CN112661822B - 一种植物淀粉生物合成相关蛋白OsSBP1及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一个植物淀粉生物合成相关蛋白OsSBP1及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将SEQ ID NO.1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物淀粉生物合成相关的由SEQ ID NO.1衍生的蛋白质。将所述蛋白的编码基因导入淀粉合成异常的植物中，可以培育淀粉生物合成正常的植物。所述蛋白及其编码基因可以应用于作物遗传改良。

Description

一种植物淀粉生物合成相关蛋白OsSBP1及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一个植物淀粉生物合成相关蛋白OsSBP1及其编码基因与应用。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)胚乳中主要以淀粉形式储存能量，淀粉含量占稻米干重90％左右，作为稻米中的第一大营养物质，淀粉一方面供应种子萌发和幼苗生长发育，另一方面为人类日常饮食提供能量。因此，深入研究淀粉的生物合成机制以及调控网络，对于改良稻米的食味品质和营养品质都具有重要意义。

淀粉属于高分子碳水化合物，其基本单位是α-D-葡萄糖，根据其化学成分分为直链淀粉(Amylose)和支链淀粉(Amylopectin)两种类型。其中支链淀粉具有高度分支，除了含有α-1,4-糖苷键，还含有大约5％的葡聚糖以α-1,6-糖苷键连接形成分支链，这些分支之间能够相互作用形成高度有序的晶体结构。然而直链淀粉主要由α-1,4-糖苷键连接而成，几乎没有分支，直链淀粉的含量主要决定了稻米的食味品质。

淀粉的生物合成是通过一系列酶促反应把淀粉合成的前体物质ADP葡萄(ADPG，ADP glucose)最终转变成淀粉的过程，其中主要的淀粉合成酶在单双子叶物种中都已经被鉴定。主要包括淀粉的生物合成途径中第一步的限速酶ADPG葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase，ADP glucose pyrophosphorylase)、可溶性淀粉合成酶(SS，starch synthase)、淀粉分支酶(SBE，starch branching enzyme)和淀粉去分支酶(DBE，debranching enzyme)被称为淀粉合成过程中的4类关键酶。除此之外，一系列调节淀粉合成的转录因子或调节子近几年陆续被鉴定。主要包括一系列FLOURY(2-15)突变体，转录因子RSR1，BZIP58等。其中在水稻胚乳中这些重要的淀粉合成酶或者调节子出现异常，淀粉的生物合成受阻，通常表现出籽粒粉质不透明，干瘪，皱缩，心白等表型，严重影响了稻米的外观和营养品质。因此进一步挖掘淀粉合成途径的调节基因，将有助于我们通过基因工程的手段来对稻米品质进行改良。

发明内容

本发明的目的是提供一种淀粉生物合成相关蛋白OsSBP1及其编码基因与应用。

本发明提供的水稻淀粉合成相关蛋白OsSBP1，来源于稻属水稻(Oryza sativavar.W017)，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将SEQ ID NO.1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与淀粉合成相关的由SEQ ID NO.1衍生的蛋白质。

序列表中的SEQ ID NO.1由618个氨基酸残基组成，自氨基末端第346至606位为Try-rich结构域。

为了使(a)中的OsSBP1便于纯化，可在由序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
FLAG	8	DYKDDDDK

上述(b)中的OsSBP1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的OsSBP1的编码基因可通过将序列表中SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码上述淀粉生物合成相关蛋白的基因(OsSBP1)也属于本发明的保护范围。

所述基因OsSBP1可为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：

1)序列表中SEQ ID NO.2所示的DNA分子；

2)序列表中SEQ ID NO.3所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码淀粉合成相关蛋白的DNA分子。

序列表中的SEQ ID NO.2由2125个核苷酸组成。

所述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

含有以上任一所述基因的重组表达载体也属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组表达载体可为在pCUBi1390载体的多克隆位点KpnI和BamHI之间重组***所述基因(OsSBP1)得到的重组质粒。所述重组质粒具体可为pCUBi1390-OsSBP1；所述pCUBi1390-OsSBP1是将将OsSBP1基因组编码序列通过重组技术***pCUBi1390多克隆位点KpnI和BamHI之间得到的(Clontech公司，Infusion重组试剂盒)。

将含有OsSBP1的pCUBi1390命名为pCUBi1390-OsSBP1。

含有以上任一所述基因(OsSBP1)的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。

扩增所述基因(OsSBP1)全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种培育淀粉生物合成正常的转基因植物的方法。

本发明提供的培育淀粉合成正常的转基因植物的方法，是将所述基因导入淀粉生物合成缺陷的植物中，得到淀粉合成正常的转基因植物；具体来说，所述基因通过所述重组表达载体导入淀粉合成异常植物中；所述淀粉合成异常植物可为sbp1。

所述蛋白、所述基因、所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌或所述方法均可应用于水稻育种。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将编码所述蛋白的基因导入植物细胞，可获转基因细胞系及转基因植株。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、百脉根、拟南芥、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。

本发明首次发现、定位并克隆得到一个新的影响淀粉生物合成相关蛋白的基因OsSBP1。将所述蛋白的编码基因导入淀粉生物合成缺陷的植物中，可以得到淀粉合成正常的转基因植物。所述蛋白及其编码基因可以应用于作物的遗传改良。

附图说明

图1为野生型W017(WT)和突变体sbp1成熟籽粒外观表型图(标尺＝1mm)。

图2为野生型W017(WT)和突变体sbp1的成熟种子横断面淀粉颗粒扫描电镜观察比较(标尺＝10um)。

图3为野生型W017(WT)和突变体sbp1花后不同天数(6DAF,9DAF和12DAF)胚乳中淀粉颗粒半薄切片观察(标尺＝20um)。

图4为野生型W017(WT)和突变体sbp1主要储藏物质含量的测定。

图5为野生型W017(WT)和突变体sbp1支链淀粉链长分布图

图6为OsSBP1基因精细定位示意图

图7为OsSBP1转基因互补验证T2代纯和家系恢复籽粒外观图

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1、植物种子淀粉合成相关蛋白及其编码基因的发现

一、水稻淀粉合成缺陷突变体sbp1表型及其遗传分析

粳稻品种W017经MNU诱变突变体库中筛选出种子粉质不透明突变体,命名为sbp1。

图1为W017(WT)成熟种子籽粒，表现为胚乳完全透明的表型，以及sbp1成熟种子籽粒，表现为胚乳粉质的表型。

图2为W017(WT)和sbp1扫描电镜分析图。W017(WT)的成熟种子扫描电镜表现为淀粉颗粒排列紧密，大小均一，而sbp1中淀粉颗粒排列松散，使得颗粒之间存在间隙。因此在光线通过时会发生散射，导致sbp1籽粒外观呈现不透明表型。

利用半薄切片后的I₂-KI染色来观察花后不同天数W017(WT)和sbp1复合淀粉颗粒的形态(图3)。在野生型W017(WT)淀粉胚乳细胞中，每个造粉体内部产生多个独立存在的淀粉颗粒，这是水稻典型的复合淀粉颗粒结构，淀粉颗粒排列紧密(图3)。然而在突变体sbp1中，我们发现其淀粉胚乳细胞中，淀粉颗粒发育异常并且严重受阻，存在许多小的、零散分布的单粒淀粉颗粒，而且淀粉颗粒之间排列不紧密，会有空泡，并且有复合型淀粉颗粒内部结构丧失的异常淀粉颗粒的产生(图3)。

通过对成熟籽粒淀粉主要储藏物质测定我们发现，sbp1突变体的种子总淀粉含量极显著下降，这和我们半薄切片发观察的结果比较吻合，表明在突变体sbp1中淀粉生物合成存在异常。此外，我们发现脂肪，蛋白质和直链淀粉含量有一定程度的上升(图4)。

由于突变体产生了粉质的胚乳表型，并且在胚乳不同发育时期我们观察到突变体sbp1中复合型淀粉粒发育存在严重的缺陷，进一步我们利用毛细管电泳对野生型W017(WT)和突变体支链淀粉链长分布进行分析比较，我们发现在突变体中聚合度6-11(DP)的短链在突变中下降，聚合度13-22(DP)的中长链上升。(图5)

二、突变基因定位

1、突变基因初步定位

首先我们构建野生型W017和突变体sbp1正反交，所得F1自交后后代中正常型和突变型的种子符合3:1的分离比例，因此,sbp1中淀粉合成异常的表型是由单个隐性核基因控制的。

突变体sbp1与NJ11杂交构建定位群体，在sbp1与NJ11构建的F2分离群体中随机选取籽粒粉质与突变体表型相似的极端个体进行发芽，提取1周大幼苗DNA。首先，用覆盖水稻全基因组的565对SSR引物在W017和NJ11之间进行多态性分析，之后每间隔3M物理距离挑选一对在两个亲本间有多态的标记。利用挑选好的覆盖12条染色体的且具有多态的引物进行分析，最后将淀粉合成关键基因Ossbp1定位在第11号染色体标记YD-10和RM27154两个分子标记之间。

上述SSR标记分析的方法如下所述：

(1)提取上述选取单株的总DNA作为模板，具体方法如下：

①取0.2克左右的水稻幼嫩叶片，置于Eppendorf管中，管中放置一粒钢珠，把装好样品的Eppendorf管在液氮中冷冻5min，置于2000型GENO/GRINDER仪器上粉碎样品1min。

②加入660μL提取液(含100mM Tris-HCl(pH 8.0)，20mM EDTA(pH 8.0)，1.4MNaCl,0.2g/ml CTAB的溶液)，漩涡器上剧烈涡旋混匀，65℃水浴30min，每隔10分钟摇一次。

③加入40μL 20％SDS，65℃温浴10min，每隔两分钟轻轻上下颠倒混匀。

④加入100μL 5M NaCl，温和混匀。

⑤加入100μL 10×CTAB，65℃温浴10min，间断轻轻上下颠倒混匀。

⑥加入900μL氯仿，充分混匀，12000rpm离心3min。

⑦转移上清液至1.5mL Eppendorf管中，加入600μL异丙醇，混匀，12000rpm离心5min。

⑧弃上清液，沉淀用70％(体积百分含量)乙醇漂洗一次，室温凉干。

⑨加入100μL 1×TE(121克Tris溶于1升水中，用盐酸调PH值至8.0得到的溶液)溶解DNA。

⑩取2μL电泳检测DNA质量，并用DU800分光光度仪测定浓度(BechmanInstrumentInc.U.S.A)。

(2)将上述提取的DNA稀释成约20ng/μL，作为模板进行PCR扩增；PCR反应体系(10μL)：DNA(20ng/μL)1μL，上游引物(2pmol/μL)1μL，下游引物(2pmol/μL)1μL，10xBuffer(MgCl₂ free)1μL，dNTP(10mM)0.2μL，MgCl₂(25mM)0.6μL，rTaq(5u/μL)0.1μL，ddH₂O 5.1μL，共10μL。

PCR反应程序：94.0℃变性5min；94.0℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，共循环35次；72℃延伸7min；10℃保存。PCR反应在MJ Research PTC-225热循环仪中进行。

(3)SSR标记的PCR产物检测

扩增产物用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。以50bp的DNA Ladder为对照比较扩增产物的分子量大小，银染显色。

2、突变基因精细定位

根据初步定位的结果，在突变位点所在区域间开发新的分子标记，以便在该染色体的相关区段筛选更多标记进一步定位突变***点。从W017/NJ11杂交组合获得的F₂分离群体中挑出确认为突变表型的极端个体，用于突变位点的精细定位。利用公共图谱上的分子标记和基于水稻基因组序列数据自行开发的SSR、Indel分子标记对突变位点进行了精细定位，并根据定位结果初步确定突变位点，具体方法如下：

(1)SSR标记开发

将公共图谱的SSR标记与水稻基因组序列进行整合，下载突变位点附近的BAC/PAC克隆序列。用SSR Hunter(***等，遗传，2005，27(5):808-810)或SSRIT软件搜索克隆中潜在的SSR序列(重复次数≥6)；将这些SSR及其邻近400～500bp的序列在NCBI通过BLAST程序在线与相应的籼稻序列进行比较，如果两者的SSR重复次数有差异，初步推断该SSR引物的PCR产物在籼、粳间存在多态性；再利用Primer Premier 5.0软件设计SSR引物,并由上海英俊/南京金斯瑞生物技术有限公司合成。将自行设计的SSR成对引物等比例混合，检测其在W017和NJ11之间的多态性，具有多态的分子标记用作精细定位OsSBP1基因的分子标记。用于精细定位的分子标记见表2。

表2用于精细定位的分子标记

YD10	TATGGCATTGCTACGACAA	TATCAGGAGCGACGGGAG
			I11-9	TGCAGTACAACACTCAGTTCAA	CATGTTACGGTACTGGCATCA
JIN-13	TTGTTGTAAGGAATGGCATG	CGATAGCTTCCTGTGTTGGT
			JIN-19	TCGTGCCATCGTCCTGT	TGCTGCTTTGGAATGGAA
JIN-23	GATGAGTAGTAGAGGTAGGTGG	GGCATGGGCTACTCTTACTC
			JIN-25	AGCTCAGAGGTGCTGTGTTG	ATTGCTCTGTGCTTGGTGG
JIN-31	TAAAGTTGATCGGTGCTGC	GTGTTTTTATAGCGGCAGTG
			JIN-44	CGAGGAGTTCTTGACAGTTC	AGATTTACCCCTTCCTACTCA
RM26998	ACGCACGCACATCCTCTTCC	CGGTTCTCCATCTGAAATCCCTAGC
			RM27154	TAGTCGGGCATCTCCTCTTCC	GTTACCTCCGATGAAGGCAAGG

最终把OsSBP1基因精细定位在标记JIN-13和JIN-31两个标记之间，物理距离约为253kb，经网站预测该区间包含25个ORFs(图6)。

(2)突变基因的获得

经过对253kb区间内基因测序，发现了OsSBP1基因存在一个单碱基的突变(图6)

根据定位的位点设计引物，序列如下所述：

primer1：5'-GTACGGAACCAACGGTCTAG-3'(SEQ ID NO.4)

primer2：5'-GCTTCTGCTGCTGTTCCC-3'(SEQ ID NO.5)

以primer1和primer2为引物，以W017的cDNA为模板，进行PCR扩增获得目的基因。

扩增反应在PTC-200(MJ Research Inc.)PCR仪上进行：94℃3min；94℃30sec，60℃45sec，72℃2min，35个循环；72℃5min。将PCR产物回收纯化后克隆到载体pEASY(北京全式金公司)，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京Tiangen公司CB101)，挑选阳性克隆后，进行测序。序列测定结果表明，PCR反应获得的片段具有序列表中SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，编码618个氨基酸残基组成的蛋白质(从ATG到TGA)(见序列表的SEQ ID NO.1)。将SEQIDNO.1所示的蛋白命名为OsSBP1(即为基因定位中所述的OsSBP1基因)，将SEQ ID NO.1所示的蛋白的编码基因命名OsSBP1。

实施例2、转基因植物的获得和鉴定

一、重组表达载体构建

以W017的cDNA为模板，进行PCR扩增获得OsSBP1基因的编码序列，PCR引物序列如下：

primer3：5'ATGGCGTCGCCCACCCACGC3'(SEQ ID NO.6)

primer4：5'CTAATCTTTTTCAGGCTTAG 3'(SEQ ID NO.7)

上述引物分别位于SEQ ID NO.2所示基因的ATG开始到TGA结束，扩增产物包含了该基因的全部编码区部分，将PCR产物回收纯化。采用Infusion重组试剂盒(Clontech)将PCR产物克隆到载体pCUBi1390中，构建成pCUBi1390-OsSBP1；重组反应体系(10.0μL)：PCR产物5.4μL(50-100ng)，pCUBi1390载体1.6μL(30-50ng)，5×Infusion buffer 2.0μL，Infusion enzyme mix 1μL。短暂离心后将混合体系37℃水浴0.5h以上，取2.5μL反应体系用热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京Tiangen公司；CB101)。将全部转化细胞均匀涂布在含50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上。

37℃培养16h后，挑取克隆阳性克隆，进行测序。测序结果表明，得到了含有SEQ IDNO.3所示基因的重组表达载体，将含有SBP1的pCUBi1390命名为pCUBi1390-OsSBP1,OsSBP1基因***在多克隆位点KpnI和BamHI之间。

四、转基因植株的鉴定

1、潮霉素抗性鉴定

本研究中利用1‰浓度的潮霉素溶液鉴定转基因植株。具体方法：将新鲜的转基因植株叶片(没有转基因植株叶片做阴性对照)放在培养皿中，用新配的1‰的潮霉素溶液浸泡，放在28℃培养箱中暗培养48小时，与对照比较，叶片坏死的表明不抗，没有坏死的表明抗，将抗潮霉素的三个家系命名为1390#1，1390#3和1390#3。

2、表型鉴定

分别将T0代转pCUBi1390-OsSBP1的转基因植株，野生型W017和突变体sbp1种植在南京农业大学土桥实验基地大田情况下。鉴定到3个独立的转基因家系籽粒恢复到了野生型透明的表型，由此验证了转基因前的不透明粉质和淀粉生物合成异常的表型是由OsSBP1基因控制的，即该OsSBP1基因为淀粉合成相关基因(图7)。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种植物淀粉生物合成相关蛋白OsSBP1及其编码基因与应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 618

<212> PRT

<213> 稻属水稻(Oryza sativa var.W017)

<400> 1

Met Ala Ser Pro Thr His Ala Ala Tyr Leu Ala Pro Thr Ala Pro Pro

1 5 10 15

Arg His Leu His Leu Leu Leu Arg Leu Arg Leu Arg Gly Arg Pro Ala

20 25 30

Val Ser Thr Cys Val Arg Ala Thr Ala Arg Gly Gly Asp Gly Gly Ser

35 40 45

Ser Tyr Leu Asp Met Trp Lys Lys Ala Val Glu Arg Glu Arg Arg Ser

50 55 60

Ala Glu Ile Ala His Arg Leu Gln Gln Ser Ser Ser Ala Ala Ala Ala

65 70 75 80

Ala Val Lys Glu Glu Glu Gly Glu Gly Lys Ala Ala Ala Ala Ala Gly

85 90 95

Asp Val Glu Arg Arg Thr Ala Arg Phe Glu Glu Met Leu Arg Val Pro

100 105 110

Arg Glu Glu Arg Asp Arg Val Gln Arg Arg Gln Val Ile Asp Arg Ala

115 120 125

Ala Ala Ala Leu Ala Ala Ala Arg Ala Val Leu Lys Asp Pro Pro Pro

130 135 140

Pro Pro Pro Pro Ser Pro Pro Ser Thr Pro Pro Gln Glu Arg Glu Gln

145 150 155 160

Gln Gln Lys Pro Ala Ala Thr Ala Ile Gln Ala Gly Ser Glu Ser Gly

165 170 175

Leu Val Ser Arg Thr Ala Pro Gly Glu Ser Asp Arg Ala Ser Pro Pro

180 185 190

Pro Pro Val Thr Glu Thr Ala Thr Glu Ala Ala Lys Val Ser Val Pro

195 200 205

Asp Ser Gly Asp Ser Ser Pro Phe Lys Lys Ser Ser Ser Lys Leu Gly

210 215 220

Thr Pro Gly Pro Asp Phe Trp Ser Trp Leu Pro Pro Val Glu Asn Ser

225 230 235 240

Thr Lys Leu Gly Glu Ile Asp Thr Gly Leu Lys Pro Ser Glu Lys Leu

245 250 255

Asp Ser Phe Ala Gly Gln Pro Asp Leu Leu Met Glu Lys Glu Gln Ser

260 265 270

Glu Asp Ile Leu Ser Leu Pro Phe Glu Thr Ser Phe Phe Lys Lys Glu

275 280 285

Asp Arg Ser Leu Pro Pro Phe Gln Ser Phe Ala Glu Pro Glu Asn Val

290 295 300

Glu Ser Glu Pro Ser Ile Thr Ala Asp Ala Glu Glu Thr Phe Glu Asp

305 310 315 320

Gln Phe Ser Lys Asn Ala Ala Glu Ala Ala Arg Ala Leu Ser Ala Ser

325 330 335

Asp Glu Lys Ser Ser His Gly Val Arg Pro Asp Gly Ser Leu Trp Trp

340 345 350

Lys Glu Thr Gly Val Glu Gln Arg Pro Asp Gly Val Thr Cys Lys Trp

355 360 365

Thr Val Ile Arg Gly Val Ser Ala Asp Gly Ala Val Glu Trp Glu Asp

370 375 380

Lys Tyr Trp Glu Ala Ser Asp Arg Phe Asp His Lys Glu Leu Gly Ser

385 390 395 400

Glu Lys Ser Gly Arg Asp Ala Thr Gly Asn Val Trp Arg Glu Tyr Trp

405 410 415

Lys Glu Ser Met Trp Gln Asp Phe Thr Cys Gly Val Met His Met Glu

420 425 430

Lys Thr Ala Asp Lys Trp Gly Gln Asn Gly Lys Gly Glu Gln Trp Gln

435 440 445

Glu Gln Trp Trp Glu His Tyr Asp Ser Ser Gly Lys Ala Glu Lys Trp

450 455 460

Ala Asp Lys Trp Cys Ser Leu Asp Pro Asn Thr Pro Leu Asp Val Gly

465 470 475 480

His Ala His Val Trp His Glu Arg Trp Gly Glu Lys Tyr Asp Gly Cys

485 490 495

Gly Gly Ser Ala Lys Tyr Thr Asp Lys Trp Ala Glu Arg Ser Glu Gly

500 505 510

Asp Gly Trp Ser Lys Trp Gly Asp Lys Trp Asp Glu His Phe Asp Pro

515 520 525

Asn Gly His Gly Val Lys Gln Gly Glu Thr Trp Trp Ala Gly Lys Tyr

530 535 540

Gly Asp Arg Trp Asn Arg Thr Trp Gly Glu His His Asn Cys Thr Gly

545 550 555 560

Trp Val His Lys Tyr Gly Arg Ser Ser Ser Gly Glu His Trp Asp Thr

565 570 575

His Val Pro Gln Asp Thr Trp Tyr Glu Arg Phe Pro His Phe Gly Phe

580 585 590

Glu His Cys Phe Asn Asn Ser Val Gln Leu Arg Ser Val Lys Arg Gln

595 600 605

Thr Pro Lys Asn Thr Lys Pro Glu Lys Asp

610 615

<210> 2

<211> 2125

<212> DNA

<213> 稻属水稻(Oryza sativa var.W017)

<400> 2

ctccactccc tccccccaac actcgcctcc actccacctc gaaacccaca aaaatggcgt 60

cgcccaccca cgccgcctac ctcgccccca ccgcccctcc ccgccatctc cacctcctcc 120

tccgcctccg cctccgcggc cgccccgccg tctcaacctg cgtccgcgcc accgcccgcg 180

ggggggatgg cgggtcgtcg tacctggaca tgtggaagaa ggccgtggag agggagcgcc 240

gctcggcgga gatcgcgcac cgcctccagc aatcctcctc cgccgccgcc gccgccgtga 300

aggaggagga gggagagggg aaggctgcgg cggcggcggg ggacgtggag aggaggacgg 360

cgcggttcga ggagatgctg cgggtgccgc gcgaggagcg ggaccgcgtc cagcggcggc 420

aggtcatcga ccgcgccgcc gcggcgctgg cggcggcgcg cgccgtgctc aaggacccgc 480

cgcccccgcc tcccccgtcc ccgccttcca cgccgccgca ggagcgggaa cagcagcaga 540

agccggcggc gaccgcgatc caggccggat cagagagtgg cctggtttcc cgtacggctc 600

cgggggagtc ggatcgggca tccccgccgc cgccggtgac ggagacggcg accgaggcgg 660

cgaaagtttc agtgccggac tctggtgatt catctccttt caagaagtca agttccaagc 720

tcggtactcc aggcccggac ttctggtcgt ggttaccacc tgtggaaaat agcactaaac 780

taggagaaat cgacactggg ttaaaaccat ctgagaaatt agactccttc gccggtcagc 840

ctgatctgct gatggaaaag gaacagtcag aagacatttt atcgctcccg ttcgaaacct 900

ctttcttcaa gaaggaagac cgatctcttc ctcccttcca gtcgtttgct gagcctgaaa 960

atgtggaatc cgagcccagt attactgctg atgcagagga gacattcgaa gatcagtttt 1020

cgaaaaacgc agctgaggca gctagagctc ttagtgcaag cgacgagaag tcatcacatg 1080

gggtgcgtcc agatggttca ttgtggtgga aggagacagg tgtagaacaa aggcctgatg 1140

gtgtaacttg caagtggacc gtgattaggg gagttagtgc tgatggagct gttgaatggg 1200

aggacaagta ttgggaggct tcagaccggt ttgatcacaa agagctaggt tctgagaagt 1260

ctggtcgtga tgctacaggg aatgtttggc gggaatactg gaaagagtct atgtggcagg 1320

atttcacatg tggtgttatg cacatggaga agacggcaga caagtgggga cagaatggta 1380

aaggggagca gtggcaagag cagtggtggg agcattacga ttcaagcggt aaagctgaga 1440

aatgggctga taaatggtgc agcttggatc caaatacacc actagatgtt ggtcacgctc 1500

atgtttggca tgaaaggtgg ggcgagaagt atgatggctg cggaggtagt gcaaaataca 1560

ctgacaaatg ggctgaacga tcagagggtg acgggtggtc aaagtggggc gataagtggg 1620

atgagcattt cgacccgaat ggccatggag tgaagcaagg ggagacctgg tgggcaggca 1680

agtacgggga tcgctggaat cgcacctggg gcgagcatca caactgtact ggttgggtgc 1740

acaagtatgg caggagcagc agcggtgagc actgggacac acacgttccc caggacacct 1800

ggtatgagcg ttttccgcac tttggcttcg agcactgctt caacaactcg gtgcagctcc 1860

ggtctgtgaa gaggcagact ccaaaaaaca ctaagcctga aaaagattag atatttagaa 1920

tagaatctac tcaattgcta tcataaaaaa tagttggcta catggccatc tttcattttt 1980

gatcttgctg aagagcccat gcttgtaaaa taagattgaa tggctgattt cagttgtccg 2040

gttttatgcc aatacctgta ccgagctatg ttatcaaaag ttcatatgct actatgcaat 2100

agaaaggttc cttcttttag tttca 2125

<210> 3

<211> 3420

<212> DNA

<213> 稻属水稻(Oryza sativa var.W017)

<400> 3

actcgcctcc actccacctc gaaacccaca aaaatggcgt cgcccaccca cgccgcctac 60

ctcgccccca ccgcccctcc ccgccatctc cacctcctcc tccgcctccg cctccgcggc 120

cgccccgccg tctcaacctg cgtccgcgcc accgcccgcg ggggggatgg cgggtcgtcg 180

tacctggaca tgtggaagaa ggccgtggag agggagcgcc gctcggcgga gatcgcgcac 240

cgcctccagc aatcctcctc cgccgccgcc gccgccgtga aggaggagga gggagagggg 300

aaggctgcgg cggcggcggg ggacgtggag aggaggacgg cgcggttcga ggagatgctg 360

cgggtgccgc gcgaggagcg ggaccgcgtc cagcggcggc aggtcatcga ccgcgccgcc 420

gcggcgctgg cggcggcgcg cgccgtgctc aaggacccgc cgcccccgcc tcccccgtcc 480

ccgccttcca cgccgccgca ggagcgggaa cagcagcaga agccggcggc gaccgcgatc 540

caggccggat cagagagtgg cctggtttcc cgtacggctc cgggggagtc ggatcgggca 600

tccccgccgc cgccggtgac ggagacggcg accgaggcgg cgaaaggtat ggggtgattg 660

gtgcacgtga ggttgcttaa agatcacaag tactctttct tgtgaacgca ttatcttttc 720

gatttctttt ttactagctt tttgaccgtg gctaacatga taattgagct aaaaaggaca 780

actccttttt aatctgacag aatgtatgaa actaacaatc caaccataaa tcccttcctg 840

aggaatagtt gaaaaactgg gaatctattt ttaatctttt ttatgtgtat aatagaagtg 900

tttgatttat gtcaacaaaa aaaagtgttt gattcgattg ataggtgaat ggatttaggg 960

aacttgttag atatttatgg aaaattttga ttgtgtgcac tgccattttt gtctcgccat 1020

tggcaataga aattgtagct gtgcagataa cacacaggtg cctgcagtat tggcatcttg 1080

ttttgttatc catgcatatt tcttcattta tctgggtatc aaacatgaat ttattgtcga 1140

agtgcgatgc tgattccacc aaatgactta ctcccgctgt ccaataaatg tagctaaaag 1200

tagcataaat gcaccaaaat aacacctgta gacattaagc atatagaaaa aaaattatca 1260

gcatttctat tagttgcaag ttgcatctgc attttttttt cagacataca tgtattctta 1320

tgcgggatac acaattaact gcagtatttt agttagtaag gtattgtaaa accatgctgt 1380

tcttaatctg caatctgaca ttagcaatca gtttcagtgc cggactctgg tgattcatct 1440

cctttcaaga agtcaagttc caagctcggt actccaggcc cggacttctg gtcgtggtta 1500

ccacctgtgg aaaatagcac taaactagga gaaatcgaca ctgggttaaa accatctgag 1560

aaattagact ccttcgccgg tcagcctgat ctgctgatgg aaaaggaaca gtcagaagac 1620

attttatcgc tcccgttcga aacctctttc ttcaagaagg aagaccgatc tcttcctccc 1680

ttccagtcgt ttgctgagcc tgaaaatgtg gaatccgagc ccagtattac tgctgatgca 1740

gaggagacat tcgaagatca gttttcgaaa aacgcagctg aggcagctag agctcttagt 1800

gcaagcgacg agaagtcatc acatggggtg cgtccagatg gttcattgtg gtggaaggag 1860

acaggtgtag aacaaaggcc tgatggtgta acttgcaagt ggaccgtgat taggggagtt 1920

agtgctgatg gagctgttga atgggaggac aagtattggg aggcttcaga ccggtttgat 1980

cacaaagagc taggttctga gaagtctggt cgtgatgcta cagggaatgt ttggcgggaa 2040

tactggaaag agtctatgtg gcaggtaaat tgctgtctca tttggtacaa tacaaccatt 2100

tgttccttgt tcatgaaacc tacaggttac aatgttacat cataagcatt aaattatggc 2160

tattgtttct attgaaataa gattatctgg cttgagtgat gcagtcatgt gtagagagat 2220

gtgtctcact gtcatgcgtt gatttactga agtatttctg ttccgacaat actgatttac 2280

taaacttcag atgtaatatg atttgtactg aatgatcgcc ccattactcg ttagaacata 2340

actgagtact gcattttttt tttaatattt gcaggatttc acatgtggtg ttatgcacat 2400

ggagaagacg gcagacaagt ggggacagaa tggtaaaggg gagcagtggc aagagcagtg 2460

gtgggagcat tacgattcaa gcggtaaagc tgagaaatgg gctgataaat ggtgcagctt 2520

ggatccaaat acaccactag atgttggtca cgctcatgtt tggcatgaaa ggtaagagct 2580

gctaaaatag cttctttcag aatgctttct gtccgtactc ttatcttgct tttgtccgta 2640

gtcatatcac attcaagaac caacatttcc tcttgttaaa agaaatgaaa agagcaaata 2700

tttcagcaat cagattgttt gcaacataca tcatttatgc tagtactgtt gtaacatacg 2760

acagcttagt catatcaatc aactcaatac atttctggct catcctctac aggtggggcg 2820

agaagtatga tggctgcgga ggtagtgcaa aatacactga caaatgggct gaacgatcag 2880

agggtgacgg gtggtcaaag tggggcgata agtgggatga gcatttcgac ccgaatggcc 2940

atggagtgaa gcaaggggag acctggtggg caggcaagta cggggatcgc tggaatcgca 3000

cctggggcga gcatcacaac tgtactggtt gggtgcacaa gtatggcagg agcagcagcg 3060

gtgagcactg ggacacacac gttccccagg acacctggta tgagcgtttt ccgcactttg 3120

gcttcgagca ctgcttcaac aactcggtgc agctccggtc tgtgaagagg cagactccaa 3180

aaaacactaa gcctgaaaaa gattagatat ttagaataga atctactcaa ttgctatcat 3240

aaaaaatagt tggctacatg gccatctttc atttttgatc ttgctgaaga gcccatgctt 3300

gtaaaataag attgaatggc tgatttcagt tgtccggttt tatgccaata cctgtaccga 3360

gctatgttat caaaagttca tatgctacta tgcaatagaa aggttccttc ttttagtttc 3420

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

actcgcctcc actccacctc ga 22

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaaactaaaa gaaggaacct t 21

Claims (2)

1.一种培育淀粉生物合成正常的转基因水稻的方法，其特征在于：是将SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的OsSBP1基因导入淀粉合成异常的水稻中，得到淀粉生物合成正常的转基因水稻；所述淀粉生物合成异常的水稻为OsSBP1基因突变导致的胚乳呈粉质的水稻；所述淀粉生物合成正常的转基因水稻为胚乳外观透明正常的转基因水稻。

2.根据权利要求1 所述的方法，其特征在于：SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的OsSBP1基因通过含有该基因的重组表达载体导入淀粉生物合成异常的水稻中。

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