CN108642065B

CN108642065B - 一种水稻胚乳粉质相关基因OsSecY2及其编码蛋白质和应用

Info

Publication number: CN108642065B
Application number: CN201810613180.9A
Authority: CN
Inventors: 万建民; 王益华; 刘艺; 江玲; 张文伟; 刘喜; 刘世家; 田云录; 陈亮明
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2018-06-14
Filing date: 2018-06-14
Publication date: 2020-01-21
Anticipated expiration: 2038-06-14
Also published as: CN108642065A

Abstract

本发明公开一种水稻胚乳粉质相关基因Ossecy2及其编码蛋白质和应用，本发明提供的基因Ossecy2，为如下1)或2)或3)或4)所述的DNA分子：1)SEQ ID NO.1所示的DNA分子；2)SEQ ID NO.2所示的DNA分子；3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码植物淀粉合成相关蛋白的DNA分子。本发明还提供所述基因编码的蛋白质，所述蛋白影响植物胚乳中淀粉的合成，将所述蛋白的编码基因导入淀粉合成异常的植物中，可以培育淀粉合成正常的转基因植物。所述蛋白及其编码基因可以应用于植物遗传改良。

Description

一种水稻胚乳粉质相关基因OsSecY2及其编码蛋白质和应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种水稻胚乳粉质相关基因OsSecY2及其编码蛋白质和应用。

背景技术

水稻是重要的粮食作物，也是植物研究的模式物种之一。水稻种子在成熟过程中积累大量的淀粉，为种子萌发和幼苗生长发育提供主要的能量，同时淀粉也是人类重要的食物来源。水稻种子中淀粉积累的多少决定了种子的大小和重量，和水稻的产量直接相关，同时种子中直链淀粉的含量和支链淀粉的结构影响着稻米的食味品质，因此研究稻米中淀粉的合成过程具有重要的应用价值，开展其合成和调控机理的深入研究，对提高水稻产量和改良稻米品质具有重要的指导意义。

尽管许多参与淀粉合成过程的酶和调控因子已经被鉴定出来，但是该过程仍然需要进一步深入研究，而各种类型的胚乳变异突变体是研究该过程的良好材料。水稻淀粉突变体包括糯性(waxy,wx)、糖质(sugary,su)、粉质(floury,flo)、皱缩(shrunken,sh)、暗色(dull,du)、心白(white-core,wc)等类型。利用上述水稻胚乳性状变异突变体，定位和克隆了一系列淀粉合成和调控相关基因，为稻米的品质改良奠定了一定的基础。

发明内容

本发明的目的在于公开一种水稻胚乳粉质相关基因Osscy2及其编码蛋白质和应用。

本发明提供的基因OsSecY2，为如下1)或2)或3)或4)所述的DNA分子：

1)SEQ ID NO.1所示的DNA分子；

2)SEQ ID NO.2所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码植物淀粉合成相关蛋白的DNA分子。

序列表中的SEQ ID NO.1，由7360个核苷酸组成。

本发明还提供了一种上述基因OsSecY2编码的蛋白质。

具体的，本发明提供的蛋白质，选自如(a)或(b)所示的任一种：

(a)由SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将SEQ ID NO.3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与淀粉合成相关的由SEQ ID NO.3衍生的蛋白质。

序列表中的SEQ ID NO.3，由542个氨基酸组成。

本发明还提供了含有所述基因OsSecY2的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。含有以上任一所述基因的重组表达载体也属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组过表达载体可为在限制性内切酶XbaI和BamHI双酶切载体pCAMBIA1305-GFP的重组位点***所述基因(OsSecY2)得到的重组质粒。将含有OsSecY2的pCAMBIA1305-GFP命名为pCAMBIA1305-GFP-OsSecY2。

含有以上任一所述基因(OsSecY2)的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。

扩增所述基因(OsSecY2)全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围，所述的引物对优选Primer1/Primer2、Primer3/Primer4。

在精细定位此基因过程中涉及到的定位引物(见表1)，InDel引物为本实验需要而自行设计的引物，这些自行设计的引物也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了所述基因，所述蛋白质，所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌中的至少一种在植物育种中的应用。

本发明还提供了所述基因，所述蛋白质，所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌中的至少一种在培育淀粉合成正常的转基因植物中的应用。

本发明还提供了一种培育淀粉合成正常的转基因植物的方法，是将所述基因导入淀粉合成异常植物中，得到淀粉合成正常的转基因植物。

具体的，可以将所述基因通过所述重组表达载体导入淀粉合成异常的植物中。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将编码所述蛋白的基因导入植物细胞，可获转基因细胞系及转基因植株。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、百脉根、拟南芥、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。

有益效果：

本发明首次发现、定位并克隆得到一个新的植物胚乳粉质相关蛋白的编码基因OsSecY2。本发明的植物胚乳粉质相关蛋白影响植物的淀粉合成和叶绿体发育过程。抑制该蛋白编码基因的表达可导致植物种子中淀粉合成和叶绿体发育的缺陷，从而可以培育胚乳和叶绿体变异的转基因植物。将所述蛋白的编码基因导入淀粉合成异常的植物中，可以培育淀粉合成正常的植物。所述蛋白及其编码基因可以应用于植物遗传改良。

附图说明

图1为野生型滇粳优1号与突变体D138的植株表型(图A)和籽粒表型(图B、图C)。

图2为野生型滇粳优1号与突变体D138籽粒扫描电镜观察。

图3为野生型滇粳优1号与突变体D138的10DAF胚乳半薄切片观察和3叶期叶鞘的叶绿体观察。

图4为突变基因在第5染色体上的精细定位和测序差异。

图5为转pCAMBIA1305-GFP-OsSecY2的T₁代植株的T₂籽粒表型。

图6为转pCAMBIA1305-GFP-OsSecY2的T₂代胚乳半薄切片和T₁代3叶期叶鞘叶绿体观察。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1、水稻淀粉合成相关位点及其编码基因的发现

一、水稻胚乳粉质突变体D138的表型分析

在利用MNU化学诱变产生的滇粳优1号突变体中，筛选出一个胚乳粉质突变体，命名为D138。

与滇粳优1号比较，D138的主要特征是：种子籽粒粉质不透明(见图1)，同时具有植株叶片白化表型(见图1)。这说明基因突变影响了淀粉的合成，导致淀粉粒的结构和性质发生了变化，使胚乳在外观上表现出巨大的差异。同时，基因的突变亦影响了植株叶绿体的发育，从而产生叶片白化的表型。

对野生型和突变体成熟种子的横截面进行了扫描电镜观察(见图2)，在放大200倍的照片上，野生型种子的横截面的淀粉片层结构比较规则整齐，而突变体比较松散。由此可以推断，这些淀粉粒结构和排布的改变可能是导致胚乳呈现粉质表型的直接原因。

对野生型和突变体发育10DAF的胚乳进行半薄切片观察，发现突变体造粉体面积变大、数量变少(见图3)。同时观察野生型和突变体叶鞘中叶绿体(3叶)，发现突变体叶绿体面积变大，数量减少(见图3)。由此推断，突变体胚乳粉质表型是由造粉体变大，造粉体之间孔隙增多导致；而叶片白化表型是由叶绿体大小和数量变化导致。

二、突变基因位点的图位克隆

1、突变基因的定位

首先，配制了突变体D138和另一野生型N22的杂交组合F₁，自交一代后获得了F₂种子。将F₂种子去壳，以表型不透明和叶片白化为标准筛选10株极端个体进行连锁分析，将目的基因初步确定在水稻第5条染色体长臂上，增加极端个体至31株，将目标基因初定位在s5-7和s5-32两个标记之间。增加极端个体至257株，利用实验室的公用引物与自己设计的引物，将目的基因最终定位在s5-14和Fy-10两标记之间，物理距离为88kb(图4)。，

上述SSR标记分析的方法如下所述：

(1)提取上述选取单株的总DNA作为模板，具体方法如下：

①取0.2g左右的水稻幼嫩叶片，置于2.0mL Eppendorf管中，加入一粒钢珠，把装好样品的Eppendorf管在液氮中冷冻5min，置于GENO/GRINDER 2000型仪器上粉碎样品1min。

②加入660μL提取液(含100mM Tris-HCl(pH 8.0)，20mM EDTA(pH 8.0)，1.4MNaCl,0.2g/mL CTAB的溶液)，65℃温浴30min。

③加入40μL 20％SDS，65℃温浴10min，每隔两分钟轻轻上下颠倒混匀。

④加入100μL 5M NaCl，温和混匀。

⑤加入100μL 10×CTAB，65℃温浴10min，间断轻轻上下颠倒混匀。

⑥加入900μL氯仿，充分混匀，12000rpm离心3min。

⑦转移上清液至1.5mL Eppendorf管中，加入600μL异丙醇，混匀，12000rpm离心5min。

⑧弃上清液，沉淀用70％(体积百分含量)乙醇漂洗一次，室温凉干。

⑨加入100μL 1×TE(121g Tris溶于1升水中，用盐酸调pH值至8.0得到的溶液)溶解DNA。

⑩取2μL电泳检测DNA质量，并用Nano Drop分光光度仪测定浓度。

(2)将上述提取的DNA稀释成约20ng/μL，作为模板进行PCR扩增；

PCR反应体系(10μL)：DNA(20ng/μL)1μL，上游引物(2pmol/μL)1μL，下游引物(2pmol/μL)1μL，10×Buffer(MgCl₂ free)1μL，dNTP(10mM)0.2μL，MgCl₂(25mM)0.6μL，rTaq(5U/μL)0.1μL，ddH₂O 5.1μL，共10μL。

PCR反应程序：94.0℃变性5min；94.0℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，共循环35次；72℃延伸7min；10℃保存。PCR反应在LongGene A200 PCR仪中进行。

(3)SSR标记的PCR产物检测

扩增产物用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。以50bp的DNA Ladder为对照比较扩增产物的分子量大小，银染显色。

上述引物开发过程如下：

(1)SSR标记开发

将公共图谱的SSR标记与水稻基因组序列进行整合，下载突变位点附近的BAC/PAC克隆序列。用SSRHunter(***等，遗传，2005，27(5):808-810)或SSRIT在线软件(http://archive.gramene.org/db/markers/ssrtool)搜索克隆中潜在的SSR序列(重复次数≥6)；将这些SSR及其邻近400～500bp的序列在NCBI通过BLAST程序在线与相应的籼稻序列进行比较，如果两者的SSR重复次数有差异，初步推断该SSR引物的PCR产物在籼、粳间存在多态性；再利用Primer Premier 5.0软件设计SSR引物，并由上海英骏生物技术有限公司合成。将自行设计的SSR成对引物等比例混合，检测其在滇粳优1号和N22之间的多态性，表现多态者用作精细定位的分子标记。用于精细定位的分子标记见表1。

表1 用于精细定位的分子标记

引物名称	上游引物(5’-3’)	下游引物(5’-3’)
			S5-7	GAGAACAATGTGCCGTG	CAGTGGACTTTGAGGGAT
S5-8	ATCCACCTACCACCACTG	CCCCTTACTCTTCCAATG
			S5-41	GTGAACCCTTGTGTAATCGC	GCAGCCACCTGACTACTAAT
Fy-13	AGCTGGTACTAAGAATGCAC	TCCCACAAACACACACGC
			S5-14	GGGGTTTGCTTCAGGTTAG	GCTAAAGCTGGAGCTGATGA
Fy-10	AATCCGATTTAGTACGAGGC	TCCCTTCATATCAGCAAACA
			S5-15	TCACGCCACCACTTGTTG	GCAGAGATGGATGTGCTTCA
S5-20	ACCTCCTACCTCCCGTTGCT	TCCTGTGGTGGAACCTGTC
			S5-32	GCTAAGTTTGGTGGGGTCA	CTCCGACTCCATCCAAAATC
I5-9	CTGCACTGCTGAAATGGAGA	GCTGGGATATCAACCCTACG

2、粉质基因的获得

经过对88kb区间内的测序，发现了secy2基因存在一个单碱基的突变，

根据网上公布的序列设计引物，序列如下所述：

primer1：5'CGCCATGCCGCACTCACTCT3'(SEQ ID NO.4)；

primer2：5'TGGTCAACCCGCCAGCCTCT 3'(SEQ ID NO.5)。

以primer1和primer2为引物，以滇粳优1号发育中胚乳cDNA为模板，进行PCR扩增获得目的基因。扩增反应在LongGene A200 PCR仪上进行：94℃3min；94℃30s，60℃45s，72℃10min，35个循环；72℃5min。将PCR产物回收纯化后连接到pMD18-T(日本TaKaRa公司上)，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京Tiangen公司CB101)，挑选阳性克隆后，进行测序。

序列测定结果表明，PCR反应获得的片段具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，编码542个氨基酸残基组成的蛋白质(见序列表的SEQ ID NO.3)。将SEQ ID NO.3所示的蛋白命名为OsSecY2，将SEQ ID NO.3所示的蛋白的编码基因命名OsSecY2。

实施例2、转基因植物的获得和鉴定

一、重组表达载体构建

以滇粳优1号(来自南京农业大学水稻所种质资源库)的cDNA为模板，进行PCR扩增获得OsSecY2基因CDS序列，PCR引物序列如下：

primer3：

5'CGGAGCTAGCTCTAGAATGCCGCACTCACTCTCCCT3'(SEQ ID NO.6)；

primer4：

5'TGCTCACCATGGATCCGGCACCATATCTCCTTAGAA 3'(SEQ ID NO.7)。

上述引物位于SEQ ID NO.2所示基因的ATG开始到TGA前结束，不包括TGA，扩增产物包含了该基因的全部编码区部分，将PCR产物回收纯化。采用INFUSION重组试剂盒(日本TaKaRa公司)将PCR产物克隆到载体pCAMBIA1305-GFP中。INFUSION重组反应体系(10μL)：PCR产物1.0μL，pCAMBIA1305-GFP 6.0μL，5×infusion buffer 2.0μL，infusion enzymemix 1μL。短暂离心后将混合体系50℃水浴15分钟，取出置于冰上，取2.5μL反应体系用热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京Tiangen公司；CB101)。将全部转化细胞均匀涂布在含50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上。37℃培养16h后，挑取克隆阳性克隆，进行测序。测序结果表明，得到了含有SEQ ID NO.2所示基因的重组表达载体，将含有OsSecY2的pCAMBIA1305-GFP命名为pCAMBIA1305-GFP-OsSecY2，OsSecY2基因片段利用INFUSION重组试剂盒(日本TaKaRa公司)***到该载体的XbaI和BamHI酶切位点之间。

二、重组农杆菌的获得

用冻融法将pCAMBIA1305-GFP-OsSecY2转化农杆菌EHA105菌株(实验室保存)，得到重组菌株，提取质粒进行PCR及酶切鉴定。将PCR及酶切鉴定正确的重组菌株命名为EH-pCAMBIA1305-GFP-OsSecY2。

用pCAMBIA1305-GFP作为对照载体转化农杆菌EHA105菌株，方法同上，得到转空载体对照菌株。

三、转基因植物的获得

分别将EH-pCAMBIA1305-GFP-OsSecY2和转空载体对照菌株转化水稻胚乳粉质突变体D138，具体方法为：

(1)28℃培养EH-pCAMBIA1305-GFP-OsSecY2(或转空载体对照菌株)16小时，收集菌体，并稀释到N6液体培养基(Sigma公司，C1416)中至浓度为OD600≈0.5，获得菌液；

(2)将培养至一个月的D138水稻成熟胚胚性愈伤组织与步骤(1)的菌液混合侵染30min，滤纸吸干菌液后转入共培养培养基(N6固体共培养培养基，Sigma公司)中，24℃共培养3天；

(3)将步骤(2)的愈伤接种在含有100mg/L潮霉素的N6固体筛选培养基上第一次筛选(16天)；

(4)挑取健康愈伤转入含有100mg/L潮霉素的N6固体筛选培养基上第二次筛选，每15天继代一次；

(5)挑取健康愈伤转入含有50mg/L潮霉素的N6固体筛选培养基上第三次筛选，每15天继代一次；

(6)挑取抗性愈伤转入分化培养基上分化；得到分化成苗的T₀代阳性植株。

四、转基因植株的鉴定

1、PCR分子鉴定

将步骤三获得的T₀代植株提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，利用Primer3和Primer4为引物进行扩增。

PCR反应体系：DNA(20ng/μL)2μL，Primer3(10pmoL/μL)2μL，Primer4(10pmol/μL)2μL，10×Buffer(MgCl₂ free)2μL，dNTP(10mM)0.4μL，MgCl₂(25mM)1.2μL，rTaq(5U/μL)0.4μL，ddH₂O 10μL，总体积20μL。扩增反应在LongGeneA200PCR仪上进行，PCR程序为：94℃3min；94℃30s，55℃(引物不同，有所调整)45s，72℃2min，35个循环；72℃5min。

PCR产物用1％的琼脂糖电泳检测，阳性植株中可以检测到SEQ ID NO.2大小的目标条带，阴性植株中不能检测到。

2、表型鉴定

分别将T₀代转pCAMBIA1305-GFP-Oscysecy2阳性植株、T₀代转空载体对照植株、突变体D138和滇粳优1号种植在南京农业大学土桥水稻育种基地转基因田内。种子成熟后，收取各材料种子，观察到pCAMBIA1305-GFP-OsSecY2植株的种子中出现了透明的种子(图5)，进一步的半薄切片和水稻3叶叶鞘观察显示，转入pCAMBIA1305-GFP-OsSecY2的D138种子的淀粉颗粒形态和数量以及叶鞘叶绿体的形态和数量均恢复至正常水平(图6)。因此证明D138中的突变表型是由OsSecY2的突变造成的。pCAMBIA1305-GFP-OsSecY2可以使D138株系的淀粉合成恢复至正常水平。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种水稻胚乳粉质相关基因OsSecY2及其编码蛋白质和应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7360

<212> DNA

<213> 稻属水稻(Oryza sativavar.Dianjingyou1)

<400> 1

cggattttgc aatcccatcg gccggcagag cgcgacggcg gcagctcggc caccgccgcg 60

gcatcgccgc catgccgcac tcactctccc tcctgctcgc gcccagccgc gcgctctccc 120

tctcctcccc accgctccgc ctcgccccaa cgcacccacc acttcgcctg caccacgacg 180

gcggccacct cctcgtgggc acgacgaggc ggcaggctcc ctcgcctcgc cgccgccgtc 240

tccatgccgc cagggcttcc gcgccgtccg ccgccgcggc gtcccccgta gggcctgcgg 300

gcgagggtgg cgaggtgggg ggcagggcga ggaaggcggc ggggtaccgg aacaggttcc 360

tggacctggc gcggctgggg gccgtggcgg agagcgcggc ggaggcgctc ttccgcagcg 420

agattcgccg gcggctggcc gtcacggccg tgctcatcct gctcagccgc gtcggctact 480

tcgtcccgct tcccgggttc gaccgacggc tcatccccga ttcctacctc agctttgcac 540

cccttcctgc aggtctcttc cctttacagt cctccgagaa tattagttcg tgctagctgt 600

agtgtatgaa agtgcgcggt cgtttgatca ttttgatggc cttggtgaac tgtttgaaga 660

atgtgcggtg ctctttcggt tgtgcagatg acctcggtga tttttcatcc gaattgaagc 720

tgtcattttt ccagctcgga atcagtcatc agatttcagc atctattgtc atgcaggttc 780

tattttatcc cttgtttggt cctgctcttt tgttttccaa tggcaacgta tgtctcaagt 840

agcagcaatc cgctcaataa cctgttgcaa actgagcctt agttctttta ttctagagtg 900

tgttcgtttt tgctctttaa gagcgttttg catcagttgc ttctaacgtc gtactaaagc 960

ttttctcagt atttggtgat agtaacaaat tgtgattttt aggttctctg tcatgttctt 1020

ccatcacttg aaaaactacg aaaggaaggg ttagatggac atgagaagat caaaggctat 1080

atgtgagtcg agttctcttt cttgaactga attatttgaa aaggggatct tttattttct 1140

ttctcaacat tcatctactt ttaaatttta agtctggtta ttttgatgtt ctagttggtg 1200

gctgtcgctg ggttttgcac ttgtggcggc ttttacagtg tcatgctact cactgcaata 1260

ttctatatat gctgcaagtt acaggtgaca gtatgttagc tctatatgga gaaaaagctt 1320

tactaataat aatttgtttg gactggaagg atgctcatca gtatttcttt acctatacct 1380

ttttttaatc tttcagagtt aagcatgtaa tgataacaag ccttttcctt gttcttggtg 1440

caatgacaat gacatggatc tgtgacacta tatcggaatc tggatttggt aatactctat 1500

atcatgtata tcggaatctt ggatttggta ttctagcatc atctctgcat gctttgatta 1560

tactgtgtta aagctgtatt caatatggca tattatgcca tatccaaact ttaagactaa 1620

actcagctgt tggacatgaa aacatgcatg ctggcatgat ttctttacca tatatctcta 1680

tgattgcgat tcacgtaaat gatcttgtaa agtaaaagca taaaatgatg gttgttatcc 1740

atttagtgca tattttcttg tacttggttg gaacttttgt tcttatattt tcttctatgt 1800

ctttgcatcc aggacatggc tcttccttga ttatctgtgt gggaatattg actggttata 1860

cagacacact ccacaagatg ttaactcaat tttcaggtaa tctttcacga cactaattgc 1920

aacttttcaa ctgctaagtt ttactccttt gagttggatg cgaccagtaa attctaatga 1980

taatgatgtg tatgtactga atttattatc cttgcatctt cttatatctc tttgcggaag 2040

ttttgtggta ggtggagtat ttcaaggcac ttttccaaac tgcattgtca tctatgatga 2100

tcttatactt tgattttttt ttatctgcct gtttggtgcc tcacattgtg ttgccaacca 2160

aaactcattg ttggattgta actcctttaa aggattgaat ttcattacag cttggcataa 2220

ctgttgctca aataaataag aagcaacatg gtctgagtag aatggataat tccattatgc 2280

cactcaaatt ttgccaaacc agggatgtgc tgttatcgta caagtacaat actttaccct 2340

tttatttcat tgcagacaaa attccatcag tcaaatcatg cccaggatgt gcaaagacta 2400

ttttacccct tctctatcag tttcctctgt tttctattgc acttttccat agctgactgg 2460

agagaacgac ctcatctatc ctccaatgac caatggctag tttagagata tgttagtcat 2520

tattcagaga aattaaaaaa tgagagcaaa ggggtaaaat ttgatcaaca agggtagaaa 2580

agggtaatgt tttggtacag tacagtcata tctggagttg gttttcaatg ggatatctag 2640

gctcagacat attgttaatg atatatatgg aattatccct tttcatcttc tattaaatca 2700

ttacaggatg gtgaaatctt attttgcact taaaaatctt ggatggttgt gtctgttata 2760

acctcgtcag tagtgttatc ttagctgatc tacctgagct ccatttctct agctgagcat 2820

aacataatat gcatcgtgca atgttaaggt ttgtttgcac gatcatttgg gcactagcca 2880

gttcatgaag atataatgtt gacatttttg tcagtaacgt gtatatacga actagaattt 2940

taagtcttaa aacacttcac cagtttctac aatacaataa cttgtttacc aagatggatc 3000

agataaacat ttggagaaaa gaaaccgaaa atgtaactcc taatttcttt cggtcatata 3060

cagtatgtac acagacagct gatatgctga gacttctagt gttattttct tttatttgat 3120

atgcctttcg aaacaggaaa ttggtacagc tgttggccct acatcttggg gatagctggg 3180

acttttattt tggttaccat gggagcagta ctggtgactg aagggtgtag gaagataaag 3240

cttcagtact atggatttaa attggcttct ggtgcaaggt aatgataaaa tcaactctac 3300

actcattttt attatcatgt acttttgaat gctatttttg catggagcac ataagaacat 3360

tatccacaca agctgcacat aagaaccttt catgttgccc aaatgcccaa acagaatata 3420

ctttatcaca ttaactgcaa accttttgtt tgaaacatct atttatgtta tttgaaaact 3480

ccagtttgtt atattctgct taagttctaa tttctaaaca atttaacagc acccttctac 3540

cggtattttt agctgcagcc tggcatggtt atatggctca atgatatggt tggatgtgga 3600

ttgacctagc aaaggctact ccatcatcac ctatttgtgc taatactacg ctttatggtt 3660

ttctcaatcc ttttacttat cttatatttg atcattcttt tgtaggagtg agagctcccc 3720

agttacagag gtagagccat atatcccttt taacataaat ccaactggga tgcagccttt 3780

gcttaccacc tcatacttat tagcttttcc aagcattatg gccaggtaat tcattgtgtt 3840

tattttttgg gtatgttttg gttaaaattt ccattctgat tttggaattt ctccagcatt 3900

tttggtacgc aattttggga aagtttgaag gaaacgttga atccaaagac ttcagttggt 3960

ggtggtccat gggtttatta tttgacatat gcatttcttg tcttcgtctt caatattttt 4020

gacattgtaa gttactttct catcttaata actgtctaac tattttattt ttcaggatac 4080

agtcattata ccaatattcc ttctattatc ttgtggtgat gttctcttat agttgctcgt 4140

gaccttgttt tggtgcctgc ggaacctggc tgaccccctt agagaatgca ttgtttaaaa 4200

aattccgtaa tgaattgtgg atgtagcaca cagagtcctt taaacctaca aaaaaaaaat 4260

tcaaattgtc tagatgttga gatacagaaa ggacaagcat acatcacggt attgttcacc 4320

atgaagtagc agtagccgta agacttttcc ttttgtatct tgacatgtag gaaaaaactt 4380

gagttttata tttttcttta cacagagcta ctcatgctac atccatgaat cattttggaa 4440

ttttttaatc atcgcttatg ttgattcatc agattttttt atgggggaca acgaatcccc 4500

tggggaccaa caactatgca taatctaact gttgaaccta gtatcacata caaaactttt 4560

cttaacaatg ctcttgtaga tcttcaaaaa catgacagat atttgtgatg taattttgat 4620

atcagaactc atgttctcaa cattttcagg aagataatat tcttttattt tcttttcatg 4680

attttatttg cacatgcctt atcaaatata gcttaatcta cacattattc actgcaggca 4740

aacttgccaa aagagatatc tgactacctg aataaaatga gtgctagagt accgaagata 4800

aagcctggaa gagcaacagt agagtatctt acaaaaatac aaacatctac acgtttctgg 4860

ggtaggtggc cttcacgaga acttgtagca tggccaaact ttcctctgtt ttgctttatg 4920

ttttttctta tttttaaaaa gtgtttcttt ccttgaattc cagggggtat attgctgagc 4980

ttgttggcga cttcctcttt attacttgac cgatatctca ggcagataaa tgagggattt 5040

tctataggtt tcacgtcggt gttgattatt gtgagtgcat ctcaattata ttcttcatta 5100

tcatttgtca ccatgaagaa gattgatgtt gaattgcatt ttcaatcata ttcttagtta 5160

actatttgcc acttttaaga tgtggcaatt aaggatttgc cactcgcagt ctatgacatc 5220

tgggtccagt ggcaaatcct taagtgtcac ttgtaataat ggcaaatagt taattatctc 5280

ttttcatggt gctatttttt ccaagtattg gcctttttac atgtgttttc tctgaatatc 5340

ttctaggtgc ctgaatctga aattctaaat gaacttaaac ttggtcaagt gactagggat 5400

tttagctgat tatgcacact tccaatgttg accttctgta ttttgttttt tcaatgtttc 5460

tgccttttga tcttcttaaa aatattgata aaatccaaat ggtgtattag atgatttagg 5520

gcttaaggcc tttcgctctg tcaagttaag ccctcctagc tgtccccaca atgcattcct 5580

gctccccaca ggcccacacc cataaaaaat gccattagaa tctctgtttg atgtactatt 5640

tgttgtactt atggaggaag gctgggtgat tttgaccttt gagagatgaa tattatgtaa 5700

ttaaatatta tgtttatgca gtttagcaca ttattgcaag ttgttccata atgcagagcc 5760

cactgctatg cataatttat aaatctagga tatatattta gaaagtaaaa gcacacaatt 5820

tttttattga aaagaacaaa acaactgaag attttgtttc cttaaaatct taaatgaaaa 5880

gcttgagcct atgcagtata ggaatcattt ccagccgtaa tcatattagc agtgaacttg 5940

gcaaatgtgt tagttctttg ccactaaata attaatatgc ttacctgcct atagatagtt 6000

accgtaccga tgtgttcttc catccacaat ttcattttac atggatagct caaagtttgt 6060

gttcatttcc ctctacattg cattttcttt ttattatttt tgtttaaaaa caaaaatgca 6120

tatcaactat aaagaattct attagtgtgc tgcttatttt ctgctgctgc attaggtgtt 6180

ctagcccttt tctaccttca tttacttatg gacattaaat attttttttc tttgatcaaa 6240

tgggacatgt gcgtgatgaa catgtgtttg gataatgaaa ctatatgaag atgattgttc 6300

aggtgggctc aatcatcgag ctgagaaggt cttatcaagc atacaatgtg atgccagcac 6360

taagcaaagt tctaaggaga tatggtgcct gaggttatgt acgccacata tttggttatg 6420

atggtatcat ccacaaggta cttcttcctt tgctgctagt ctttgttaat attaagctaa 6480

gcctgccttt ttcccctttg ttttagaaga agagggccat ttcaaaaaaa cttcagagtt 6540

tacaggctta cagccgacta gatgctgtga ccttgattat tgtcaacaac ttgcagtacg 6600

gtgcagtaag aagagttcta taacccagac caatattgtg cttgggttgg gatgagatta 6660

gtatagtttg atatcaatct tctgtggcat aaactggaac tgaagaacca aggaggatat 6720

tttgttactc atggcacagc aactatgaag agcgtgacct acgaggagct gtgtaattgt 6780

gttgtctttg gccacttctg gaatggttga cggcttgatg caatgcgaac gaaaatttgg 6840

atccaatctc acccagctgt ataattttct gaagatcaga ttgccaaatt gctggctagc 6900

tgcatcacgc ttagtaaatg gtgcggtcag aagtcagaac ctgaagtctg caaaattgct 6960

ggttttgggt tgattgttgg aacgttctac atcagaggct ggcgggttga ccatctggac 7020

ttatccgtgt agcacaatga agatcagctg tcgtgcgttt gctgaccagt agtatctctc 7080

tgtaggctta tgtttttgta aatatatggc ttattaacag tagaacttcc actcctgtcc 7140

tgacttctca aaggctgttc tgttcacttt tccaaaaagc agcttcatat ttacaaaaga 7200

taaagaagca catttttctt ttattgacaa agatatagct gagctgcatg ctgaagaaac 7260

agacgtatca tacaggtcga gcctccaatg tgacattatt gcgctcaatg gcgcgttgta 7320

ccattatcta ctacagtaca tcagtactaa tgtctttcaa 7360

<210> 2

<211> 1629

<212> DNA

<213> 稻属水稻(Oryza sativavar.Dianjingyou1)

<400> 2

atgccgcact cactctccct cctgctcgcg cccagccgcg cgctctccct ctcctcccca 60

ccgctccgcc tcgccccaac gcacccacca cttcgcctgc accacgacgg cggccacctc 120

ctcgtgggca cgacgaggcg gcaggctccc tcgcctcgcc gccgccgtct ccatgccgcc 180

agggcttccg cgccgtccgc cgccgcggcg tcccccgtag ggcctgcggg cgagggtggc 240

gaggtggggg gcagggcgag gaaggcggcg gggtaccgga acaggttcct ggacctggcg 300

cggctggggg ccgtggcgga gagcgcggcg gaggcgctct tccgcagcga gattcgccgg 360

cggctggccg tcacggccgt gctcatcctg ctcagccgcg tcggctactt cgtcccgctt 420

cccgggttcg accgacggct catccccgat tcctacctca gctttgcacc ccttcctgca 480

gatgacctcg gtgatttttc atccgaattg aagctgtcat ttttccagct cggaatcagt 540

catcagattt cagcatctat tgtcatgcag gttctctgtc atgttcttcc atcacttgaa 600

aaactacgaa aggaagggtt agatggacat gagaagatca aaggctatat ttggtggctg 660

tcgctgggtt ttgcacttgt ggcggctttt acagtgtcat gctactcact gcaatattct 720

atatatgctg caagttacag agttaagcat gtaatgataa caagcctttt ccttgttctt 780

ggtgcaatga caatgacatg gatctgtgac actatatcgg aatctggatt tggacatggc 840

tcttccttga ttatctgtgt gggaatattg actggttata cagacacact ccacaagatg 900

ttaactcaat tttcaggaaa ttggtacagc tgttggccct acatcttggg gatagctggg 960

acttttattt tggttaccat gggagcagta ctggtgactg aagggtgtag gaagataaag 1020

cttcagtact atggatttaa attggcttct ggtgcaagga gtgagagctc cccagttaca 1080

gaggtagagc catatatccc ttttaacata aatccaactg ggatgcagcc tttgcttacc 1140

acctcatact tattagcttt tccaagcatt atggccagca tttttggtac gcaattttgg 1200

gaaagtttga aggaaacgtt gaatccaaag acttcagttg gtggtggtcc atgggtttat 1260

tatttgacat atgcatttct tgtcttcgtc ttcaatattt ttgacattgc aaacttgcca 1320

aaagagatat ctgactacct gaataaaatg agtgctagag taccgaagat aaagcctgga 1380

agagcaacag tagagtatct tacaaaaata caaacatcta cacgtttctg ggggggtata 1440

ttgctgagct tgttggcgac ttcctcttta ttacttgacc gatatctcag gcagataaat 1500

gagggatttt ctataggttt cacgtcggtg ttgattattg tgggctcaat catcgagctg 1560

agaaggtctt atcaagcata caatgtgatg ccagcactaa gcaaagttct aaggagatat 1620

ggtgcctga 1629

<210> 3

<211> 542

<212> PRT

<213> 稻属水稻(Oryza sativavar.Dianjingyou1)

<400> 3

Met Pro His Ser Leu Ser Leu Leu Leu Ala Pro Ser Arg Ala Leu Ser

1 5 10 15

Leu Ser Ser Pro Pro Leu Arg Leu Ala Pro Thr His Pro Pro Leu Arg

20 25 30

Leu His His Asp Gly Gly His Leu Leu Val Gly Thr Thr Arg Arg Gln

35 40 45

Ala Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Leu His Ala Ala Arg Ala Ser Ala

50 55 60

Pro Ser Ala Ala Ala Ala Ser Pro Val Gly Pro Ala Gly Glu Gly Gly

65 70 75 80

Glu Val Gly Gly Arg Ala Arg Lys Ala Ala Gly Tyr Arg Asn Arg Phe

85 90 95

Leu Asp Leu Ala Arg Leu Gly Ala Val Ala Glu Ser Ala Ala Glu Ala

100 105 110

Leu Phe Arg Ser Glu Ile Arg Arg Arg Leu Ala Val Thr Ala Val Leu

115 120 125

Ile Leu Leu Ser Arg Val Gly Tyr Phe Val Pro Leu Pro Gly Phe Asp

130 135 140

Arg Arg Leu Ile Pro Asp Ser Tyr Leu Ser Phe Ala Pro Leu Pro Ala

145 150 155 160

Asp Asp Leu Gly Asp Phe Ser Ser Glu Leu Lys Leu Ser Phe Phe Gln

165 170 175

Leu Gly Ile Ser His Gln Ile Ser Ala Ser Ile Val Met Gln Val Leu

180 185 190

Cys His Val Leu Pro Ser Leu Glu Lys Leu Arg Lys Glu Gly Leu Asp

195 200 205

Gly His Glu Lys Ile Lys Gly Tyr Ile Trp Trp Leu Ser Leu Gly Phe

210 215 220

Ala Leu Val Ala Ala Phe Thr Val Ser Cys Tyr Ser Leu Gln Tyr Ser

225 230 235 240

Ile Tyr Ala Ala Ser Tyr Arg Val Lys His Val Met Ile Thr Ser Leu

245 250 255

Phe Leu Val Leu Gly Ala Met Thr Met Thr Trp Ile Cys Asp Thr Ile

260 265 270

Ser Glu Ser Gly Phe Gly His Gly Ser Ser Leu Ile Ile Cys Val Gly

275 280 285

Ile Leu Thr Gly Tyr Thr Asp Thr Leu His Lys Met Leu Thr Gln Phe

290 295 300

Ser Gly Asn Trp Tyr Ser Cys Trp Pro Tyr Ile Leu Gly Ile Ala Gly

305 310 315 320

Thr Phe Ile Leu Val Thr Met Gly Ala Val Leu Val Thr Glu Gly Cys

325 330 335

Arg Lys Ile Lys Leu Gln Tyr Tyr Gly Phe Lys Leu Ala Ser Gly Ala

340 345 350

Arg Ser Glu Ser Ser Pro Val Thr Glu Val Glu Pro Tyr Ile Pro Phe

355 360 365

Asn Ile Asn Pro Thr Gly Met Gln Pro Leu Leu Thr Thr Ser Tyr Leu

370 375 380

Leu Ala Phe Pro Ser Ile Met Ala Ser Ile Phe Gly Thr Gln Phe Trp

385 390 395 400

Glu Ser Leu Lys Glu Thr Leu Asn Pro Lys Thr Ser Val Gly Gly Gly

405 410 415

Pro Trp Val Tyr Tyr Leu Thr Tyr Ala Phe Leu Val Phe Val Phe Asn

420 425 430

Ile Phe Asp Ile Ala Asn Leu Pro Lys Glu Ile Ser Asp Tyr Leu Asn

435 440 445

Lys Met Ser Ala Arg Val Pro Lys Ile Lys Pro Gly Arg Ala Thr Val

450 455 460

Glu Tyr Leu Thr Lys Ile Gln Thr Ser Thr Arg Phe Trp Gly Gly Ile

465 470 475 480

Leu Leu Ser Leu Leu Ala Thr Ser Ser Leu Leu Leu Asp Arg Tyr Leu

485 490 495

Arg Gln Ile Asn Glu Gly Phe Ser Ile Gly Phe Thr Ser Val Leu Ile

500 505 510

Ile Val Gly Ser Ile Ile Glu Leu Arg Arg Ser Tyr Gln Ala Tyr Asn

515 520 525

Val Met Pro Ala Leu Ser Lys Val Leu Arg Arg Tyr Gly Ala

530 535 540

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgccatgccg cactcactct 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tggtcaaccc gccagcctct 20

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cggagctagc tctagaatgc cgcactcact ctccct 36

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgctcaccat ggatccggca ccatatctcc ttagaa 36

Claims

1.SEQ ID NO.1 或SEQ ID NO.2所示的基因，SEQ ID NO.3所示的蛋白质，包含SEQ IDNO.1 或SEQ ID NO.2所示的基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在培育种子淀粉合成正常的水稻中的应用，所述水稻存在SEQ ID NO.2所示基因的缺陷。

2.一种培育种子淀粉合成正常的转基因植物的方法，是将SEQ ID NO.1 或SEQ IDNO.2所示的基因导入因SEQ ID NO.2所示基因的突变导致的淀粉合成异常水稻中，得到种子淀粉合成正常的转基因水稻。