CN112630365A - 一种高效液相色谱测定二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱的高效液相色谱检测方法。其色谱条件为：色谱柱：用十八烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱；流动相：A相为4mmol/L pH＝4的醋酸铵缓冲溶液，B相为4mmol/L醋酸铵甲醇溶液，按一定的梯度洗脱，使用蒸发光散射检测器(ELSD)，进行高效液相色谱分析，测定二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱的含量。本发明通过高效液相检测，运用反相色谱法，能够准确测出二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱的含量，且与其他有关物质能够达到很好的分离效果，提高了检测准确性，且对检测仪器及色谱柱损害较小。

Description

一种高效液相色谱测定二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱含量的方法

技术领域

本发明涉及一种利用高效液相色谱测定二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱含量的方法，属于仪器分析领域。

背景技术

二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)属于合成磷脂，广泛应用于药用辅料，适合用于改进制剂处方，并制备成多种多样的脂质体和磷脂复合物。二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱已应用于Visudyne(维替泊芬脂质体)和Abelect(两性霉素B磷脂复合物)，已收录于美国食品药品管理局非活性药用成分(辅料)数据库，其质量标准未收载于中国药典、美国药典、欧洲药典中。目前国内外文献尚无二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱含量测定方法。

二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱一般可通过化学合成法制得。常用的工业方法使用肉豆蔻酸(十四酸)和磷酸酰胆碱为起始原料，通过缩合反应，并加以提纯精制制备。该制备工艺中，肉豆蔻酸为起始原料，也是产物的降解产物。此外，反应中会产生副产物溶血磷脂酰胆碱，同时也是产物降解过程中易产生的化合物。这两种化合物会干扰二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱含量检测的准确性。开发能够分离二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱和其有关物质的含量检测方法是非常有必要的。

目前国内外其它磷脂酰胆碱类化合物的含量检测有TLC法、以紫外检测器检测的液相色谱法、以ELSD检测器检测的液相正相色谱法等。TLC法无法准确定量检测，且人为主观性较大，故含量检测误差较大，无法准确的检测产品含量。因磷脂类化合物几乎无紫外吸收，故以紫外检测器检测的液相色谱法，检测波长一般选择190～210nm之间，该检测波长下流动相所用溶剂等干扰较大，样品响应值也较低，含量检测的重复性及准确性都较差。中国药典中大豆磷脂及蛋黄卵磷脂的质量标准中，磷脂酰胆碱的含量检测以ELSD检测器，用硅胶为填充剂的色谱柱，以正己烷、异丙醇、甲醇等为溶剂的正相色谱法检测，该方法对色谱柱及仪器的损害较大。且以上磷脂或磷脂酰胆碱类化合物含量的检测均未有专门针对二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱的含量检测。

发明内容

针对目前尚无二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱的含量测定方法，本发明提供一种二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱的高效液相色谱测定方法，可有效解决上述问题，对二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱进行准确测定。

为达到上述发明目的，本发明实施了如下的技术方案：

一种高效液相色谱测定二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱含量的方法，色谱条件为：色谱柱：高效液相反相色谱柱；流动相：A相为醋酸铵缓冲溶液，B相为醋酸铵甲醇溶液；蒸发光散射检测器，梯度洗脱。

优选的，色谱条件为：

色谱柱：十八烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱，在不影响检测效果的情况下，优选色谱柱的长度为150mm，直径为4.6mm，填料粒径为3.5μm。例如：Agilent Eclipse Plus C18柱(4.6×150mm，3.5μm)。

采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，流动相：A相为4mmol/L pH＝4的醋酸铵缓冲溶液，B相为4mmol/L醋酸铵甲醇溶液。

梯度洗脱程序为：

在0～8分钟内，流动相A和流动相B由初始体积比15:85线性梯度变至0:100，以100％B相持续洗脱至第14分钟，在14.01分时，改用体积比15:85流动相A和流动相B的混合溶液持续洗脱至结束。

具体的，梯度洗脱条件如下表所示：

优选流动相流速：1.0～1.3mL/min；

优选色谱柱柱温：35～45℃；

蒸发光散射检测器温度：40～80℃，气体流速：1.5～2.0L/min，进行高效液相色谱分析，测定二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱的含量。

本发明所述的二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱的高效液相色谱检测方法建立过程包括以下步骤：

步骤a、配制不同浓度的二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱线性标准溶液；

步骤b、采用高效液相色谱仪对不同浓度的二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱线性标准溶液进行测定，记录所得到的峰面积，以二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱系列标准溶液峰面积的自然对数为纵坐标，其对应浓度的自然对数为横坐标，作标准曲线，进行线性回归，得到标准曲线回归方程；

步骤c、配制二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱供试品溶液，采用高效液相色谱仪，按标准溶液相同的测定条件进行测定，记录峰面积，带入步骤c所得到的标准曲线回归方程计算，得到二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱的含量。

所述的二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱线性标准溶液浓度分别为：30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml，进样量为10μl。

本发明优点：

流动相的选择：二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱在甲醇溶解，在水中几乎不溶，选择甲醇作为样品溶液的稀释剂，采用流动相A(4mmol/L pH＝4的醋酸铵缓冲溶液)和流动相B(4mmol/L醋酸铵甲醇溶液)混合流动相进行梯度洗脱，采用C18柱进行分离，流动相的极性远大于固定相的极性，为反相色谱法，对色谱柱及仪器的损害较小；且各组分出峰时间快，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱的出峰时间约11min。

本发明所述二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱的高效液相色谱测定方法，具有准确度高，稳定性好的特点。在本发明的检测条件下，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱出峰时间较合适，主要杂质溶血磷脂酰胆碱、肉豆蔻酸与产品肉豆蔻酰磷脂酰胆碱获得很好的分离，不仅可以准确测定肉豆蔻酰磷脂酰胆碱的含量，还可以对杂质溶血磷脂酰胆碱和肉豆蔻酸进行定量，对二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱质量标准的建立以及杂质控制非常有意义。

本发明分析方法，一定浓度范围内线性好，精密度高，重复性好，稳定性强。

本发明选定的色谱条件，各组分能有效分离和检出，采用二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱标准品配制的标准溶液进行测定，按方法计算线性回归方程，相关系数r＝0.9994，检测范围广，本发明方法在30～70μg/ml浓度范围内线性良好，精密度高，对同一份样品进行6次平行测定，峰面积的相对标准偏差仅为0.22％。

附图说明

图1是实施例1中高效液相的色谱图。

图2是实施例2中二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱标准溶液的线性图。

图3是实施例3中专属性分离度的高效液相的色谱图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实例，进行方法筛选，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1：二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱的高效液相色谱测定方法一

实验材料与仪器

对照品、样品及试剂：二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)对照品(Lipoid含量99.6％)、溶血磷脂酰胆碱(江苏东南纳米材料有限公司)、肉豆蔻酸(凌峰化学)、色谱四氢呋喃(TEDIA)、三氟乙酸(国药集团)。

仪器：具体仪器的名称和型号见下表1。

表1具体仪器的名称和型号

仪器名称	型号
		分析天平	SQP/SECURA225D-1CN
高效液相色谱仪	Agilent1260
		ELSD检测器	奥泰6000
酸度计	PHS-3C

液相色谱条件：

色谱柱采用Kromasil 100-5-C18柱(4.6*150mm)；以四氢呋喃：水：三氟乙酸＝900:10:1为流动相进行等度洗脱30分钟；柱温40℃；蒸发光散射检测器温度45℃，氮气流速为每分钟1.7L。

实验过程：

别取二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱对照品、溶血磷脂酰胆碱、肉豆蔻酸各适量，用甲醇溶解并稀释制成每1mL中分别含上述对照品为0.05mg、0.01mg、0.01mg的混合溶液。精密量取该混合溶液10μL注入液相色谱仪，记录色谱图。

试验结果如图1所示。结果显示肉豆蔻酸与溶血磷脂酰胆碱的分离度0.42，溶血磷脂酰胆碱与二棕榈酸磷脂酰胆碱的分离度0.52，均无法有效分离。

实施例2：二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱的高效液相色谱测定方法二(本发明所述测定方法)

实验材料与仪器

对照品、样品及试剂：二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱对照品(Lipoid含量99.6％)、溶血磷脂酰胆碱(江苏东南纳米材料有限公司)、肉豆蔻酸(凌峰化学)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(江苏东南纳米材料有限公司)、色谱甲醇(TEDIA)、醋酸铵(凌峰化学)。

试验仪器同实施例1。

液相色谱条件：

色谱柱采用Agilent Eclipse Plus C18柱(4.6*150mm，3.5μm)；以4mmol/L pH＝4的醋酸铵缓冲溶液为流动相A，以4mmol/L醋酸铵甲醇为流动相B；按下表2进行梯度洗脱；柱温40℃；蒸发光散射检测器，温度70℃，氮气流速为每分钟1.8L。

实验过程：

取本品约5mg，精密称定，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。另精密称取二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱对照品适量，用甲醇稀释制成每1mL中含二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱0.03mg、0.04mg、0.05mg、0.06mg、0.07mg的溶液作为标准溶液。精密量取供试品溶液和对照品溶液各10μL分别注入液相色谱仪，记录色谱图。由标准溶液测得的线性回归方程计算二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱的含量。

标准溶液线性回归方程见图2。三批样品检测数据见表2

表2

结果表明，本发明检测方法线性和每批样品平行检测结果均良好，含量测定结果均符合要求，此方法适用于二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱的产品含量检测。

实施例3

为验证上述实施例2的可行性和准确性，进一步进行专属性试验、精密度试验、样品溶液稳定性试验、线性关系试验。试验材料及仪器同实施例2。

1.专属性

溶液配制：

空白溶液：甲醇。

专属性溶液：分别取二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、肉豆蔻酸各适量，用甲醇溶解并稀释制成每1mL中分别含上述对照品为0.05mg、0.01mg、0.01mg的混合溶液。

溶血磷脂酰胆碱定位溶液：精密称定溶血磷脂酰胆碱对照品1mg至100mL容量瓶中，加甲醇适量使溶解，然后用稀释剂稀释定容至刻度，混匀。

肉豆蔻酸定位溶液：精密称定肉豆蔻酸1mg至100mL容量瓶中，加甲醇适量使溶解，然后用稀释剂稀释定容至刻度，混匀。

二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱定位溶液：精密称定二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱5mg至100mL容量瓶中，加甲醇适量使溶解，然后用甲醇定容至刻度，混匀。

待***平衡后，分别取各溶液10μL注入液相色谱仪，记录色谱图，如图3所示。将结果记录于表3中。

表3专属性试验结果

试验结果显示：在该色谱条件下，选择溶剂甲醇为检测溶剂，基线平稳，溶剂对本品测定无干扰，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱峰理论塔板数66452，混合溶液中二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱与相邻峰的分离度良好(均在1.5以上，见图3)，专属性较好。二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱保留时间均在11min左右，出峰时间良好。

2.精密度-重复性

溶液配制：精密称定二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱5mg至100mL容量瓶中，加甲醇适量使溶解，然后用甲醇定容至刻度，混匀。分别取10μL注入液相色谱仪，一共进样6次，记录所有峰面积，计算所有峰面积自然对数的RSD(％)。结果见表4。

表4重复性试验数据

时间	重复性-1	重复性-2	重复性-3	重复性-4	重复性-5	重复性-6	RSD(％)
								峰面积	1008.85	990.3	991.06	991.99	999.69	1028.02	/
lg峰面积	3.0038	2.9958	2.9961	2.9965	2.9999	3.0120	0.22

结果表明：样品重复性试验进样峰面积均在1000左右，lg峰面积为3.0左右，lg峰面积RSD为0.22％，该方法的精密度良好。

3.样品溶液稳定性试验

精密称定供试品5mg至100mL容量瓶中，加甲醇适量使溶解，然后用甲醇定容至刻度，混匀制成0.05mg/ml的样品溶液，分别在配制后0h、2h、4h、6h、8h进样，记录峰面积，计算所有时间点峰面积自然对数的RSD(％)。结果见表5。

表5样品溶液稳定性试验

结果表明：样品溶液在放置8小时内峰面积均在1000左右，lg峰面积为3.0左右，lg峰面积RSD为0.17％，样品溶液在8小时内样品溶液稳定性良好。

4.线性

二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱标准储备液配制：精密称定二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱对照品5mg至10mL容量瓶中，加甲醇适量使溶解，然后用甲醇稀释定容至刻度，混匀。作为标准储备液。

线性：分别精密移取二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱标准储备溶液0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL置10ml量瓶中，用甲醇定容，摇匀，得到一系列浓度的标准溶液。精密吸取上述系列梯度浓度溶液各10μl从低浓度到高浓度依次进样分析，记录色谱图，以二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱对照品溶液浓度的自然对数为横坐标，对照品峰面积的自然对数为纵坐标，进行线性回归并求出回归方程，结果见表6和图2。

表6线性考察结果

结果表明，样品浓度在30～70μg/ml范围内，相关系数R＝0.9994，线性良好。

以上实施例结果表明，本发明检测方法专属性较好、线性关系良好、溶液稳定性良好、精密度良好，检测结果准确可靠。

Claims (9)

1.一种高效液相色谱测定二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱的含量方法，其特征在于，色谱条件为：色谱柱：高效液相反相色谱柱；流动相：A相为醋酸铵缓冲溶液，B相为醋酸铵甲醇溶液；蒸发光散射检测器，梯度洗脱。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述流动相：A相为4mmol/L pH＝4～4.5的醋酸铵缓冲溶液，B相为4mmol/L醋酸铵甲醇溶液。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述高效液相反相色谱柱为十八烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述梯度洗脱程序为：在0～8分钟内，流动相A和流动相B由初始体积比15:85线性梯度变至0:100，以100％B相持续洗脱至第14分钟，在14.01分时，改用体积比15:85流动相A和流动相B的混合溶液持续洗脱至结束。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述蒸发光散射检测器，检测器温度：40～80℃，空气流速为1.5～2.0L/min。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述流动相流速：1.0～1.3mL/min。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于色谱柱柱温：35～45℃。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱检测的线性范围为：30～70μg/ml。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于进样体积为5～15μL。

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