CN113322194B - 一株敲入Sic1基因的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

一株敲入Sic1基因的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株敲入Sic1基因的酿酒酵母基因工程菌，所述酿酒酵母由原始酿酒酵母利用CRISPR‑Cas9技术敲入基因Sic1后改造而成。由于原始菌株在固定化发酵中菌体聚集过多且聚集体不成熟，电阻较高，阻碍了传质传导，导致其发酵周期的加长，而敲入Sic1基因的酿酒酵母基因工程菌对比原始酿酒酵母菌株在游离发酵中絮凝特性明显减弱，在固定化发酵中细胞粘附聚集情况减少，黏附性降低，游离细胞增多，加强了传质传导，缩短了发酵周期。

Description

一株敲入Sic1基因的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法和 应用
技术领域
本发明属于基因工程及微生物技术领域，具体涉及一株敲入Sic1基因的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法和应用。
背景技术
生物膜也称为生物被膜，是一种由微生物细胞和其分泌的胞外基质共同组成的生物聚集体，由微生物集群与其分泌出的多糖、蛋白、脂肪酸等形成膜状结构附着于载体表面。生物膜的存在，不仅作为屏障为细胞的生命活动创造了稳定的内环境，介导了细胞与细胞、细胞与基质之间的连接，而且还承担了物质转运、信息的跨膜传递和能量转换等功能，更重要的是，生物膜还作为一种重要的工业应用——固定化发酵。与游离细胞发酵相比，固定化发酵中所形成的生物膜能在发酵过程中表现出较高的底物耐受性和较快的发酵效率。通常条件下，常规的游离细胞发酵50g葡萄糖大约需要8h左右，而固定化细胞只需要6h就可以将糖转化为乙醇，展现了固定化细胞出色的发酵效率和发酵能力。但生物膜过多，会造成菌体聚集过多且聚集体不成熟，电阻较高，阻碍了传质传导，导致其发酵周期的加长。
成簇规律间隔的短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced ShortPalindromic Repeats，即CRISPR)II型***是细菌免疫***，现已被改造用于基因工程。CRISPR-Cas9是继ZFN、TALENs等基因编辑技术推出后的第三代基因编辑技术，短短几年内，CRISPR-Cas9技术风靡全球，成为现有基因编辑和基因修饰里面效率最高、最简便、成本最低、最容易上手的技术之一，成为当今最主流的基因编辑***。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一株敲入Sic1基因的酿酒酵母基因工程菌。
本发明还要解决的技术问题是提供上述酿酒酵母基因工程菌的构建方法。
本发明最后要解决的技术问题是提供上述酿酒酵母基因工程菌的应用。
发明思路：酿酒酵母的周期素依赖性激酶抑制剂(cyclin-dependent kinaseinhibitor,Cki)Sic1是酵母细胞周期的关键调控因子，控制细胞进入S期，协调细胞生长和增殖。因此，本发明选取Sic1基因作为改造对象，构建酿酒酵母基因工程菌，以定向减弱菌株絮凝性及减少固定化发酵中生物被膜量，进而提高发酵效率和发酵能力。
为了解决上述第一个技术问题，本发明公开了一株酿酒酵母基因工程菌，该菌株由向原始酿酒酵母敲入Sic1基因后改造得到，所述Sic1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
其中，所述酿酒酵母为Saccharomyces cerevisiae 1308，来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏编号：CICC 1308，可商购得到。
其中，所述Sic1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明利用CRISPR-Cas9***进行基因改造。
为了解决上述第二个技术问题，本发明公开了上述酿酒酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将Cas9质粒上gRNA scaffold序列上的靶位点改为酿酒酵母Saccharomycescerevisiae 1308基因组上的靶位点，得到修改后的质粒，优选地，将质粒pCAS#60847上gRNA scaffold序列上基因靶位点改为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae 1308c基因组上的靶位点，靶位点可以是任何满足以下两点条件的约20nt的DNA序列：该序列在基因组中是特异存在的；靶位点紧邻着PAM(Protospacer Adjacent Motif)区并位于PAM区上游，
(2)提取酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae 1308的基因组；
(3)以步骤(2)得到的基因组DNA为模板，在靶位点的上下游各设置长度为500bp的同源臂且同源臂不包含此靶向序列；以上游同源臂、Sic1基因序列和下游同源臂为模板，通过重叠PCR扩增得到Sic1基因敲入组件；
(4)将步骤(1)和(3)得到的修改后的质粒和Sic1基因敲入片段转化至原始酿酒酵母感受态中，即得Sic1基因敲入的酿酒酵母基因工程菌。
步骤(3)中，上游同源臂引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
步骤(3)中，所述上游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
步骤(3)中，扩增Sic1基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。
步骤(3)中，Sic1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
步骤(3)中，下游同源臂引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。
步骤(3)中，所述下游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
步骤(3)中，所述重叠PCR扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.7所示。
步骤(3)中，所述基因敲入片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
步骤(4)中，利用含有500μg/mLG418的YPD培养基筛选获得阳性转化子，得到敲入Sic1基因的酿酒酵母基因工程菌。
为了解决上述第三个技术问题，本发明公开了上述酿酒酵母基因工程菌在减弱生物膜形成中细胞与介质粘附性的应用。
进一步地，本发明公开了上述酿酒酵母基因工程菌在发酵制备乙醇中的应用。
其中，所述酿酒酵母基因工程菌的种子液按照1％～20％的体积比接种于发酵培养基中；优选为按照10％的体积比。
优选地，通过固定化发酵制备乙醇。
其中，所述固定化发酵以天然有机载体、人工合成高分子载体、人工无机高分子材料、复合材料作为固定化介质。
优选地，所述固定化发酵以棉纤维材料作为固定化介质。
其中，所述固定化介质的浓度为10～60g/L，优选为40g/L。
其中，所述发酵的温度为30℃-40℃。
其中，所述发酵的时间为20-30h。
其中，所述发酵的发酵培养基配方如下：55-110g/L葡萄糖，2-4g/L蛋白胨、0.2-0.6g/L硫酸铵、3-5g/L磷酸二氢钾、2-5g/L酵母膏、0.2-0.6g/L硫酸镁、0.01-0.05g/L七水合硫酸亚铁、0.01-0.05g/L七水合硫酸锌，溶剂为水。
优选地，所述酵的发酵培养基配方如下：60g/L葡萄糖，4g/L蛋白胨、0.5g/L硫酸铵、3g/L磷酸二氢钾、3g/L酵母膏、0.5g/L硫酸镁、0.05g/L七水合硫酸亚铁、0.05g/L七水合硫酸锌，溶剂为水。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
有益效果：本发明公开了一株敲入Sic1基因的酿酒酵母基因工程菌，由于原始菌株1308在固定化发酵中菌体聚集过多且聚集体不成熟，电阻较高，阻碍了传质传导，导致其发酵周期的加长，而敲入Sic1基因的酿酒酵母基因工程菌对比原始酿酒酵母菌株在游离发酵中絮凝特性明显减弱，在固定化发酵中细胞粘附聚集情况减少，黏附性降低，游离细胞增多，加强了传质传导，缩短了发酵周期。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：重组菌1308-pSic1的构建。
一、Sic1基因敲入组件的构建
(1)以原始酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae 1308)的基因组DNA为模板，利用普通PCR扩增得到上游、Sic1基因和下游同源臂扩增片段(上游同源臂扩增引物序列up-F、up-R分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；Sic1基因扩增引物序列Sic1-F、Sic1-R分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示；下游同源臂扩增引物序列down-F、down-R分别如SEQID NO.6和SEQ ID NO.7所示)；PCR反应体系见表1，PCR反应条件如下：1)95℃预变性3min；2)95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸1min，三个步骤进行35次循环，72℃再延伸5min。其中，退火温度取决于引物的Tm值，72℃的延伸时间取决于扩增片段的长度(1kb·min-1)。通过琼脂糖凝胶电泳，见图1，切胶回收PCR扩增得到的上游、Sic1基因、下游同源臂扩增片段，上游同源臂扩增片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，Sic1基因扩增片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游同源臂扩增片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。
表1 PCR反应体系
(2)以步骤(1)得到的上游同源臂、Sic1基因、下游同源臂为模板，以up-F为上游引物，以down-R为下游引物(up-F核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，Sic1-down-R核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示)，利用重叠PCR技术扩增Sic1基因敲入组件。反应体系见表2，PCR反应条件如下：1)95℃预变性3min；2)95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸2min，三个步骤进行35次循环，72℃再延伸5min。其中，退火温度取决于引物的Tm值，72℃的延伸时间取决于扩增片段的长度(1kb·min-1)。其中，退火温度取决于引物的Tm值，72℃的延伸时间取决于扩增片段的长度(1kb·min-1)。反应完成后PCR产物利用琼脂糖凝胶电泳定量，见图1，切胶回收得到酿酒酵母Sic1基因敲入组件。基因敲入组件的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。
表2 PCR反应体系
二、质粒改造
(1)利用限制性内切酶SnaBⅠ和BglⅡ获得线性化质粒pCAS#60847，线性化体系见表3，胶回收大片段。以pCAS#60847序列为模板，利用普通PCR扩增得到包含所需基因靶位点的两个片段1、2(片段1扩增引物序列1-F、1-R分别如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示；片段2扩增引物序列2-F、2-R分别如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示；靶位点序列如SEQ IDNO.16所示)；PCR反应体系见表4，PCR反应条件如下：1)95℃预变性3min；2)95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸1min，三个步骤进行35次循环，72℃再延伸5min。其中，退火温度取决于引物的Tm值，72℃的延伸时间取决于扩增片段的长度(1kb·min-1)。通过琼脂糖凝胶电泳，见图2，切胶回收PCR扩增得到的片段1和2，片段1的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，2片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。
表3质粒线性化体系
表4 PCR反应体系
(2)以步骤(1)得到的片段1和2为模板，以1-F为上游引物，以2-R为下游引物(1-F核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，2-R核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示)，利用重叠PCR技术扩增片段。反应体系见表5，PCR反应条件如下：1)95℃预变性3min；2)95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸1min，三个步骤进行35次循环，72℃再延伸5min。其中，退火温度取决于引物的Tm值，72℃的延伸时间取决于扩增片段的长度(1kb·min-1)。其中，退火温度取决于引物的Tm值，72℃的延伸时间取决于扩增片段的长度(1kb·min-1)。反应完成后PCR产物利用琼脂糖凝胶电泳定量，见图3，切胶回收得到酿酒酵母基因靶位点组件。靶位点组件的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示。
表5 PCR反应体系
(3)利用一步克隆操作将步骤(2)中重叠PCR技术扩增片段与酶切质粒导入大肠杆菌DH5α中，获得DH5α—pCAS#60847—Sic1菌株。提取所获得的目标大肠杆菌的质粒。一步克隆操作严格按照Vazyme公司一步克隆试剂盒内附操作步骤进行操作。质粒提取过程完全按照Takara公司质粒提取试剂盒内附的操作要求进行操作。
(5)质粒酶切验证并测序。
三、酿酒酵母菌株感受态制备。
(1)挑取酿酒酵母菌株Saccharomyces cerevisiae 1308接种于YPD液体培养基，于30℃、200r/min过夜培养，得到活化种子液；
(2)按照体积比1％的接种比例，将种子液转接至100mL新鲜的YPD液体培养基，于30℃、200r/min继续培养至菌液OD600在0.8-1.2之间；
(3)将步骤(2)得到的菌液冰水浴预冷30min，低温高速离心机4℃、4000r/min离心5min收集菌体；
(4)用25mL预冷无菌水重悬菌体，低温高速离心机4℃、4000r/min离心5min收集菌体，重复两次；用10mL预冷的1M山梨醇水溶液重悬菌体，低温高速离心机4000r/min、4℃离心5min收集菌体，重复两次；
(5)用1mL1 M山梨醇水溶液重悬菌体，分装每管100μL。
四、酿酒酵母菌株感受态转化及转化子的鉴定。
(1)步骤三所得分装后的菌液取1管，加入1μL步骤二得到的改造质粒和5uL步骤一得到的基因敲入组件，混合后转入电转杯；
(2)冰上放置5min；
(3)1.5kv电击5.0ms，加入1mLYPD培养基将电转液洗出，于30℃、200r/min培养1h；
(4)涂布于含有500μg/mLG418的YPD培养基平板上，于30℃培养至菌落长出；
(5)挑取步骤(4)得到的转化子作为模板，使用验证引物(核苷酸序列如SEQ IDNO.12和SEQ ID NO.13所示)进行菌落PCR扩增以鉴定Sic1基因被敲入的阳性转化子，见图4；阳性转化子的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；
(6)挑选阳性转化子1308-pSic1接入5mL含有500μg/mLG418的YPD液体培养基中活化24h，与灭菌的30％甘油1：1混合，-80℃保藏。
上述过程所使用的引物如下：
CGAAAACGATAATGCCAATATTTTG(up-F)-SEQ ID NO.2
GGTGGGGTGGAAGGAGTCATAGTGACGCAGAAGAGGTTCT(up-R)-SEQ ID NO.3
AGAACCTCTTCTGCGTCACTATGACTCCTTCCACCCCACC(Sic1-F)-SEQ ID NO.4
AGAAAAAAATAAACATCATATCAATGCTCTTGATCCCTAG(Sic1-R)-SEQ ID NO.5
CTAGGGATCAAGAGCATTGATATGATGTTTATTTTTTTCT(down-F)-SEQ ID NO.6
TTCCAGGAGAAGACAAGGAAGTGGA(down-R)-SEQ ID NO.7
GTCTCTATATACTACGTATAGGAAATG(1-F)-SEQ ID NO.8
CATGGATGTTCTTGTTTGTGAAAGTCCCATTCGCCACCCG(1-R)-SEQ ID NO.9
CACAAACAAGAACATCCATGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC(2-F)-SEQ ID NO.10
GCAAGCTAAACAGATCTCTAGACCTATATC(2-R)-SEQ ID NO.11
GTGGATCCTGCGAAAAGACT-SEQ ID NO.12
CCAATGGTTCCTGCTCTTCC-SEQ ID NO.13
实施例2
(1)各取10μL甘油菌1308(原始菌)和1308-pSic1(实施例1构建得到的敲入菌)加入灭菌的5mLYPD液体培养基中过夜培养，活化；
(2)按照体积比1％的接种比例，将步骤(1)所得的菌液转接至100mL的YPD液体培养基，于30℃、200r/min继续培养至菌液OD600在2.0左右；
(3)取2mL步骤(2)所得菌液在OD600下测量吸光值，用灭菌的YPD液体培养基稀释菌液，使得稀释后菌液OD600为1；
(4)取190μLYPD培养基和10μL步骤(3)稀释后的菌液加入96孔板，30℃培养24h；
(5)将96孔板菌液倒出，用0.01M PBS缓冲液缓冲3次，拍干；
(6)取1％结晶紫溶液200μL加入96孔板，染色10min，PBS缓冲液冲洗，晾干；
(7)取冰醋酸200μL加入96孔板溶解后，轻轻振荡，OD570测量生物膜产率，取平均值：原始菌在96孔板培养24h OD值为0.52左右，1308-pSic1的敲入菌株在96孔板培养24hOD值为0.43左右。实验结果如图5所示，表明敲入Sic1基因的酿酒酵母生物被膜明显减少。
实施例3
(1)各取10μL甘油菌1308(原始菌)和1308-pSic1(实施例1构建得到的敲入菌)加入灭菌的5mLYPD液体培养基中过夜培养，活化；
(2)按照体积比1％的接种比例，将步骤(1)所得的菌液转接至100mL的YPD液体培养基，于30℃、200r/min继续培养至菌液OD600在0.8～1.2之间；
(3)将步骤(2)的种子液按10％的接种体积比例转接至100mL的发酵培养基中，分为游离发酵与固定化发酵两种。
进行固定化发酵时：向发酵培养基中加入棉纤维材料作为固定化材料，每个摇瓶中加入4g棉纤维介质；于30℃、200r/min发酵，葡萄糖耗尽后反应结束，利用测糖仪测定各时段发酵液残糖量，高效气相色谱仪测定发酵液中酒精的含量；
进行分离发酵时：仅不添加固定化材料，其余与固定化发酵相同；
其中，发酵培养基配方如下：60g/L葡萄糖，4g/L蛋白胨、0.5g/L硫酸铵、3g/L磷酸二氢钾、3g/L酵母膏、0.5g/L硫酸镁、0.05g/L七水合硫酸亚铁、0.05g/L七水合硫酸锌，溶剂为水。
(4)发酵结果见图6和图7(W-野生菌游离发酵，WI-野生菌固定化发酵，pSic1-敲入菌游离发酵，pSic1I-敲入菌固定化发酵)由发酵数据可以看出，固定化发酵比游离发酵有较快的耗糖速率和较高的乙醇产量；原始菌株和基因改造菌株1308-pSic1固定化发酵的周期分别为30h和23h，基因改造菌株发酵周期缩短约7h，耗糖率提高了约30％；在固定化发酵终点时，原始菌株和基因改造菌株1308-pSic1乙醇产量分别为21g/L和34g/L，基因改造菌株乙醇产量提高约为13g/L，发酵效率提高了约61％。
本发明提供了一株利用CRISPR-Cas9技术改造的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法与应用，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
序列表
<110> 南京工业大学
<120> 一株敲入Sic1基因的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法和应用
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 855
<212> DNA
<213> Sic1基因的核苷酸序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgactcctt ccaccccacc aaggtccaga gggactaggt accttgcgca gcctagtggc 60
aatactagtt ctagtgccct aatgcaaggt caaaagaccc cccaaaagcc ttcacagaac 120
ctagtccctg tcactccctc aacaactaag tcttttaaaa atgcgccatt attagcacct 180
cccaattcga acatgggtat gacctctcca tttaatgggc ttacgtctcc tcaacgctcg 240
ccgtttccaa aatcttcagt gaagaggaca ctattccaat ttgaaagtca tgataatgga 300
acagtaaggg aagagcagga accattgggt cgtgtaaata ggatattgtt tcccacgcag 360
caaaatgtgg atatagatgc agcagaagaa gaagaagaag gagaagttct tcttcccccc 420
agcagaccta catctgccag gcagttacat ttatcacttg aaagagatga gtttgatcag 480
acacatagaa agaagattat taaagatgta cctggtacgc ccagcgacaa ggtgataaca 540
tttgaattgg caaaaaattg gaacaacaac tctccgaaaa atgacgccag gagtcaagaa 600
agtgaagacg aggaagacat catcatcaat ccagtgcggg tgggtaaaaa tccctttgca 660
tcagatgaac tggtcactca ggaaattaga aatgaacgta aaagggcaat gttgagagaa 720
aacccagata tagaagacgt aataacatat gtcaataaga agggagaggt ggtagagaaa 780
cgaaggttaa cggatgaaga aaagagaaga ttcaagccaa aggcattgtt tcaatctagg 840
gatcaagagc attga 855
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
cgaaaacgat aatgccaata ttttg 25
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
ggtggggtgg aaggagtcat agtgacgcag aagaggttct 40
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
agaacctctt ctgcgtcact atgactcctt ccaccccacc 40
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
agaaaaaaat aaacatcata tcaatgctct tgatccctag 40
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
ctagggatca agagcattga tatgatgttt atttttttct 40
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
ttccaggaga agacaaggaa gtgga 25
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
gtctctatat actacgtata ggaaatg 27
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<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
catggatgtt cttgtttgtg aaagtcccat tcgccacccg 40
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<213> Artificial Sequence
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cacaaacaag aacatccatg gttttagagc tagaaatagc 40
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
gcaagctaaa cagatctcta gacctatatc 30
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
gtggatcctg cgaaaagact 20
<210> 13
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
ccaatggttc ctgctcttcc 20
<210> 14
<211> 500
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
gccaatattt tgtttggtaa acatggcatt aacaccgatg tttctgaatt atctgcagct 60
aatctctctc caccattgaa tcataaaaat attttatccc gtaaactatc gatgagtaac 120
accactaata ggagctcaaa taattccaac agtagcgtgc atgactttgg tgcacataca 180
ccggttaata aattaagtat tgcttctgta ttagagtcag tacctcaaga aacaggatat 240
attacaccta acgggaccgg tacaactact acaagtgcca aaaactcacc caatctgaag 300
aatttgtcac tggctatacc tccacatatg agggatcgca gatcaagtaa attgaatgat 360
tcacaaacgg aatttggttc ttttaatttc aggaatttat cggctcttga taaagctaat 420
aaagatgcta taaatagact gaaaagtgaa catttttctg aacaacctgg ggttcacaga 480
agaacctctt ctgcgtcact 500
<210> 15
<211> 501
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
tatgatgttt atttttttct caattacaat aacttatata tatatatata tatatgtacg 60
tatatatatt ctcctttgtt agagttaatt tatgatctaa tttcatttct caatttcgag 120
gctaaattag aatttttgaa gtccctaatt tcatattttg tatcaaaact ttaaaatctg 180
gaaatattaa aagcagaata aaacacatat attattctat atagtattgt tacatatttt 240
ggagaacgtc ctatttaacc tatgaatgtg tctatgatag atcattttaa tagaataaaa 300
gccatctaga tatcatctgg gaaagagaat tcaacctttt tttttcctcg agggtcgaaa 360
tcatcatcct ctggaagaat agttctccca gcacttaaca attggaagtt attagggctt 420
tgtggtggat taatttttgg tgttgacggt ggtttgtaat gcgactcccc caagaagtcg 480
tttgatgatt ccacttcctt g 501
<210> 16
<211> 1856
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
gccaatattt tgtttggtaa acatggcatt aacaccgatg tttctgaatt atctgcagct 60
aatctctctc caccattgaa tcataaaaat attttatccc gtaaactatc gatgagtaac 120
accactaata ggagctcaaa taattccaac agtagcgtgc atgactttgg tgcacataca 180
ccggttaata aattaagtat tgcttctgta ttagagtcag tacctcaaga aacaggatat 240
attacaccta acgggaccgg tacaactact acaagtgcca aaaactcacc caatctgaag 300
aatttgtcac tggctatacc tccacatatg agggatcgca gatcaagtaa attgaatgat 360
tcacaaacgg aatttggttc ttttaatttc aggaatttat cggctcttga taaagctaat 420
aaagatgcta taaatagact gaaaagtgaa catttttctg aacaacctgg ggttcacaga 480
agaacctctt ctgcgtcact atgactcctt ccaccccacc aaggtccaga gggactaggt 540
accttgcgca gcctagtggc aatactagtt ctagtgccct aatgcaaggt caaaagaccc 600
cccaaaagcc ttcacagaac ctagtccctg tcactccctc aacaactaag tcttttaaaa 660
atgcgccatt attagcacct cccaattcga acatgggtat gacctctcca tttaatgggc 720
ttacgtctcc tcaacgctcg ccgtttccaa aatcttcagt gaagaggaca ctattccaat 780
ttgaaagtca tgataatgga acagtaaggg aagagcagga accattgggt cgtgtaaata 840
ggatattgtt tcccacgcag caaaatgtgg atatagatgc agcagaagaa gaagaagaag 900
gagaagttct tcttcccccc agcagaccta catctgccag gcagttacat ttatcacttg 960
aaagagatga gtttgatcag acacatagaa agaagattat taaagatgta cctggtacgc 1020
ccagcgacaa ggtgataaca tttgaattgg caaaaaattg gaacaacaac tctccgaaaa 1080
atgacgccag gagtcaagaa agtgaagacg aggaagacat catcatcaat ccagtgcggg 1140
tgggtaaaaa tccctttgca tcagatgaac tggtcactca ggaaattaga aatgaacgta 1200
aaagggcaat gttgagagaa aacccagata tagaagacgt aataacatat gtcaataaga 1260
agggagaggt ggtagagaaa cgaaggttaa cggatgaaga aaagagaaga ttcaagccaa 1320
aggcattgtt tcaatctagg gatcaagagc attgatatga tgtttatttt tttctcaatt 1380
acaataactt atatatatat atatatatat gtacgtatat atattctcct ttgttagagt 1440
taatttatga tctaatttca tttctcaatt tcgaggctaa attagaattt ttgaagtccc 1500
taatttcata ttttgtatca aaactttaaa atctggaaat attaaaagca gaataaaaca 1560
catatattat tctatatagt attgttacat attttggaga acgtcctatt taacctatga 1620
atgtgtctat gatagatcat tttaatagaa taaaagccat ctagatatca tctgggaaag 1680
agaattcaac cttttttttt cctcgagggt cgaaatcatc atcctctgga agaatagttc 1740
tcccagcact taacaattgg aagttattag ggctttgtgg tggattaatt tttggtgttg 1800
acggtggttt gtaatgcgac tcccccaaga agtcgtttga tgattccact tccttg 1856
<210> 17
<211> 756
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
gtctctatat actacgtata ggaaatgttt acattttcgt attgttttcg attcactcta 60
tgaatagttc ttactacaat ttttttgtct aaagagtaat actagagata aacataaaaa 120
atgtagaggt cgagtttaga tgcaagttca aggagcgaaa ggtggatggg taggttatat 180
agggatatag cacagagata tatagcaaag agatactttt gagcaatgtt tgtggaagcg 240
gtattcgcaa tattttagta gcccgttaca gtccggtgcg tttttggttt tttgaaagtg 300
cgtcttcaga gcgcttttgg ttttcaaaag cgctctgaag ttcctatact ttctagagaa 360
taggaacttc ggaataggaa cttcaaagcg tttccgaaaa cgagcgcttc cgaaaatgca 420
acgcgagctg cgcacataca gctcactgtt cacgtcgcac ctatatctgc gtgttgcctg 480
tatatatata tacatgagaa gaacggcata gtgcgtgttt atgcttaaat gcgtatatgt 540
gttatgtagt atactctttc ttcaacaatt aaatactctc ggtagccaag ttggtttaag 600
gcgcaagact gtaatttatc actacgaaat cttgagatcg ggcgttcgac tcgcccccgg 660
gagagatggc cggcatggtc ccagcctcct cgctggcgcc ggctgggcaa caccttcggg 720
tggcgaatgg gactttcaca aacaagaaca tccatg 756
<210> 18
<211> 181
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60
ggcaccgagt cggtgctttt tttatttttt gtcactattg ttatgtaaaa tgccacctct 120
gacagtatgg aacgcaaact tctgtctagt ggatataggt ctagagatct gtttagcttg 180
c 181
<210> 19
<211> 937
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
gtctctatat actacgtata ggaaatgttt acattttcgt attgttttcg attcactcta 60
tgaatagttc ttactacaat ttttttgtct aaagagtaat actagagata aacataaaaa 120
atgtagaggt cgagtttaga tgcaagttca aggagcgaaa ggtggatggg taggttatat 180
agggatatag cacagagata tatagcaaag agatactttt gagcaatgtt tgtggaagcg 240
gtattcgcaa tattttagta gcccgttaca gtccggtgcg tttttggttt tttgaaagtg 300
cgtcttcaga gcgcttttgg ttttcaaaag cgctctgaag ttcctatact ttctagagaa 360
taggaacttc ggaataggaa cttcaaagcg tttccgaaaa cgagcgcttc cgaaaatgca 420
acgcgagctg cgcacataca gctcactgtt cacgtcgcac ctatatctgc gtgttgcctg 480
tatatatata tacatgagaa gaacggcata gtgcgtgttt atgcttaaat gcgtatatgt 540
gttatgtagt atactctttc ttcaacaatt aaatactctc ggtagccaag ttggtttaag 600
gcgcaagact gtaatttatc actacgaaat cttgagatcg ggcgttcgac tcgcccccgg 660
gagagatggc cggcatggtc ccagcctcct cgctggcgcc ggctgggcaa caccttcggg 720
tggcgaatgg gactttcaca aacaagaaca tccatggttt tagagctaga aatagcaagt 780
taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt gcttttttta 840
ttttttgtca ctattgttat gtaaaatgcc acctctgaca gtatggaacg caaacttctg 900
tctagtggat ataggtctag agatctgttt agcttgc 937
<210> 20
<211> 1029
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 20
gtggatcctg cgaaaagact gggtgcgaaa ggaattcaag aaattaaaga tcacccttat 60
ttcaagaatg tggattggga tcatgtttac gatgaggaag cttcttttgt ccctacaata 120
gacaatccag aagatactga ttattttgac ctaaggggtg cagagctcca agattttgga 180
gacgatatcg aaaacgataa tgccaatatt ttgtttggta aacatggcat taacaccgat 240
gtttctgaat tatctgcagc taatctctct ccaccattga atcataaaaa tattttatcc 300
cgtaaactat cgatgagtaa caccactaat aggagctcaa ataattccaa cagtagcgtg 360
catgactttg gtgcacatac accggttaat aaattaagta ttgcttctgt attagagtca 420
gtacctcaag aaacaggata tattacacct aacgggaccg gtacaactac tacaagtgcc 480
aaaaactcac ccaatctgaa gaatttgtca ctggctatac ctccacatat gagggatcgc 540
agatcaagta aattgaatga ttcacaaacg gaatttggtt cttttaattt caggaattta 600
tcggctcttg ataaagctaa taaagatgct ataaatagac tgaaaagtga acatttttct 660
gaacaacctg gggttcacag aagaacctct tctgcgtcac tatgactcct tccaccccac 720
caaggtccag agggactagg taccttgcgc agcctagtgg caatactagt tctagtgccc 780
taatgcaagg tcaaaagacc ccccaaaagc cttcacagaa cctagtccct gtcactccct 840
caacaactaa gtcttttaaa aatgcgccat tattagcacc tcccaattcg aacatgggta 900
tgacctctcc atttaatggg cttacgtctc ctcaacgctc gccgtttcca aaatcttcag 960
tgaagaggac actattccaa tttgaaagtc atgataatgg aacagtaagg gaagagcagg 1020
aaccattgg 1029

Claims (6)

1.一种利用转入Sic1基因的酿酒酵母基因工程菌发酵制备乙醇的方法，其特征在于，该菌株由向原始酿酒酵母转入Sic1基因后改造得到，所述Sic1基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述原始酿酒酵母来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏编号：CICC 1308，通过固定化发酵制备乙醇。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用CRISPR-Cas9***进行基因改造。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的酿酒酵母基因工程菌通过如下步骤构建得到：
（1）将Cas9质粒上gRNA scaffold序列上的靶位点改为酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae） 1308基因组上的靶位点，得到修改后的质粒；
（2）提取酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）1308的基因组；
（3）以步骤（2）得到的基因组DNA为模板，在靶位点的上下游各设置长度为500bp的同源臂且同源臂不包含此靶向序列；以上游同源臂、Sic1基因序列和下游同源臂为模板，通过重叠PCR扩增得到Sic1基因转入组件；
（4）将步骤（1）和（3）得到的修改后的质粒和Sic1基因转入组件转化至原始酿酒酵母感受态中，即得Sic1基因转入的酿酒酵母基因工程菌。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固定化发酵以天然有机载体、人工合成高分子载体、人工无机高分子材料、复合材料作为固定化介质。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵的温度为30℃-40℃。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵的发酵培养基配方如下：55-110g/L葡萄糖，2-4 g/L蛋白胨、0.2-0.6 g/L硫酸铵、3-5 g/L磷酸二氢钾、2-5 g/L酵母膏、0.2-0.6 g/L硫酸镁、0.01-0.05 g/L七水合硫酸亚铁、0.01-0.05g/L七水合硫酸锌，溶剂为水。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Mutations in SID2, a Novel Gene in Saccharomyces cerevisiae, Cause Synthetic Lethality With sic1 Deletion and May Cause a Defect During S Phase";Matthew D. Jacobson et al.,;《Genetics》;20010930(第159期);第17-33页 *

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