CN102311951A - 里氏木霉组成型表达盒、表达载体、重组菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，提供了一种里氏木霉组成型表达盒，所述表达盒由外源目的基因、里氏木霉丙酮酸脱羧酶基因启动子(P_pdc)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，和里氏木霉丙酮酸脱羧酶基因终止子(T_pdc)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示组成。本发明的表达盒采用将里氏木霉丙酮酸脱羧酶基因的启动子序列和终止子序列构成，无需诱导即可表达来源于动物、植物或真菌的基因，且可以对表达产物进行合适的修饰，不但可以利用里氏木霉高效的合成和分泌能力进行蛋白的表达，且蛋白表达量高，而且可以避免表达产物中产生过多的杂蛋白。本发明的重组菌株可高效表达不含纤维素酶的木聚糖酶，这类木聚糖酶在造纸工业中具有很重要的应用。

Description

里氏木霉组成型表达盒、表达载体、重组菌株及其应用

技术领域

本发明属于基因工程研究领域，具体涉及一种里氏木霉组成型表达盒及其应用。

背景技术

部分丝状真菌具有很强的合成和分泌蛋白能力，而且可以对表达的蛋白进行糖基化修饰，因此是用来进行外源蛋白质表达的一类具有潜力的宿主菌，常用的有构巢曲霉、黑曲霉、里氏木霉、泡盛曲霉等。

里氏木霉(Trichoderma reesei)是高效的纤维素酶产生菌，其纤维素酶系包括五种内切-β-葡萄糖苷酶(EG I、EGII、EGIII、EGIV和EGV)、两种纤维二糖水解酶(CBH I和CBH II)和两种纤维二糖酶(BG I和BG II)。其中CBH I的含量最高，其表达量可达里氏木霉胞外分泌性蛋白总量的50％，而在诱导的情况下里氏木霉合成和分泌蛋白的总量最高可达到40g/L。

里氏木霉的CBH I由单拷贝的cbh1基因编码，由此可见，调控其表达的cbh1启动子是一个很强的丝状真菌启动子，因此，利用cbh1基因启动子构建的里氏木霉表达***被认为是一种有效的表达***。

目前，国内外所构建的里氏木霉表达***均使用cbh1启动子调节外源基因的表达。芬兰的VTT生物技术实验室于1990年代率先构建了基于cbh1启动子的里氏木霉表达***，并进行了异源和同源蛋白的一系列表达(Haakana H，Miettinen-oinonen A，Joutsjoki V.Enzyme Microb Technol.2004，34(2)：159-167)。Mantyla等将真菌Chaetomium thermophilum中编码三个木聚糖酶的基因置于cbh1强启动子的控制之下，用此表达盒转化里氏木霉后获得了高效表达木聚糖酶的工程菌种。替换染色体的cbh1位点之后，EG1的产量是通常强纤维素分解菌所产CBH I量的2倍或者与其一样多(Mantyla A，Paloheimo M，Haskola S.ApplMicrobiol Biotechnol.2007，76(2)：377-386)。Miettinen-Oinonen等用eg2置换cbh1，使其位于cbh1启动子的下游表达(Miettinen-OinonenA，Suominen PL.ApplEnviron Microbiol 2002，68(8)：3956-3964)，结果发现，内切葡萄糖苷酶的活力比出发菌株增加2.3倍；再增加一个转化到里氏木霉中的eg2表达盒的拷贝数，内切葡萄糖苷酶的活力比出发菌株增加3倍。汪天虹等构建了Pcbh1-eg3-Tcbh1表达盒，用eg3基因替换了cbh1基因，成功地实现了EG 3在cbh1启动子控制下的表达(Wang TH，Liu T，Wu ZH.ACTA Biochim Biophysica Sin.2004，36(10)：667-672)。

里氏木霉被广泛用来表达同源蛋白和异源蛋白(如来源于动物的基因)，而且里氏木霉在大规模生产条件中(高达360m³发酵液)的表现良好，特别适于蛋白的大量生产。然而，在里氏木霉中使用cbh1基因启动子表达蛋白时必须使用纤维素、乳糖或槐二糖等进行诱导，而诱导不仅使cbh1基因启动子被激活，而且会使其它纤维素酶组分的启动子被激活。这将使表达液中杂蛋白的含量高，一方面造成原料的浪费，另一方面不利于对表达产物进行分离纯化。

使用强的组成型启动子，利用里氏木霉高效的合成和分泌能力进行蛋白的表达可能是解决这一问题的有效手段。组成型启动子在以葡萄糖为碳源的培养基中不受阻遏，不需要诱导就可以启动目的基因的转录。对于里氏木霉而言，使用组成型启动子将可以避免产生过多的杂蛋白，因为里氏木霉所产生的胞外蛋白多是经诱导后产生的纤维素酶组分。

Joutsjoki VV等人就将酿酒酵母DPM1基因(编码甘露糖基磷酸多萜醇合成酶)的编码区***到pLMRS3质粒中，在瑞氏木霉pki启动子和cbh2终止子控制下表达。在pFG1质粒(含有瑞氏木霉pyr4基因)存在下，与pLMRS3质粒一起对瑞氏木霉的一种pyr4阴性突变株TU-6进行共转化，然后筛选pyr4阳性转化子，得到4株多拷贝DPM1基因串联整合的稳定转化子。与受体菌株TU-6相比，转化子的甘露糖基磷酸多萜醇合成酶活力提高了15-19倍，分泌的蛋白总量也提高了4倍(Joutsjoki VV，Kuittinen M，Torkkeli TK，Suominen PL.FEMS Microbiol Lett.1993，112(3)：281-286)。

丙酮酸脱羧酶(PDC)催化丙酮酸脱羧形成乙醛，其编码基因在里氏木霉中是被大量表达的管家基因。由此可见，调控其表达的pdc启动子可能是一个很强的组成型启动子。

木聚糖酶在食品工业、饲料工业、造纸工业和生物质能源工业中都得到广泛的运用。在生物质能源工业中，通过木聚糖酶可将半纤维素水解为可发酵糖，提高过程的效率。然而在有些工业应用过程，如造纸工业，需要使用不含纤维素酶的木聚糖酶。

里氏木霉不仅可以大量合成并分泌纤维素酶，而且也能分泌XYN I、XYN II、XYN III和XYN IV等4种内切木聚糖酶，其中XYN I和XYN II的酶活力占发酵液总活力的90％以上。T.reesei中木聚糖酶的合成受木质纤维素、乳糖等的诱导，而且其合成过程与纤维素酶的合成同步，因此使用T.reesei野生菌株生产木聚糖酶时其中必定混有纤维素酶。XYN II作为T.reesei主要的两种木聚糖酶之一，已经在Aspergillus niger、Schizosaccharomyces pombe和Pichia stipitis等宿主菌中实现了异源表达。由于表达后修饰的差异，使用T.reesei进行XYN II的同源表达是理想的选择。然而，XYN II在T.reesei本身诱导型启动子的调控下表达时，表达量较低，而且混有纤维素酶，不能适用于某些工业应用过程。

迄今为止，利用里氏木霉的pdc基因的启动子构建组成型表达***在国内外尚未见报道，由此方法所构建的能高效表达不含纤维素酶的木聚糖酶的里氏木霉重组菌株在国内外亦未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种无需诱导即可表达来源于动物、植物或真菌的基因，且表达产物中杂蛋白少的里氏木霉组成型表达盒。

所述表达盒由外源目的基因、里氏木霉丙酮酸脱羧酶基因启动子和里氏木霉丙酮酸脱羧酶基因终止子组成。

所述里氏木霉丙酮酸脱羧酶基因启动子由1534个碱基组成，如SEQ ID NO.1所示，命名为P_pdc。

所述里氏木霉丙酮酸脱羧酶基因终止子由1030个碱基组成，如SEQ ID NO.2所示，命名为T_pdc。

本发明的第二个目的在于提供一种含有所述里氏木霉组成型表达盒的表达载体。

本发明的第三个目的在于提供含有所述表达载体的重组菌株。

本发明的第四个目的在于提供上述重组菌株的应用。

所述重组菌株在制备蛋白质药物、工业酶制剂或饲料添加剂中的应用。

所述工业酶制剂为木聚糖酶。

本发明的第五个目的在于提供一种含有木聚糖酶基因里氏木霉组成型表达盒的重组里氏木霉的制备方法，包括以下步骤：

1)构建木聚糖酶基因表达盒P_pdc-XYN-T_pdc；

2)利用P_pdc-XYN-T_pdc表达盒构建重组质粒pUC-PXT；

3)用质粒pUC-PXT和质粒pAN7-1共转化里氏木霉，获得含有木聚糖酶基因里氏木霉组成型表达盒的重组里氏木霉。

本发明通过以下技术方案实现：

1)克隆里氏木霉丙酮酸脱羧酶基因启动子(P_pdc)和终止子(T_pdc)：提取里氏木霉Trichoderma reesei QM9414基因组DNA，设计引物，通过PCR技术从里氏木霉Trichoderma reesei QM9414基因组DNA中克隆克隆里氏木霉丙酮酸脱羧酶基因启动子和终止子，分别命名为P_pdc和T_pdc。

2)构建里氏木霉组成型表达盒。

3)构建里氏木霉组成型表达载体pUC-PT。

4)利用里氏木霉组成型表达载体表达木聚糖酶基因xyn2：将xyn2基因***表达载体pUC-PT的Xba I和BamH I位点之间，构建成重组质粒pUC-PXT。将重组质粒pUC-PXT转化里氏木霉原生质体，得到重组里氏木霉，命名为T.reesei-XYNII。

4)重组里氏木霉T.reesei-XYNII表达产物分析，结果证明T.reesei-XYNII产木聚糖酶具有组成型产酶的特性，进入对数生长期即开始产酶，并一直持续到144h，最高酶活达到7532IU/ml，并且具有遗传稳定性。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明的重组表达盒由里氏木霉丙酮酸脱羧酶基因的启动子序列(Ppdc)和终止子序列(Tpdc)构成，不但可以利用里氏木霉高效的合成和分泌能力进行蛋白的表达，且蛋白表达量高，而且可以避免表达产物中产生过多的杂蛋白；

2、本发明采用将里氏木霉丙酮酸脱羧酶基因的启动子序列(Ppdc)和终止子序列(Tpdc)构成组成型表达载体，无需诱导即可表达来源于动物、植物或真菌的基因，且可以对表达产物进行合适的修饰；

3、本发明的重组里氏木霉可高效表达不含纤维素酶的木聚糖酶，这类木聚糖酶在造纸工业中具有很重要的应用。

附图说明

图1为里氏木霉组成型表达载体pUC-PT的质粒图谱；

图2为含Ppdc-XYN-Tpdc表达盒的重组载体pUC-PXT的质粒图谱；

图3为重组菌株T.reesei-XYNII表达产物的SDS-PAGE电泳图；

图4为重组菌株T.reesei-XYNII表达木聚糖酶的时间曲线；

其中，1为蛋白分子量标记，2为野生型里氏木霉菌株在表达培养基中培养的发酵上清液，3为重组菌株T.reesei-XYNII在表达培养基中培养的上清液。

具体实施方式

以下优选的实施例可对本发明的技术路线做进一步说明，但不构成对本发明的限制。

实施例1  里氏木霉组成型表达盒及表达载体的构建

1、里氏木霉基因组DNA的提取及检验

将里氏木霉Trichoderma reesei QM9414(本领域常用菌种)接种于PDA培养基上，于28℃恒温培养7天至孢子成熟。制备适量孢子悬液接种于液体种子培养基中，于30℃，180rpm条件下培养2天至菌丝体浓度达到4～5g/L用于提取基因组DNA。

上述液体种子培养基的配方为：将葡萄糖20.0g、蛋白胨2.0g、Mandels营养液浓缩液100ml、柠檬酸缓冲液(pH4.5，1mol/L)50ml和Mandels微量元素浓缩液1ml混合后，用蒸馏水溶解并且定容至1L。

上述Mandels营养液浓缩液的配方为：将14g(NH4)2SO4、3g尿素、20gKH2PO4、4g CaCl2·2H2O和3g MgSO4·7H2O混合后，用蒸馏水溶解并且定容至1L。

上述Mandels微量元素浓缩液的配方为：将5g FeSO4·7H2O、1.7gZnSO4·7H2O、3.7g CoCl2·6H2O和1.6g MnSO4·H2O混合后，用蒸馏水溶解并且定容至1L。

上述柠檬酸缓冲液(pH4.5，1mol/L)的配方为：取一水合柠檬酸210g，NaOH约78g，加水750ml，混合溶解后定容至1L。

本实施例采用本领域常用的2-巯基乙醇/CTAB法提取里氏木霉基因组DNA，提取完毕后用琼脂糖凝胶(含1％琼脂糖和0.5μg/ml溴化乙锭)电泳检验所提取基因组DNA。

2、里氏木霉丙酮酸脱羧酶基因的启动子序列(P_pdc)和终止子序列(T_pdc)的克隆

在Trichoderma reesei genome database v2.0(http://genome.jgi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html)上检索丙酮酸脱羧酶(PDC)基因的启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示和终止子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。以上述提取的里氏木霉基因组DNA为模板，以上游引物P1和下游引物P2进行特异的PCR扩增分离P_pdc，以上游引物T1和下游引物T2进行特异的PCR扩增分离T_pdc。

表1 PCR引物

注：加下划线的序列为酶切位点

上游引物P1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，其中含有Pst I的酶切位点；

下游引物P2，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，其中含Xba I的酶切位点。

上游引物T1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，其中含BamH I的酶切位点；

下游引物T2，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，其中含EcoR I的酶切位点。

PCR扩增反应条件以及反应体系参考试剂盒说明书，PCR扩增里氏木霉丙酮酸脱羧酶基因的启动子序列(P_pdc)大小为1534bp和终止子序列(T_pdc)大小为1030bp。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳和DNA序列分析，结果表明所获得的扩增产物为目的片段。

3、里氏木霉组成型表达盒及表达载体pUC-PT的构建

用限制性内切酶酶切(Pst I与Xba I，及BamH I与EcoR I)和连接酶将Tpdc与Ppdc这两个片段依次连接到质粒pUC19(市售)中，即得到可表达外源基因的里氏木霉组成型表达载体pUC-PT，其质粒图谱如图1所示。

表1 PCR引物

注：下划线部分为酶切位点

实施例2  利用里氏木霉组成型表达***表达木聚糖酶基因xyn2

1、xyn2基因的分离

以里氏木霉的基因组DNA为模板，以表1中引物X1和X2进行PCR扩增，得到xyn2基因。

上游引物X1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，其中含Xba I的酶切位点；

下游引物X2，其核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，其中含BamH I的酶切位点。

扩增产物经琼脂糖电泳检测，其分子大小为805bp，与预期结果相符合；经DNA序列分析，其序列与GeneBank上发布的序列具有100％的同源性。

2、Ppdc-XYN-Tpdc表达盒的构建

将上述所获得的xyn2基因经Xba I和BamH I酶切后与经同样酶切的表达载体pUC-PT连接，经转化大肠杆菌、筛选，获得含表达盒Ppdc-XYN-Tpdc的重组质粒pUC-PXT，其质粒图谱如图2所示。将重组质粒中的表达盒进行DNA测序分析，结果表明表达盒中各元素包括启动子、目的基因以及终止序列的结构正确。

3、表达盒Ppdc-XYN-Tpdc的获得

使用引物P1(其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)和T2(其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示)，以重组质粒pUC-PXT为模板，通过PCR扩增获得表达盒Ppdc-XYN-Tpdc。

4、表达盒Ppdc-XYN-Tpdc与质粒pAN7-1对里氏木霉原生质体的共转化

采用本领域的常规做法将上述表达盒Ppdc-XYN-Tpdc和质粒pAN7-1共转化里氏木霉原生质体，转化后的原生质体在原生质体液体再生培养基中进行再生，培养24h后球状原生质体再生并长出芽管，呈短丝状，有些则凝集在一起。上述液体再生培养基的成分为里氏木霉液体种子培养基+STC(1.2M山梨醇-10mM pH7.5的Tris·Cl-50mM CaCl2)，其中里氏木霉液体种子培养基的成分如实施例1中步骤(1)所述。

将液体再生的原生质体均匀涂布在含100μg/ml潮霉素B的筛选平板上，28℃培养2天后得到具有潮霉素抗性的转化子10株，转化效率为2株/μg DNA。在对照实验中，未转化质粒的T.reesei原生质体在100μg/ml潮霉素B的筛选平板上不生长。

5、重组菌株的鉴定

取一株重组菌株进行基因型鉴定。以重组菌株的基因组DNA为模板，用引物P1(其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)和T2(其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示)可以扩增出3.4kb左右的片段，对应于表达盒Ppdc-XYN-Tpdc的大小，该重组菌株命名为T.reesei-XYNII，用于后续的实施方案。

实施例3  重组菌株T.reesei-XYNII表达产物的分析

将在含潮霉素抗性的PDA平板上生长良好的重组菌株T.reesei-XYNII接种于里氏木霉液体种子培养基中，培养48h后按5％的接种量转接到重组里氏木霉表达培养基中，培养144h后分析XYNII的表达情况。

上述里氏木霉液体种子的配方为：100ml/L Mandels营养液浓缩液，1.0ml/LMandels微量元素浓缩液，10g/L葡萄糖，1.0g/L蛋白胨，50ml/L的柠檬酸缓冲液(pH4.5，1mol/L)，1.0～2.0g/L吐温80。

上述重组里氏木霉表达培养基配方为：100ml/L Mandels营养液浓缩液，1.0ml/L Mandels微量元素浓缩液，60g/L葡萄糖，5.0g/L蛋白胨，50ml/L的柠檬酸缓冲液(pH4.5，1mol/L)，1.0～2.0g/L吐温80。

上述Mandels营养液浓缩液、Mandels微量元素浓缩液和柠檬酸缓冲液的配方同实施例1。

以桦木木聚糖(birch xylan，Sigma)为底物，根据一个活力单位(IU)定义为在体系中反应中每分钟形成1μmol的还原糖(以木糖计)所需要的酶量来检测重组菌株T.reesei-XYNII表达产物(木聚糖酶)活性，经测定重组菌株T.reesei-XYNII在不诱导的情况下产木聚糖的活性为2690IU/ml。

将发酵液经常规处理后进行SDS-PAGE分析，分析表明，组成型的重组菌株T.reesei-XYNII直接将XYNII分泌到胞外，XYNII占胞外总蛋白的80％以上。而原菌在没有诱导的情况下不表达XYNII。T.reesei-XYNII所表达木聚糖酶的表达分子量为21KD，SDS-PAGE电泳结果如图3所示。

对重组菌株T.reesei-XYNII的表达产物采用Applied Biosystems VoyagerDE-STR MALDI-TOF-MS生物质谱仪进行质谱分析，使用MALDI-TOF-MS质谱仪进行分析。经质谱分析后所得到的实验数据与Matrixscience的数据库进行比较，质谱分析结果显示：检测到6个肽段与里氏木霉所产生的XYNII中肽段的氨基酸序列完全一致，提示所表达的蛋白为重组XYNII。

实施例4  重组菌株T.reesei-XYNII表达木聚糖酶的条件优化

本实施例选择初始培养基中不同的碳源浓度以及氮源浓度对重组菌株表达产酶的培养基进行优化，结果表明，使用的葡萄糖初始浓度为70.0g/L、蛋白胨初始浓度为10.0g/L、黄豆饼粉初始浓度为40.0g/L时效果最佳。表达结束后发酵上清液中的木聚糖酶活性达到7532IU/ml。在优选的培养条件下(100ml/L营养液浓缩液，1.0ml/L Mandels微量元素浓缩液，40.0g/L黄豆饼粉，70.0g/L葡萄糖，10.0g/L蛋白胨，50ml/L的柠檬酸缓冲液(pH 4.5，1mol/L)，1.0～2.0g/L吐温80)，重组菌株T.reesei-XYNII产木聚糖酶具有组成型产酶的特性，进入对数生长期即开始产酶，并一直持续到144h，最高酶活达到7532IU/ml，在发酵末期发酵液中的酶活性略有下降，结果如图4所示。

实施例5  重组菌株T.reesei-XYNII的稳定性实验

将重组菌株T.reesei-XYNII在不含潮霉素抗性的PDA平板上连续传代五次，分别测定各次传代的重组菌株在表达培养基中的产酶活性，发现各次传代的重组菌株的产木聚糖酶的能力没有显著差异，说明本发明所构建的重组菌株具有遗传稳定性。

Claims (9)

1.一种里氏木霉组成型表达盒，其特征在于所述表达盒由外源目的基因、里氏木霉丙酮酸脱羧酶基因启动子和里氏木霉丙酮酸脱羧酶基因终止子组成。

2.根据权利要求1所述的里氏木霉组成型表达盒，其特征在于：所述里氏木霉丙酮酸脱羧酶基因启动子由1534个碱基组成，如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的里氏木霉组成型表达盒，其特征在于：所述里氏木霉丙酮酸脱羧酶基因终止子由1030个碱基组成，如SEQ ID NO.2所示。

4.含有权利要求1-3中任意一项所述里氏木霉组成型表达盒的表达载体。

5.含有权利要求4所述表达载体的重组菌株。

6.根据权利要求5所述的重组菌株，其特征在于所述重组菌株为重组里氏木霉。

7.权利要求5或6所述重组菌株在制备蛋白质药物、工业酶制剂或饲料添加剂中的应用。

8.根据权利要求5或6所述重组菌株的应用，其特征在于所述工业酶制剂为木聚糖酶。

9.含有木聚糖酶基因里氏木霉组成型表达盒的重组里氏木霉的制备方法，包括以下步骤：

1)构建木聚糖酶基因表达盒P_pdc-XYN-T_pdc；

2)利用P_pdc-XYN-T_pdc表达盒构建重组质粒pUC-PXT；

3)用质粒pUC-PXT和质粒pAN7-1共转化里氏木霉，获得含有木聚糖酶基因里氏木霉组成型表达盒的重组里氏木霉。

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