CN101457212A - 一株同时降解黄曲霉毒素b1、赭曲霉毒素a的菌株的筛选、培养和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开1株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)菌株,能够同时降解真菌毒素(mycotoxins)中的黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)和赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)。首先通过香豆素为惟一碳源的培养基初筛目的菌株,再用AFB1和OTA的毒素纯品二次筛选,然后应用到加标的粮食样本中,该菌株对加标粮食中AFB1和OTA的平均降解率分别达到82.2和78.7%。该发明可以应用到食品及饲料行业,脱除粮食、饲料中的AFB1和OTA。
Description
技术领域
本发明涉及一种同时降解AFB1和OTA的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)MZH-11,已经于2008.10.10在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏,保藏编号为CGMCC No.2775;本发明还涉及地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)CGMCC No.2775的分离、培养保存方法及应用。
背景技术
黄曲霉毒素(aflatoxin,AFT)是由Aspergillus flavus、A.nomius、A.parasiticus等多种真菌产生的次级代谢产物,其中黄曲霉毒素B1(AFB1)分布范围最广且化学性质最稳定,具有很强的致癌性、致突变性和致畸性,是国际认可的A类致癌物。
赭曲霉毒素A(OTA)是赭曲霉毒素中毒性最强,分布范围最广的化合物。1993年IARC将其确定为2B类致癌物。食品法典委员会(2001)认定赭曲霉毒素对人类威胁最重要的食品类别依次为:谷类>葡萄及其制品>咖啡豆及其制品>其他。
AFB1和OTA均属于剧毒化学品(LD50≤1mg.kg-1.bw)。而且在谷物里会同时存在,AFB1和人类的肝癌有正相关;OTA可能是地区性慢性肾病以及尿道肿瘤的原因。针对婴儿食品,国际黄曲霉毒素B1的最低限量标准为0.10μg·kg-1,2006年欧盟最新的赭曲霉毒素A的最大限量为0.50μg·kg-1。
地衣芽孢杆菌是普遍认可的一个功能菌株。已经在医学方面有应用,例如调整肠道菌群等。地衣芽孢杆菌可以抑制真菌,本发明中解除毒素的作用,可以应用到饲料领域;其纯化的代谢物也可以有条件的应用到食品领域。
发明内容
为了减少AFB1和OTA对人和动物的危害,减少真菌毒素在饲料和食品中的含量,最终保证食品安全,本文通过选择样本、初筛、复筛、验证效果,获得1株地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)CGMCC No.2775,该菌株可以同时降解AFB1和OTA,加标玉米中AFB1和OTA的平均降解率分别达到78%和83%。
地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)CGMCC No.2775的形态学特征为:杆状,芽孢中生,革兰氏染色阳性,菌落光滑,边缘不整齐,与营养琼脂培养与培养基结合较紧密;地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)CGMCC No.2775的形态学特征为:接触酶阴性,氧化酶阴性,发酵葡萄糖、果糖、蔗糖、海藻糖、麦芽糖,不发酵半乳糖、棉籽糖、乳糖,菌株生长耐10%的盐,耐60℃温度,淀粉水解酶阳性,明胶水解阴性,pH值5-9生长;其分子生物学特征,16srDNA序列(TACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAGCCTCGCGGCTTCGCTGCCCTTTGTTCTGCCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGAAGCCCTATCTCTAGGGTTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTTGCTGCAGCACTAAAGGGCGGAAACCCTCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTACCGCCCTATTCGAACGGTACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGTTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCTAAAAGCCACCTTTTATGATTGAACCATGCGGTTCAATCAAGCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTGACCTAAGGGAGCAAGCTCCCGTCGGTCCGCTCGAC)
本发明中提供了地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)的筛选、分离方法以及培养、保存方法。
本发明之所以获得可以同时降解AFB1和OTA的地衣芽孢杆菌(B.licheniformis),主要是采用了合适的样本来源(从动物粪便、发霉粮食、腐败饲料、枯枝败叶以及发酵食品等),初筛和复筛的二次筛选方法,而且,在初筛中选择了合适的、特定的初筛培养基(A:基本培养基,磷酸氢二铵0.01-0.1%,磷酸二氢钾0.1-0.2%,磷酸氢二钠0.3-0.4%,硫酸钠0.05-0.1%,硝酸钠0.1-0.2g,琼脂1.2-2%,pH7.2-7.4;B:香豆素≤0.5%),培养温度36±1℃,筛选出的菌株可能能够降解具香豆素结构的化合物(例如,AFB1或者OTA)。
之后选择复筛降解AFB1的培养基(蛋白胨0.5-1%,牛肉膏0.3-1%,AFB1 0.1-5mg/L,pH7.2-7.4),以及降解OTA的培养基(蔗糖2-3%,硝酸钠0.2-0.3%,磷酸二氢钾0.1-0.2%,硫酸镁0.05-0.1%,氯化钾0.05-0.1%,硫酸亚铁0.001-0.005%,OTA达到0.1-5mg/L,pH6.0-6.5)分别检测降解毒素的能力,温度36±1℃培养,该方法筛选出的阳性菌株就能够降解AFB1和OTA,选择其中生长最好的一株菌株MZH-11。
本发明之一还在于在常规培养和保存中,既能保有菌株降解AFB1和OTA的性质,又能保证其正常生长,采用了特殊的保存培养基(蛋白胨0.1-0.5%,牛肉膏0.1-0.5%,香豆素≤0.05%,pH7.2-7.4),培养温度同上,常规保存温度在4℃。
本发明还包括应用到加标的粮食样本中(AFB1和OTA分别为0.1-5mg/L),对AFB1和OTA的进行降解。可以初步应用到饲料行业。
有益效果
本发明通过使用地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)CGMCC No.2775,降解粮食中的AFB1和OTA,加标玉米的AFB1和OTA浓度分别为0.1-5mg/L时,多次试验的AFB1和OTA平均降解率分别达到82.2和78.7%。
保藏信息说明
本发明的地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)MZH-11菌株,已经于2008.10.10在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏(中国、北京、朝阳区大屯路甲3号中国微生物所内),保藏编号为CGMCC No.2775。
具体实施方式
下面结合具体实施范例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
降解AFB1和OTA的芽孢杆菌(Bacillus spp)菌株的初筛
以动物粪便、发霉粮食、腐败饲料、枯枝败叶以及发酵食品等为材料,采用80℃水浴15min后的梯度稀释分离法,37℃好氧营养琼脂培养(蛋白胨5g;牛肉膏3g;水1000mL;pH7.2-7.4),获得1500多株芽孢菌菌株。
以香豆素为惟一碳源和能源进行AFB1和OTA降解菌株的初筛。配制浓度为≤0.5%香豆素溶液(初筛培养基B组分),选取筛选到的芽孢菌,用灭菌竹签接于装有香豆素溶液的36孔接种器中,然后接种到初筛培养基A中,保证香豆素成为惟一的碳源和能源,将其置于37℃培养箱中培养一周,观察菌株的生长情况。将10株生长较好的菌落在保存培养基试管斜面上划线培养(蛋白胨5g;牛肉膏3g;水1000mL;香豆素≤0.05%;pH7.2-7.4)。这些菌株可能降解具香豆素结构的化合物——AFB1、OTA。
菌株通过梯度稀释倾注平板法分离单菌落,镜检验证其纯度,试管斜面冷藏使用,并将菌株备份保存于甘油管中,放置于-20℃的冰箱保藏。
实施例2
降解AFB1芽孢杆菌(Bacillus spp)菌株的复筛
初筛菌株分别接种于降解AFB1的复筛培养基(不加AFB1)中发酵24小时,取800μL菌体发酵液加入200μL的AFB1(500μg·kg-1)置于灭菌的玻璃试管中,以无菌降解AFB1的复筛培养基作为空白对照,将其置于37℃培养箱培养72小时,做三次重复。结果:MZH-11的降解AFB1能力最强,降解率达到84.5%;39-4的降解能力次之,第三是E-2(表1)。而且前几个菌株在固体培养基生长的速度比较快,香豆素利用能力较强,复筛结果证实这3株菌均能降解AFB1(AFB1降解率≥75%)。
表1 初筛菌株降解AFB1的检测结果*
*对照的AFB1值设为100%-表示检测结果不确定
实施例3
同时降解OTA的芽孢杆菌MZH-11的复筛和鉴定
选择芽孢杆菌MZH-11、39-4、E-2菌株活化培养,分别接种于降解OTA的复筛培养基(不加OTA)中发酵24小时,取发酵液20mL,加入100μg的OTA(5mg·kg-1)置于灭菌的玻璃试管中,以无菌的降解OTA的复筛培养基作为空白对照(CK),将其置于37℃培养箱避光培养36小时,做三次重复。结果:MZH-11的降解OTA能力最强,降解率达到73.6%(表2)。而且该菌株在固体培养基生长的速度较快,菌落较大,复筛结果证实其不仅降解AFB1,还能够降解OTA。
选择MZH-11进行培养鉴定,形态学表现为杆状,有芽孢,革兰氏染色阳性,菌落光滑,边缘不整齐,与营养琼脂培养与培养基结合较紧密;生理生化反应结果为:接触酶阴性,氧化酶阴性,发酵葡萄糖、果糖、蔗糖、海藻糖、麦芽糖,不发酵半乳糖、棉籽糖、乳糖,菌株生长耐10%的盐,耐60℃温度,淀粉水解酶阳性,明胶水解阴性,pH值5-9生长,最适培养温度37℃;参考《伯杰氏细菌鉴定手册》初步鉴定MZH-11属于芽孢杆菌属(Bacillus,sp),通过其16srDNA序列,鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。
表2 降解AFB1的菌株降解OTA的检测结果*
*对照的OTA值设为100%
实施例4
地衣芽孢杆菌CGMCC No.2775同时降解粮食中的AFB1和OTA(浓度分别为0.1mg/L)
粮食中含有AFB1或OTA会给人畜造成危害,AFB1表明和人类的肝癌有关系,OTA的实验动物结果表明其具致癌、致畸、致突变的危害。而且,常常多种真菌毒素存在于一类商品中。我国用于食用的粮食中规定其含量均低于5μg.kg-1。本发明中的地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)CGMCC No.2775可同时降解粮食中的AFB1和OTA(浓度分别为0.1mg/L),降解率均高于80%(表3)。
300mL三角瓶中加入100g不含AFB1和OTA的玉米面,灭菌备用。其中加入AFB1和OTA标准品,分别达到100μg.kg-1,接种107cfu/mL浓度的地衣芽孢杆菌100mL,37℃避光培养,实验设不加菌的对照(CK)。72小时后检测AFB1和OTA,设三个重复。
表3 地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)CGMCC No.2775降解玉米中AFB1和OTA的检测结果*
*对照的AFB1和OTA值设为100%
试验表明,地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)CGMCC No.2775能够同时降解加标玉米中AFB1和OTA,降解率达到88.6%和84.4%。
实施例5
地衣芽孢杆菌CGMCC No.2775同时降解玉米中的AFB1和OTA(浓度分别为0.5mg/L)
我国规定的作为饲料用粮食(尤其是玉米)中含有AFB1≤20μg.kg-1,含有OTA的限量为≤100μg.kg-1。我国的饲用用玉米中就同时检出过AFB1和OTA。玉米中的AFB1和OTA浓度分别为0.5mg/L时,本发明中的地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)CGMCC No.2775可同时降解其中的AFB1和OTA,AFB1和OTA的平均降解率分别达到78%和83%(表4)。
300mL三角瓶中加入100g不含AFB1和OTA的玉米面,灭菌备用。其中加入AFB1和OTA标准品,分别达到500μg.kg-1,接种107cfu/mL浓度的地衣芽孢杆菌100mL,37℃避光培养,实验设不加菌的对照(CK)。72小时后检测AFB1和OTA,设三个重复。
表4 地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)CGMCC No.2775降解玉米中AFB1和OTA的检测结果*
*对照的AFB1和OTA值设为100%
试验表明,地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)CGMCC No.2775能够同时降解加标玉米中AFB1和OTA,降解率分别达到80.5-85.2%和76.4-80.1%,平均降解率为82.9%和78.3%。
实施例6
地衣芽孢杆菌CGMCC No.2775同时降解玉米中的AFB1和OTA(浓度分别为5mg/L)
在玉米样本中添加AFB1和OTA浓度高达5mg/L时,地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)CGMCC No.2775仍然可以同时降解粮食中的AFB1和OTA,降解率超过70%(表5)。
300mL三角瓶中加入100g不含AFB1和OTA的玉米面,灭菌备用。其中加入AFB1和OTA标准品,分别达到5mg.kg-1,接种107cfu/mL浓度的地衣芽孢杆菌100mL,37℃避光培养,实验设不加菌的对照(CK)。72小时后检测AFB1和OTA,设三个重复。
表5 地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)CGMCC No.2775降解玉米中AFB1和OTA的检测结果*
*对照的AFB1和OTA值设为100%
试验表明,地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)CGMCC No.2775在玉米样本中添加AFB1和OTA浓度高达5mg/L时,仍然能够同时降解加标玉米中AFB1和OTA,玉米中AFB1和OTA平均降解率为75.0%和73.5%。
Claims (6)
1、筛选降解AFB1和OTA的地衣芽孢杆菌的筛选方法,其包括内容:从动物粪便、发霉粮食、腐败饲料、枯枝败叶以及发酵食品等样本中筛选能够降解香豆素的菌株;二次筛选能够降解黄曲霉毒素(AFB1)和赭曲霉毒素A(OTA)的菌株,采用初筛培养基(基础培养基含≤0.5%的香豆素)分离的多株能够降解香豆素的菌株,再用这些菌株同时分别接种复筛培养基(肉汤培养基+特定浓度的真菌毒素),选择到1株同时降解两种毒素的细菌,通过形态学,生理、生化鉴定,以及16rDNA序列分析,确定该菌株是地衣芽孢杆菌。
2、根据权利要求1所获得的筛选降解AFB1和OTA的培养基配方,
初筛培养基:
A:基本培养基
磷酸氢二铵 0.01-0.1%
磷酸二氢钾 0.1-0.2%
磷酸氢二钠 0.3-0.4%
硫酸钠 0.05-0.1%
硝酸钠 0.1-0.2g
琼脂 1.2-2%
pH7.2-7.4
B:香豆素(≤0.5%,过滤灭菌,实验中将菌株接于其中,再转接于初筛培养基A中)复筛培养基(降解AFB1):
蛋白胨 0.5-1%
牛肉膏 0.3-1%
AFB1 0.1-5mg/L
pH7.2-7.4
复筛培养基(降解OTA):
蔗糖 2-3%
硝酸钠 0.2-0.3%
磷酸二氢钾 0.1-0.2%
硫酸镁 0.05-0.1%
氯化钾 0.05-0.1%
硫酸亚铁 0.001-0.005%
OTA达到 0.1-5mg/L
pH6.0-6.5
3、根据权利要求1所述方法获得的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)MZH-11,保藏编号为CGMCC No.2775。
4、由权利要求1分离的权利要求3的菌株的培养,其特征在于所用培养和保存用培养基的组分
蛋白胨 0.1-0.5%
牛肉膏 0.1-0.5%
香豆素 ≤0.05%
pH7.2-7.4
5、权利要求3的地衣芽孢杆菌在分别或同时降解AFB1和OTA的应用。
6、权利要求5的地衣芽孢杆菌的解毒作用。主要应用在以粮食为原料的饲料行业。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20090617 |