CN112618796B - 一种脱细胞真皮基质材料及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种脱细胞真皮基质材料及其制备方法和应用。所述方法为：真皮原料的预处理；病毒灭活处理：在超声波清洗机中将真皮原料用碱溶液浸泡处理，然后用纯化水洗净；在超声波清洗机中用酸溶液对病毒灭活处理的材料进行脱细胞处理；更换酸溶液后重复脱细胞处理步骤1～5次，得到脱细胞处理材料；在超声波清洗机中依次用磷酸盐缓冲溶液和纯化水对脱细胞处理材料进行清洗，得到脱细胞真皮组织；将脱细胞真皮组织进行冷冻干燥；对材料依次进行裁剪和包装，采用环氧乙烷灭菌，制得脱细胞真皮基质材料。本发明降低了产品的细胞毒性风险，能更好的保留材料的三维结构与胶原蛋白，避免了酶残留导致的免疫原性，更有利于保持材料良好的机械性能。

Description

一种脱细胞真皮基质材料及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种脱细胞真皮基质材料及其制备方法和应用。
背景技术
脱细胞真皮基质(acellular dermal matrix ADM)是用物理、化学等方法将人或动物皮肤中的表皮层及细胞成分彻底去除仅保留真皮中含胶原网架的细胞外基质。脱细胞真皮基质由于完全没有了细胞成分和Ⅰ、Ⅱ型细胞相容性抗原的主要免疫活性，故一般不会诱发排斥反应。但脱细胞真皮基质保留有正常胶原的三维结构和真皮中含胶原支架的细胞外基质能为组织细胞的再生提供一个良好的支架结构，具有创面覆盖、组织缺损填充、引导组织再生和支架等作用。
根据来源的不同脱细胞真皮基质分为异体脱细胞真皮基质(来源主要为尸体皮)和异种脱细胞真皮基质(来源为动物皮以猪皮和牛皮为主)两种。制备过程都是尽可能的去除具有抗原性的细胞(表皮细胞、毛囊、皮脂腺、汗腺及真皮中血管内皮细胞、成纤维细胞等)，保留完整的胶原纤维成分和组织基本结构。早期人们利用反复冻融法、胰酶消化法等制备ADM，但由于这些方法不能完全去除真皮内细胞成分，导致ADM移植后引起宿主强烈的排异反应，而且制备过程也过于复杂，因而并未广泛开展。目前ADM的制备方法主要有DispaseⅡ-Triton法、高渗盐-SDS法、高渗盐-酶消化法、NaOH销蚀法等。
中国专利申请CN 104941008 A公开了一种引导组织再生膜的制备方法及其应用；该发明的方法包括以下步骤：(1)使用表面活性剂溶液浸泡处理离体动物的皮肤；(2)使用碱溶液浸泡处理步骤(1)的产物；(3)使用过氧化物溶液浸泡处理步骤(2)的产物；(4)使用辐照保护试剂溶液浸泡处理步骤(3)的产物；(5)使用缓冲液浸泡处理步骤(4)的产物；(6)将步骤(5)产物依次进行冷冻干燥和辐照灭菌，即得到所述引导组织再生膜。中国专利申请CN109364298A公开了一种脱细胞真皮基质材料的制备方法，其特点是将动物皮去肉去毛后取断层皮片，经脱脂、脱毛、病毒灭活、脱细胞、交联改性、清洗保湿、包装和辐照灭菌工艺得到的脱细胞真皮基质。然而，在上述的脱细胞真皮基质材料的制备方法中，尚存在以下不足：①生产工艺繁琐，不利于大规模生产线的建立；②都使用了离子型或非离子型表面活性剂，处理工程中材料的三维空间结构与胶原蛋白会相应的受到损伤，使产品的力学性能下降，而且表面活性剂本身具有细胞毒性，在去除过程中往往会有残留，增加了产品的细胞毒性风险；③各种化学试剂处理时间长，容易造成材料的胶原变性、蛋白裂解；④使用生物酶时较短的处理时间不能完全去除细胞，而较长的处理时间会导致胶原蛋白和弹性蛋白含量下降，进而导致基质的机械强度下降；⑤在最终灭菌时采用了60Co辐照灭菌，高剂量的辐照对灭菌、灭活病毒是有利的，但对胶原类产品而言，高剂量会导致胶原变性及胶原链状结构的破裂，导致产品力学性能下降、降解过快、热变温度降低等，使产品性能变差；部分工艺虽然增加了产品辐照保护环节，却同时增加了工艺的复杂性，更多试剂的添加使用也导致产品污染风险增大。
发明内容
为了解决现有技术中存在的一个或者多个技术问题，本发明提供了一种脱细胞真皮基质材料及其制备方法和应用。本发明方法降低了产品的细胞毒性风险，脱细胞效果好，能更好的保留材料的三维结构与胶原蛋白，避免了酶残留导致的免疫原性，更有利于保持材料良好的机械性能。
本发明在第一方面提供了一种脱细胞真皮基质材料的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)取动物皮肤组织材料，清除表面脂肪及表皮，并用超声波清洗机洗净，得到预处理后的真皮原料；
(2)在超声波清洗机中将步骤(1)得到的预处理后的真皮原料用碱溶液浸泡处理，然后用纯化水洗净，得到病毒灭活处理的真皮材料；
(3)在超声波清洗机中用酸溶液对步骤(2)得到的病毒灭活处理的真皮材料进行脱细胞处理；
(4)更换所述酸溶液后重复步骤(3)1～5次，得到脱细胞处理材料；
(5)在超声波清洗机中依次用磷酸盐缓冲溶液和纯化水对步骤(4)得到的脱细胞处理材料进行清洗，得到脱细胞真皮组织；
(6)将步骤(5)得到的脱细胞真皮组织进行冷冻干燥；
(7)对步骤(6)中冷冻干燥后的脱细胞真皮组织依次进行裁剪和包装，然后采用环氧乙烷灭菌，制得脱细胞真皮基质材料。
优选地，在步骤(1)中，所述动物皮肤组织材料选自猪、牛或羊的皮肤组织，优选的是，所述动物皮肤组织材料选自猪或牛的皮肤组织。
优选地，所述超声波清洗机的频率为10～40kHz优选为25～40kHz。
优选地，在步骤(2)中，所述碱溶液为KOH溶液和/或NaOH溶液，所述碱溶液的浓度为0.001～1mol/L，所述碱溶液的体积用量为所述预处理后的真皮原料体积的2～20倍；和/或在步骤(2)中，用碱溶液浸泡处理的时间为30～120min。
优选地，在步骤(3)中，所述酸溶液为盐酸、硫酸、硝酸、甲酸中的一种或多种，所述酸溶液的浓度为0.001～1mol/L，所述酸溶液的体积用量为所述预处理后的真皮原料体积的2～20倍；和/或在步骤(3)中，用酸溶液进行脱细胞处理的时间为30～120min。
优选地，在步骤(5)中，所述磷酸盐缓冲溶液的pH值为7.0～7.4，用于配制所述磷酸盐缓冲溶液的试剂为NaCl、KCl、KH2PO4和Na2HPO4，所述磷酸盐缓冲溶液的体积用量为所述预处理后的真皮原料体积的10～30倍；和/或在步骤(5)中，用磷酸盐缓冲溶液进行清洗的时间为30～120min。
优选地，在步骤(6)中，所述冷冻干燥包括如下子步骤：
(a)将步骤(5)得到的脱细胞真皮组织在温度为-30℃下进行预冷冻2h；
(b)将进行预冷冻后的脱细胞真皮组织在温度为-10℃的真空条件下处理10h，然后置于温度为0℃的真空条件下处理10h，以完成脱细胞真皮组织的第一阶段升华过程；
(c)将完成了第一阶段升华过程的脱细胞真皮组织在温度为5℃的真空条件下处理4h，然后置于温度为15℃的真空条件下处理2h，再置于温度为25℃的真空条件下处理2h，最后置于温度为35℃的真空条件下处理2h，以完成脱细胞真皮组织的第二阶段升华过程，由此完成脱细胞真皮组织的冷冻干燥。
优选地，在步骤(7)中，采用无菌特卫强包装袋进行包装；和/或在步骤(7)中，所述环氧乙烷的浓度为600～700mg/L，采用环氧乙烷灭菌的灭菌温度为10～42℃，灭菌湿度为35～65％RH，灭菌时间为1～6h。
本发明在第二方面提供了由本发明在第一方面所述的制备方法制得的脱细胞真皮基质材料。
本发明在第三方面提供了由本发明在第一方面所述的制备方法制得的脱细胞真皮基质材料在制备牙种植或辅助骨再生或引导组织生长的产品中的应用。
本发明与现有技术相比至少具有如下有益效果：
(1)本发明方法提供了一种步骤简捷有效的脱细胞真皮基质材料的制备工艺，有利于工艺的放大生产；工艺简捷，有利于产品进行产业化生产。
(2)本发明在制备过程中未使用表面活性剂等具有细胞毒性的有机溶剂，从而降低了产品的细胞毒性风险。
(3)本发明在制备过程中采用超声波振荡和试剂处理相结合的方式，提高了试剂的处理效率，减少了材料与试剂的接触时间，更好的保留了材料的三维结构与胶原蛋白。
(4)本发明在处理过程中只采用了酸、碱、盐等三类化学试剂，清洗过程中易去除，不会造成产品污染；未使用生物酶等试剂，避免了酶残留导致的免疫原性。
(5)本发明的最终灭菌采用了环氧乙烷灭菌，与60Co辐照灭菌相比，对产品的损坏更小，更有利于保持良好的机械性能。
附图说明
图1是本发明实施例1制得的脱细胞真皮基质材料在×20倍光学显微镜下HE染色后的微结构照片。
图2是本发明实施例2制得的脱细胞真皮基质材料在×20倍光学显微镜下HE染色后的微结构照片。
图3是本发明实施例3制得的脱细胞真皮基质材料在×20倍光学显微镜下HE染色后的微结构照片。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明在第一方面提供了一种脱细胞真皮基质材料的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)取动物皮肤组织材料，清除表面脂肪及表皮，并用超声波清洗机洗净，得到预处理后的真皮原料；
(2)在超声波清洗机中将步骤(1)得到的预处理后的真皮原料用碱溶液浸泡处理，然后用纯化水洗净，得到病毒灭活处理的真皮材料；在本发明中，采用碱溶液处理与超声波清洗机超声波振荡相结合的方式对预处理后的真皮原料进行病毒灭活；
(3)在超声波清洗机中用酸溶液对步骤(2)得到的病毒灭活处理的真皮材料进行脱细胞处理；在本发明中，脱细胞处理步骤采用酸溶液处理进行脱细胞，一方面酸能使细胞成分溶解从而破坏细胞，另一方面DNA等免疫原性物质对酸很不稳定，可以达到完全去除的目的；
(4)更换所述酸溶液后重复步骤(3)1～5次(例如1、2、3、4或5次)，得到脱细胞处理材料；在本发明中，更换所述酸溶液指的不是更换所述酸溶液的种类，而是将步骤(3)中的同一种酸溶液重新配制后再重复步骤(3)进行所述脱细胞处理；在本发明中，重复步骤(3)1～5次，通过多次酸处理，一方面能保证细胞膜充分碎裂使细胞核裸露，另一方面能将裸露出来的DNA等遗传物质充分洗脱。
(5)在超声波清洗机中依次用磷酸盐缓冲溶液和纯化水对步骤(4)得到的脱细胞处理材料进行清洗，得到脱细胞真皮组织；
(6)将步骤(5)得到的脱细胞真皮组织进行冷冻干燥；
(7)对步骤(6)中冷冻干燥后的脱细胞真皮组织依次进行裁剪和包装，然后采用环氧乙烷灭菌，制得脱细胞真皮基质材料。
本发明方法建立了一个步骤简洁有效的脱细胞真皮基质材料制备工艺，有利于工艺的放大生产；在制备过程中，不采用表面活性剂等具有细胞毒性的有机溶剂，从而降低产品的细胞毒性风险；在制备过程中，利用超声波振荡，提高试剂的作用效率，减少试剂的处理时间，能在脱去细胞的同时完整的保留基质的三维空间结构与胶原蛋白成分，使材料具有良好的力学性能；在制备过程中，只采用酸和碱溶液进行脱细胞，不使用生物酶等生物方法，一方面避免了酶残留的风险，另一方面适当的酸碱工艺能使材料具有更好的生物相容性；在本发明中，最终灭菌时采用环氧乙烷灭菌，环氧乙烷可用于不耐高温，不耐湿物品的灭菌，穿透性强，可用于各种难通透部位的灭菌；对物品损坏小，由于EO(环氧乙烷)灭杀微生物是利用烷基化原理而非氧化过程，因此对物品的损坏非常小。本发明方法降低了产品的细胞毒性风险，脱细胞效果好，能更好的保留材料的三维结构与胶原蛋白，避免了酶残留导致的免疫原性，更有利于保持材料良好的机械性能。
根据一些具体的实施方式，本发明中的脱细胞真皮基质材料的制备包括如下步骤：
①真皮原料的预处理：
取动物皮肤组织材料，清除表面脂肪及表皮，并用超声波清洗机洗净，得到预处理后的真皮原料；
②病毒灭活处理：
在超声波清洗机中将步骤①预处理后的真皮原料用碱溶液浸泡处理，然后用纯化水洗净，得到病毒灭活处理的真皮材料；
③脱细胞处理：
在超声波清洗机中用酸溶液对步骤②得到的病毒灭活处理的真皮材料进行脱细胞处理；
④更换步骤③中的酸溶液，重复步骤③1～5次，得到脱细胞处理材料；
⑤清洗：
在超声波清洗机中分别用磷酸盐缓冲溶液和纯化水对步骤④得到的脱细胞处理材料进行清洗，得到脱细胞真皮组织；
⑥成型：
将步骤⑤制得的脱细胞真皮组织进行冷冻干燥；
⑦包装灭菌：
将步骤⑥制得的冻干后的脱细胞真皮组织裁剪成所需尺寸，采用无菌特卫强包装袋进行包装，并采用环氧乙烷灭菌，得到所述脱细胞真皮基质材料；在本发明中，采用的无菌屏障***为特卫强包装袋。
根据一些优选的实施方式，在步骤(1)中，所述动物皮肤组织材料选自猪、牛或羊的皮肤组织，优选的是，所述动物皮肤组织材料选自猪或牛的皮肤组织。
根据一些优选的实施方式，所述超声波清洗机的频率为10～40kHz(例如10、15、20、25、30、35或40kHz)优选为25～40kHz(例如25、30、35或40kHz)。
根据一些优选的实施方式，在步骤(2)中，所述碱溶液为KOH溶液和/或NaOH溶液，所述碱溶液的浓度为0.001～1mol/L(例如0.001、0.005、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1mol/L)，所述碱溶液的体积用量为所述预处理后的真皮原料体积的2～20倍(例如2、4、6、8、10、12、14、16、18或20倍)；和/或在步骤(2)中，用碱溶液浸泡处理的时间为30～120min(例如30、40、50、60、70、80、90、100、110或120min)。在本发明中，优选为所述碱溶液的浓度为0.001～1mol/L，优选为所述碱溶液的体积用量为所述预处理后的真皮原料体积的2～20倍，并且优选为用碱溶液浸泡处理的时间为30～120min；本发明发现，如果所述碱溶液的浓度过小、用量过少或处理时间过短时，不能将残留的脂类杂质充分去除，而如果所述碱溶液浓度过大、用量过多或处理时间过长时，则会导致胶原蛋白水解，破坏真皮基质空间结构。
根据一些优选的实施方式，在步骤(3)中，所述酸溶液为盐酸、硫酸、硝酸、甲酸中的一种或多种，所述酸溶液的浓度为0.001～1mol/L(例如0.001、0.005、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1mol/L)，所述酸溶液的体积用量为所述预处理后的真皮原料体积的2～20倍(例如2、4、6、8、10、12、14、16、18或20倍)；和/或在步骤(3)中，用酸溶液进行脱细胞处理的时间为30～120min(例如30、40、50、60、70、80、90、100、110或120min)。在本发明中，优选为所述酸溶液的浓度为0.001～1mol/L，优选为所述酸溶液的体积用量为所述预处理后的真皮原料体积的2～20倍，并且优选为用酸溶液进行脱细胞处理的时间为30～120min；本发明发现，如果所述酸溶液的浓度过小、用量过少或处理时间过短时，不能充分碎裂细胞膜，也不能将DNA充分洗脱；而如果所述酸溶液的浓度过大、用量过多或处理时间过长时又会使蛋白质变性，破坏基质材料的三维结构和理化性能。
根据一些优选的实施方式，在步骤(5)中，所述磷酸盐缓冲溶液的pH值为7.0～7.4(例如7.0、7.1、7.2、7.3或7.4)，用于配制所述磷酸盐缓冲溶液的试剂为NaCl、KCl、KH2PO4和Na2HPO4，所述磷酸盐缓冲溶液的体积用量为所述预处理后的真皮原料体积的10～30倍(例如10、12、14、16、18、20、22、24、26、28或30倍)；和/或在步骤(5)中，用磷酸盐缓冲溶液进行清洗的时间为30～120min(例如30、40、50、60、70、80、90、100、110或120min)。在本发明中，优选为所述磷酸盐缓冲溶液的pH值为7.0～7.4，并且优选为所述磷酸盐缓冲溶液的体积用量为所述预处理后的真皮原料体积的10～30倍，这是因为，细胞外液的pH值范围是7.35～7.45，选择采用pH值为7.0～7.4的磷酸盐缓冲液来清洗材料，是尽量模拟组织的生理环境，更容易清洗掉残留试剂及杂质，而所述磷酸盐缓冲溶液用量过少会导致清洗次数增加，用量过大又会造成所述磷酸盐缓冲溶液的浪费。
根据一些优选的实施方式，在步骤(5)，用纯化水清洗的时间为30～120min(例如30、40、50、60、70、80、90、100、110或120min)。
根据一些优选的实施方式，在步骤(6)中，所述冷冻干燥包括如下子步骤：
(a)将步骤(5)得到的脱细胞真皮组织在温度为-30℃下进行预冷冻2h；
(b)将进行预冷冻后的脱细胞真皮组织在温度为-10℃的真空条件下处理10h，然后置于温度为0℃的真空条件下处理10h，以完成脱细胞真皮组织的第一阶段升华过程；
(c)将完成了第一阶段升华过程的脱细胞真皮组织在温度为5℃的真空条件下处理4h，然后置于温度为15℃的真空条件下处理2h，再置于温度为25℃的真空条件下处理2h，最后置于温度为35℃的真空条件下处理2h，以完成脱细胞真皮组织的第二阶段升华过程，由此完成脱细胞真皮组织的冷冻干燥。
在本发明中，优选为采用包括上述步骤(a)至(c)的冷冻干燥工艺进行所述冷冻干燥，本发明发现，采用上述冷冻干燥工艺有利于保持脱细胞真皮组织产品的三维结构。
根据一些优选的实施方式，在步骤(7)中，采用无菌特卫强包装袋进行包装；和/或在步骤(7)中，所述环氧乙烷的浓度为600～700mg/L(例如600、610、620、630、640、650、660、670、680、690或700mg/L)，采用环氧乙烷灭菌的灭菌温度为10～42℃(例如10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或42℃)，灭菌湿度为35～65％RH(相对湿度例如为35％、40％、45％、50％、55％、60％或65％RH)，灭菌时间为1～6h(例如1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5或6h)。本发明经过大量创造性试验，得出了本发明最优化的环氧乙烷灭菌参数，本发明最优化的环氧乙烷灭菌参数为：所述环氧乙烷的浓度为600～700mg/L，采用环氧乙烷灭菌的灭菌温度为10～42℃，灭菌湿度为35～65％RH，灭菌时间为1～6h；本发明发现如果环氧乙烷浓度、灭菌温度、灭菌湿度、灭菌时间等参数变小或变少，会导致灭菌不合格；如果各个参数变大或灭菌时间变长，则会使蛋白质变性，产品降解速度变快，环氧乙烷残留量变大。
本发明在第二方面提供了由本发明在第一方面所述的制备方法制得的脱细胞真皮基质材料。
本发明在第三方面提供了由本发明在第一方面所述的制备方法制得的脱细胞真皮基质材料在制备牙种植或辅助骨再生或引导组织生长的产品中的应用。在一些具体的实施方式中，本发明将制得的脱细胞真皮基质材料应用于牙种植中，在牙种植实验中，通过切片图发现本发明制得的脱细胞真皮基质材料具有良好的引导骨组织再生性能。
下文将通过举例的方式对本发明进行进一步的说明，但是本发明的保护范围不限于这些实施例。
实施例1
①真皮原料的预处理：
取动物(牛)皮肤组织材料，清除表面脂肪及表皮，并用超声波清洗机洗净，得到预处理后的真皮原料；其中，超声波清洗机的频率为40kHz。
②病毒灭活处理：
在超声波清洗机中将步骤①预处理后的真皮原料用碱溶液浸泡处理，然后用纯化水洗净，得到病毒灭活处理的真皮材料；其中，超声波清洗机的频率为25kHz，碱溶液为浓度为0.5mol/L的NaOH溶液，碱溶液的体积用量为步骤①预处理后的真皮原料的体积的10倍，用碱溶液浸泡处理的时间为60min。
③脱细胞处理：
在超声波清洗机中用酸溶液对步骤②得到的病毒灭活处理的真皮材料进行脱细胞处理；其中，超声波清洗机的频率为25kHz，酸溶液为浓度为0.5mol/L的盐酸，盐酸的体积用量为步骤①预处理后的真皮原料的体积的10倍，用酸溶液进行脱细胞处理的时间为60min。
④更换步骤③中的酸溶液，重复步骤③两次，得到脱细胞处理材料。
⑤清洗：
在超声波清洗机中分别用磷酸盐缓冲溶液和纯化水对步骤④得到的脱细胞处理材料进行清洗，得到脱细胞真皮组织；其中，超声波清洗机的频率为40kHz，所述磷酸盐缓冲溶液的pH值为7.2，用于配制所述磷酸盐缓冲溶液的试剂为NaCl、KCl、KH2PO4和Na2HPO4，所述磷酸盐缓冲溶液的体积用量为步骤①预处理后的真皮原料体积的20倍；用磷酸盐缓冲溶液进行清洗的时间为60min，纯化水清洗的时间为60min。
⑥成型：
将步骤⑤制得的脱细胞真皮组织进行冷冻干燥；冷冻干燥的具体步骤包括：预冻(温度-30℃、时间2h)→第一阶段升华(温度-10℃、时间10h、抽真空)→(温度0℃、时间10h、抽真空)→第二阶段升华(温度5℃、时间4h、抽真空)→(温度15℃、时间2h、抽真空)→(温度25℃、时间2h、抽真空)→(温度35℃、时间2h、抽真空)→冻干完成。
⑦包装灭菌：
将步骤⑥制得的冻干后的脱细胞真皮组织裁剪成所需尺寸，采用无菌特卫强包装袋进行包装，并采用环氧乙烷灭菌，得到所述脱细胞真皮基质材料；其中，环氧乙烷浓度为670mg/L，灭菌温度为37℃，灭菌湿度为55％RH，灭菌时间为2h。
实施例2
实施例2与实施例1基本相同，不同之处在于：
在步骤②中，碱溶液的体积用量为步骤①预处理后的真皮原料的体积的5倍，用碱溶液浸泡处理的时间为120min。
在步骤③中，盐酸的体积用量为步骤①预处理后的真皮原料的体积的5倍，用酸溶液进行脱细胞处理的时间为120min。
在步骤④中，更换步骤③中的酸溶液，重复步骤③四次，得到脱细胞处理材料。
在步骤⑤中，所述磷酸盐缓冲溶液的体积用量为步骤①预处理后的真皮原料体积的10倍；用磷酸盐缓冲溶液进行清洗的时间为120min，纯化水清洗的时间为120min。
在步骤⑦中，灭菌温度为30℃，灭菌湿度为35％RH，灭菌时间为4h。
实施例3
实施例3与实施例1基本相同，不同之处在于：
在步骤②中，碱溶液的体积用量为步骤①预处理后的真皮原料的体积的20倍，用碱溶液浸泡处理的时间为45min。
在步骤③中，盐酸的体积用量为步骤①预处理后的真皮原料的体积的20倍，用酸溶液进行脱细胞处理的时间为45min。
在步骤⑤中，所述磷酸盐缓冲溶液的体积用量为步骤①预处理后的真皮原料体积的30倍；用磷酸盐缓冲溶液进行清洗的时间为30min，纯化水清洗的时间为30min。
在步骤⑦中，灭菌温度为40℃，灭菌湿度为65％RH，灭菌时间为1h。
将实施例1～3制得的脱细胞真皮基质材料在×20倍光学显微镜下HE染色后观察其微结构，结果分别如图1、图2和图3所示；结果显示，动物皮三维组织构造不变，结构完整，且不带有脂肪和毛根等杂质。从图1至图3观察实施例1、实施例2和实施例3制备的脱细胞真皮皮基质HE染色切片，可以看出：切片视野内基本无完整细胞，未发现细胞核物质，材料***结构完整，说明此脱细胞方法能成功进行脱细胞，并且保留材料的三维结构。
对比例1
对比例1与实施例1基本相同，不同之处在于：
在步骤②中，碱溶液的体积用量为步骤①预处理后的真皮原料的体积的30倍，用碱溶液浸泡处理的时间为150min。
在步骤③中，盐酸的体积用量为步骤①预处理后的真皮原料的体积的30倍，用酸溶液进行脱细胞处理的时间为150min。
在步骤④中，更换步骤③中的酸溶液，重复步骤③六次，得到脱细胞处理材料。
在步骤⑤中，所述磷酸盐缓冲溶液的体积用量为步骤①预处理后的真皮原料体积的40倍；用磷酸盐缓冲溶液进行清洗的时间为120min，纯化水清洗的时间为120min。
在步骤⑦中，灭菌温度为30℃，灭菌湿度为25％RH，灭菌时间为3h。
本对比例中，碱溶液和盐酸的用量过大，并且碱溶液浸泡处理时间和酸溶液进行脱细胞处理时间过长，将导致制得的材料蛋白质变性甚至酸碱水解，破坏材料的各项性能；并且，本对比例中的灭菌工艺可能会造成产品无菌不合格。
对比例2
对比例2与实施例1基本相同，不同之处在于：
在步骤②中，碱溶液的体积用量为步骤①预处理后的真皮原料的体积的2倍，用碱溶液浸泡处理的时间为20min。
在步骤③中，盐酸的体积用量为步骤①预处理后的真皮原料的体积的2倍，用酸溶液进行脱细胞处理的时间为20min。
在步骤④中，更换步骤③中的酸溶液，重复步骤③2次，得到脱细胞处理材料。
在步骤⑤中，所述磷酸盐缓冲溶液的体积用量为步骤①预处理后的真皮原料体积的5倍；用磷酸盐缓冲溶液进行清洗的时间为20min，纯化水清洗的时间为20min。
在步骤⑦中，灭菌温度为30℃，灭菌湿度为25％RH，灭菌时间为3h。
本对比例中，碱溶液和盐酸的用量过少，并且碱溶液浸泡处理时间和酸溶液进行脱细胞处理时间过短，将导致材料脱细胞不完全，容易产生残留脂肪等杂质；而且清洗过程中磷酸盐缓冲溶液试剂用量过少，清洗时间过短，也会造成材料酸碱度不合格，残留DNA超标等问题，破坏材料的各项性能；并且，本对比例中的灭菌工艺可能会造成产品无菌不合格。
将实施例1～3以及对比例1～2制得的脱细胞真皮基质材料进行性能检测。
1、撕裂力检测
撕裂力检测方法为：将实施例1～3以及对比例1～2制得的脱细胞真皮基质材料样品剪成规格为1cm×3cm的长条状，在离短边边缘3-5mm处用4-0号缝合线穿过样品，对折缝合线，在距离穿孔处约5cm处将缝合线打结，防止缝合线脱落；然后将上述样品用纯化水水化3-5分钟，将未穿线的一端固定在拉力试验机的下部，将穿线一端通过挂钩固定于拉力试验机的上部，开始检测，直至试样被撕裂，读取拉伸负荷力的最大值，即为本样品的撕裂力。每个样品取30片进行测试，测得撕裂力的平均值如表1所示。
2、脂肪含量检测脂肪含量的测定方法是依据《中华人民共和国药典》二部“胰酶脂肪检测”制定。实验重复三次，分别取实施例1～3以及对比例1～2中的脱细胞真皮基质材料各1g，检测脂肪含量，结果取三次结果的平均值，如表2所示。
3、DNA残留量检测
将实施例1～3以及对比例1～2制得的脱细胞真皮基质材料进行DNA残留量的检测，方法参照《YY 0606.25-2014组织工程医疗产品第25部分：动物源性生物材料DNA残留量测定法》中的荧光染色法进行检测。实验重复三次，结果取三次结果的平均值，如表3所示。
表1：实施例1～3以及对比例1～2制得的脱细胞真皮基质材料的撕裂力。
实施例 实施例1 实施例2 实施例3 对比例1 对比例2
撕裂力 9.89N 10.04N 9.95N 5.82N 7.36N
表2：实施例1～3以及对比例1～2制得的脱细胞真皮基质材料的脂肪含量。
实施例 实施例1 实施例2 实施例3 对比例1 对比例2
脂肪含量 0.07％ 0.07％ 0.08％ 0.19％ 0.42％
表3：实施例1～3以及对比例1～2制得的脱细胞真皮基质材料的DNA残留量。
实施例 实施例1 实施例2 实施例3 对比例1 对比例2
DNA残留量 8.03ng/mg 7.25ng/mg 7.52ng/mg 35.95ng/mg 367.12ng/mg
本发明从表3中DNA残留量检测的数据可以很直观的表达本发明脱细胞效果，本发明实施例1～3制得的脱细胞真皮基质材料的DNA残留量很少，证明脱细胞效果好，而对比例1～2制得的材料的DNA残留量很大，脱细胞工艺不成功。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (6)

1.一种脱细胞真皮基质材料的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)取动物皮肤组织材料，清除表面脂肪及表皮，并用超声波清洗机洗净，得到预处理后的真皮原料；
(2)在超声波清洗机中在频率为25～40kHz下将步骤(1)得到的预处理后的真皮原料用碱溶液浸泡处理，然后用纯化水洗净，得到病毒灭活处理的真皮材料；所述碱溶液为KOH溶液和/或NaOH溶液，所述碱溶液的浓度为0.5mol/L，所述碱溶液的体积用量为所述预处理后的真皮原料体积的5～20倍；用碱溶液浸泡处理的时间为45～120min；
(3)在超声波清洗机中在频率为25～40kHz下用盐酸溶液对步骤(2)得到的病毒灭活处理的真皮材料进行脱细胞处理；所述盐酸溶液的浓度为0.5mol/L，所述盐酸溶液的体积用量为所述预处理后的真皮原料体积的5～20倍；用盐酸溶液进行脱细胞处理的时间为45～120min；
(4)更换所述盐酸溶液后重复步骤(3)2～4次，得到脱细胞处理材料；
(5)在超声波清洗机中依次用磷酸盐缓冲溶液和纯化水对步骤(4)得到的脱细胞处理材料进行清洗，得到脱细胞真皮组织；
(6)将步骤(5)得到的脱细胞真皮组织进行冷冻干燥；
(7)对步骤(6)中冷冻干燥后的脱细胞真皮组织依次进行裁剪和包装，然后采用环氧乙烷灭菌，制得脱细胞真皮基质材料；所述环氧乙烷的浓度为600～700mg/L，采用环氧乙烷灭菌的灭菌温度为30～42℃，灭菌湿度为35～65％RH，灭菌时间为1～4h；
在步骤(6)中，所述冷冻干燥包括如下子步骤：
(a)将步骤(5)得到的脱细胞真皮组织在温度为-30℃下进行预冷冻2h；
(b)将进行预冷冻后的脱细胞真皮组织在温度为-10℃的真空条件下处理10h，然后置于温度为0℃的真空条件下处理10h，以完成脱细胞真皮组织的第一阶段升华过程；
(c)将完成了第一阶段升华过程的脱细胞真皮组织在温度为5℃的真空条件下处理4h，然后置于温度为15℃的真空条件下处理2h，再置于温度为25℃的真空条件下处理2h，最后置于温度为35℃的真空条件下处理2h，以完成脱细胞真皮组织的第二阶段升华过程，由此完成脱细胞真皮组织的冷冻干燥。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
在步骤(1)中，所述动物皮肤组织材料选自猪、牛或羊的皮肤组织。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
在步骤(5)中，所述磷酸盐缓冲溶液的pH值为7.0～7.4，用于配制所述磷酸盐缓冲溶液的试剂为NaCl、KCl、KH2PO4和Na2HPO4，所述磷酸盐缓冲溶液的体积用量为所述预处理后的真皮原料体积的10～30倍；和/或
在步骤(5)中，用磷酸盐缓冲溶液进行清洗的时间为30～120min。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
在步骤(7)中，采用无菌特卫强包装袋进行包装。
5.由权利要求1至4中任一项所述的制备方法制得的脱细胞真皮基质材料。
6.由权利要求1至4中任一项所述的制备方法制得的脱细胞真皮基质材料在制备牙种植或辅助骨再生或引导组织生长的产品中的应用。
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