CN114264765A

CN114264765A - 一种利用hplc测定格列美脲中间体中有关物质的分析方法

Info

Publication number: CN114264765A
Application number: CN202010971754.7A
Authority: CN
Inventors: 吴晓桐; 陆海波; 郭美丽; 王冉; 胡玉敬
Original assignee: Jiangsu Wanbang Biopharmaceutical Group Co ltd; Xuzhou Wanbang Jinqiao Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Wanbang Biopharmaceutical Group Co ltd; Xuzhou Wanbang Jinqiao Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2020-09-16
Filing date: 2020-09-16
Publication date: 2022-04-01
Anticipated expiration: 2040-09-16
Also published as: CN114264765B

Abstract

本发明公开一种利用HPLC测定格列美脲中间体中有关物质的分析方法，具体地说涉及一种格列美脲中间体及其中4个杂质的HPLC分析方法。本发明方法所述的色谱柱类型和规格、检测波长、流动相类型、流动相比例、运行时间等具有快速、简便、准确、高效地洗脱、分离和定量检测格列美脲中间体中的各杂质，可实现杂质峰与主峰、杂质与杂质峰之间完全分离，达到最佳检测结果；且分析方法操作方便、运行时间短，专属性强，灵敏度高，稳定性强，在低浓度范围内具有较好的线性曲线，并具有较强的重复性和准确度，不受人员和仪器的影响，稳定可靠，为此类化合物提供了研究开发和质量检测的基础。

Description

一种利用HPLC测定格列美脲中间体中有关物质的分析方法

技术领域

本发明属于化学药物分析方法开发领域，特别涉及一种格列美脲中间体中有关物质的分析方法。

背景技术

4-[2-(3-乙基-4-甲基-2-氧代-3-吡咯啉-甲酰胺基)乙基]苯磺酰胺，CAS：119018-29-0，其结构式如下：

分子式：C₁₆H₂₁N₃O₄S分子量：351.47

格列美脲(glimepiride)是磺酰脲类抗糖尿病药，适用于控制饮食、运动疗法及减轻体重均不能充分控制血糖的2型糖尿病。最早由德国Hoechst Marion Roussel公司于八十年代初期研制开发，首先在德国上市，后在瑞士、瑞典、丹麦等多个国家陆续上市。1995年获得美国仪器药物管理局(FDA)批准，2000年在中国上市。格列美脲作为第三代磺酰脲类降血糖药，与其他磺酰脲类药物相比，具有降糖作用强、服用剂量小、作用时间长、副作用小、安全可靠等优点，被广泛使用，市场需求高。4-[2-(3-乙基-4-甲基-2-氧代-3-吡咯啉-甲酰胺基)乙基]苯磺酰胺为目前国际市场上格列美脲的中间体之一。

为保证药品的安全有效，需全面考察药品质量，而有关物质与药品质量、安全性及疗效密切相关，有关物质的存在可能会降低药物的疗效，甚至引起毒副作用，因此必须对药品中有关物质进行研究、检测和监控，来确保药品质量。4-[2-(3-乙基-4-甲基-2-氧代-3-吡咯啉-甲酰胺基)乙基]苯磺酰胺为关键中间体物料，故对其有关物质检测方法的色谱条件进行研究具有重要意义。

现有技术中没有对格列美脲中间体进行杂质谱研究，并未对已知杂质进行杂质分析和方法学研究，只简单的对格列美脲中间体色谱纯度进行检测。色谱纯度检测中并无4个已知杂质的定位及杂质校正因子的计算。因此对检测格列美脲中间体4-[2-(3-乙基-4-甲基-2-氧代-3-吡咯啉-甲酰胺基)乙基]苯磺酰胺中有关物质的分析方法进行开发。

发明内容

基于背景技术存在的技术问题，本发明提出一种格列美脲中间体中有关物质的分析方法，本发明杂质分离度高，检出杂质多，灵敏度高，能全面快速，准确有效地监控其质量水平。

本发明中名词“格列美脲中间体”、“苯磺酰胺”或“4-[2-(3-乙基-4-甲基-2-氧代-3-吡咯啉-甲酰胺基)乙基]苯磺酰胺”均表示“4-[2-(3-乙基-4-甲基-2-氧代-3-吡咯啉-甲酰胺基)乙基]苯磺酰胺”。

针对上述技术问题，本发明人进行了大量的深入研究，从而提出以下技术方案：一种利用HPLC测定格列美脲中间体中有关物质的分析方法：

固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相；

流动相：以磷酸盐缓冲溶液和有机相体积比为(50～70)：(30～50)形成的混合溶剂为流动相；

柱温：20～30℃；

流速：0.4～1.0ml/min；

检测波长：225nm。

在发明的一种实施例中，本发明所述的样品配制，是用流动相稀释样品，配制成0.05～0.2mg/ml的溶液。

本发明所述的格列美脲中间体为4-[2-(3-乙基-4-甲基-2-氧代-3-吡咯啉-甲酰胺基)乙基]苯磺酰胺，其相关物质如下：

杂质A：3-乙基-4-甲基-3-吡咯啉-2-酮；

杂质B：3-[2-(3-乙基-4-甲基-2-氧代-3-吡咯啉-1-甲酰胺基)-乙基]-苯磺酰胺；

杂质C：2-[2-(3-乙基-4-甲基-2-氧代-3-吡咯啉-1-甲酰胺基)-乙基]-苯磺酰胺；

杂质D：3-乙基-4-甲基-2-氧-3-吡咯啉-N-(2-苯乙基)甲酰胺；

上述杂质结构式如下：

在本发明的一些实施例中，本发明采用的色谱柱长度为150～250mm，优选的长度为150mm；直径为4～5mm，优选直径为4.6mm；填料粒径为2.7～5.0μm，优选的粒径为2.7μm的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱。进一步优选地，色谱柱为：Agilent Poroshell 120PFP五氟苯基柱或柱效相当的色谱柱(150mm*4.6mm，2.7μm)。不同厂家生产的色谱柱具有不同的型号，本领域技术人员可以根据色谱柱型号进行筛选色谱柱。

在本发明的一种实施例中，本发明采用的有机相为甲醇或乙腈，进一步优选地，有机相为乙腈。

在本发明的一种实施例中，本发明所述的磷酸盐缓冲溶液为磷酸二氢铵缓冲溶液。在一些实施例中，磷酸二氢铵缓冲溶液的浓度为0.01～0.1mol/L；在一些实施例中，磷酸二氢铵缓冲溶液的pH为3.0-5.0。

在本发明的一种实施例中，本发明采用的流动相为磷酸二氢铵缓冲溶液和乙腈的体积比为50～70：30～50，进一步优选地，磷酸二氢铵缓冲溶液和乙腈的体积比为60：40。

在本发明的一些实施例中，洗脱时间为25～60min，优选为30min。

在本发明的一种实施例中，流动相的流速优选为0.5ml/min。

在本发明的一种实施例中，柱温优选为25℃。

在本发明的一些实施例中，进样量为10～20μl；在本发明的一种具体的实施例中，进样量优选为20μl。

在本发明的一种实施例中，本发明对该方法进行专属性试验，使用流动相进行等度洗脱的具体步骤为：分别配制***适用性溶液，供试混合溶液，格列美脲中间体对照溶液，格列美脲中间体供试溶液，各组分定位溶液并进样，并按面积归一化法计算各杂质含量。

在一种实施例中，使用流动相进行等度洗脱的具体步骤为：空白流动相进样。

在一种实施例中，对该分析方法进行检测限、定量限试验，使用流动相进行等度洗脱的具体步骤为：分别配制格列美脲中间体及各杂质的检测限溶液和定量限溶液分别进样，并计算检测限度和定量限度。

在一种实施例中，对该分析方法进行线性与范围试验，使用流动相进行等度洗脱的具体步骤为：分别配制格列美脲中间体及各杂质的不同浓度的线性溶液(定量限浓度至限度浓度的120％)分别进样，并计算线性方程和线性范围。在一种实施例中，对该分析方法进行重复性和中间精密度试验，使用流动相进行等度洗脱的具体步骤为：配制重复性溶液和中间精密度溶液分别进样，并计算各自溶液的RSD。

在一种实施例中，对该分析方法进行准确度试验，使用流动相进行等度洗脱的具体步骤为：分别配制20％加样回收溶液、50％加样回收溶液和120％加样回收溶液别进样，并计算各自溶液的回收率。

在一种实施例中，对该分析方法进行溶液稳定性试验，使用流动相进行等度洗脱的具体步骤为：配制每1ml中约含1mg格列美脲中间体的供试品溶液，并分别于配制后0、12、24、36h、48h进样，并计算主峰及各杂质峰的含量，并统计杂质个数。

本发明所述的分析分离方法，可以依照以下方法实现：

(1)色谱条件：以五氟苯基侧链基团键合硅胶为固定相，色谱柱长度为150mm、粒径为2.7μm，以磷酸二氢铵缓冲溶液和乙腈的混合溶剂作为流动相，流速为0.5ml/min，检测波长为225nm；

(2)样品溶液的配制：将待检测样品和杂质对照品用流动相稀释并配制成样品溶液；

(3)分离分析：将样品溶液20μl，注入高效液相色谱仪，完成格列美脲中间体及其杂质有关物质的测定。

本发明中，通过所述的色谱条件可以有效地分析监控格列美脲中间体4-[2-(3-乙基-4-甲基-2-氧代-3-吡咯啉-甲酰胺基)乙基]苯磺酰胺中的有关物质。本发明所述的分析方法，色谱柱、检测波长、流动相比例设置等对苯磺酰胺与其各杂质以及各杂质与杂质间的分离度及各物质的响应信号有较大影响。因此，发明人通过综合考虑色谱柱、检测波长、流动相类型、流动相比例、样品稀释剂和进样量对分离检测的综合影响，使检测结果达到最优化，具有快速、简便、准确、高效地洗脱、分离和定量检测苯磺酰胺中的各杂质，可实现苯磺酰胺主峰与其各杂质峰、杂质与杂质峰之间完全分离，分离度均满足要求。且该分析方法操作方便，具有很高的灵敏度及稳定性，适用于分离检测和监控格列美脲中间体4-[2-(3-乙基-4-甲基-2-氧代-3-吡咯啉-甲酰胺基)乙基]苯磺酰胺中的有关物质，从而有效控制原料药的质量。该检测方法专属性强、灵敏度高，操作方便，可有效控制药品质量。

本发明所述的流动相和洗脱时间，可以将格列美脲中间体及其杂质在同一色谱条件下进行快速高效的分离，有效检测中间体质量，进而保证原料药的质量。该分析方法操作方便，快速有效，且具有很高的灵敏度及稳定性，为此类化合物提供了研究开发和质量检测的基础。且分析方法操作方便、运行时间短，专属性强，灵敏度高，稳定性强，在低浓度范围内具有较好的线性曲线，并具有较强的重复性和准确度，不受人员和仪器的影响，稳定可靠。

本发明方法通过综合考虑色谱柱类型和规格、检测波长、流动相类型、流动相比例、运行时间、样品稀释剂和进样量对分离检测的综合影响，使检测结果达到最优化，具有快速、简便、准确、高效地洗脱、分离和定量检测格列美脲中间体中的各杂质，可实现杂质峰与主峰、杂质与杂质峰之间完全分离。且分析方法操作方便、运行时间短，专属性强，灵敏度高，稳定性强，在低浓度范围内具有较好的线性曲线，并具有较强的重复性和准确度，不受人员和仪器的影响，稳定可靠。为此类化合物提供了研究开发和质量检测的基础。

附图说明

图1为***适用性溶液。

图2为供试混合溶液。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1不同色谱柱的对比

高效液相色谱条件：

分别对Agilent Poroshell 120PFP色谱柱(150*4.6mm,2.7μm)、Welch UltimateAQ-C18色谱柱(250*4.6mm,5μm)、Welch Ultimate XB-C18色谱柱(250*4.6mm,5μm)色谱柱进行试验，采用以磷酸调节的pH为3.5的0.01mol/L的磷酸二氢铵缓冲溶液和甲醇的体积比为50:50为流动相，检测波长225nm，流速1.0ml/min或0.5ml/min，柱温25℃，进样量20μl，进行等度洗脱。

样品配制：

***适用性溶液：称取苯磺酰胺对照品及各杂质对照品适量，制成每1ml中约含苯磺酰胺对照品0.1mg、杂质A0.5μg、杂质B 0.5μg、杂质C 0.5μg及杂质D 0.5μg的混合溶液。

试验操作：取***适用性溶液20μl分别进样，记录色谱图。结果见表1。

表1色谱柱筛选结果汇总表

从表1可以看出，本发明所采用的Agilent Poroshell 120PFP色谱柱(150*4.6mm,2.7μm)相对于其他色谱柱分离度较好，组分响应高，灵敏度高，运行时间短，流速慢。

实施例2有机相的对比

高效液相色谱条件：

分别对甲醇作为有机相和乙腈作为有机相进行试验，色谱柱为AgilentPoroshell 120PFP色谱柱(150*4.6mm,2.7μm)，采用以磷酸调节的pH为3.5的0.01mol/L的磷酸二氢铵缓冲溶液和有机相的体积比为50:50为流动相，检测波长225nm，流速0.5ml/min，柱温25℃，进样量20μl，进行等度洗脱。

样品配制同实施例1。

试验操作：取***适用性溶液20μl分别进样，记录色谱图。结果见表2。

表2有机相筛选结果汇总表

从表2可以看出，采用甲醇或乙腈均可出峰，有机相选用本发明优选的乙腈时，各组分出峰时间较早。

实施例3流动相比例的对比

高效液相色谱条件：

分别对流动相比例进行试验，色谱柱为Agilent Poroshell 120PFP色谱柱(150*4.6mm,2.7μm)，采用以磷酸调节的pH为3.5的0.01mol/L的磷酸二氢铵缓冲溶液和乙腈的混合溶剂为流动相，检测波长225nm，流速0.5ml/min，柱温25℃，进样量20μl，进行等度洗脱。

样品配制同实施例1。

试验操作：取***适用性溶液20μl分别进样，记录色谱图。结果见表3。

表3流动相比例筛选结果汇总表

从表2可以看出，当选用本发明所述的比例为0.01mol/L的磷酸二氢铵缓冲溶液和乙腈的体积比为60：40作为流动相时，可以实现最佳的出峰时间且分离性好。并且该方法运行时间优选为30min。

实施例4

高效液相色谱条件：

色谱柱为Agilent Poroshell 120PFP色谱柱(150*4.6mm,2.7μm)，采用以磷酸调节的pH为3.5的0.01mol/L的磷酸二氢铵缓冲溶液和乙腈的体积比为60：40为流动相，检测波长225nm，流速0.5ml/min，柱温25℃，进样量20μl，进行等度洗脱。

样品配制：

格列美脲中间体对照溶液：称取对照品，用流动相定容至刻度，得每1ml中约含苯磺酰胺0.1mg的对照溶液。

格列美脲中间体供试溶液：称取供试品，用流动相定容至刻度，得每1ml中约含苯磺酰胺0.1mg的供试溶液。

组分定位溶液：称取各组分对照品适量，分别制成每1ml中约含0.5μg的杂质A定位溶液、每1ml中约含0.5μg的杂质B定位溶液、每1ml中约含0.5μg的杂质C定位溶液、每1ml中约含0.5μg的杂质D定位溶液和每1ml中约含0.5μg的苯磺酰胺定位溶液。

供试混合溶液：称取苯磺酰胺供试品及各杂质对照品适量，制成每1ml中约含苯磺酰胺供试品0.1mg、杂质A0.5μg、杂质B 0.5μg、杂质C 0.5μg及杂质D0.5μg的混合溶液。

试验操作：取各组分定位溶液、***适用性溶液和供试混合溶液各20μl分别进样，记录色谱图至30min。

典型色谱图见图1***适用性溶液色谱图、图2供试混合溶液色谱图。

对本发明通过***适用性溶液、供试混合溶液、各杂质定位溶液进行专属性验证，结果见表4、表5和图1、图2。

表4专属性试验结果1

表5专属性试验结果2

由表3和图1、图2可以看出，本发明所述的色谱条件下，苯磺酰胺和各杂质均可有效检出，***适用性溶液色谱图、供试混合溶液色谱图中，苯磺酰胺及各杂质峰的保留时间(t_R)与相应定位溶液色谱图中主峰保留时间(t_R)一致。

由表2和图1可以看出，***性溶液图谱中，出峰顺序依次为杂质A、苯磺酰胺、杂质B、杂质C和杂质D。主峰苯磺酰胺与杂质B峰之间的分离度大于1.5、杂质与杂质之间的分离度大于1.5。并且5针***适用性溶液RSD均≤1.0％。

实施例5

高效液相色谱条件同实施例4。

样品配制：采用空白流动相作为空白溶剂进行检测。

试验操作：取空白溶剂20μl进样，记录色谱图至30min。

本发明人选用的空白溶剂对本发明进行了研究，流动相色谱图中，主峰苯磺酰胺、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D出峰位置附近无显著干扰峰。证明空白溶剂对本发明没有干扰。

实施例6

高效液相色谱条件同实施例4。

样品配制：

检测限溶液：苯磺酰胺及各杂质信噪比约为3：1的溶液。

定量限溶液：苯磺酰胺及各杂质信噪比约为10：1的溶液。

试验操作：取检测限溶液和定量限溶液各20μl分别进样，记录色谱图至30min。

本发明人对苯磺酰胺及各杂质的检测限、定量限进行验证，结果见表6。

表6检测限、定量限试验结果

由表6可以看出，本发明主峰苯磺酰胺的检测灵敏度高。

实施例7

高效液相色谱条件同实施例4。

样品配制：

溶液一：分别配制苯磺酰胺及各杂质限度浓度120％的溶液。

溶液二：分别配制苯磺酰胺及各杂质限度浓度100％的溶液。

溶液三：分别配制苯磺酰胺及各杂质限度浓度60％的溶液。

溶液四：分别配制苯磺酰胺及各杂质限度浓度20％的溶液。

溶液五：分别配制苯磺酰胺及各杂质定量限浓度的溶液。

试验操作：分别取苯磺酰胺及各杂质的五个线性溶液各20μl，分别进样，记录色谱图至30min。

本发明人对苯磺酰胺及各杂质的线性与范围进行验证，结果见表7。

表7线性与范围试验结果

峰名称	线性方程	相关系数R<sup>2</sup>	浓度范围(ug/ml)
				苯磺酰胺	y＝0.2683x+0.0157	0.9999	0.0083-6.024
杂质A	y＝0.2389x+0.0195	0.9996	0.0050-6.013
				杂质B	y＝0.1976x+0.0318	0.9998	0.0106-5.987
杂质C	y＝0.2269x+0.0177	0.9998	0.0119-6.045
				杂质D	y＝0.1753x+0.0479	0.9996	0.0294-5.989

由表7可以看出，本发明主峰苯磺酰胺及其杂质在其定量限浓度至限度浓度的120％之间线性关系良好。

实施例8

高效液相色谱条件同实施例4。

样品配制：

苯磺酰胺供试溶液：称取供试品，用流动相定容至刻度，得每1ml中约含三苯基溴化膦0.1mg的供试溶液。重复性为一个实验员配6份供试溶液；中间精密度为两个实验员分别配6份供试溶液，共12份。

试验操作：取供试溶液20μl分别进样，记录色谱图至30min。

本发明人对三苯基溴化膦及各杂质的重复性和中间精密度进行验证，结果见表8。

表8重复性和中间精密度试验结果

从表8得出主峰及各杂质重复性和中间精密度测得的RSD均符合接受标准。由此可以看出，该发明具有良好的可重复性和中间精密度。

实施例9

高效液相色谱条件同实施例4。

样品配制：

样品配制：称取苯磺酰胺供试品、各杂质对照品适量，配制限度浓度20％加样回收溶液、限度浓度50％加样回收溶液和限度浓度120％加样回收溶液。

试验操作：取20％加样回收溶液、50％加样回收溶液和120％加样回收溶液各20μl分别进样，记录色谱图至30min。

本发明人对苯磺酰胺各杂质的准确度进行验证，结果见表9。

表9准确度试验结果

从表9可以看出各杂质的加标回收率符合可接受标准，说明该发明能够准确稳定的检测各杂质含量。

实施例10

高效液相色谱条件同实施例4。

样品配制：

苯磺酰胺供试溶液：称取供试品，用流动相定容至刻度，得每1ml中约含三苯基溴化膦0.1mg的供试溶液。

试验操作：取供试溶液分别于0、12、24、36、48h各20μl，分别进样，记录色谱图至30min。

本发明人对苯磺酰胺及各杂质的溶液稳定性进行验证。

结果表明，供试品溶液放置48h，均未检出更多杂质，48h内稳定。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种利用HPLC测定格列美脲中间体中有关物质的分析方法，其特征在于：

(1)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱为固定相，以磷酸盐缓冲溶液和有机相体积比为(50～70)：(30～50)形成的混合溶剂为流动相；流速为0.4～1.0ml/min，柱温为20～30℃，检测波长为225nm。

2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于：待检样品用流动相稀释配制成样品溶液，优选的，配制成0.05～0.2mg/ml的溶液。

3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于：格列美脲中间体为4-[2-(3-乙基-4-甲基-2-氧代-3-吡咯啉-甲酰胺基)乙基]苯磺酰胺，相关物质如下：

杂质A：3-乙基-4-甲基-3-吡咯啉-2-酮；

杂质D：3-乙基-4-甲基-2-氧-3-吡咯啉-N-(2-苯乙基)甲酰胺。

4.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，色谱柱的长度为150～250mm，优选为150mm；直径为4～5mm，优选直径为4.6mm；填料粒径为2.7～5.0μm，优选的粒径为2.7μm；优选的，色谱柱为Agilent Poroshell 120PFP五氟苯基柱。

5.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，磷酸盐缓冲溶液为磷酸二氢铵缓冲溶液，优选的，磷酸二氢铵缓冲溶液的浓度为0.01～0.1mol/L，优选的，磷酸二氢铵缓冲溶液的pH为3.0-5.0。

6.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，有机相为甲醇或乙腈，优选乙腈。

7.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，流动相磷酸盐缓冲溶液和乙腈的体积比为60：40；优选的，洗脱时间为25～60min，更优选为30min。

8.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，流动相的流速为0.5ml/min。

9.据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，柱温为25℃。

10.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，进样量为10～20μl，优选的，进样量为20μl。