CN115806922B - 运动发酵单胞菌的基因工程菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种运动发酵单胞菌的基因工程菌株及其应用。该基因工程菌株是将ZM4‑Cas12a菌株中pZM32、pZM36、pZM33、pZM39四个内源性质粒敲除得到的菌株。该基因工程菌株ZMNP获得了一种精简的基因组，减少能量消耗，并且具有一系列的优良性状，如转化效率高、更加耐受抑制物、对二次母液的利用能力更好等优异性能，十分适合作为工业微生物的底盘细胞。

Description

运动发酵单胞菌的基因工程菌株及其应用
技术领域
本申请涉及运动发酵单胞菌技术领域，具体涉及运动发酵单胞菌的基因工程菌株。
背景技术
生物产业作为一种绿色、可持续发展的现代化制造方式不仅有效缓解资源能源短缺、环境弱化等全球面临的压力，而且是生物经济的重要组成部分，是减少化石燃料的依赖、能源和资源消耗、以及创造绿色就业机会和促进可持续发展的主要动力。生物产业发展的核心与关键是建立优良的菌种资源。目前，已经在多种微生物中通过菌株改造赋予其优良特性，实现多种化合物的产品生产。微生物基因组精简优化是构建优良底盘细胞的重要策略，对基因组中非必需的编码区域和非编码区域进行大规模的删减，得到“最小基因组”，通过敲除冗余基因减少细胞能耗，使更多的能量用于产品生产。
运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)作为一种兼性厌氧革兰氏阴性菌，具有许多独特的生理特点和优异的工业生产特性，是目前唯一已知能够在厌氧条件下利用2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸(Entner-Doudoroff，ED)途径的微生物，具有较高的糖吸收率、乙醇收率和乙醇耐受性等优良特性；近年来被作为纤维素类生物质生物炼制生产生物能源的细胞工厂受到重视天然产乙醇菌株，目前已经在运动发酵单胞菌中实现了乳酸、2-3丁二醇，异丁醇,PHB等产品的生产。相比于模式微生物酿酒酵母(12.12Mb)和大肠杆菌(5.15Mb)，运动发酵单胞菌(2.14Mb)有基因组小的优势，便于开展基因组精简优化，是一个理想的工业微生物底盘细胞。然而，由于其某些内源性质粒的不必要表达而造成运动发酵单胞菌最为微生物底盘细胞进行发酵而造成负面的影响，不利于提高其对抑制物的耐受性和对底物的利用能力。
发明内容
为此，本申请发明人通过基因组测序发现，显示ZM4的基因组包括4个内源质粒：pZM32，32791bp；pZM33，33006bp；pZM36，36494bp和pZM39，39266bp)，内源质粒大小占据了总基因组大小的6.43％，且ZM4菌株内四个内源质粒的拷贝数在厌氧条件下的数量在1-2个，在有氧条件下的数量为在1～6个。本申请以运动发酵单胞菌ZM4-Cas12a为出发菌株，通过基因工程的手段对菌株的四个内源质粒进行消除，得到无内源质粒的菌株ZMNP。建立的基因工程菌株ZMNP获得了一种精简的基因组，减少能量消耗，并且具有一系列的优良性状，如转化效率高、更加耐受抑制物、对二次母液的利用能力更好等优异性能，十分适合作为工业微生物的底盘细胞。为此，本申请至少公开了如下技术方案：
第一方面，本申请实施例公开了一种运动发酵单胞菌的基因工程菌株，所述基因工程菌株是在ZM4-Cas12a菌株中敲除pZM32、pZM36、pZM33、pZM39四个内源性质粒得到的菌株。
第二方面，本申请实施例公开了一种运动发酵单胞菌的基因工程菌株的构建方法，其中，所述基因工程菌株是在ZM4-Cas12a菌株中敲除pZM32、pZM36、pZM33、pZM39四个内源性质粒得到的菌株；
所述构建方法包括：
构建用于靶向消除的pZM32和pZM36的第一编辑质粒，构建靶向消除pZM33的第二编辑质粒，构建靶向消除pZM39的第三编辑质粒，构建用于替换pZM39上的毒素-抗毒素***基因的第四编辑质粒，构建靶向消除Cas12a和壮观霉素基因的第五编辑质粒；
将所述第一编辑质粒转入ZM4-Cas12a菌株中，得到pZM32和pZM36消除的ZM4-Cas12a菌株；
将所述第二编辑质粒转入pZM32和pZM36消除的ZM4-Cas12a菌株中，得到pZM32、pZM36和pZM33消除的ZM4-Cas12a菌株；
将所述第四编辑质粒转入pZM32、pZM36和pZM33消除的ZM4-Cas12a菌株，得到pZM39上的毒素-抗毒素***基因替换为抗性基因的ZM4-Cas12a菌株；
将所述第三编辑质粒转入至pZM32、pZM36和pZM33消除的ZM4-Cas12a菌株中，得到pZM32、pZM36、pZM33和pZM39四个内源性质粒消除的菌株ZMNP-Cas12a；以及
将所述替换Cas12a和壮观霉素基因的第五编辑质粒电转到pZM32、pZM36、pZM33和pZM39四个内源性质粒消除的菌株ZMNP-Cas12a中，得到所述基因工程菌株。
第三方面，本申请实施例公开了第一方面所述的基因工程菌株、或第二方面所述的构建方法得到的基因工程菌株在构建乙醇发酵底盘细菌中的应用。
第四方面，本申请实施例公开了第一方面所述的基因工程菌株、或第二方面所述的构建方法得到的基因工程菌株在乙醇发酵中的应用。
第五方面本申请实施例公开了第一方面所述的基因工程菌株、或第二方面所述的构建方法得到的基因工程菌株在构建低ROS水平的底盘细菌中应用。
与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果之一：
本申请构建了消除四个内源质粒的运动发酵单胞菌的基因工程菌株ZMNP，并公开了其构建方法。该菌株有以下的优势：
(1)精简了基因组的大小，可以降低基因组的复杂性，增强基因通路的可预测性和可操作性，获得更加易于控制的底盘细胞。
(2)转化效率更高，更有利于外源DNA进入细胞发挥功能。
(3)ZMNP菌株对抑制物的耐受性更强，从而提高菌株的鲁棒性。
(4)本研究得到的运动发酵单胞菌ZMNP菌株，在玉米芯纤维素水解液二次母液中可以更快的利用其中的葡萄糖，从而更快生产产物乙醇，降低了发酵过程中的成本。
附图说明
图1为本申请实施例提供一种运动发酵单胞菌的基因工程菌株的构建流程示意图。
图2为本申请实施例提供的ZMNP菌株构建过程中的ZM4-Cas12a菌株、ZM4-Cas12aΔ32Δ36菌株、ZM4-Cas12aΔ32Δ33Δ36菌株和ZMNP菌株(a图)，以及ZM4和ZMNP菌株(b图)的电泳验证结果图；图b用于验证敲除Cas12a和壮观霉素的同时，ZMO0038是否回补成功；Out泳道表示用ZMO0038基因上游和下游的一对引物PCR扩增的电泳结果图；“in”泳道表示用ZMO0038基因上游的一个引物和基因内部的一个引物PCR扩增的电泳结果图。
图3为本申请实施例提供的ZMNP及ZM4透射电子显微镜形态观察结果图。
图4为本申请实施例提供的ZM4和ZMNP通过菌落数计算相应的转化效率结果图。
图5为本申请实施例提供的ZMNP和ZM4在30℃和40℃下的生长曲线图，以及不同时间点下的葡萄糖消耗和乙醇生成代谢结果图。
图6为本申请实施例提供的ZMNP和ZM4在RMG5条件下生长情况及ROS测试结果图。
图7为本申请实施例提供的ZMNP和ZM4在MMG5条件下生长情况及ROS测试结果图。
图8为本申请实施例提供的ZMNP和ZM4在RMAce条件下生长情况及ROS测试结果图。
图9为本申请实施例提供的ZMNP和ZM4在MMAce条件下生长情况及ROS测试结果图。
图10为本申请实施例提供的ZMNP和ZM4在RMF条件下生长情况及ROS测试结果图。
图11为本申请实施例提供的ZMNP和ZM4在MMF条件下生长情况及ROS测试结果图。
图12为本申请实施例提供的ZMNP和ZM4在RMEth条件下生长情况及ROS测试结果图。
图13为本申请实施例提供的ZMNP和ZM4在MMEth条件下生长情况及ROS测试结果图。
图14为本申请实施例提供的ZMNP及ZM4在玉米芯纤维素水解液二次母液中葡萄糖消耗及乙醇生成结果图。
图15为本申请实施例提供的第四编辑质粒的构建流程图。
图16为本申请实施例提供的第五编辑质粒的敲除Cas12a和Spe抗性基因的基因编辑原理图。
图17为本申请实施例提供的pEZ-HsdSp质粒的结构图。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。本申请中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。
需要说明的是，本申请的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序，也不对其后的技术特征起到实质的限定作用。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本申请的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、***、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
本申请实施例提供的运动发酵单胞菌的基因工程菌株是以运动发酵单胞菌ZM4-Cas12a为出发菌株，通过基因工程的手段对菌株的四个内源质粒进行消除，得到无内源质粒的菌株ZMNP。此菌株可以减少基因组的复杂程度，减少能量消耗，并且具有一系列的优良性状，如转化效率高、更加耐受抑制物、对二次母液的利用能力更好等。为此，本申请实施例公开了一种运动发酵单胞菌的基因工程菌株，所述基因工程菌株是将ZM4-Cas12a菌株中敲除pZM32、pZM36、pZM33、pZM39四个内源性质粒得到的菌株。其中，运动发酵单胞菌ZM4-Cas12a是将来源于弗朗西斯菌(F.novicida)的核酸酶Cas12a基因和壮观霉素抗性基因通过同源重组的方法整合到ZM4(Z mobilis subsp.mobilis ZM4 ATCC3182)菌株基因组ZMO0038位点，构建了重组菌株ZM4-Cas12a，构建方法参照“Establishment andapplication of a CRISPR-Cas12a assisted genome-editing system In Zymomonasmobilis[J],Microbial Cell Factories，2019,18:162”。其中，ZM4-Cas12a菌株中的四个内源质粒按照大小命名依次为:pZM32(32,791bp，Genbank编号CP023678)、pZM33(33,006bp，Genbank编号NZ－P023679)、pZM36(36,494bp，Genbank编号CP023680)和pZM39(39,266bp，Genbank编号CP023681)。
为此，本申请实施例还公开了该种运动发酵单胞菌的基因工程菌株的构建方法。该构建方法包括：
构建用于靶向消除的pZM32和pZM36的第一编辑质粒，构建靶向消除pZM33的第二编辑质粒，构建靶向消除pZM39的第三编辑质粒，构建用于替换pZM39上的毒素-抗毒素***基因的第四编辑质粒，构建靶向消除Cas12a和壮观霉素基因的第五编辑质粒；
将所述第一编辑质粒转入ZM4-Cas12a菌株中，得到pZM32和pZM36消除的ZM4-Cas12a菌株；
将所述第二编辑质粒转入pZM32和pZM36消除的ZM4-Cas12a菌株中，得到pZM32、pZM36和pZM33消除的ZM4-Cas12a菌株；
将所述第四编辑质粒转入pZM32、pZM36和pZM33消除的ZM4-Cas12a菌株，得到pZM39上的毒素-抗毒素***基因替换为抗性基因的ZM4-Cas12a菌株；
将所述第三编辑质粒转入至pZM32、pZM36和pZM33消除的ZM4-Cas12a菌株中，得到pZM32、pZM36、pZM33和pZM39四个内源性质粒消除的菌株ZMNP-Cas12a；以及
将所述第五编辑质粒转入替换Cas12a和壮观霉素基因的编辑质粒电转到pZM32、pZM36、pZM33和pZM39四个内源性质粒消除的菌株ZMNP-Cas12a中，得到所述基因工程菌株。
在一些实施例中，第一编辑质粒携带有第一CRISPR表达单元，所述第一CRISPR表达单元包含具有如SEQ ID NO.1所示的先导区、具有如SEQ ID NO.2所述的重复区和具有如SEQ ID NO.3所示的第一向导RNA。
在一些实施例中，第二编辑质粒携带有第二CRISPR表达单元，所述第二CRISPR表达单元包含具有如SEQ ID NO.1所示的先导区、具有如SEQ ID NO.2所述的重复区和具有如SEQ ID NO.4的第二向导RNA。
在一些实施例中，第三编辑质粒携带有第三CRISPR表达单元，所述第三CRISPR表达单元包含具有如SEQ ID NO.6所示的先导区、具有如SEQ ID NO.7所述的重复区和具有如SEQ ID NO.5的第三向导RNA。
在一些实施例中，第四编辑质粒携带有pZM39同源的同源臂和用于替换pZM39上的毒素-抗毒素***基因的抗性基因。在一些实施例中，所述抗性基因选自氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因、氯霉素抗性基因、链霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、壮观霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、杀稻瘟菌素抗性基因、遗传霉素抗性基因、霉酚酸抗性基因、嘌呤霉素抗性基因、博莱霉素抗性基因或新霉素抗性基因中的一种。
在一些实施例中，第五编辑质粒携带有第五CRISPR表达单元，所述第五CRISPR表达单元包含具有如SEQ ID NO.6所示的先导区、具有如SEQ ID NO.7所述的重复区和具有如SEQ ID NO.8的第五向导RNA。
在一些实施例中，如图1所示，该构建方法包括：以运动发酵单胞菌ZM4-Cas12a为出发菌株(该菌株是将来源于弗朗西斯菌(F.novicida)的核酸酶Cas12a基因与用于筛选的壮观霉素抗性基因通过同源重组的方法整合到ZM4(Z mobilis subsp.mobilis ZM4ATCC3182)菌株基因组ZMO0038位点，构建了重组菌株ZM4-Cas12a，构建方法参照“Establishment and application of a CRISPR-Cas12a assisted genome-editingsystem In Zymomonas mobilis[J],Microbial Cell Factories，2019,18:162”)，这一菌株中含有运动发酵单胞菌内源型CRISPR-ⅠF基因编辑***，及外源型CRISPR-Cas12a编辑***。首先，构建第一编辑质粒(其靶向消除pZM32和pZM36)，将第一编辑质粒转入ZM4-Cas12a中，得到了pZM32和pZM36消除的菌株ZM4-Cas12aΔ32Δ36；再将第二编辑质粒(靶向消除pZM33，具体靶向pZM33的复制酶基因ZMOp33×028)转入ZM4-Cas12aΔ32Δ36中，得到内源质粒pZM32、pZM33和pZM36被消除的菌株ZM4-Cas12aΔ32Δ33Δ36；再将第四编辑质粒转入ZM4-Cas12aΔ32Δ33Δ36中，通过同源重组将pZM39质粒上毒素-抗毒素***(T-A***)基因替换为氯霉素基因，得到ZM4-Cas12aΔ32Δ33Δ36ΔTA::Cm菌株；再将第三编辑质粒(靶向消除pZM39，具体靶向pZM39的复制酶基因ZMOp39×032)转入ZM4-Cas12aΔ32Δ33Δ36ΔTA::Cm菌株，得到菌株ZMNP-Cas12a；最后，再将第五编辑质粒(携带ZMO0038)转入ZMNP-Cas12a中，通过ZMO0038替换Cas12a和壮观霉素基因，得到菌株ZMNP。各敲除阶段菌落PCR验证结果如图2所示。并对ZMNP菌株进行了一系列表型的验证：形态验证、转化效率测试、在30℃和40℃下的生长及葡萄糖-乙醇代谢测试、乙酸、糠醛、乙醇抑制物下生长及ROS测试、二次母液培养基的利用情况等。
(1)形态验证
通过投射电子显微镜分别对ZM4和ZMNP进行形态观察。ZM4和ZMNP从形态上来看都呈短棒状形态，无论从横切面还是纵切面比较，细胞形态都很相似，且细胞大小都约为2～3μm×1～1.5μm。说明四个内源质粒的消除不影响细胞的形态。ZMNP及ZM4透射电子显微镜形态观察结果图见图3。
(2)ZMNP转化效率的测试
由于ZMNP菌株缺乏具有识别并切割序列5’GAAGNNNNNNNTCC的限制修饰***的pZM32内源质粒，故本申请中对ZMNP的转化效率进行测定。构建pEZ-HsdSp质粒用于转化效率测试。50ng去甲基化和甲基化状态的质粒分别电转到ZM4和ZMNP中，通过菌落数计算相应的转化效率，结果如图4所示。无论是甲基化质粒还是去甲基化质粒都表现为ZMNP转化效率得到1000倍的提高。
(3)ZMNP不同温度下的生长、葡萄糖-乙醇代谢测试
本申请中，将基因工程改造菌株ZMNP和野生型菌株ZM4分别在30℃和40℃中进行生长和葡萄糖-乙醇代谢测试。具体为在30℃，装瓶量为80％的RMG5培养基于50mL三角瓶，100rpm培养条件下进行测试，在40℃，装瓶量为80％的RMG5培养基于50mL三角瓶，100rpm培养条件下进行测试。在发酵过程中每隔一定时间取样测试OD600 nm，同时取1mL样品暂储存于-80℃，待发酵液葡萄糖耗完，收集菌体测量发酵过程中葡萄糖与乙醇的变化情况。得到ZMNP和ZM4在30℃和40℃下的生长曲线图，以及不同时间点下的葡萄糖消耗和乙醇生成代谢结果图，如图5所示。在两种温度下，ZMNP和ZM4的生长、葡萄糖消耗及乙醇生成相近。
(4)ZMNP在不同抑制物添加下的生长及ROS水平测试
①无抑制物培养基下的生长及ROS测试
本申请中将ZMNP和ZM4分别运用RMG5培养基和基本培养基MMG5，在装瓶量为80％的50mL三角瓶中进行培养，培养温度为30℃，转速为100rpm，初始接种量为0.1OD600nm。取不同时间点的样品进行OD600 nm测定，绘制生长曲线。RMG5中，取3h样品进行ROS测定，MMG5中，取12h样品进行ROS测定。RMG5条件下生长情况及ROS测试结果见图6。MMG5条件下生长情况及ROS测试结果见图7。两种培养基下ZMNP和ZM4的生长相似，胞内ROS水平较ZM4低。
②乙酸抑制物培养基下的生长及ROS测试
本申请中将ZMNP和ZM4分别运用RMAce培养基(添加有200mM乙酸的RMG5培养基)和MMAce培养基(添加有200mM乙酸的MMG5培养基)，在装瓶量为80％的50mL三角瓶中进行培养，培养温度为30℃，转速为100rpm，初始接种量为0.1OD600 nm。取不同时间点的样品进行OD600 nm测定，绘制生长曲线。RMAce中，取3h样品进行ROS测定，MMAce中，取12h样品进行ROS测定。RMAce条件下生长情况及ROS测试结果见图8。MMAce条件下生长情况及ROS测试结果见图9。两种培养基下ZMNP和ZM4的生长相似，胞内ROS水平较ZM4低。
③糠醛抑制物培养基下的生长及ROS测试
本申请中将ZMNP和ZM4分别运用RMF培养基(添加有27mM糠醛的RMG5培养基)和MMF培养基(添加有27mM糠醛的MMG5培养基)，在装瓶量为80％的50mL三角瓶中进行培养，培养温度为30℃，转速为100rpm，初始接种量为0.1OD600 nm。取不同时间点的样品进行OD600 nm测定，绘制生长曲线。RMF中，取3h样品进行ROS测定，MMF中，取12h样品进行ROS测定。RMF条件下生长情况及ROS测试结果见图10。MMF条件下生长情况及ROS测试结果见图11。两种培养基下ZMNP和ZM4的生长相似，胞内ROS水平较ZM4低。
④乙醇抑制物培养基下的生长及ROS测试
本申请中将ZMNP和ZM4分别运用RMEth培养基(添加有6％v/v无水乙醇的RMG5培养基)和MMEth培养基(添加有6％v/v无水乙醇的RMG5培养基)，在装瓶量为80％的50mL三角瓶中进行培养，培养温度为30℃，转速为100rpm，初始接种量为0.1OD600 nm。取不同时间点的样品进行OD600 nm测定，绘制生长曲线。RMEth中，取3h样品进行ROS测定，MMEth中，取12h样品进行ROS测定。RMEth条件下生长情况及ROS测试结果见图12。MMEth条件下生长情况及ROS测试结果见图13。两种培养基下ZMNP和ZM4的生长相似，胞内ROS水平较ZM4低。
(5)ZMNP二次母液利用情况
本申请中使用的二次母液来自浙江华康公司，是玉米芯纤维素预处理后的水解液，在经过一次糖结晶后剩余的含糖量高的残留液。该二次母液主要成分包括木糖(103.98g/L)、葡萄糖(196.18g/L)、***糖(239.2g/L)、甘露糖(45.75g/L)、乙酸(1.16g/L)、糠醛(4.44g/L)、HMF(0.87g/L)。在此使用1/3二次母液培养基，具体配置方法为：270mL的木糖二次母液，51μL的10×RM-母液(100g/L酵母提取物，20g/L磷酸二氢钾)，340mL纯水，混匀以后过滤除菌。在1L的发酵罐中放入500mL的1/3二次母液培养基，初始接种量为0.1OD600 nm，控制培养温度为30℃，转速为100rpm，用2M氢氧化钾控制pH，使之保持pH4.9。在不同时间点取样用于检测葡萄糖和乙醇含量。ZMNP及ZM4葡萄糖消耗及乙醇生成结果如图14所示。
下方将对上述实施例中使用的第一编辑质粒、第二编辑质粒、第三编辑质粒、第四编辑质粒和第五编辑质粒的构建过程，以及采用这些质粒对ZM4-Cas12a进行基因编辑得到ZMNP菌株的编辑过程进行详细说明。
1、第一编辑质粒、第二编辑质粒和第三编辑质粒的构建方法
设计ZM4四个内源质粒的复制酶基因ZMOp32×017，ZMOp33×028，ZMOp36×036，ZMOp39×032，设计向导RNA的核苷酸序列依次如如SEQ ID NO.3所示、如SEQ ID NO.4所示、如SEQ ID NO.5所示和如SEQ ID NO.8所示，分别靶向这四个内源质粒，实现内源质粒DNA双链的断裂，由于运动发酵单胞菌中缺乏非同源末端连接修复***，因此断裂的DNA不能继续遗传给下一代，从而实现内源质粒的消除。第一编辑质粒和第二编辑质粒分别靶向消除pZM32、pZM36和pZM33，构建方法及其转入ZM4-Cas12a的基因编辑方法参照CN110358767A实施。
其中，第三编辑质粒pZM39的消除运用CRISPR-ⅠF型编辑质粒，具体的构建方法如下：
从复制酶基因ZMOp39×032中选择PAM位点CCC位点下游32bp的序列作为构建靶质粒中向导RNA的靶向引物序列，引导核酸酶对靶位点的切割。具体的引物序列如下(每条引物前4个碱基设置为接头，与酶切后的载体互补配对)：39-032-gR-F:5’-gaaagtaaccagtccttttatcgacaggctaggccg-3’，如SEQ ID NO.9所示；39-032-gR-R:5’-gaaccggcctagcctgtcgataaaaggactggttac-3’，如SEQ ID NO.10所示。
将向导RNA引物序列)连接到专利CN110408642A中含有CRISPR-ⅠF表达单元的卡那霉素编辑质粒载体上：首先利用限制性内切酶BsaⅠ将载体进行线性化处理，然后将向导RNA引物对进行退火(10μM的引物各取1μL加水补足至10μL，95℃变性5min，然后冷却至室温备用)。退火的产物与线性化载体使用T4 DNA连接酶进行连接，然后通过本领域通用化学转化法转入到大肠杆菌克隆菌株DH5α中进行质粒构建，通过菌落PCR对重组子进行筛选最后通过测序验证。BsaⅠ酶切及T4 DNA连接酶酶连体系见表1和表2。
表1BsaⅠ酶切反应体系
表2T4DNA连接酶酶连反应体系
2、第四编辑质粒的构建
本申请实施例使用的第四编辑质粒用于替换pZM39上的T-A***基因，第四编辑质粒的构建方法为包括(1)～(6)的步骤，其流程示意图如图15所示。
(1)提取ZM4基因组：收取2mL过夜培养的ZM4菌液，使用细菌基因组提取试剂盒提取基因组。
(2)同源臂US和DS序列的获取：设计带有与pUC57-Ori和氯霉素基因cat同源的引物，以ZM4基因组为模板，PCR扩增ZMOp39×020上游1kb的同源臂序列(US)和ZMOp39×023下游1kb的同源臂序列(DS)，并胶回收。扩增US的引物如SEQ ID NO.11～12所示，扩增DS的引物如SEQ ID NO.13～14所示。
(3)氯霉素基因的获取：从具有氯霉素抗性的pEZ15A质粒上扩增氯霉素基因，并胶回收，扩增氯霉素抗性基因的引物如SEQ ID NO.15～16所示。
(4)pUC57-Ori序列的获取：从pUC57质粒上扩增Ori序列，并胶回收。扩增Ori序列的引物如SEQ ID NO.17～18所示。
(5)US片段、氯霉素基因和DS片段连接产物的获得：通过Overlap PCR，将US、氯霉素基因和DS片段连接成一个长片段，并通过胶回收得到产物。Overlap PCR体系及程序见表3和表4。
(6)同源重组替换ZMOp39×020、ZMOp39×021、ZMOp39×022、ZMOp39×023质粒的获得：将(4)和(5)中的最终片段用T5外切酶处理(表5)，并转化到大肠杆菌DH5α细胞感受态中，PCR验证平板上的阳性克隆，过夜培养后提取其中的质粒(质粒提取按照质粒提取试剂盒标准步骤)。
表3 Overlap PCR体系
试剂 体积
US-F-primer(10μM) 2.4μL
DS-R-primer(10μM) 2.4μL
2×PrimerSTAR(Takara) 30μL
US fragment 80ng
DS fragment 80ng
Cat fragment 80ng
ddH2O Up to 60μL
Total volume 60μL
表4 PCR反应程序
表5基于T5外切酶的Gibson组装
试剂 体积
DNA fragment 0.12pM
Vector 0.04pM
10×Buffer 4(Thermo) 0.5μL
T5 Exonuclease 0.5U
ddH2O To 5μL
3、第五编辑质粒的构建
(1)靶位点的选取
选择ZM4-Cas12a基因组中Cas12a基因作为靶位点，对其及上游壮观霉素基因进行敲除，原理如图16所示。从靶基因中选择PAM位点CCC位点下游32bp的序列作为构建靶质粒中向导RNA的靶向引物序列，引导核酸酶对靶位点的切割。具体的引物序列如下(每条引物前4个碱基设置为接头，与酶切后的载体互补配对)：Cas12a-gR-F:5’-gaaatgcgttttgaactgattccgcagggtaaaacc-3’，如SEQ ID NO.19所示；Cas12a-gR-R:5’-gaacggttttaccctgcggaatcagttcaaaacgca-3’，如SEQ ID NO.20所示。
(2)构建靶质粒
将向导RNA引物序列连接到专利CN110408642A中含有CRISPR-ⅠF表达单元的氯霉素编辑质粒载体上：首先利用限制性内切酶BsaⅠ将载体进行线性化处理，然后将向导RNA引物对进行退火(10μM的引物各取1μL加水补足至10μL，95℃变性5min，然后冷却至室温备用)。退火的产物与线性化载体使用T4DNA连接酶进行连接，然后通过本领域通用化学转化法转入到大肠杆菌克隆菌株DH5α中进行质粒构建，通过菌落PCR对重组子进行筛选最后通过测序验证。
(3)构建第五编辑质粒
采用Cas12a-US-F(如SEQ ID NO.21所示)和Cas12a-US-R(如SEQ ID NO.22所示)扩增靶基因上游1kb序列，采用Cas12a-DS-F(如SEQ ID NO.23所示)和Cas12a-DS-R(如SEQID NO.24所示)扩增靶基因下游1kb序列，采用0038-F(如SEQ ID NO.25所示)和0038-R(如SEQ ID NO.26所示)扩增ZMO0038基因序列，通过PCR分别扩增其DNA片段，再通过OverlapPCR获得上、下游连接在一起的片段。Overlap PCR体系及程序见表3和表4。
将上一步构建好的靶载体利用引物进行反向PCR扩增(PCR扩增程序设置为：98℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸(根据片段长度按照10s/kb进行设置，反向扩增的引物如SEQ ID NO.27～28所示)，共30个循环；循环反应结束后72℃保持5min)，然后通过Gibson装配的方法将片段和载体进行连接，然后转入到大肠杆菌克隆菌株DH5α中进行质粒构建，通过菌落PCR对重组子进行筛选最后通过测序验证，验证正确得到第五编辑质粒。
4、基因编辑质粒的转化
在本申请实施例中，第一编辑质粒、第二编辑质粒、第三编辑质粒、第四编辑质粒和第五编辑质粒转入菌株的方法基本相同，其转化过程大致如下：
(1)待转化的感受态菌株的制备
将冻存菌从-80℃冰箱中取出，取100μL接种在装有1mL RMG5的冻存管中，于30℃培养箱静置培养以活化菌株。待培养至浑浊后，转接至装有200mL RMG5液体培养基的250mL蓝盖瓶中，使初始OD600 nm在0.025～0.3范围内，于30℃培养箱静置培养，待OD600 nm超过0.3时，常温100rpm收集菌体，随后用无菌水洗1次，10％甘油洗两次，最终用1～2mL10％甘油缓慢重悬菌体，分装55μL感受态到1.5mL EP管中。
(2)质粒电转化过程
将200ng的第一编辑质粒、第二编辑质粒、第三编辑质粒、第四编辑质粒或500ng的第五编辑质粒，加入到装有55μL感受态的1.5mL EP管中，轻轻混匀后转移到1mm电转杯中。电转仪程序设置：200Ω，电容：25μF，电压：1.6KV。将电转杯放入电转仪中进行电转，电转后立即加入1mL RMG5液体培养基，混匀后转移到无菌EP管中，用封口膜封好后于30℃恒温培养箱中孵育4-6h。取100μL菌液，均匀涂布到RMG5+Cm平板(100μg mL-1氯霉素)上，其中第三编辑质粒电转后涂布在RMG5+Km平板(300μg mL-1卡那霉素)上。用封口膜将平板封好后放在30℃培养箱中倒置。
(3)菌落PCR验证过程
平板上长出单菌落后，用验证转入的编辑质粒的引物对单菌落进行PCR验证。PCR体系和PCR程序如下。将获得的正确阳性克隆在所带RMG5+Cm培养基中活化后，甘油保菌。
表6菌落PCR体系
试剂 体积
F-primer(10μM) 0.4μL
R-primer(10μM) 0.4μL
2×T5 Super PCR Mix(Tsingke) 5μL
Template(单菌落溶于10μLddH2O) 1μL
ddH2O 3.2μL
Total volume 10μL
表7 PCR程序
温度 时间 循环数
98℃ 3min
98℃ 10s 29
55℃ 10s
72℃ 10s
72℃ 3min
16℃ 保持
(4)编辑质粒消除过程
将内源质粒消除成功的菌株接种在没有抗性的RMG5液体培养基中，待长到浑浊后转接100μL菌液到1mL新鲜的RMG5液体培养基中，如此连续传代4-5代后，取100μL菌液稀释涂在RMG5平板上。待平板上长出单菌落后，用验证编辑质粒的引物对单菌落进行PCR验证，若PCR没有条带，则编辑质粒可能丢失。将菌落PCR没有条带的单菌落分别接种在RMG5液体培养基和RMG5+Cm液体培养基中，放置在30℃静置培养。第二天对两种培养基下的培养结果进行观察，若在RMG5液体培养基可以生长变浑浊，而在RMG5+Cm液体培养基中无法生长呈澄清状态，则可以确认编辑质粒已被消除。其中第三编辑质粒的消除在RMG5+Kan培养基下验证。
5、内源质粒消除具体实例：
将靶向ZMOp32×017的编辑质粒电转入ZM4-Cas12a中，涂布在RMG5+Cm平板上。得到的转化子用引物32-check-F/R(SEQ ID NO.31～32)进行验证。菌落PCR以ZM4-Cas12a的PCR结果作为对照。菌落PCR以引物33-check-F/R(SEQ ID NO.33～34)、36-check-F/R(SEQID NO.35～36)、39-check-F/R(SEQ ID NO.37～38)的PCR扩增结果观察其它内源质粒是否存在。菌落PCR结果显示消除pZM32的同时pZM36也同时被消除。单菌落在RMG5液体培养基中连续传代后得到编辑质粒丢失的得到ZM4-Cas12aΔ32Δ36菌株。将此菌株制备感受态以供后续使用。
将靶向ZMOp33×028的编辑质粒电转入ZM4-Cas12aΔ32Δ36中，涂布在RMG5+Cm平板上。得到的转化子用引物33-check-F和33-check-R进行验证。菌落PCR以ZM4-Cas12aΔ32Δ36的PCR结果作为对照。同时以33-check-F/R、36-check-F/R、39-check-F/R的PCR扩增结果观察其它内源质粒是否存在。菌落PCR结果显示在此前基础上pZM33被消除。单菌落在RMG5液体培养基中连续传代后得到编辑质粒丢失的得到ZM4-Cas12aΔ32Δ33Δ36菌株。将此菌株制备感受态以供后续使用。
将替换pZM39上的T-A***基因所用到的质粒电转到ZM4-Cas12aΔ32Δ33Δ36菌株中，得到的转化子用引物39-TA-check-F/R菌落PCR验证，确定敲除T-A基因后在RMG5液体培养基中培养，并制备感受态。
将靶向ZMOp39×032的编辑质粒电转入上一步感受态中，涂布在RMG5+Kan平板上。得到的转化子用引物39-check-F/R进行验证。菌落PCR以ZM4-Cas12a的PCR结果作为对照。菌落PCR以引物32-check-F/R、33-check-F/R、39-check-F/R的PCR扩增结果观察其它内源质粒是否存在。菌落PCR结果显示在此前基础上pZM39被消除。单菌落在RMG5液体培养基中连续传代后得到编辑质粒丢失的ZMNP-Cas12a菌株。将此菌株制备感受态以供后续使用。
将替换Cas12a和壮观霉素基因的编辑质粒电转到ZMNP-Cas12a感受态中，涂布在RMG5+Cm平板上。得到的转化子用引物0038-out-F/R(SEQ ID NO.39、40)和0038-out-F/in-R2(SEQ ID NO.39、41)进行验证。ZMO0038替换Cas12a和壮观霉素基因成功的单菌落在RMG5液体培养基中连续传代后得到编辑质粒丢失的ZMNP菌株。
6、ZMNP转化效率测定方法
(1)转化效率测试pEZ-HsdSp质粒的构建：
通过引物设计，将5’GAAGNNNNNNNTCC序列信息放置在正向引物HsdSp-F(SEQ IDNO.42)和反向引物HsdSp-R(SEQ ID NO.43)的5’端，利用这一对引物对pEZ15A进行PCR扩增，得到的PCR产物回收后，利用基于T5外切酶的Gibson组装方法进行反扩载体的自连，从而得到基于pEZ15A添加5’GAAGN7TCC序列的pEZ-HsdSp质粒，最后通过测序验证。
(2)转化效率测定：
分别从大肠杆菌DH5α和Trans110(其细胞的甲基化转移酶被敲除，购自擎科生物公司)中提取甲基化和去甲基化的pEZ-HsdSp质粒。取ZM4(Z mobilis subsp.ZM4(野生型)ATCC3182，购自ATCC)和ZMNP的感受态放置在冰上解冻，待融化后，将50ng的质粒分别加入50μL感受态中，混匀后转入电转杯中，用电转仪进行电转。RMG5液体培养基重悬后放置在30℃培养4～6h，将培养物稀释不同的倍数后分别涂布100μL到RMG5+Spe(RMG5+100μg/mL)的平板上。待平板长出单菌落后，对平板上的菌落数(CFU)进行计数。转化效率计算方法为:
CFU/μg-1DNA＝(Cp/Tp)×(Vt/Vp)；其中Cp指在平板上的总菌落数，Tp指使用的质粒总量，Vt为电转体系的总体积，Vp为涂布在平板上的体积。
7、菌株发酵测试方法
将所得到的目的菌株ZMNP及野生型菌株ZM4在RMG5中进行发酵测试。首先取一定量甘油菌接种到含有1mL RMG5的冻存管中，于30℃培养箱静置活化至浑浊后，转接入装有80mL RMG5培养基的100mL的三角瓶中作为发酵种子液，于30℃培养箱静置培养至对数中后期。进一步转接到装有40mL RMG5培养基的50mL三角瓶中发酵。在OD600nm处控制初始OD为0.1。在发酵过程中，用紫外分光光度计测量OD值600nm处的光密度，测定不同时间点的细胞生长，并将不同时间点取得的发酵液收集，后用于HPLC(高效液相色谱仪)中检测葡萄糖和乙醇的含量。采用岛津商贸有限公司Agilent 1100系列高效液相色谱仪(LC-20AD)；检测器为示差折光检测器(RID-10A)；色谱柱为有机酸色谱柱(Bio-Rad Aminex HPX-87H，300mm×7.8mm)；池温度为40℃，柱温箱温度为60℃；流动相为5mM的硫酸，流速为0.5mL/min，仪器运行时初始流速设置为0.2mL/min，待柱压稳定后以0.1mL/min的流速逐渐增加至0.5mL/min；进样量为20μL。待检测结束后，导出数据并做图。
流动相的配置：取1.41mL色谱级浓硫酸至5L的蓝盖瓶中，用超纯水定容至5L后混合均匀，使用0.45μm孔径的水相滤膜进行过滤。将过滤后的流动相分装至1L流动相蓝盖瓶中进行超声脱气20～30min。等恢复至室温后即可使用。
8、ROS测定
本申请中ROS测定使用碧云天活性氧检测试剂盒(ROS Assay Kit)，本试剂盒中利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测，DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DVFH不能透过细胞膜，从而使探针很容易被装在到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。其中Rosup作为阳性对照试剂。
在生长曲线测定过程中，对RMG5中培养3h，MMG5中培养12h的培养物，收取0.6OD600nm的细胞，并用PBS洗一次。而后用500μL PBS重悬，并加入1μL DCFH-DA探针，混匀后于30℃-100rpm孵育1h。而后离心取上清，用PBS清晰三次后重悬在300μL PBS中。其中阴性对照样品处理过程中不加DCFH-DA探针，阳性对照样品处理过程中另需加入6μL Rosup。处理好的样品用流式细胞仪CytoFLEX FCM(Beckman coulter,CA,USA)检测，激发光和发射光波长为488nm和525nm。选择荧光强度为103～105范围内的细胞，每个样品分析20,000个细胞。
9、二次母液发酵测试
取一定量ZM4和ZMNP甘油菌接种到含有1mL RMG5的冻存管中，于30℃培养箱静置活化至浑浊后，转接入装有80mL RMG5培养基的100mL的三角瓶中作为发酵种子液，于30℃培养箱静置培养至对数中后期。进一步转接到装有500mL 1/3二次母液培养基的1L发酵罐中发酵。在OD600 nm处控制初始OD为0.1。发酵罐中接入2M氢氧化钾导管，以控制pH保持初始pH值4.9。发酵罐设置为30℃，100rpm。在发酵过程中，将不同时间点取得的发酵液收集，后用于HPLC(高效液相色谱仪)中检测葡萄糖和乙醇的含量，检测方法同上。
以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）的基因工程菌株，所述基因工程菌株是将ZM4-Cas12a菌株中四个内源性质粒pZM32、pZM36、pZM33、pZM39消除，并靶向消除Cas12a和壮观霉素基因得到的菌株ZMNP；
其中，所述ZM4-Cas12a菌株是将来源于弗朗西斯菌（F. novicida）的核酸酶Cas12a基因和壮观霉素抗性基因通过同源重组的方法整合到运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）ZM4 ATCC3182菌株基因组ZMO0038位点，并采用诱导型启动子Ptet来控制Cas12a表达，构建得到的重组菌株；pZM32的Genbank编号为CP023678，pZM33的Genbank编号为NZ－P023679，pZM36的Genbank编号为CP023680，pZM39的Genbank编号为CP023681。
2.一种运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）的基因工程菌株的构建方法，其中，所述基因工程菌株是将ZM4-Cas12a菌株中四个内源性质粒pZM32、pZM36、pZM33、pZM39消除，并靶向消除Cas12a和壮观霉素基因得到的菌株ZMNP；其中，所述ZM4-Cas12a菌株是将来源于弗朗西斯菌（F. novicida）的核酸酶Cas12a基因和壮观霉素抗性基因通过同源重组的方法整合到运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）ZM4 ATCC3182菌株基因组ZMO0038位点，并采用诱导型启动子Ptet来控制Cas12a表达，构建得到的重组菌株；pZM32的Genbank编号为CP023678，pZM33的Genbank编号为NZ－P023679，pZM36的Genbank编号为CP023680，pZM39的Genbank编号为CP023681；
所述构建方法包括：
构建用于靶向消除的pZM32和pZM36的第一编辑质粒，构建靶向消除pZM33的第二编辑质粒，构建靶向消除pZM39的第三编辑质粒，构建用于替换pZM39上的毒素-抗毒素***基因的第四编辑质粒，构建靶向消除Cas12a和壮观霉素基因的第五编辑质粒；其中，所述第一编辑质粒和所述第二编辑质粒采用CRISPR-Cas12a基因编辑***构建，所述第三编辑质粒采用Zymomonas mobilis 内源CRISPR-IF型基因编辑***构建；
其中，所述第四编辑质粒的构建方法包括：提取ZM4基因组，以ZM4基因组为模板，扩增同源臂，包括ZMOp39×020上游1kb的US和ZMOp39×023下游1kb的DS序列，扩增US的引物如SEQ ID NO.11~12所示，扩增DS的引物如SEQ ID NO.13~14所示；从具有氯霉素抗性的pEZ15A质粒上扩增氯霉素基因，并胶回收，扩增氯霉素抗性基因的引物如SEQ ID NO.15~16所示；从pUC57质粒上扩增Ori序列，并胶回收，扩增Ori序列的引物如SEQ ID NO.17~18所示；通过Overlap PCR，将US、氯霉素基因和DS片段连接成一个长片段，并通过胶回收得到US片段、氯霉素基因和DS片段连接产物；将所述Ori序列与所述US片段、氯霉素基因和DS片段连接产物用T5外切酶处理，并转化到大肠杆菌DH5α细胞感受态中，PCR验证平板上的阳性克隆，过夜培养后提取其中的质粒；
所述第五编辑质粒的构建方法包括：将如SEQ ID NO.19~20所示的向导引物序列连接到含有CRISPR-ⅠF表达单元的氯霉素编辑质粒载体上，得到靶质粒；采用如SEQ ID NO.21所示的Cas12a-US-F和如SEQ ID NO.22所示的Cas12a-US-R扩增靶基因上游1kb序列，采用如SEQ ID NO.23所示的Cas12a-DS-F和如SEQID NO.24所示的Cas12a-DS-R扩增靶基因下游1kb序列，采用如SEQ ID NO.25所示的0038-F和如SEQ ID NO.26所示的0038-R扩增ZMO0038基因序列，通过PCR分别扩增其DNA片段，再通过OverlapPCR获得所述上游1kb序列、所述ZMO0038基因序列和所述下游1kb序列连接在一起的片段；将所述靶载体利用如SEQ IDNO.27~28所示的引物进行反向PCR扩增，然后通过Gibson装配的方法将片段和载体进行连接，然后转入到大肠杆菌克隆菌株DH5α中进行质粒构建，通过菌落PCR对重组子进行筛选最后通过测序验证，验证正确得到第五编辑质粒；
将所述第一编辑质粒转入ZM4-Cas12a菌株中，得到pZM32和pZM36消除的ZM4-Cas12a∆32∆36菌株；
将所述第二编辑质粒转入pZM32和pZM36消除的所述ZM4-Cas12a∆32∆36菌株中，得到pZM32、pZM36和pZM33消除的ZM4-Cas12a∆32∆33∆36菌株；
将所述第四编辑质粒转入pZM32、pZM36和pZM33消除的所述ZM4-Cas12a∆32∆33∆36菌株，得到pZM39上的毒素-抗毒素***基因替换为抗性基因的ZM4-Cas12a∆32∆33∆36∆TA::Cm菌株；
将所述第三编辑质粒转入至所述ZM4-Cas12a∆32∆33∆36∆TA::Cm菌株中，得到pZM32、pZM36、pZM33和pZM39四个内源性质粒消除的菌株ZMNP-Cas12a；
将所述第五编辑质粒转入pZM32、pZM36、pZM33和pZM39四个内源性质粒消除的所述ZMNP-Cas12a菌株中，替换Cas12a和壮观霉素基因，得到所述基因工程菌株ZMNP。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其中，所述第一编辑质粒携带有第一CRISPR表达单元，所述第一CRISPR表达单元包含具有如SEQ ID NO.1所示的先导区、具有如SEQ ID NO.2所述的重复区和具有如SEQ ID NO.3所示的第一向导RNA；
所述第二编辑质粒携带有第二CRISPR表达单元，所述第二CRISPR表达单元包含具有如SEQ ID NO.1所示的先导区、具有如SEQ ID NO.2所述的重复区和具有如SEQ ID NO.4的第二向导RNA；
所述第三编辑质粒携带有第三CRISPR表达单元，所述第三CRISPR表达单元包含具有如SEQ ID NO.6所示的先导区、具有如SEQ ID NO.7所述的重复区和具有如SEQ ID NO.5的第三向导RNA；
所述第四编辑质粒携带有pZM39同源的同源臂和用于替换pZM39上的毒素-抗毒素***基因的抗性基因；
所述第五编辑质粒携带有第五CRISPR表达单元，所述第五CRISPR表达单元包含具有如SEQ ID NO.6所示的先导区、具有如SEQ ID NO.7所述的重复区和具有如SEQ ID NO.8的第五向导RNA。
4.根据权利要求2所述的构建方法，其中，所述抗性基因选自氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因、氯霉素抗性基因、链霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、壮观霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、杀稻瘟菌素抗性基因、遗传霉素抗性基因、霉酚酸抗性基因、嘌呤霉素抗性基因、博莱霉素抗性基因或新霉素抗性基因中的一种。
5.权利要求1所述的基因工程菌株、或权利要求2~4任一所述的构建方法得到的基因工程菌株在构建乙醇发酵底盘细菌中的应用。
6.权利要求1所述的基因工程菌株、或权利要求2~4任一所述的构建方法得到的基因工程菌株在乙醇发酵中的应用。
7.权利要求1所述的基因工程菌株、或权利要求2~4任一所述的构建方法得到的基因工程菌株在构建低ROS水平的底盘细菌中应用。
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