麦生长中的应用。