CN112639073A - 里氏木霉的突变株和使用该突变株的蛋白质的制造方法 - Google Patents

里氏木霉的突变株和使用该突变株的蛋白质的制造方法 Download PDF

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Abstract

本发明是包含序列号4～6的任一项所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损或降低了的里氏木霉(Trichoderma reesei)的突变株，以及通过用包含乳糖的培养基培养该突变株来高产蛋白质的方法。

Description

里氏木霉的突变株和使用该突变株的蛋白质的制造方法
技术领域
本发明涉及蛋白质制造能力提高的里氏木霉(Trichoderma reesei)突变株和使用该突变株的蛋白质的制造方法。
背景技术
已知里氏木霉(Trichoderma reesei)具有高的蛋白质制造能力，到目前为止已经进行了使用里氏木霉(Trichoderma reesei)的蛋白质的制造的研究。里氏木霉(Trichoderma reesei)在蛋白质之中特别是制造被分类为糖化酶的纤维素酶的能力优异，例如为了进一步提高纤维素酶制造量，进行了控制纤维素酶制造的因子的过表达、缺损、用于纤维素酶制造的培养条件的研究等。
非专利文献1中，在里氏木霉(Trichoderma reesei)的控制纤维素酶的制造的因子之中，通过使作为抑制纤维素酶的制造的转录因子的Cre1的功能降低，获得了具有高的纤维素酶制造能力的里氏木霉(Trichoderma reesei)的突变株。
另外，作为使里氏木霉(Trichoderma reesei)的纤维素酶的生产量提高的方法，非专利文献2中记载了用添加了葡萄糖、乳糖的培养基对里氏木霉(Trichoderma reesei)进行培养的方法。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:Juliano P，Single nucleotide polymorphism analysis of aTrichoderma reesei hyper-cellulolytic mutant developed in Japan，Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry，Volume 77，2013，Issue 3，P534-543
非专利文献2:Antonella A，Rugulation of cellulase and hemicellulasegene expression in fungi，Current genomics，Volume 14，2013，P230-249
发明内容
发明要解决的课题
如上所述，作为控制里氏木霉(Trichoderma reesei)的蛋白质制造的因子之一的转录因子已经被阐明，但考虑这不过是控制机制的一部分。因此本发明中，以探索控制里氏木霉(Trichoderma reesei)的蛋白质制造的新机制、获得蛋白质制造能力被进一步强化的里氏木霉(Trichoderma reesei)的突变株和提供使用该里氏木霉(Trichoderma reesei)的突变株的蛋白质的制造方法为课题。
用于解决课题的手段
本发明者考虑，如果能够特定到目前为止未知的能够增加蛋白质的生产量的基因，则能够进一步提高里氏木霉(Trichoderma reesei)的蛋白质的制造量，进而进行了深入研究，结果发现，通过培养选自包含序列号4、5、6的任一项所示的氨基酸序列的多肽中的1种以上多肽的功能缺损或降低了的里氏木霉(Trichoderma reesei)的突变株，能够提高蛋白质制造能力，从而完成了本发明。
即，本发明由以下(1)～(15)构成。
(1)里氏木霉(Trichoderma reesei)的突变株，具有包含序列号4～6的任一项所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损或降低的突变。
(2)根据(1)所述的突变株，所述突变是包含序列号4所示的氨基酸序列的多肽的HSF型DNA结合结构域缺损的突变。
(3)根据(2)所述的突变株，所述突变是伴随比HSF型DNA结合结构域更靠近N末端侧的区域中的突变而发生的移码突变。
(4)根据(3)所述的突变株，所述突变是由序列号4所示的氨基酸序列的从N末端侧起第30位的组氨酸残基突变成除组氨酸以外的氨基酸残基而产生的移码突变。
(5)根据(1)所述的突变株，所述突变是包含序列号5所示的氨基酸序列的多肽的TLD结构域缺损的突变。
(6)根据(5)所述的突变株，所述突变是伴随比TLD结构域更靠近N末端侧的区域中的突变而发生的移码突变。
(7)根据(6)所述的突变株，所述突变是由序列号5所示的氨基酸序列的从N末端侧起第3位的谷氨酰胺残基突变成除谷氨酰胺以外的氨基酸残基而产生的移码突变。
(8)根据(1)所述的突变株，所述突变是包含序列号6所示的氨基酸序列的多肽的F-box结构域区域的氨基酸序列的突变。
(9)根据(8)所述的突变株，所述突变是由伴随F-box结构域区域的氨基酸序列的突变而发生的移码突变从而产生的包含序列号6所示的氨基酸序列的多肽的缺损。
(10)根据(9)所述的突变株，所述突变是由序列号6所示的氨基酸序列中从N末端侧起第167位的丙氨酸残基突变成除丙氨酸以外的氨基酸残基而产生的移码突变。
(11)蛋白质的制造方法，包括：培养(1)～(10)的任一项所述的突变株的工序。
(12)蛋白质的制造方法，包括：用至少包含乳糖的培养基培养(1)～(10)的任一项所述的突变株的工序。
(13)纤维素酶的制造方法，包括：培养(1)～(10)的任一项所述的突变株的工序。
(14)纤维素酶的制造方法，包括：用至少包含乳糖的培养基培养(1)～(10)的任一项所述的突变株的工序。
(15)糖的制造方法，包括：通过(13)或(14)所述的纤维素酶的制造方法来制造纤维素酶的工序，和使用通过上述工序得到的纤维素酶对含纤维素的生物质进行糖化的工序。
发明的效果
包含序列号4～6的任一项所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损或降低了的里氏木霉(Trichoderma reesei)的突变株，与该突变导入前的亲本株相比，蛋白质的制造能力提高，能够高产蛋白质。进而，在所制造的蛋白质是纤维素酶的情况下，还得到纤维素酶的各种比活性也提高这样的预料外的效果。
具体实施方式
本发明以通过在作为本来蛋白质的制造能力优异的微生物的里氏木霉(Trichoderma reesei)的亲本株中导入突变而进一步提高蛋白质制造能力为特征。具体地，本发明涉及里氏木霉(Trichoderma reesei)的突变株，以具有包含序列号4～6的任一项所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损或降低的突变为特征。
本发明中使用的里氏木霉(Trichoderma reesei)的亲本株不限于野生株，以蛋白质制造能力提高的方式进行了改良的突变株也优选作为亲本株使用，例如，可以利用通过诱变剂、紫外线照射等施加了突变处理从而蛋白质的制造性提高了的突变株作为上述亲本株。作为上述亲本株使用的突变株的具体例，可列举作为属于里氏木霉(Trichodermareesei)的公知的突变株的QM6a株(NBRC31326)、QM9123株(ATCC24449)、QM9414株(NBRC31329)、PC-3-7株(ATCC66589)、QM9123株(NBRC31327)、RutC-30株(ATCC56765)、CL-847株(Enzyme.Microbiol.Technol.10，341-346(1988))、MCG77株(Biotechnol.Bioeng.Symp.8，89(1978))、MCG80株(Biotechnol.Bioeng.12，451-459(1982))等。此外，QM6a株、QM9414株、QM9123株可以从NBRC(NITE Biological ResourceCenter)获得，PC-3-7株、RutC-30株可以从ATCC(American Type Culture Collection)获得。
包含序列号4所示的氨基酸序列的多肽是里氏木霉(Trichoderma reesei)所具有的多肽，在National Center for Biotechnology Information(NCBI，美国国家生物信息中心)中，也作为里氏木霉(Trichoderma reesei)QM6a株所具有的预测蛋白(predictedprotein)，partial(不完全)(EGR45828)登记。包含序列号4所示的氨基酸序列的多肽是功能未知的多肽，但根据National Center for Biotechnology Information的CenservedDomain Architecture Retrieval Tool(保守结构域功能区检索工具)，公开了从N末端侧起第86～186位的氨基酸残基为heat shock factor(热激因子，HSF)型DNA结合结构域。已知HSF型DNA结合结构域具有与编码HSF的基因的上游区域结合的功能，所述HSF是控制热激蛋白的表达的转录因子(Cell，65(3)，363-366(1991))。作为编码包含序列号4所示的氨基酸序列的多肽的基因的具体例，可列举序列号1所示的碱基序列。
作为使包含序列号4所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损或降低的方法，可列举HSF型DNA结合结构域的全部缺损、HSF型DNA结合结构域的一部分缺损、导入使包含序列号4所示的氨基酸序列的多肽全部缺损那样的突变的方法，具体地，可列举对编码包含序列号4所示的氨基酸序列的多肽的基因序列，通过碱基的缺失、***、替换等而导入移码突变、终止密码子突变的方法。
HSF型DNA结合结构域的缺损是指该结构域全部消失、一部分消失、全部变成不同的氨基酸、一部分变成不同的氨基酸、或这些的组合。更具体地是指在序列号4所示的氨基酸序列中，与上述所示的HSF型DNA结合结构域的氨基酸序列的序列同一性为80％以下，优选为50％以下，进一步优选为20％以下，进一步优选为10％以下，进一步优选为5％以下，进一步优选为3％以下，进一步优选为1％以下，最优选为0％。
作为通过位于HSF型DNA结合结构域内的氨基酸序列发生缺失、替换、或添加等突变从而包含序列号4所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损或降低的具体例，可列举序列号4所示的氨基酸序列中相当于HSF型DNA结合结构域的从N末端侧起第86～186位的区域的一部分或全部缺损那样的突变。作为这样的突变的具体例，可列举在序列号1所示的碱基序列中在第85位***1碱基鸟嘌呤的引起移码的突变，通过该突变，序列号4所示的氨基酸序列的从N末端侧起第30位的氨基酸残基从组氨酸变为苏氨酸，以后移码的结果是翻译在从N末端侧起第90位的氨基酸残基终止，构成HSF型DNA结合结构域的氨基酸序列消失。
包含序列号5所示的氨基酸序列的多肽是里氏木霉(Trichoderma reesei)所具有的多肽，在National Center for Biotechnology Information(NCBI，美国国家生物信息中心)中，也作为里氏木霉(Trichoderma reesei)QM6a株所具有的预测蛋白(predictedprotein)(EGR47155)登记。包含序列号5所示的氨基酸序列的多肽是功能未知的多肽，但根据National Center for Biotechnology Information的Censerved DomainArchitecture Retrieval Tool(保守结构域功能区检索工具)，公开了从N末端侧起第362～553位的氨基酸残基为TLD结构域。TLD结构域是功能未知的。作为编码包含序列号5所示的氨基酸序列的多肽的基因的具体例，可列举序列号2所示的碱基序列。
作为使包含序列号5所示的氨基酸序列的多肽的功能降低的方法，可列举TLD结构域的全部缺损、TLD结构域的一部分缺损、导入使包含序列号5所示的氨基酸序列的多肽全部缺损那样的突变的方法，具体地，可列举对编码包含序列号5所示的氨基酸序列的多肽的基因序列，通过碱基的缺失、***、替换等而导入移码突变、终止密码子突变的方法。
TLD结构域的缺损是指该结构域全部消失、一部分消失、全部变成不同的氨基酸、一部分变成不同的氨基酸、或这些的组合。更具体地是指在序列号5所示的氨基酸序列中，与上述所示的TLD结构域的氨基酸序列的序列同一性为80％以下，优选为50％以下，进一步优选为20％以下，进一步优选为10％以下，进一步优选为5％以下，进一步优选为3％以下，进一步优选为1％以下，最优选为0％。
作为位于TLD结构域内的氨基酸序列发生缺失、替换、或添加等突变从而包含序列号5所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损的具体例，可列举序列号5所示的氨基酸序列中相当于TLD结构域的从N末端侧起第362～553位的区域一部分或全部缺损那样的突变。作为这样的突变的具体例，可列举在序列号2所示的碱基序列中在第6位***序列号27所示的46碱基的移码突变。通过该突变，序列号5所示的氨基酸序列的从N末端侧起第3位的谷氨酰胺残基变成精氨酸，翻译在该位置终止，构成TLD结构域的氨基酸序列消失。
包含序列号6所示的氨基酸序列的多肽是里氏木霉(Trichoderma reesei)所具有的多肽，在National Center for Biotechnology Information(NCBI，美国国家生物信息中心)中，也作为里氏木霉(Trichoderma reesei)QM6a株所具有的预测蛋白(predictedprotein)(EGR48056)登记。包含序列号6所示的氨基酸序列的多肽是功能未知的多肽，但根据National Center for Biotechnology Information的Censerved DomainArchitecture Retrieval Tool(保守结构域功能区检索工具)，公开了从N末端侧起第130～172位的氨基酸残基为F-box结构域。已知F-box结构域是在控制细胞周期的蛋白质内发现的结构域(Proc.Natl.Acad.Sci.，95，2417-2422(1998))。作为编码包含序列号6所示的氨基酸序列的多肽的基因的具体例，可列举序列号3所示的碱基序列。
作为使包含序列号6所示的氨基酸序列的多肽的功能降低的方法，可列举F-box结构域的全部缺损、F-box结构域的一部分缺损、导入使包含序列号6所示的氨基酸序列的多肽全部缺损那样的突变的方法，具体地，可列举对编码包含序列号6所示的氨基酸序列的多肽的基因序列，通过碱基的缺失、***、替换等而导入移码突变、终止密码子突变的方法。
F-box结构域的缺损是指该结构域全部消失、一部分消失、全部变成不同的氨基酸、一部分变成不同的氨基酸、或这些的组合。更具体地是指在序列号6所示的氨基酸序列中，与上述所示的F-box结构域的氨基酸序列的序列同一性为80％以下，优选为50％以下，进一步优选为20％以下，进一步优选为10％以下，进一步优选为5％以下，进一步优选为3％以下，进一步优选为1％以下，最优选为0％。
作为位于F-box结构域内的氨基酸序列发生缺失、替换、或添加等突变从而包含序列号6所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损的具体例，可列举在序列号3所示的碱基序列中，第499位的胞嘧啶单碱基缺损的移码突变。通过该突变，序列号6所示的氨基酸序列的从N末端侧起第167位的氨基酸残基从丙氨酸变成精氨酸，以后移码的结果是翻译在从N末端侧起第193位终止，因而构成F-box结构域的氨基酸序列消失。
此外，通过导入使包含序列号4～6的任一项所示的氨基酸序列的多肽的表达量降低、或使表达消失的突变，也可以使该多肽的功能降低，具体地，可以是如下引起的：由编码序列号4～6的任一项所示的氨基酸序列的基因的启动子、终止子区域的突变产生的多肽的表达量的降低或消失。一般地，启动子和终止子区域相当于参与转录的基因的前后数百碱基的区域。
向上述基因的突变导入可以使用对于本领域技术人员来说公知的利用诱变剂或紫外线照射等的突变处理、使用选择标志物的同源重组等基因重组、或者利用转座子的突变等现有的基因突变方法。
本发明的突变株只要包含序列号4～6氨基酸序列的多肽中的至少1种以上多肽的功能缺损或降低即可，但也可以这些多肽的2种以上或全部的功能缺损或降低。功能缺损或降低了的多肽的组合不特别限定，包含序列号4和5所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损或降低了的里氏木霉(Trichoderma reesei)的突变株、包含序列号4和6所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损或降低了的里氏木霉(Trichoderma reesei)的突变株、包含序列号5和6所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损或降低了的里氏木霉(Trichoderma reesei)的突变株均包含在本发明的突变株中。
另外，本发明的突变株也可以是包含序列号4～6所示的氨基酸序列的全部3种多肽的功能缺损或降低了的突变株。包含序列号4～6所示的氨基酸序列的全部多肽的功能缺损或降低了的突变株，可以通过对成为亲本株的里氏木霉(Trichoderma reesei)的孢子，使用亚硝基胍(NTG)、甲基磺酸乙酯(EMS)、紫外线等进行基因突变处理，对所得的突变株的基因进行分析，筛选具有上述突变的突变株来获得。
本发明的突变株与该突变导入前的亲本株相比，蛋白质的制造能力提高，因而本发明的突变株的培养液与通过同一培养条件得到的该突变导入前的亲本株的培养液相比，蛋白浓度增加。另外，在蛋白质是酶的情况下，酶的比活性增加。这里，蛋白质浓度的增加率、酶的比活性的增加率只要增加就不特别限定，优选为20％以上。
本发明的突变株除了包含序列号4～6的氨基酸序列的多肽的功能缺损或降低的突变以外，还可以具有蛋白质制造量的提高和/或培养液的粘度降低、培养液中的溶解氧饱和度的降低被抑制的突变。具体地，可列举序列号7、9、11的任一项所示的多肽的功能降低的基因突变。
包含序列号7所示的氨基酸序列的多肽是里氏木霉(Trichoderma reesei)所具有的多肽，在National Center for Biotechnology Information(NCBI，美国国家生物信息中心)中，也作为里氏木霉(Trichoderma reesei)QM6a株所具有的预测蛋白(predictedprotein)的EGR50654登记。包含序列号7所示的氨基酸序列的多肽是功能未知的多肽，但根据National Center for Biotechnology Information的Censerved DomainArchitecture Retrieval Tool(保守结构域功能区检索工具)，公开了从N末端侧起第95位～第277位的氨基酸残基具有“Middle domain of eukaryotic initiation factor 4G结构域(真核起始因子4G的中间结构域)”(以后记载为MIF4G结构域)，从N末端侧起第380位～第485位的氨基酸残基具有MA-3结构域。已知MIF4G和MA-3这两个结构域具有与DNA或RNA结合的功能(Biochem.44,12265-12272(2005)，Mol.Cell.Biol.1,147-156(2007))。根据这些记载推定包含序列号7所示的氨基酸序列的多肽至少具有与DNA和/或RNA结合的功能。
作为编码包含序列号7所示的氨基酸序列的多肽的基因的具体例，可列举序列号8所示的碱基序列。作为EGR50654的功能降低的基因突变，可列举EGR50654所具有的MIF4G结构域和/或MA-3结构域的全部缺损、MIF4G结构域和/或MA-3结构域的一部分缺损、MIF4G结构域与MA-3结构域的立体构型关系变化的基因突变。进而，通过导入使包含序列号7所示的氨基酸序列的多肽的表达量降低、消失的突变也能够使该多肽的功能降低。作为包含序列号7所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损的具体例，可列举在序列号8所示的碱基序列中第1039位至第1044位的任一碱基缺失的突变。
包含序列号9所示的氨基酸序列的多肽是里氏木霉(Trichoderma reesei)所具有的多肽，在National Center for Biotechnology Information(NCBI，美国国家生物信息中心)中，也作为里氏木霉(Trichoderma reesei)QM6a株所具有的预测蛋白(predictedprotein)EGR44419登记。包含序列号9所示的氨基酸序列的多肽是功能未知的多肽，但根据National Center for Biotechnology Information的Censerved Domain ArchitectureRetrieval Tool(保守结构域功能区检索工具)，公开了从N末端侧起第26～499位的氨基酸残基具有糖(及其他)转运蛋白结构域。由该记载推定包含序列号9所示的氨基酸序列的多肽至少参与菌体的内侧与外侧之间的糖的运输。
作为编码包含序列号9所示的氨基酸序列的多肽的基因的具体例，可列举序列号10所示的碱基序列。作为EGR44419的功能降低的基因突变，可列举EGR44419所具有的糖(及其他)转运蛋白结构域的全部缺损、糖(及其他)转运蛋白结构域的一部分缺损、糖(及其他)转运蛋白结构域的构型关系变化的基因突变。进而，通过导入使包含序列号9所示的氨基酸序列的多肽的表达量降低、消失的突变也能够使该多肽的功能降低。作为包含序列号9所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损的具体例，可列举在序列号10所示的碱基序列中第1415位***11个碱基的突变。
包含序列号11所示的氨基酸序列的多肽是里氏木霉(Trichoderma reesei)所具有的多肽，在National Center for Biotechnology Information(NCBI，美国国家生物信息中心)中，也作为里氏木霉(Trichoderma reesei)QM6a株所具有的β-衔接蛋白大亚基的EGR48910登记。包含序列号11所示的氨基酸序列的多肽是构成衔接体蛋白质的蛋白质之一，该衔接体蛋白质在真核生物中广泛保守，构成与网格蛋白结合的参与细胞内外、菌体内外的运输的囊泡(Proc.Nati.Acad.Sci.USA.101,14108-14113(2004))。
作为编码包含序列号11所示的氨基酸序列的多肽的基因的具体例，可列举序列号12所示的碱基序列。作为EGR48910的基因突变，可列举在序列号12所示的碱基序列中作为第1080位的碱基的胞嘧啶向腺嘌呤的突变。
另外，本发明涉及包括培养所述突变株的工序的蛋白质的制造方法。
在本发明的蛋白质的制造方法中，通过将所述突变株用包含诱导剂的培养基培养，从而蛋白质的生产能力进一步提高。特别是作为提高纤维素酶的生产性的诱导剂，可列举乳糖、葡萄糖、纤维素、纤维二糖、木聚糖等。其中，优选乳糖和/或葡萄糖，特别优选乳糖。
在培养基中添加诱导剂的情况下，可以在培养开始时、培养中途等任意时机添加，但特别是在添加乳糖、葡萄糖作为诱导剂的情况下，通过在培养中途添加，能够在培养中使蛋白质生产能力的提高效果持续，因而优选。乳糖的添加量优选每1天相对于培养液1L为1g～50g左右，更优选3～25g左右，特别优选6～20g左右。另外，葡萄糖添加量优选每1天相对于培养液1L为1～200g左右，更优选5～100g左右，特别优选20～80g左右。
在添加纤维素、纤维二糖或木聚糖作为诱导剂的情况下，也可以添加包含它们的生物质作为诱导物质。作为生物质的具体例，可以使用种子植物、蕨类植物、苔藓植物、藻类、水草等植物、以及废建材等。种子植物分类为裸子植物和被子植物，任一种都优选使用。被子植物进一步分类为单子叶植物和双子叶植物，作为单子叶植物的具体例，可列举甘蔗渣、柳枝稷、象草、蔗茅、玉米秸(玉米的茎叶)、玉米棒(玉米的芯)、稻秸、麦秸等，作为双子叶植物的具体例，优选使用甜菜浆、桉树、栎树、白桦等。
在使用所述生物质作为诱导剂的情况下，可以使用进行了前处理的。前处理方法不特别限定，可以使用例如，酸处理、硫酸处理、稀硫酸处理、碱处理、水热处理、亚临界处理、微粉碎处理、蒸煮处理等公知的手法。作为进行了这样的前处理的包含纤维素、木聚糖的生物质，可以使用浆。
本发明的里氏木霉(Trichoderma reesei)的突变株的培养工序中使用的培养基的组成，只要是里氏木霉(Trichoderma reesei)能够制造蛋白质那样的培养基组成就不特别限制，可以采用木霉属丝状菌的公知的培养基组成。作为氮源，可使用例如，多聚胨、肉汁、CSL、大豆粕等。此外，该培养基中可以添加用于制造蛋白质的上述诱导物质。
培养方法不特别限定，可以通过例如使用离心管、烧瓶、缸式发酵槽、罐等的液体培养、使用平板等的固体培养等进行培养。里氏木霉(Trichoderma reesei)优选在需氧条件下培养，在这些培养方法中，特别优选在缸式发酵槽、罐内一边进行通气、搅拌一边培养的深层培养。通气量优选为0.1～2.0vvm左右，更优选为0.3～1.5vvm，特别优选为0.5～1.0vvm。培养温度优选为25～35℃左右，更优选为25～31℃。培养中的pH条件优选为pH3.0～7.0，更优选为pH4.0～6.0。培养时间进行到在能生产蛋白质的条件下能回收的量的蛋白质积累。通常为24～288小时、优选为24～240小时、更优选为36～240小时、进一步优选为36～192小时。
本发明中制造的蛋白质不特别限制，能够有效地制造分泌到菌体外的蛋白质，其中优选为酶，更优选为纤维素酶、淀粉酶、转化酶、几丁质酶、果胶酶等糖化酶，进一步优选为纤维素酶。
本发明中制造的纤维素酶包含各种水解酶，包含具有对木聚糖、纤维素、半纤维素的分解活性的酶等。作为具体例，可列举通过水解纤维素链来制造纤维二糖的纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)、从纤维素链的中央部分开始水解的内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)、水解纤维寡糖和纤维二糖的β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)、以作用于半纤维素、特别是木聚糖为特征的木聚糖酶(EC 3.2.1.8)、水解木寡糖的β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)等。
本发明的里氏木霉(Trichoderma reesei)突变株与亲本株相比蛋白质的制造能力提高、纤维素酶的比活性提高可以如下确认：对将突变株和亲本株在相同条件下培养而得的培养液，将通过以下方法测定的蛋白质浓度、选自β-葡糖苷酶比活性、β-木糖苷酶比活性和纤维二糖水解酶比活性中的任意1种以上比活性进行比较，从而确认。
关于蛋白质浓度，在将突变株和亲本株的培养液以15,000×g离心分离10分钟而得的上清中添加在Quick Start Bradford蛋白测定试剂盒(Bio-Rad社制)250μL中稀释后的纤维素酶溶液5μL，测定室温静置15分钟后在595nm使用的吸光度。以牛血清白蛋白溶液作为标准液，基于标准曲线计算糖化酶溶液所包含的蛋白质浓度。
关于β-葡糖苷酶比活性，对所述培养液上清，首先，在含有1mM的对硝基苯基-β-吡喃葡萄糖苷(シグマアルドリッチジャパン社制)的50mM醋酸缓冲液90μL中添加酶稀释液10μL，在30℃使其反应10分钟，接着加入2M碳酸钠10μL充分混合使反应停止，测定405nm的吸光度的增加。最后以每1分钟游离1μmol的对硝基苯酚的活性作为1U，计算出比活性。
关于，β-木糖苷酶比活性，对所述培养液上清，首先，在含有1mM的对硝基苯基-β-吡喃木糖苷(シグマアルドリッチジャパン社制)的50mM醋酸缓冲液90μL中添加酶稀释液10μL，在30℃使其反应30分钟，接着，加入2M碳酸钠10μL充分混合使反应停止，测定405nm的吸光度的增加。最后以每1分钟游离1μmol的对硝基苯酚的活性作为1U，从而计算出比活性。
关于纤维二糖水解酶比活性，对所述培养液上清，首先，在含有1mM的对硝基苯基-β-吡喃乳糖苷(シグマアルドリッチジャパン社制)的50mM醋酸缓冲液90μL中添加酶稀释液10μL，在30℃使其反应60分钟，接着，加入2M碳酸钠10μL充分混合使反应停止，测定405nm的吸光度的增加。最后，以每1分钟游离1μmol的对硝基苯酚的活性作为1U，从而计算出比活性。
对培养所述突变株而得的培养液所包含的蛋白质进行回收的方法不特别限定，可以从培养液中除去所述突变株的菌体，回收蛋白质。作为菌体的除去方法，可列举离心分离法、膜分离法、压滤法等为例。
另外，在不从培养所述突变株而得的培养液除去菌体而制成蛋白质的溶解液利用的情况下，优选进行处理使得所述突变株在培养液中不能生长。作为进行处理使得菌体不能生长的方法，可列举热处理、药剂处理、酸/碱处理、UV处理等。
在蛋白质是酶的情况下，可以将如上所述除去菌体或进行处理使得菌体不生长而得的培养液直接作为酶液利用。
另外，在作为制造对象的蛋白质是纤维素酶的情况下，可以使用该纤维素酶使含纤维素的生物质糖化，从而制造糖。另外，培养所述突变株而得的纤维素酶，与培养所述突变导入前的亲本株而得的纤维素酶相比，特别是β-葡糖苷酶的比活性高，因而能够有效地分解含纤维素的生物质而获得葡萄糖浓度的高的糖液，能够获得更多的糖。
本发明中使用的含纤维素的生物质可以使用与作为上述诱导剂记载的包含纤维素的生物质同样的生物质、经前处理的生物质。
糖化反应的条件不特别限定，但糖化反应的温度优选为25～60℃的范围，特别更优选为30～55℃的范围。糖化反应的时间优选为2～200小时的范围。糖化反应的pH优选为pH3.0～7.0的范围，进一步优选pH4.0～6.0的范围，在木霉属来源的纤维素酶的情况下，其反应最适pH为5.0。进而，由于在水解的过程中发生pH的变化，因此优选在反应液中添加缓冲液，或者使用酸、碱一边保持一定pH一边实施。
在从糖化液分离回收酶的情况下，可以将糖化液用超滤膜等过滤，在非透过侧回收。根据需要作为过滤的前工序，也可以预先从糖化液中除去固体成分。回收的酶可以再次用于糖化反应。
实施例
以下列举实施例具体说明本发明。
＜参考例1＞蛋白质浓度测定条件
使用的蛋白质浓度测定试剂：Quick Start Bradford蛋白测定试剂盒(Bio-Rad制)
测定条件
测定温度：室温
蛋白质浓度测定试剂：250μL
丝状菌的培养液：5μL
反应时间：5分钟
吸光度：595nm
标准品：BSA。
＜参考例2＞纤维素酶的比活性的测定条件
(β-葡糖苷酶比活性的测定条件)
底物：对硝基苯基-β-吡喃葡萄糖苷(シグマアルドリッチジャパン社制)
反应液：含有1mM的对硝基苯基-β-吡喃葡萄糖苷的50mM乙酸缓冲液90μL
酶稀释液：10μL
反应温度：30℃
反应时间：10分钟
反应停止剂：2M碳酸钠10μL
吸光度：405nm。
(β-木糖苷酶比活性的测定条件)
底物：对硝基苯基-β-吡喃木糖苷(シグマアルドリッチジャパン社制)
反应液：含有1mM的对硝基苯基-β-吡喃木糖苷的50mM乙酸缓冲液90μL
酶稀释液：10μL
反应温度：30℃
反应时间：10分钟
反应停止剂：2M碳酸钠10μL
吸光度：405nm。
(纤维二糖水解酶比活性的测定条件)
底物：对硝基苯基-β-吡喃乳糖苷(シグマアルドリッチジャパン社制)
反应液：含有1mM的对硝基苯基-β-吡喃乳糖苷的50mM乙酸缓冲液90μL
酶稀释液：10μL
反应温度：30℃
反应时间：10分钟
反应停止剂：2M碳酸钠10μL
吸光度：405nm。
＜参考例3＞含纤维素的生物质的糖化试验
作为含纤维素的生物质，使用Arbocel(注册商标)B800(レッテンマイヤー社制)或粉末化成平均粒径100μm的甘蔗渣。作为酶液，采集里氏木霉(Trichoderma reesei)的突变导入前的亲本株或突变株的培养液1ml进行离心分离，回收除去菌体后的上清，进而用0.22μm的过滤器进行过滤，使用过滤而得的滤液。
(糖化反应)
作为糖化反应的缓冲液添加1M醋酸钠缓冲液100μL，作为杂菌的繁殖防止添加50g/L红霉素溶液2μL，作为糖化对象物分别使用Arbocel(注册商标)B800(レッテンマイヤー株式会社制)或粉末化成平均粒径100μm的甘蔗渣0.1g。另外，作为酶液，分别将使用ArbocelI(注册商标)B800的烧瓶培养中得到的酶液添加150μL，通过使用乳糖的烧瓶培养而得的酶液添加300μL，通过5L缸式发酵槽培养而得的酶液以蛋白质浓度0.8mg添加，用灭菌水定容至共计1mL，然后装入2mL管。在50℃的温度条件进行24小时糖化反应，回收将糖化物离心分离后的上清作为糖化液，添加回收的糖化液的10分之1量的1N NaOH溶液，使酶反应停止。用下述所示的UPLC测定反应停止后的糖化液中的葡萄糖浓度。
(葡萄糖浓度的测定)
关于葡萄糖，使用ACQUITY UPLC***(Waters)，在以下条件下进行定量分析。以用葡萄糖的标准品制作的标准曲线为基础，进行定量分析。
柱：AQUITY UPLC BEH Amide1.7μm 2.1×100mm Column
分离法：HILIC
移动相：制成移动相A：80％乙腈、0.2％TEA水溶液，移动相B：30％乙腈、0.2％TEA水溶液，按照下述梯度。梯度制成达到与下述时间对应的混合比的线性梯度。
开始条件：(A99.90％、B0.10％)、开始2分钟后：(A96.70％、B3.30％)、开始3.5分钟后：(A95.00％、B5.00％)、开始3.55分钟后：(A99.90％、B0.10％)、开始6分钟后：(A99.90％、B0.10％)。
检测方法：ELSD(蒸发光散射检测器)
流速：0.3mL/min
温度：55℃。
＜实施例1＞包含序列号4所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损了的里氏木霉(Trichoderma reesei)的突变株的制作
(突变株的制作方法)
包含序列号4所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损了的里氏木霉(Trichodermareesei)的突变株，以乙酰胺作为选择标志物，通过将编码包含序列号4所示的氨基酸序列的多肽的序列号1所示的基因，置换成作为选择标志物基因能够分解乙酰胺的乙酰胺酶(AmdS)基因(amdS)，从而将其破坏。为了使包含序列号4所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损，制作包含序列号13所示的基因序列的DNA片段，将该DNA片段转化到里氏木霉(Trichoderma reesei)ATCC66589株中，制作包含序列号4所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损了的里氏木霉(Trichoderma reesei)的突变株。通过该方法，得到序列号1所示的碱基序列缺损了的里氏木霉(Trichoderma reesei)的突变株。为了在包含amdS的DNA序列的上游和下游导入包含上述序列号1所示的碱基序列的DNA片段，以添加与里氏木霉(Trichoderma reesei)QM9414株的基因序列同源的部分的方式制作突变导入用质粒。
具体地，使用从里氏木霉(Trichoderma reesei)QM9414株按照常规方法提取出的基因组DNA、和序列号14和15所示的寡聚DNA进行PCR，以将所得的扩增片段用限制性酶AflII与NotI处理而得的DNA片段作为上游DNA片段。另外，使用序列号16和17所示的寡聚DNA进行PCR，以将所得的扩增片段用限制性酶MluI与SpeI处理而得的DNA片段作为下游DNA片段。然后，将上游和下游DNA片段分别使用AflII与NotI、MluI与SpeI的限制性酶导入到***有amdS的质粒中，构建突变导入用质粒。然后，将突变导入用质粒用限制性酶AflII与SpeI处理，用序列号13所示的所得的DNA片段转化里氏木霉(Trichoderma reesei)ATCC66589株。分子生物学的手法如Molecular cloning，laboratory manual，1st，2nd，3rd(1989)记载的那样进行。另外，转化使用作为标准手法的原生质体-PEG法，具体如Gene，61，165-176(1987)所记载的那样进行。
(突变株的制作·评价)
将按照前述方法获得的里氏木霉(Trichoderma reesei)的突变株作为里氏木霉(Trichoderma reesei)突变株I，用于以下的蛋白质制造试验以及蛋白质浓度和纤维素酶比活性测定的实验。
＜实施例2＞包含序列号5所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损了的里氏木霉(Trichoderma reesei)的突变株的制作
(突变株的制作方法)
包含序列号5所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损了的里氏木霉(Trichodermareesei)的突变株，以乙酰胺作为选择标志物，通过将编码包含序列号5所示的氨基酸序列的多肽的序列号2所示的基因，置换成作为选择标志物基因能够分解乙酰胺的乙酰胺酶(AmdS)基因(amdS)，从而将其破坏。为了使包含序列号5所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损，制作包含序列号18所示的基因序列的DNA片段，将该DNA片段转化到里氏木霉(Trichoderma reesei)ATCC66589株中，制作包含序列号5所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损了的里氏木霉(Trichoderma reesei)的突变株。通过该方法，得到序列号2所示的碱基序列缺损了的里氏木霉(Trichoderma reesei)的突变株。为了在包含amdS的DNA序列的上游和下游导入包含上述序列号2所示的碱基序列的DNA片段，以添加与里氏木霉(Trichoderma reesei)QM9414株的基因序列同源的部分的方式制作突变导入用质粒。
具体地，以将序列号19所示的合成的DNA片段用限制性酶AflII与NotI处理而得的DNA片段作为上游DNA片段。另外，使用从里氏木霉(Trichoderma reesei)QM9414株按照常规方法提取出的基因组DNA、和序列号20和21所示的寡聚DNA进行PCR，以将所得的扩增片段用限制性酶MluI与SpeI处理而得的DNA片段作为下游DNA片段。然后，将上游和下游DNA片段分别使用AflII与NotI、MluI与SpeI的限制性酶导入到***有amdS的质粒中，构建突变导入用质粒。然后，将突变导入用质粒用限制性酶AflII与SpeI处理，用序列号18所示的所得的DNA片段转化里氏木霉(Trichoderma reesei)ATCC66589株。分子生物学的手法如Molecular cloning，laboratory manual，1st，2nd，3rd(1989)记载的那样进行。另外，转化使用作为标准手法的原生质体-PEG法，具体如Gene，61，165-176(1987)所记载的那样进行。
(突变株的制作·评价)
将通过前述方法获得的里氏木霉(Trichoderma reesei)的突变株作为里氏木霉(Trichoderma reesei)突变株II，用于以下的蛋白质制造试验以及蛋白质浓度和纤维素酶比活性测定的实验。
＜实施例3＞包含序列号6所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损了的里氏木霉(Trichoderma reesei)的突变株的制作
(突变株的制作方法)
包含序列号6所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损了的里氏木霉(Trichodermareesei)的突变株，以乙酰胺作为选择标志物，通过将编码包含序列号6所示的氨基酸序列的多肽的序列号3所示基因，置换成作为选择标志物基因能够分解乙酰胺的乙酰胺酶(AmdS)基因(amdS)，从而将其破坏。为了使包含序列号6所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损，制作包含序列号22所示的基因序列的DNA片段，将该DNA片段转化到里氏木霉(Trichoderma reesei)ATCC66589株中，制作包含序列号6所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损了的里氏木霉(Trichoderma reesei)的突变株。通过该方法，得到序列号3所示的碱基序列缺损了的里氏木霉(Trichoderma reesei)的突变株。为了在包含amdS的DNA序列的上游和下游导入包含上述序列号3所示的碱基序列的DNA片段，以添加与里氏木霉(Trichoderma reesei)QM9414株的基因序列同源的部分的方式制作突变导入用质粒。
具体地，使用从里氏木霉(Trichoderma reesei)QM9414株按照常规方法提取出的基因组DNA、和序列号23和24所示的寡聚DNA进行PCR，以将所得的扩增片段用限制性酶AflII与NotI处理而得的DNA片段作为上游DNA片段。另外，使用序列号25和26所示的寡聚DNA进行PCR，以将所得的扩增片段用限制性酶MluI与XhoI处理而得的DNA片段作为下游DNA片段。然后，将上游和下游DNA片段分别使用AflII与NotI、MluI与XhoI的限制性酶导入到***有amdS的质粒中，构建突变导入用质粒。然后，将突变导入用质粒用限制性酶AflII与SpeI处理，用序列号22所示的所得的DNA片段转化里氏木霉(Trichoderma reesei)ATCC66589株。分子生物学的手法如Molecular cloning，laboratory manual，1st，2nd，3rd(1989)记载的那样进行。另外，转化使用作为标准手法的原生质体-PEG法，具体如Gene，61，165-176(1987)所记载的那样进行。
(突变株的制作·评价)
将按照前述方法获得的里氏木霉(Trichoderma reesei)的突变株作为里氏木霉(Trichoderma reesei)突变株III，用于以下的蛋白质制造试验以及蛋白质浓度和纤维素酶比活性测定的实验。
＜实施例4＞使用里氏木霉(Trichoderma reesei)突变株的蛋白质的制造试验
(预培养)
将实施例1～3中制作的里氏木霉(Trichoderma reesei)的突变株的孢子分别用生理盐水稀释为1.0×107/mL，将该稀释孢子溶液2.5mL接种到表1所示的加入到1L带挡板的烧瓶中的250mL的预培养基中，利用振荡培养机以28℃、120rpm的条件进行72小时培养。作为对照，使用里氏木霉(Trichoderma reesei)ATCC66589株，进行以下同样的实验操作。
表1
Figure BDA0002948227360000211
*5×マルデルス溶液为以下组成
7g/L(NH4)2SO4
10g/L KH2PO4
2g/L CaCl2·2H2O
1.5g/L MgSO4·7H2O
**10×酒石酸铵溶液包含92g/L酒石酸铵
***微量元素溶液为以下组成
0.3g/L H3BO3
1.3g/L(NH4)6Mo7O24·4H2O
5g/L FeCl3·6H2O
2g/L CuSO4·5H2O
0.4g/L MnCl2·4H2O
10g/L ZnCl2
(主培养)
将ArbocelI(注册商标)B800添加到表2所示的主培养培养基中，使用5L缸式发酵槽(バイオット社)进行深层培养研究。
将里氏木霉(Trichoderma reesei)ATCC66589株和实施例1、2、3中制作的里氏木霉(Trichoderma reesei)突变株的预培养液200mL接种到添加有ArbocelI(注册商标)B800的主培养培养基2L中。
培养条件是，在主培养培养基中接种预培养培养基后，以28℃、700rpm、通气量100mL/min的培养条件一边控制pH5.0一边进行深层培养。
表2
Figure BDA0002948227360000221
*与表1相同。
***与表1相同。
(主培养中途的液糖的添加)
在主培养开始第40小时，将表3所示的液糖培养基每1天各向主培养液持续添加250mL。
表3
Figure BDA0002948227360000222
(培养液的采集)
对于实施例1～3中制作的里氏木霉(Trichoderma reesei)的突变株的主培养液，从培养开始起经时地在各时刻采集20mL的培养液。将采集的培养液的一部分在15000×g、4℃的条件下进行10分钟离心分离，获得上清。将该上清用0.22μm的过滤器过滤，以其滤液作为纤维素酶溶液而在以下实验中使用。
(蛋白质浓度的测定)
对于经时地采集的实施例1～3的培养液的蛋白质浓度，用参考例1的条件进行测定。其结果是，与里氏木霉(Trichoderma reesei)ATCC66589株相比，实施例1～3中制作的里氏木霉(Trichoderma reesei)的突变株以相对值而培养液中的蛋白质浓度变高。
(酶活性的测定)
将经时地采集的实施例1～3的培养液作为酶液，用参考例2的条件分别测定β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、纤维二糖水解酶的比活性。测定405nm的吸光度的增加，将每1分钟游离1μmol的底物的活性作为1U，从而计算出比活性。其结果是，与里氏木霉(Trichodermareesei)ATCC66589株相比，实施例1～3中制作的里氏木霉(Trichoderma reesei)的突变株培养液中的上述3种比活性变高。
(烧瓶培养)
将实施例1～3中制作的里氏木霉(Trichoderma reesei)突变株I～III各自的孢子用生理盐水稀释为1.0×107/mL，将该稀释孢子溶液0.1mL接种到表4所示的包含ArbocelI(注册商标)B800或乳糖的50mL带挡板的烧瓶中的10mL的烧瓶培养基中，利用振荡培养机以28℃、120rpm的条件进行120小时培养。
另外，对于作为突变株I～III的突变导入前的亲本株的里氏木霉(Trichodermareesei)ATCC66589株，也作为各自的比较对象按照前述的方法进行120小时培养。
表4
Figure BDA0002948227360000241
*与表1相同。
**与表1相同。
***与表1相同。
(培养液的采集)
在烧瓶培养开始120小时后采集1mL培养液。将培养液在15000×g、4℃的条件下进行10分钟离心分离，获得上清。将该上清用0.22μm的过滤器过滤，以其滤液作为纤维素酶溶液，在以下各种实验中使用。
(蛋白质浓度的测定)
在使用ArbocelI(注册商标)B800的烧瓶培养中，在以培养里氏木霉(Trichodermareesei)ATCC66589株而得的培养液所含的蛋白质浓度作为1的情况下，里氏木霉(Trichoderma reesei)突变株I、突变株II、突变株III的培养液所含的蛋白质浓度的相对值均为1.1，确认了突变株的蛋白质制造能力比亲本株提高。
在使用乳糖的烧瓶培养中，在以培养里氏木霉(Trichoderma reesei)ATCC66589株而得的培养液所含的蛋白质浓度作为1的情况下，里氏木霉(Trichoderma reesei)突变株I：1.2、突变株II：1.3、突变株III：1.2，也确认了突变株的蛋白质制造能力比亲本株提高。
(纤维素酶各种比活性的测定)
在使用ArbocelI(注册商标)B800的烧瓶培养中，在以培养里氏木霉(Trichodermareesei)ATCC66589株而得的培养液的纤维素酶的各种比活性作为1的情况下，β-葡糖苷酶比活性为里氏木霉(Trichoderma reesei)突变株I：1.1、突变株II：1.2、突变株III：1.1，β-木糖苷酶比活性是里氏木霉(Trichoderma reesei)突变株I、II、III均为1.1，纤维二糖水解酶比活性也是突变株I、II、III均为1.1，确认了获得了纤维素酶的各种比活性也提高这样的预料外的效果。
在使用乳糖的烧瓶培养中，在以培养里氏木霉(Trichoderma reesei)ATCC66589株而得的培养液的纤维素酶的各种比活性作为1的情况下，β-葡糖苷酶比活性是里氏木霉(Trichoderma reesei)突变株I：1.1、突变株II：1.2、突变株III：1.4，β-木糖苷酶比活性是里氏木霉(Trichoderma reesei)突变株I：1.1、突变株II：1.4、突变株III：1.4，纤维二糖水解酶比活性是突变株I：1.2、突变株II：1.1、突变株III：1.1，也确认获得了纤维素酶的各种比活性也提高这样的预料外的效果。
(糖化反应试验)
按照参考例3中记载的方法，使用从里氏木霉(Trichoderma reesei)突变株I、突变株II和突变株III的烧瓶培养开始第120小时的培养液作为纤维素酶，进行含纤维素的生物质的糖化反应试验。作为含纤维素的生物质，使用ArbocelI(注册商标)B800或粉末甘蔗渣。
其结果是，在以ArbocelI(注册商标)B800作为糖化对象物的情况下的糖化反应中，在以使用通过使用乳糖进行烧瓶培养而得的里氏木霉(Trichoderma reesei)ATCC66589株的纤维素酶时的糖化液所含的葡萄糖浓度作为1的情况下，使用里氏木霉(Trichoderma reesei)突变株I的纤维素酶时的糖化液的葡萄糖浓度的相对值为1.2，使用突变株II的纤维素酶时的糖化液的葡萄糖浓度的相对值为1.3，使用突变株III的纤维素酶时的糖化液的葡萄糖浓度的相对值为1.1。另外，在以使用通过使用ArbocelI(注册商标)B800进行烧瓶培养而得的里氏木霉(Trichoderma reesei)ATCC66589株的纤维素酶时的糖化液所含的葡萄糖浓度作为1的情况下，使用里氏木霉(Trichoderma reesei)突变株I的纤维素酶时的糖化液的葡萄糖浓度的相对值为1.1，使用突变株II的纤维素酶时的糖化液的葡萄糖浓度的相对值为1.2，使用突变株III的纤维素酶时的糖化液的葡萄糖浓度的相对值为1.1。
在以粉末甘蔗渣作为糖化对象物的情况下的糖化反应中，在以使用通过使用乳糖进行烧瓶培养而得的里氏木霉(Trichoderma reesei)ATCC66589株的纤维素酶时的糖化液所含的葡萄糖浓度作为1的情况下，使用里氏木霉(Trichoderma reesei)突变株I的纤维素酶时的糖化液的葡萄糖浓度的相对值为1.3，使用突变株II的纤维素酶时的糖化液的葡萄糖浓度的相对值为1.3，使用突变株III的纤维素酶时的糖化液的葡萄糖浓度的相对值为1.1。另外，在以使用通过使用ArbocelI(注册商标)B800进行烧瓶培养而得的里氏木霉(Trichoderma reesei)ATCC66589株的纤维素酶时的糖化液所含的葡萄糖浓度作为1的情况下，使用里氏木霉(Trichoderma reesei)突变株I的纤维素酶时的糖化液的葡萄糖浓度的相对值为1.2，使用突变株II的纤维素酶时的糖化液的葡萄糖浓度的相对值为1.3，使用突变株III的纤维素酶时的糖化液的葡萄糖浓度的相对值为1.1。
由这些结果确认了，由里氏木霉(Trichoderma reesei)突变株I～III所生产的纤维素酶均比由亲本株生产的纤维素酶酶活性优异，由此制造来自含纤维素的生物质的葡萄糖的能力优异。
＜实施例5＞包含序列号4、5和6所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损了的里氏木霉(Trichoderma reesei)的突变株的制作
对作为里氏木霉(Trichoderma reesei)QM9414株的传代株的QM9414-A株进行基因突变处理，获得作为突变株的QM9141-B株。关于基因突变处理，将QM9414-A株的孢子以在表1所示的预培养培养基每1mL中成为1.0×105孢子的方式进行接种，将预培养培养基15mL培养半天后进行离心分离，回收孢子。然后，将回收的孢子用Tris-马来酸缓冲液(pH6.0)悬浮制成10mL的孢子溶液，向其中添加用Tris-马来酸缓冲液(pH6.0)溶解成1.0g/L的NTG溶液0.5mL，进行28℃、100分钟的基因突变处理。基因突变处理后的孢子用离心分离回收之后，用Tris-马来酸缓冲液(pH6.0)洗涤3次，最终用Tris-马来酸缓冲液(pH6.0)10mL悬浮，将所得的产物作为基因突变处理孢子。接着向添加结晶纤维素而制备的琼脂培养基中添加基因突变处理孢子，以在集落周围产生的作为由纤维素酶造成的结晶纤维素分解区域的晕的大小作为指标，挑选晕较大的QM9414-B株。
进行QM9414-B株的基因分析，结果确认了序列号1、2、3所示的碱基序列发生了以下突变。
序列号1所示的碱基序列中在第85位***了1碱基的鸟嘌呤。该突变使序列号4所示的氨基酸序列的从N末端侧起第30位的氨基酸残基由组氨酸变成苏氨酸，以后移码的结果是翻译在从N末端侧起第90位的氨基酸残基终止了。
序列号2所示的碱基序列中在第6位***了序列号27所示的46碱基。该突变使序列号5所示的氨基酸序列的从N末端侧起第3位的谷氨酰胺残基变成精氨酸，在该位置使翻译终止了。
序列号3所示的碱基序列中第499位的胞嘧啶发生了单碱基缺损。该突变使序列号6所示的氨基酸序列的从N末端侧起第167位的氨基酸残基由丙氨酸变成精氨酸，以后移码的结果在从N末端侧起第193位使翻译终止了。
＜实施例6＞使用里氏木霉(Trichoderma reesei)QM9414-B株的蛋白质的制造试验
对于实施例5中获得的突变株QM9414-B株，依据实施例4中记载的(预培养)、(主培养)、(主培养中途的液糖的添加)和(培养液的采集)进行培养，以参考例1的条件测定蛋白质浓度。对照使用作为亲本株的QM9414-A株与QM9414-B株同样地进行培养，以参考例1的条件测定蛋白质浓度。
测定培养开始第120小时的蛋白质生产浓度的结果是，与QM9414-A株相比，QM9414-B株的相对值提高到1.2倍。另外，同样地测定培养开始第200小时的蛋白质浓度的结果是，QM9414-A株与培养开始第120小时相比蛋白质浓度不变化，QM9414-B株的蛋白质浓度与培养开始第120小时的蛋白质浓度相比提高到1.3倍。
另外，以培养开始第120小时的QM9414-A株的蛋白质浓度作为1时的QM9414-B株的蛋白质浓度的相对值为1.8，以培养开始第185小时的QM9414-A株的蛋白质浓度作为1时的QM9414-B株的蛋白质浓度的相对值为2.7。
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Claims (15)

1.里氏木霉(Trichoderma reesei)的突变株，具有包含序列号4～6的任一项所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损或降低的突变。
2.根据权利要求1所述的突变株，所述突变是包含序列号4所示的氨基酸序列的多肽的HSF型DNA结合结构域缺损的突变。
3.根据权利要求2所述的突变株，所述突变是伴随比HSF型DNA结合结构域更靠近N末端侧的区域中的突变而发生的移码突变。
4.根据权利要求3所述的突变株，所述突变是由序列号4所示的氨基酸序列的从N末端侧起第30位的组氨酸残基突变成除组氨酸以外的氨基酸残基而产生的移码突变。
5.根据权利要求1所述的突变株，所述突变是包含序列号5所示的氨基酸序列的多肽的TLD结构域缺损的突变。
6.根据权利要求5所述的突变株，所述突变是伴随比TLD结构域更靠近N末端侧的区域中的突变而发生的移码突变。
7.根据权利要求6所述的突变株，所述突变是由序列号5所示的氨基酸序列的从N末端侧起第3位的谷氨酰胺残基突变成除谷氨酰胺以外的氨基酸残基而产生的移码突变。
8.根据权利要求1所述的突变株，所述突变是包含序列号6所示的氨基酸序列的多肽的F-box结构域区域的氨基酸序列的突变。
9.根据权利要求8所述的突变株，所述突变是由伴随F-box结构域区域的氨基酸序列的突变而发生的移码突变从而产生的包含序列号6所示的氨基酸序列的多肽的缺损。
10.根据权利要求9所述的突变株，所述突变是由序列号6所示的氨基酸序列中从N末端侧起第167位的丙氨酸残基突变成除丙氨酸以外的氨基酸残基而产生的移码突变。
11.蛋白质的制造方法，包括：培养权利要求1～10的任一项所述的突变株的工序。
12.蛋白质的制造方法，包括：用至少包含乳糖的培养基培养权利要求1～10的任一项所述的突变株的工序。
13.纤维素酶的制造方法，包括：培养权利要求1～10的任一项所述的突变株的工序。
14.纤维素酶的制造方法，包括：用至少包含乳糖的培养基培养权利要求1～10的任一项所述的突变株的工序。
15.糖的制造方法，包括：通过权利要求13或14所述的纤维素酶的制造方法来制造纤维素酶的工序，和使用通过上述工序得到的纤维素酶对含纤维素的生物质进行糖化的工序。
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