CN111849844A - 一种地衣芽孢杆菌a10201及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种地衣芽孢杆菌A10201及其应用，所述的地衣芽孢杆菌A10201已于2020年6月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.61046。该菌株分离于茶卡盐湖湖水样品中，其发酵产物经试验证明有高效抑制马铃薯干腐病病原菌，具有作为生防菌制剂进行马铃薯干腐病防治的潜力和应用前景。

Description

一种地衣芽孢杆菌A10201及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种地衣芽孢杆菌A10201及其应用。

背景技术

马铃薯干腐病是马铃薯储藏期和生长期常见的病害，该病由一种或多种镰刀菌共同作用引起，导致贮藏期损失最高达60％。部分镰孢菌能产生毒素和其他类型的次生代谢产物，如镰孢菌素A和B、萎蔫酸、脱氢萎蔫酸、串珠菌素、赤霉素等。这些有害的次级代谢产物不仅危害人畜，还会严重地影响我国马铃薯产业的发展。目前，对马铃薯干腐病的防治主要运用化学药剂，但化学防治会造成环境污染、农药残留、干腐病病原菌抗药性等问题。因此，生物防治，特别是微生物源生防制剂的相关研究，目前备受国内外学者的关注。

嗜盐菌可在高盐极端条件下生存，其中，中度嗜盐菌的最适生长盐度为3％-15％。与轻度嗜盐菌和极端嗜盐菌相比，中度嗜盐菌环境适应能力更强，分布更广泛，营养需求更低，从而可以将其发展为生防制剂新材料。特殊的生长环境必定会使嗜盐菌产生特殊的次级代谢产物，也造就了嗜盐菌多样化的代谢产物结构和独特的生物活性功能。因此，近几年来，嗜盐菌一直是研究的热点，是有着广阔的应用前景的微生物类群。

发明内容

本发明从青海盐湖地区样品中分离纯化到大量的嗜盐菌菌株，并进行了相关农用活性的筛选。选取部分嗜盐菌菌株资源，进行抑制马铃薯窖藏病原菌活性的筛选及活性菌株的鉴定，并对其发酵液萃取物的抑菌活性进行研究，从中发现了具有抑制马铃薯窖藏病害新活性的嗜盐菌菌株，为进一步防治马铃薯窖藏病害提供新的生防制剂和生防菌剂，并为马铃薯干腐病的防治提供新的生防途径。

本发明具体通过以下技术方案实现：

本发明从茶卡盐湖湖水样品中分离得到菌株A10201，提取所述的菌株A10201的16S rDNA，扩增16S rDNA片段，测得的16S序列如SEQ ID NO.1所示。将所测得的16S序列提交至网址https://www.ezbiocloud.net/上与数据库中已知的16S rDNA序列进行比较，下载与菌株A10201的16S rDNA序列同源性大于95％的序列，构建***发育树，最终将菌株A10201鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus liche niformis)。

基于以上特征，本发明提供了一种地衣芽孢杆菌(Bacillus liche niformis)A10201，该菌株已进行保藏，保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期：2020年6月8日，保藏编号为GDMCC No.61046。

在本发明的另一方面，提供了所述的地衣芽孢杆菌A10201在防治马铃薯干腐病中的应用。

所述的马铃薯干腐病由病原菌镰刀菌引起。

优选的，所述的地衣芽孢杆菌A10201的发酵产物在防治马铃薯干腐病中的应用也在本发明的保护范围之内。

在本发明的另一方面，提供了所述的地衣芽孢杆菌A10201在制备防治马铃薯干腐病生物制剂中的应用。

优选的，所述的地衣芽孢杆菌A10201的发酵产物在制备防治马铃薯干腐病生物制剂中的应用也在本发明的保护范围之内。

所述的制剂通过常规的液体或固体培养，获得包括菌体的培养物，通过常规的液体发酵生产，然后加入表面活性剂如分散剂、稳定剂、湿润剂、粘结剂、消泡剂、崩解剂、抗冻剂等中的一种或几种，或吸附载体按一定比例混合后，制备成可湿性粉剂、水分散粒剂、悬浮剂、悬乳剂、水乳剂或微乳剂。

本发明的有益效果为：

本发明提供了一种地衣芽孢杆菌A10201，该菌株从茶卡盐湖湖水中分离获得，对马铃薯干腐病病原菌具有抑制活性，此外，菌株A10201发酵液提取物具有很好的耐盐性和稳定性，作为生物农药开发时可以适应不同的环境。经试验证明，菌株A10201发酵液提取物对镰刀菌引起的马铃薯干腐病具有较强的抑制活性，具有作为生防菌制剂进行马铃薯干腐病防治的潜力和应用前景。

附图说明

图1是本发明菌株A10201的培养性状及革兰氏染色特征；其中a为LB培养基；b为革兰氏染色；

图2是本发明菌株A10201基于16Sr DNA序列的***发育树。

具体实施方式

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1菌株A10201的分离

供试病原菌：马铃薯病原菌镰刀菌(青9A-4-13和青9A-5-10)分离自青薯9号病薯薯块，保存在-4℃冰箱。

供试中度嗜盐菌：从自茶卡盐湖湖水样品中分离纯化得到中度嗜盐菌菌株A10201，保存在-4℃冰箱。

供试培养基：

PDA培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂18g、蒸馏水1000mL，pH7.0。

LB培养基：牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、NaCl5g、蒸馏水1000mL。

将中度嗜盐菌A10201划线接种于LB培养基上，平板倒置放入37℃的培养箱中培养1d。

采用平板对峙法，4mm的打孔器在培养7d的病原真菌上打孔，将菌饼置于PDA培养基中央，同时，以十字划线法，在距离菌落边缘3cm处上下左右分别点接接种中度嗜盐菌菌株A10201，每个处理重复3次，于28℃的培养箱中培养7d，观察生长情况，计算抑制率。

抑制率＝(C-T)/C×100％

式中：T为处理组菌落直径(mm)；C为对照组菌落直径(mm)。

结果显示，菌株A10201对马铃薯干腐病病原菌表现出强抑制作用(表1)。A10201对青9A-4-13、青9A-5-10的抑制率为41.74％和50.93％，抑制效果显著。

表1中度嗜盐菌对马铃薯干腐病病原菌的抑制活性

实施例2菌株A10201的鉴定

1)生理生化特征

参照《常见细菌***鉴定手册》以及《伯杰氏细菌鉴定手册(第8版)》对菌株A10201进行柠檬酸盐试验、接触酶、葡萄糖氧化发酵、糖、醇类发酵、甲基红、V-P测定、硝酸盐还原、明胶液化等生理生化特征的鉴定。

如图1所示，在LB固体培养基平板上，A10201菌落呈乳白色，边缘不整齐，直径2～6mm，细胞呈杆状，能在20～41℃条件下生长,革兰氏染色成阳性菌。

A10201的生理生化特性结果显示，革兰氏染色、硝酸盐还原试验、过氧化氢酶试验、厌氧生长试验、接触酶试验、明胶液化试验、基甲醇试验、甲基红、淀粉水解试验呈阳性，柠檬酸盐、吲哚、溶菌酶试验呈阴性。能利用葡萄糖、果糖、蔗糖，不能利用乳糖(表2)。

表2 A10201的生理生化特性

2)分子生物学鉴定

活性菌株DNA提取根据上海生工生物工程(上海)股份有限公司的柱式细菌DNA提取试剂盒的程序操作。选择通用的细菌16S r DNA引物F27(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGG-3′)和P1541(5′-AAGGAGGTGGTGATCCAGCCGCA-3′)。

PCR扩增体系为：10×Buffer2.5μL，dNTP(10mol·L-1)2μL，模板DNA1μL，引物各1μL，TaqDNA聚合酶0.2μL，水补足至25μL。

PCR反应条件如下：94℃5min；变性94℃40s，退火55℃45s，延伸72℃80s，35个循环；72℃10min。

反应结束后，取5μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，回收产物送至上海生工生物工程公司测序。反应结束后，取5μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，回收产物送至上海生工生物工程公司测序。将得到的16S r DNA序列在网站https://www.ezbiocloud.net/上进行序列对比，用MEGA7.0软件，构建***发育树。

将菌株A10201测序得到的16S rDNA序列(SEQ ID NO.1)提交至网址https://www.ezbiocloud.net/上与数据库中已知的16S rDNA序列进行比较，并下载与菌株A10201的16S rDNA序列同源性大于95％的序列，使用Mega(7.0)软件，根据Neighbor-Joining方法构建***发育树(图2)。结合菌株A10201的形态特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析结果，最终将菌株A10201鉴定为地衣芽孢杆菌(B acillus licheniformis)。

基于以上特征，对地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)A10201进行了保藏，保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期：2020年6月8日，保藏编号为GDMCC No.61046。

实施例3菌株A10201的稳定性

将得到的活性菌株A10201与病原菌对峙培养7d和14d后，测量活性菌株的抑菌带宽度，且计算14d抑菌带宽度缩小率，确定活性菌株的稳定性。计算公式如下：

抑菌带宽度缩小率(％)＝(S7-S14)/S7×100％

式中：S7为7d抑菌带宽度值，S14为14d抑菌带宽度值。

菌株稳定评价标准：抑菌带宽度缩小率≥70％为不稳定，用“--”表示；50％≤抑菌带宽度缩小率F<70％为较不稳定，用“-”表示；20％≤抑菌带宽度缩小率<50％为较稳定，用“+”表示；抑菌带宽度缩小率<20％为稳定，用“++”表示。“*”表示无数据。

结果如表3所示，菌A10201不仅具有较高的抑制活性，抑制稳定性表现稳定，在第14天时抑菌带宽度缩小率为13.94％，表现出高的稳定性。

表3中度嗜盐菌对马铃薯病原真菌青9A-5-10抑制稳定性

实施例4菌株A10201发酵液萃取物抑菌作用

将活化好的菌株A10201接入装有800mLLB液体培养基的锥形瓶中，放置于摇瓶柜中，在37℃下，以180rpm/min的转速，振荡培养7d，收获发酵液。分别用正己烷、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇依次对发酵液进行等体积萃取，萃取液经减压浓缩，得到不同有机溶剂的萃取物。萃取物经DMSO(＜0.1％)预溶，用无菌水分别将不同萃取物配制成浓度100mg/ml的萃取物溶液，溶液经0.22μm微孔滤膜过滤后，备用。

采用生长速率法，将4种萃取物溶液加入冷却至50℃的培养基(121℃灭菌20min)，混合均匀后倒入培养皿中，使其终浓度为2、5、10mg/mL用直径6mm打孔器切下各病原真菌的菌饼，接种至P DA平板中，置于培养箱中37℃恒温培养7d，每个处理3个重复。计算抑制率，计算公式如下：

抑制率＝(C-T)/C×100％

式中：T为处理组菌落直径(mm)；C为对照组菌落直径(mm)。

通过生长速率法对发酵液萃取物的抑菌作用进行测定，结果如表4所示，菌株A10201的发酵液萃取物对指示病原菌均有抑制活性。随着发酵液萃取物浓度的升高，病原菌菌落半径逐渐减小，对病原菌抑菌率升高。其中，在10mg/mL浓度下，菌株A10201的乙酸乙酯、正己烷、氯仿、正丁醇萃取物对病原菌的抑菌率达71.10％、46.59％、71.60％、78.57％，结果均表明正丁醇萃取物的抑菌活性最高。

表4中度嗜盐菌发酵液萃取物对马铃薯病原菌青9A-5-10的抑制率

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 青海省农林科学院

<120> 一种地衣芽孢杆菌A10201及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1402

<212> DNA

<213> 地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)

<400> 1

aaaggttacc tcaccgactt cgggtgttac aaactctcgt ggtgtgacgg gcggtgtgta 60

caaggcccgg gaacgtattc accgcggcat gctgatccgc gattactagc gattccagct 120

tcacgcagtc gagttgcaga ctgcgatccg aactgagaac agatttgtgg gattggctta 180

gcctcgcggc ttcgctgccc tttgttctgc ccattgtagc acgtgtgtag cccaggtcat 240

aaggggcatg atgatttgac gtcatcccca ccttcctccg gtttgtcacc ggcagtcacc 300

ttagagtgcc caactgaatg ctggcaacta agatcaaggg ttgcgctcgt tgcgggactt 360

aacccaacat ctcacgacac gagctgacga caaccatgca ccacctgtca ctctgccccc 420

gaaggggaag ccctatctct agggttgtca gaggatgtca agacctggta aggttcttcg 480

cgttgcttcg aattaaacca catgctccac cgcttgtgcg ggcccccgtc aattcctttg 540

agtttcagtc ttgcgaccgt actccccagg cggagtgctt aatgcgtttg ctgcagcact 600

aaagggcgga aaccctctaa cacttagcac tcatcgttta cggcgtggac taccagggta 660

tctaatcctg ttcgctcccc acgctttcgc gcctcagcgt cagttacaga ccagagagtc 720

gccttcgcca ctggtgttcc tccacatctc tacgcatttc accgctacac gtggaattcc 780

actctcctct tctgcactca agttccccag tttccaatga ccctccccgg ttgagccggg 840

ggctttcaca tcagacttaa gaaaccgcct gcgcgcgctt tacgcccaat aattccggac 900

aacgcttgcc acctacgtat taccgcggct gctggcacgt agttagccgt ggctttctgg 960

ttaggtaccg tcaaggtgcc gccctattcg aacggtactt gttcttccct aacaacagag 1020

ttttacgatc cgaaaacctt catcactcac gcggcgttgc tccgtcagac tttcgtccat 1080

tgcggaagat tccctactgc tgcctcccgt aggagtctgg gccgtgtctc agtcccagtg 1140

tggccgatca ccctctcagg tcggctacgc atcgtcgcct tggtgagccg ttacctcacc 1200

aactagctaa tgcgccgcgg gtccatctgc aagtggtagc taaaagccac cttttatgat 1260

tgaaccatgc ggttcaatca agcatccggt attagccccg gtttcccgga gttatcccag 1320

tcttacaggc aggttaccca cgtgttactc acccgtccgc cgctgaccta agggagcaag 1380

ctcccgtcgg tccgctcgac tt 1402

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agagtttgat cctggctcag g 21

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaggaggtgg tgatccagcc gca 23

Claims (5)

1.一种地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)A10201，其特征在于，所述的地衣芽孢杆菌A10201已于2020年6月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo.61046。

2.权利要求1所述地衣芽孢杆菌A10201在防治镰刀菌引起的马铃薯干腐病中的应用。

3.权利要求1所述地衣芽孢杆菌A10201的发酵产物在防治镰刀菌引起马铃薯干腐病中的应用。

4.权利要求1所述地衣芽孢杆菌A10201在制备防治马铃薯干腐病生物制剂中的应用。

5.权利要求1所述地衣芽孢杆菌A10201的发酵产物在制备防治马铃薯干腐病生物制剂中的应用。

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