CN112461982A - 一种l-樟脑磺酸甲酯和l-樟脑磺酸乙酯的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种L‑樟脑磺酸甲酯和L‑樟脑磺酸乙酯的检测方法，属于药品质量检测技术领域。本发明采用高效液相色谱‑质谱联用的方法检测L‑樟脑磺酸甲酯和L‑樟脑磺酸乙酯，专属性好，灵敏度高，小范围内改变流速、流动相比例、柱温等色谱条件不会影响伏立康唑基因毒杂质L‑樟脑磺酸酯的检出，且本发明提供的检测方法能准确定量基因毒杂质L‑樟脑磺酸甲酯与L‑樟脑磺酸乙酯，各峰分离度、理论塔板数均较好。

Description

一种L-樟脑磺酸甲酯和L-樟脑磺酸乙酯的检测方法

技术领域

本发明涉及药品质量检测技术领域，尤其涉及一种L-樟脑磺酸甲酯和L-樟脑磺酸乙酯的检测方法。

背景技术

伏立康唑为广谱的***抗真菌药，作用机制为抑制真菌中由细胞色素P450介导的14α-甾醇去甲基化，从而抑制麦角甾醇的生物合成。而麦角甾醇是构成真菌细胞膜的重要成分，在维持细胞膜的流动性、生物调节以及立体结构等方面起着重要作用。麦角甾醇的缺失破坏了真菌细胞的完整性，从而影响了细胞膜的流动性、通透性和细胞膜上许多酶的活性，最终导致真菌的死亡。

伏立康唑的制备工艺中使用到L-樟脑磺酸作为手性拆分剂，可能会与工艺中使用到的溶剂甲醇、乙醇反应产生L-樟脑磺酸甲酯和L-樟脑磺酸乙酯，L-樟脑磺酸甲酯和L-樟脑磺酸乙酯为基因毒杂质。但伏立康唑各标准中均未对这两个基因毒杂质进行控制。

现有技术《Development and Validation of a GC–MS Method for theDetermination of Methyl and Ethyl Camphorsulfonates in EsomeprazoleMagnesium》采用GCMS对埃索美拉唑中的L-樟脑磺酸甲酯与L-樟脑磺酸乙酯进行测定，但是伏立康唑易高温降解，采用直接进样时产生较多杂峰，对L-樟脑磺酸甲酯与L-樟脑磺酸乙酯检测产生干扰，导致回收率较差，无法满足检测要求。此外，注射用伏立康唑最大日剂量为600mg，治疗期不超过6个月，根据ICH指导原则查得对应的总摄入量为20μg/天，通过换算，各L-樟脑磺酸酯的限度为33ppm，由于限度较低，分析难度较大。

发明内容

本发明的目的在于提供一种L-樟脑磺酸甲酯和L-樟脑磺酸乙酯的检测方法，包括如下步骤：

(1)将待测样品溶解于溶剂中，得到待测液；

(2)采用高效液相色谱-质谱联用对所述待测液进行检测，得到谱图；

所述高效液相色谱-质谱联用中液相色谱的条件为：

色谱柱：填料为十八烷基硅烷键合硅胶；

柱温：33～37℃；

流动相：流动相A：甲酸水溶液；流动相B：甲醇或乙腈；

流动相流速：0.4～0.6mL/min；

所述高效液相色谱-质谱联用中质谱的条件为：

ESI源；正离子扫描模式；

(3)根据所得谱图计算得到待测样品中L-樟脑磺酸甲酯和L-樟脑磺酸乙酯的含量。

优选的，所述待测样品为伏立康唑。

优选的，所述步骤(1)中溶剂为甲醇、乙腈、甲醇水溶液或乙腈水溶液。

优选的，所述步骤(2)中流动相A与流动相B的体积比为30:70～70:30。

优选的，所述步骤(2)中流动相A与流动相B的体积比为38:62～42:58。

优选的，所述步骤(2)中流动相A与流动相B的体积比为40:60。

优选的，所述步骤(2)流动相中甲酸水溶液的体积浓度为0.05～0.15％。

优选的，所述质谱的条件还包括：碎裂电压为70～90V。

优选的，所述流动相流速为0.5mL/min。

优选的，步骤(2)中所述色谱柱的规格为柱长100mm、内径4.6mm，填料粒径2.7μm。

本发明所提供的检测方法，专属性好，灵敏度高，小范围内改变流速、流动相比例、柱温等色谱条件不会影响伏立康唑基因毒杂质L-樟脑磺酸酯的检出，且本发明提供的检测方法能准确定量基因毒杂质L-樟脑磺酸甲酯与L-樟脑磺酸乙酯，各峰分离度、理论塔板数均较好。

附图说明

图1为实施例1中本发明空白溶剂谱图；

图2为实施例1中L-樟脑磺酸甲酯与L-樟脑磺酸乙酯定位谱图；

图3为实施例1中伏立康唑溶液谱图；

图4为实施例1中伏立康唑-L-樟脑磺酸酯混合溶液谱图；

图5为实施例1中***适用性谱图；

图6为实施例2中流速为0.4ml/min时混合溶液谱图；

图7为实施例2中流速为0.6ml/min时混合溶液谱图；

图8为实施例2中柱温为33℃时混合溶液谱图；

图9为实施例2中柱温为37℃时混合溶液谱图；

图10为实施例2中流动相为0.1％甲酸水溶液-甲醇(38:62)时混合溶液谱图；

图11为实施例2中流动相为0.1％甲酸水溶液-甲醇(42:58)时混合溶液谱图；

图12为实施例4中定量限谱图；

图13为实施例4中检测限谱图；

图14为L-樟脑磺酸甲酯的线性图；

图15为L-樟脑磺酸乙酯的线性图。

具体实施方式

本发明提供了一种L-樟脑磺酸甲酯和L-樟脑磺酸乙酯的检测方法，包括如下步骤：

(1)将待测样品溶解于溶剂中，得到待测液；

(2)采用高效液相色谱-质谱联用对所述待测液进行检测，得到谱图；

所述液相色谱-质谱检测中液相色谱的条件为：

色谱柱：填料为十八烷基硅烷键合硅胶；

柱温：33～37℃；

流动相：流动相A：甲酸水溶液；流动相B：甲醇或乙腈；

流动相流速：0.4～0.6mL/min；

高效液相色谱-质谱中质谱的条件为：

ESI源；正离子扫描模式；

(3)根据所得谱图计算得到待测样品中L-樟脑磺酸甲酯和L-樟脑磺酸乙酯的含量。

本发明将待测样品溶解于溶剂中，得到待测液。

在本发明中，所述溶剂优选为甲醇、乙腈、甲醇水溶液或乙腈水溶液；所述甲醇水溶液的体积浓度优选≥30％；所述乙腈水溶液的浓度优选≥30％，更优选为50％。在本发明中，上述溶剂对目标待测物没有干扰。

在本发明中，所述待测样品优选为伏立康唑，所述待测液中伏立康唑的浓度优选为1.5mg/mL。

在本发明中，优选配制L-樟脑磺酸甲酯与L-樟脑磺酸乙酯的混合溶液，作为定位溶液，用于确定L-樟脑磺酸甲酯与L-樟脑磺酸乙酯的出峰位置，在本发明实施例中，所述定位溶液的溶剂与待测样品的溶剂相同，定位溶液中L-樟脑磺酸甲酯和L-樟脑磺酸乙酯的浓度优选均为0.05μg/mL。采用与待测液相同的检测条件，进行液相色谱-质谱检测，即可定位L-樟脑磺酸甲酯与L-樟脑磺酸乙酯。

得到待测液后，本发明采用高效液相色谱-质谱联用对所述待测液进行检测，得到谱图。

在本发明中，所述高效液相色谱-质谱联用中液相色的条件为：

色谱柱:填料为十八烷基硅烷键合硅胶；色谱柱的规格优选为柱长100mm、内径4.6mm，填料粒径2.7μm(即100×4.6mm，2.7μm)；在本发明实施例中，所述色谱柱优选为InfinityLab Poroshell 120EC-C18；

柱温为33～37℃，优选为35℃；

流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为甲酸水溶液；流动相B为甲醇或乙腈，所述甲酸水溶液的体积浓度优选为0.05～0.15％，更优选为0.1％，所述流动相A和流动相B的体积比优选为30:70～70:30，更优选为38:62～42:58，最优选为40:60；

流动相流速为0.4～0.6mL/min，优选为0.5mL/min；

进样量优选为10μL。

在本发明中，所述高效液相色谱-质谱联用中质谱的条件为：

ESI源；正离子扫描模式。

在本发明中，所述质谱的其他条件为：选择离子监测优选为m/z269.0～269.2和m/z283.0～283.2，更优选为m/z269.1和m/z283.1；干燥器温度优选为350℃；干燥气流量优选为12.0L/min；雾化器压力优选为35psi；毛细管电压优选为3000V，碎裂电压优选为70～90V，更优选为80V。

在本发明中，在上述液相色谱和质谱的条件下进行检测时，L-樟脑磺酸甲酯与L-樟脑磺酸乙酯均有很好的响应，且空白试剂与样品无干扰，谱图中各峰的分离度和理论板数均较好，能够准确的检测伏立康唑中L-樟脑磺酸甲酯与L-樟脑磺酸乙酯。

得到谱图后，本发明根据所得谱图计算得到待测样品中L-樟脑磺酸甲酯和L-樟脑磺酸乙酯的含量。

在本发明中，根据所得谱图计算得到待测样品中L-樟脑磺酸甲酯和L-樟脑磺酸乙酯的含量的方法优选为外标法，更优选为单点外标法。

本发明对所述单点外标法的具体方法没有特殊限定，采用常规的单点外标法即可，在本发明实施例中，所述单点外标法优选为根据对照品溶液中L-樟脑磺酸甲酯或L-樟脑磺酸乙酯的浓度和峰面积计算出待测液中目标待测物(L-樟脑磺酸甲酯或L-樟脑磺酸乙酯)的浓度，然后根据式(1)计算得到目标待测物在伏立康唑中的含量。

其中，X为目标待测物的质量百分含量，C为待测液中目标待测物的浓度，V为待测液的体积，m为待测液中伏立康唑的质量。

在本发明中，所述对照品溶液中L-樟脑磺酸甲酯或L-樟脑磺酸乙酯的浓度优选为≤0.05μg/mL。

本发明所用试剂，如无特殊说明，均为色谱纯级别的试剂。

下面结合实施例对本发明提供的一种L-樟脑磺酸甲酯和L-樟脑磺酸乙酯的检测方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

本发明实施例中使用的仪器与试剂如下：

仪器：Agilent1260-6120B；

色谱柱:InfinityLab Poroshell 120EC-C18，100×4.6mm，2.7μm；

溶剂：甲醇(HPLC，Honeywell)，乙腈(HPLC，Honeywell)，甲酸(AR，aladdin)；

试药：伏立康唑原料(厂家：扬子江药业集团江苏海慈生物药业有限公司，批号17031701，纯度为100％；L-樟脑磺酸甲酯(含量：99.70％，厂家：Hi-CHEMIC，批号：XH18-1896)；L-樟脑磺酸乙酯(含量：96.55％，厂家：山东博洛德，批号：FLKZZZ-170625)。

实施例1

专属性及***适用性实验：

空白试剂：乙腈体积浓度为50％的乙腈-水溶液；

配制定位溶液：用乙腈体积浓度为50％的乙腈-水溶液配制L-樟脑磺酸甲酯和L-樟脑磺酸乙酯的混合溶液，作为定位溶液；其中L-樟脑磺酸甲酯和L-樟脑磺酸乙酯的浓度均为0.05μg/mL；

伏立康唑溶液的配制：用乙腈体积浓度为50％的乙腈-水溶液溶解伏立康唑原料(伏立康唑原料的纯度为100％)，配制浓度为1.5mg/mL的伏立康唑溶液；

伏立康唑-L-樟脑磺酸酯溶液的配制：将30mg伏立康唑溶解于20mL定位溶液中，得到伏立康唑-L-樟脑磺酸酯溶液；

按照如下条件，分别对空白试剂、定位溶液、伏立康唑溶液和伏立康唑-L-樟脑磺酸酯溶液进行检测：

色谱柱：InfinityLab Poroshell 120EC-C18，100(柱长)×4.6(内径)mm，2.7μm

液相色谱条件：以0.1％甲酸水溶液(流动相A)-甲醇(流动相B)为流动相，其中0.1％甲酸水溶液和甲醇的体积比为40:60；柱温为35℃；流速为0.5mL/min。

质谱条件：ESI源；正离子扫描模式；选择离子监测(IM)：m/z269.1和m/z283.1；干燥器温度：350℃；干燥气流量：12.0L/min；雾化器压力：35psi；毛细管电压：3000V，碎裂电压：80V。

检测结果如图1～4所示，其中图1为空白试剂的谱图，根据图1可以看出，溶剂对各种杂质的检测没有干扰；根据图2～4可以看出，L-樟脑磺酸甲酯与L-樟脑磺酸乙酯分离度良好，空白溶剂和伏立康唑样品均不干扰各杂质的检测，说明本发明的检测方法专属性好。

按照前述定位溶液的配制方法重新配制定位溶液，然后采用前述测试方法进行***适用性实验，结果如图5和表1所示。

表1***适用性结果

从上表可以看出，L-樟脑磺酸甲酯与L-樟脑磺酸乙酯分离度大于1.5，L-樟脑磺酸甲酯和L-樟脑磺酸乙酯理论塔板数均大于5000，说明本发明的检测方法***适用性良好。

实施例2

耐用性测试：

按照实施例1中的方法配制伏立康唑-L-樟脑磺酸酯混合液。

分别设置液相色谱条件中的流速为0.4mL/min和0.6mL/min，其他条件和实施例1一致，将伏立康唑-L-樟脑磺酸酯混合液用液质联用仪检测，所得谱图如图6～图7所示；

分别设置液相色谱条件中的柱温为33℃和37℃，其他条件和实施例1一致，将伏立康唑-L-樟脑磺酸酯混合液用液质联用仪检测，所得谱图如图8～图9所示。

分别设置流动相0.1％甲酸水溶液-甲醇比例为42:58和38:62，其他条件和实施例1一致，将伏立康唑-L-樟脑磺酸酯混合液用液质联用仪检测，所得谱图如图10～图11所示；

根据图6～图11可知，流速在0.4～0.6mL/min时、柱温为33℃～37℃时、流动相0.1％甲酸-甲醇比例为42:58～38:62时，供试品均不干扰L-樟脑磺酸酯的检测，且分离度较好，说明本发明的检测方法耐用性良好。

实施例3

溶液的稳定性检测：

按照实施例1中的方法配制伏立康唑-L-樟脑磺酸酯混合液和定位溶液，分别在放置第0h、2h、4h、8h、12h、18h和24h对伏立康唑-L-樟脑磺酸酯混合液(记为混合溶液)和定位溶液进行检测，统计检测得到的峰面积，检测条件和实施例1相同。结果如表2所示：

表2溶液稳定性测试结果

其中：MCS为L-樟脑磺酸甲酯，ECS为L-樟脑磺酸乙酯。

由表1可知，混合溶液与定位溶液在室温放置24小时内，L-樟脑磺酸甲酯和L-樟脑磺酸乙酯的峰面积RSD均小于10.0％，说明二者放置24h能够保持稳定。

实施例4

检测限与定量限的测定：

取高浓度的L-樟脑磺酸甲酯与L-樟脑磺酸乙酯的混合溶液(溶剂为乙腈体积浓度为50％的乙腈-水溶液)，分别逐级稀释，进样，检测条件与实施例1相同，以当信噪比约为3:1时即为检测限溶液，当信噪比约为10:1时即为定量限溶液。

结果如下：L-樟脑磺酸甲酯与L-樟脑磺酸乙酯的定量限均为2.1ng/mL，谱图见图12，检测限均为0.41ng/mL，谱图见图13，满足测定要求。

实施例5

线性关系与线性范围：

在定量限～限度浓度(0.5μg/mL)的200％范围内配制L-樟脑磺酸甲酯和L-樟脑磺酸乙酯的线性溶液，线性溶液的浓度依次为0.002μg/mL、0.010μg/mL、0.026μg/mL、0.052μg/mL、0.072μg/mL、0.103μg/mL，并进行检测，检测条件和实施例1一致，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，结果如图14和图15所示。

L-樟脑磺酸甲酯在浓度0.002～0.103μg/mL范围内，浓度与峰面积的线性方程为y＝2953342x-648，r＝0.9997。

L-樟脑磺酸乙酯在浓度0.002-0.103μg/mL范围内，浓度与峰面积的线性方程为y＝2606485x-868，r＝0.9992。

由上述结果可知，L-樟脑磺酸甲酯与L-樟脑磺酸乙酯在定量限～限度浓度(0.5μg/mL)的200％范围内，峰面积和浓度的线性关系良好。

实施例6

准确度测试：在伏立康唑溶液(按照实施例1的方法配制得到)中加入L-樟脑磺酸酯，得到加标样品，以浓度为0.05μg/mL的L-樟脑磺酸酯溶液为对照品溶液，溶剂与伏立康唑溶液相同，测试条件和实施例1一致，采用单点外标法计算出加标样品中L-樟脑磺酸酯的量，即为测得量，以测得量与加入量的比值作为回收率，结果如表3和表4所示；

表3L-樟脑磺酸甲酯准确度测试结果

表4L-樟脑磺酸乙酯准确度试验结果

根据表3～4的测试结果可知，本发明检测方法的回收率范围在80％～120％范围内，各杂质回收率RSD％均小于10％，说明本发明的检测方法准确度良好，测定结果可靠。

综上所述，本发明提供的检测方法专属性好，耐用性好，小范围内改变流速、柱温及流动相比例等色谱条件不会影响伏立康唑基因毒杂质L-樟脑磺酸酯的检出；本发明提供的方法能够准确检测伏立康唑中各基因毒杂质。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种L-樟脑磺酸甲酯和L-樟脑磺酸乙酯的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将待测样品溶解于溶剂中，得到待测液；

(2)采用高效液相色谱-质谱联用对所述待测液进行检测，得到谱图；

所述高效液相色谱-质谱联用中液相色谱的条件为：

色谱柱：填料为十八烷基硅烷键合硅胶；

柱温：33～37℃；

流动相：流动相A：甲酸水溶液；流动相B：甲醇或乙腈；

流动相流速：0.4～0.6mL/min；

所述高效液相色谱-质谱联用中质谱的条件为：

ESI源；正离子扫描模式；

(3)根据所得谱图计算得到待测样品中L-樟脑磺酸甲酯和L-樟脑磺酸乙酯的含量。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述待测样品为伏立康唑。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中溶剂为甲醇、乙腈、甲醇水溶液或乙腈水溶液。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中流动相A与流动相B的体积比为30：70～70：30。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中流动相A与流动相B的体积比为38:62～42:58。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中流动相A与流动相B的体积比为40:60。

7.根据权利要求1和4～6任一项所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)流动相中甲酸水溶液的体积浓度为0.05～0.15％。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述质谱的条件还包括：碎裂电压为70～90V。

9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述流动相流速为0.5mL/min。

10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述色谱柱的规格为柱长100mm、内径4.6mm，填料粒径2.7μm。

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