CN112662576B - 一株过表达Gis4的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株过表达Gis4基因的酿酒酵母基因工程菌，该菌株由原始酿酒酵母的Gis4基因过表达后改造得到。由于原始菌株在固定化发酵中菌体聚集过多且聚集体不成熟，电阻较高，阻碍了传质传导，导致其发酵周期的加长，而过表达Gis4基因的酿酒酵母基因工程菌对比原始酿酒酵母菌株在游离发酵中絮凝特性明显减弱，在固定化发酵中细胞粘附聚集情况减少，黏附性降低，游离细胞增多，加强了传质传导，缩短了发酵周期。
Description
技术领域
本发明属于基因工程及微生物技术领域，具体涉及一株过表达Gis4基因的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法和应用。
背景技术
生物膜也称为生物被膜，是一种由微生物细胞和其分泌的胞外基质共同组成的生物聚集体，由微生物集群与其分泌出的多糖、蛋白、脂肪酸等形成膜状结构附着于载体表面。生物膜的存在，不仅作为屏障为细胞的生命活动创造了稳定的内环境，介导了细胞与细胞、细胞与基质之间的连接，而且还承担了物质转运、信息的跨膜传递和能量转换等功能，更重要的是，生物膜还作为一种重要的工业应用——固定化发酵。与游离细胞发酵相比，固定化发酵中所形成的生物膜能在发酵过程中表现出较高的底物耐受性和较快的发酵效率。通常条件下，常规的游离细胞发酵50g葡萄糖大约需要8h左右，而固定化细胞只需要6h就可以将糖转化为乙醇，展现了固定化细胞出色的发酵效率和发酵能力。但生物膜过多，会造成菌体聚集过多且聚集体不成熟，电阻较高，阻碍了传质传导，导致其发酵周期的加长。
发明内容
发明目的：针对现有的酿酒酵母菌株在生物膜固定化发酵过程中生成的生物膜过多的问题，提供一株过表达Gis4基因的酿酒酵母基因工程菌，可定向减少细胞与载体的粘附性，加强传质传导，提高发酵效率。
本发明还要解决的技术问题是提供上述酿酒酵母基因工程菌的构建方法。
本发明最后要解决的技术问题是提供上述酿酒酵母基因工程菌的应用。
发明思路：有数据表明，Gis4抑制Snf1基因的表达，而Snf1调节Flo11基因的转录，Flo11又是介导生物膜形成过程中细胞与介质黏附的关键因子。。因此，本发明选取Gis4基因作为改造对象，构建酿酒酵母基因工程菌，以定向减弱菌株在生物膜形成过程中细胞与载体的黏附能力，，进而提高发酵效率和发酵能力。
为了解决上述第一个技术问题，本发明公开了一株酿酒酵母基因工程菌，所述酿酒酵母的Gis4基因过表达。
其中，所述酿酒酵母为Saccharomyces cerevisiae1308，来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏编号：CICC 1308，可商购得到。
其中，所述Gis4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明进一步提出了上述的酿酒酵母基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)以Saccharomyces cerevisiae1308基因组DNA为模板，扩增出Gis4目的基因片段；
(2)利用限制性内切酶获得线性化质粒pYX212，将Gis4目的基因片段与线性化质粒pYX212导入大肠杆菌DH5α中，获得DH5α-pYX212-Gis4菌株，提取所获得的目标大肠杆菌的质粒；
(3)将步骤(2)得到的质粒转化至酿酒酵母感受态中，即得过表达酿酒酵母基因工程菌。
其中，步骤(2)中，所述限制性内切酶为SacI。
步骤(2)中，用限制性核酸内切酶对获得质粒进行酶切验证，利用凝胶电泳对取得质粒进行可视化初筛。
步骤(1)中，扩增Gis4基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
步骤(1)中，所述Gis4基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
步骤(3)中，利用含有500g/mLG418的YPD培养基筛选获得阳性转化子，得到过表达Gis4基因的酿酒酵母基因工程菌。
进一步地，本发明公开了上述酿酒酵母基因工程菌在发酵制备乙醇中的应用。
其中，所述酿酒酵母基因工程菌的种子液按照5％～20％的体积比接种于发酵培养基中；优选为按照10％的体积比。
优选地，通过固定化发酵制备乙醇。
其中，所述固定化发酵以天然有机载体、人工合成高分子载体、人工无机高分子材料、复合材料作为固定化介质。
优选地，所述固定化发酵以棉纤维材料作为固定化介质。
其中，所述固定化介质的浓度为10～70g/L，优选为40g/L。
其中，所述发酵的温度为30℃-40℃。
其中，所述发酵的时间为20-30h。
其中，所述发酵的发酵培养基配方如下：50-100g/L葡萄糖，3-6g/L蛋白胨、0.1-1g/L硫酸铵、3-6g/L磷酸二氢钾、3-6g/L酵母膏、0.01-1g/L硫酸镁、0.01-1g/L七水合硫酸亚铁、0.01-1g/L七水合硫酸锌，溶剂为水。
优选地，所述酵的发酵培养基配方如下：60g/L葡萄糖，4g/L蛋白胨、0.5g/L硫酸铵、3g/L磷酸二氢钾、3g/L酵母膏、0.5g/L硫酸镁、0.05g/L七水合硫酸亚铁、0.05g/L七水合硫酸锌，溶剂为水。
有益效果：本发明提出了一株过表达Gis4基因的酿酒酵母基因工程菌，由于原始菌株在生物膜固定化发酵过程中形成的生物膜过多，阻碍了传质传导，导致其发酵周期的加长，而过表达Gis4基因的酿酒酵母基因工程菌对比原始酿酒酵母菌株在生物膜形成过程中细胞与介质的黏附性降低，游离细胞增多，加强了传质传导，缩短了发酵周期。
附图说明
图1为实施例1中Gis4基因片段的琼脂糖凝胶电泳图，其中，M：DNA分子量marker，Gis4：Gis4基因片段(2325bp)；
图2为实施例1中DH5α-pYX212-Gis4质粒的酶切鉴定电泳图，其中，M：DNA分子量marker；W为原始质粒对照组，1、2分别为两个质粒酶切组(2325bp)；
图3为实施例2中原始菌(WT)与Gis4基因过表达菌(pGis4)在96孔板培养1天孔板染色脱色图；
图4为实施例3中原始菌(W)与Gis4基因过表达菌(pGis4)在游离发酵与固定化发酵的发酵残糖数据；
图5为实施例3中原始菌(W)与Gis4基因过表达菌(pGis4)在游离发酵与固定化发酵的发酵产物乙醇数据。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：过表达菌株1308-pGis4的构建
一、Gis4基因敲除片段的构建
(1)以原始酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae1308)的基因组DNA为模板，利用普通PCR扩增得到Gis4基因片段(扩增引物序列Gis4-F、Gis4-R分别如SEQ ID NO.2和SEQID NO.3所示)；PCR反应体系见表1，PCR反应条件如下：1)95℃预变性3min；2)95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸2min，三个步骤进行35次循环，72℃再延伸5min。其中，退火温度取决于引物的Tm值，72℃的延伸时间取决于扩增片段的长度(1kb·min-1)。通过琼脂糖凝胶电泳，见图1，切胶回收PCR扩增得到的Gis4基因片段，Gis4基因片段的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
表1 PCR反应体系
(2)利用限制性内切酶SacI获得线性化质粒pYX212。利用一步克隆操作将Gis4纯化片段与线性化质粒导入大肠杆菌DH5α中，获得DH5α—pYX212—Gis4菌株。提取所获得的目标大肠杆菌的质粒，用SacI限制性核酸内切酶对获得质粒进行酶切验证，利用凝胶电泳对取得质粒进行可视化初筛。
表2质粒线性化体系
反应温度为37℃，反应时间为2小时
(3)一步克隆
一步克隆操作严格按照Vazyme公司一步克隆试剂盒内附操作步骤进行操作。
(4)质粒提取
质粒提取过程完全按照Takara公司质粒提取试剂盒内附的操作要求进行操作。
(5)质粒酶切验证并测序，见图2。
二、酿酒酵母菌株感受态制备。
(1)挑取酿酒酵母菌株Saccharomyces cerevisiae 1308接种于YPD液体培养基，于30℃、200r/min过夜培养，得到活化种子液；
(2)按照体积比1％的接种比例，将种子液转接至100mL新鲜的YPD液体培养基，于30℃、200r/min继续培养至菌液OD600在0.8-1.2之间；
(3)将步骤(2)得到的菌液冰水浴预冷30min，低温高速离心机4℃、4000r/min离心5min收集菌体；
(4)用25mL预冷无菌水重悬菌体，低温高速离心机4℃、4000r/min离心5min收集菌体，重复两次；用10mL预冷的1M山梨醇水溶液重悬菌体，低温高速离心机4000r/min、4℃离心5min收集菌体，重复两次；
(5)用1mL1 M山梨醇水溶液重悬菌体，分装每管100μL。
三、酿酒酵母菌株感转化及转化子的鉴定。
(1)步骤二所得分装后的菌液取1管，加入10μL步骤一得到的质粒，混合后转入电转杯；
(2)冰上放置5min；
(3)1.5kv电击5.0ms，加入1mLYPD培养基将电转液洗出，于30℃、200r/min培养1h；
(4)涂布于含有500μg/mLG418的YPD培养基平板上，于30℃培养至菌落长出；
(5)挑取步骤(4)得到的转化子作为模板，使用验证引物(核苷酸序列如SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.5所示)进行菌落PCR扩增以鉴定Gis4基因过表达的阳性转化子；
(6)挑选阳性转化子1308-pGis4接入5mL含有500μg/mLG418的YPD液体培养基中活化24h，与灭菌的30％甘油1：1混合，-80℃保藏。
上述过程所使用的引物如下：
ATGCAAAAATCCGTTAGAGT(Gis4-F)-SEQ ID NO.2
TTACATGATGGCACAACGCT(Gis4-R)-SEQ ID NO.3
TTACCGATGATTGGTTGCTG-SEQ ID NO.4
gtaacgccagggttttccca-SEQ ID NO.5
实施例2
(1)各取10μL甘油菌1308(原始菌)和1308-pGis4(实施例1构建得到的过表达菌)加入灭菌的5mLYPD液体培养基中过夜培养，活化；
(2)按照体积比1％的接种比例，将步骤(1)所得的菌液转接至100mL的YPD液体培养基，于30℃、200r/min继续培养至菌液OD600在1.5～2.0；
(3)取3mL步骤(2)所得菌液在OD600下测量吸光值，用灭菌的YPD液体培养基稀释菌液，使得稀释后菌液OD600为1；
(4)取190μLYPD培养基和10μL步骤(3)稀释后的菌液加入96孔板，30℃培养24h；
(5)将96孔板菌液倒出，用0.01M PBS缓冲液缓冲3次，拍干；
(6)取1％结晶紫溶液200μL加入96孔板，染色10min，PBS缓冲液冲洗，晾干；
(7)取冰醋酸200μL加入96孔板溶解后，轻轻振荡，OD570测量生物膜中的生物量，取平均值：1308在96孔板培养24h OD值为0.54左右，1308-pGis4的过表达菌株在96孔板培养24h OD值为0.39左右。实验结果如图3所示，表明过表达Gis4基因的酿酒酵母生物被膜中生物量减少，细胞粘附聚集情况减少，细胞与介质的黏附性降低。
实施例3
(1)各取10μL甘油菌1308(原始菌)和1308-pGis4(实施例1构建得到的过表达菌)加入灭菌的5mLYPD液体培养基中过夜培养，活化；
(2)按照体积比1％的接种比例，将步骤(1)所得的菌液转接至100mL的YPD液体培养基，于30℃、200r/min继续培养至菌液OD600在0.8～1.2之间；
(3)将步骤(2)的种子液按10％的接种体积比例转接至100mL的发酵培养基中，分为游离发酵与固定化发酵两种。
进行固定化发酵时：向发酵培养基中加入棉纤维材料作为固定化材料，每个摇瓶中加入4g棉纤维介质；于30℃、200r/min发酵，葡萄糖耗尽后反应结束，利用测糖仪测定各时段发酵液残糖量，高效气相色谱仪测定发酵液中酒精的含量；
进行分离发酵时：仅不添加固定化材料，其余与固定化发酵相同；
其中，发酵培养基配方如下：60g/L葡萄糖，4g/L蛋白胨、0.5g/L硫酸铵、3g/L磷酸二氢钾、3g/L酵母膏、0.5g/L硫酸镁、0.05g/L七水合硫酸亚铁、0.05g/L七水合硫酸锌，溶剂为水。
(4)发酵结果见图4和图5(W-野生菌游离发酵，WI-野生菌固定化发酵，pGis4-过表达菌游离发酵，pGis4I-过表达菌固定化发酵)由发酵数据可以看出，固定化发酵比游离发酵有较快的耗糖速率和较高的乙醇产量；原始菌株1308和基因改造菌株1308-pGis4固定化发酵的周期分别为30h和22h，基因改造菌株发酵周期缩短约8h，耗糖率提高了约36％；在固定化发酵终点时，原始菌株1308和基因改造菌株1308-pGis4乙醇产量分别为20g/L和28g/L，基因改造菌株乙醇产量提高约为8g/L，发酵效率提高了约40％。
序列表
<110> 南京工业大学
<120> 一株过表达Gis4的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法和应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2325
<212> DNA
<213> Gis4基因的核苷酸序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgcaaaaat ccgttagagt gggcgactat tttgacaatg atgacaatgg tttgtggtcg 60
tggtacttaa caaacctcag attaggcgat tttgaagaac ttataggcaa tcaattaaaa 120
tacactctgt taaaaagatt tctgaatagt catttttatg gtgataacaa tatttcggcc 180
aggccaaaca agaagatttt gttagtttcc atcccagaga atgttcatga agatatctcc 240
atattggaaa tcttcctcaa agattacttt catctggaaa aattagaaca cattcaaatc 300
tcaaaattaa ctcactccca ctgctacaat catgaaaatc attacctatt gacggacaac 360
ctcaacaatt tccaagaccc taccttttta gaatttgcga gtacaagttg gcaagttcaa 420
aaaaattcca aggctttaaa caataacaat agaaattcaa taccaccacc cacaatatct 480
tcatcaaaag cttcaaacgg gaagctagaa tcaaacgttt cggatgatca gtggtcaaat 540
ataaataccc agacttcaac agctacccga actaatacga atacgaggac tttgacatct 600
ccggacacag ttgatataaa cgttacatcc gtgaatagtc aaagcaataa taatgatacg 660
cctcaagata atgaaaacga agttgatgaa gaggatgcca caagttctat agtcctaaat 720
ttttctcatt cgcgaacagt agattcaaag cctaatagac tacccaaaat ttttccatca 780
tacactaatg aagactatac accgtcacat tccgagataa tgtcaataga tagttttgct 840
ggcgaagacg tatcatccac atatcccgga caagacctga gtttaactac tgccaggcgc 900
gaggatgaaa gtggtcagga tgaagttgag gatcattata gcagagtctc acatgatcta 960
ggtgacgaga gtatcgatca agcaagttat agcatggaaa gttcggtcag ctacactagc 1020
tatagtagta gcagtaatag tagtagtgcc cactacagtt taagcagtag cagccgaggt 1080
aatccaaaac gtgaaaacat cgatcacacg aatgccacct atgtctctga attgtcaagt 1140
ataacgagtt ctatagacaa tttaactact tcgacaaccc cagaggagga ggataattta 1200
attcatcata actatgacgc ccaagggtat ggatcaggag aggacgatgg agaagaggtt 1260
tatgatgatg aagatctttc ttcttccgat tactcagtac tatccattct accgtcaatc 1320
tcaatttgtg attctctagg gtattttagg ctagttttgc aatctatatt aattcaggat 1380
ccagacacca aagaaatttt tactgcgatt agacagtcaa acaataaacc tacaatggca 1440
agcgttaccg atgattggtt gctgtatgat tccaattttt caatgaataa tttacaaatt 1500
ctaacacttc aagatttgct agatatcaag agatcatttc caaaaatttt attttacaca 1560
atggttattg tgacaaactc cggcaaacag gttgaagaag aattcaaaaa tcccaattat 1620
gataataggg aaggaatatc aaaagagcaa cctctagatt ctgagttatc attaactaac 1680
gacccgcaac aatatttccc gactgcatat aataacggtt acaacgacta tattgacgat 1740
gaagacgatg aagacgatgg tgacgatgct tctttatcag aacagtcagg cccacaaatg 1800
tacataccaa ctagaatgga atctaacgtt actacagcac atcgttctat tagaaccgta 1860
aacagtatcg gggaatgggc attcaataga cataattctg ttacaaaaat cgataaaagt 1920
aatagtaacg agttggataa ctctaaaaca ggtgaaagta cagttttatc aagtgaacct 1980
catccaatga cacaactgtc gaactctaat acgacttcct cgaattttag ccattctttg 2040
aagacaaaaa attctcacaa acctaattcc aagggtaaca atgaaagtaa ttccaaaaat 2100
gagttgaaaa agataaagag ttccatcaat gctatgagtg ccgtggaaag gtccaaaagt 2160
ttgcctttac ctacattact aaagtcttta agcggcatag ataaccctac tcatgccact 2220
aacaaggata gaaagcgttg gaaattccag atgaataggt ttaagaatca taaaaacagt 2280
ggttctgcag gtacggataa atctcagcgt tgtgccatca tgtaa 2325
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 扩增引物序列Gis4-F(Artificial Sequence)
<400> 2
atgcaaaaat ccgttagagt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 扩增引物序列Gis4-R(Artificial Sequence)
<400> 3
ttacatgatg gcacaacgct 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttaccgatga ttggttgctg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtaacgccag ggttttccca 20
Claims (7)
1.一种利用过表达Gis4的酿酒酵母基因工程菌发酵制备乙醇的方法，其特征在于，该菌株由原始酿酒酵母的Gis4基因过表达后改造得到，所述Gis4基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示，所述原始酿酒酵母来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏编号：CICC 1308，其中，通过固定化发酵制备乙醇。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述过表达Gis4的酿酒酵母基因工程菌通过如下步骤构建得到：
（1）以菌株保藏编号：CICC 1308的酿酒酵母的基因组DNA为模板，扩增出Gis4目的基因片段；
（2）利用限制性内切酶获得线性化质粒pYX212，将Gis4目的基因片段与线性化质粒pYX212导入大肠杆菌DH5α中，获得DH5α-pYX212-Gis4菌株，提取所获得的目标大肠杆菌的质粒；
（3）将步骤（2）得到的质粒转化至酿酒酵母感受态中，即得过表达酿酒酵母基因工程菌。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述限制性内切酶为SacI。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，用限制性核酸内切酶对获得质粒进行酶切验证，利用凝胶电泳对取得质粒进行可视化初筛。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述固定化发酵以天然有机载体、人工合成高分子载体、人工无机高分子材料、复合材料作为固定化介质。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，发酵的温度为30℃-40℃。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，发酵的发酵培养基配方如下：50-100 g/L葡萄糖，3-6 g/L蛋白胨、0.1-1 g/L硫酸铵、3-6 g/L磷酸二氢钾、3-6 g/L酵母膏、0.0-1 g/L硫酸镁、0.01-1 g/L七水合硫酸亚铁、0.01-1g/L七水合硫酸锌，溶剂为水。
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| "Gis4, a New Component of the Ion Homeostasis System in the Yeast Saccharomyces cerevisiae";Tian Ye et al.,;《EUKARYOTIC CELL》;20061030;第5卷(第10期);第1611页摘要和右栏第2段、第1615页右栏第1段、第1618页右栏第3段 * |
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