KR102451565B1 - 수화형태 무세포화 피부대체재 및 그 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 수화형태의 무세포화 피부대체재 및 그 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서는 계면활성제 및 효소의 사용을 배제한 무세포화 공정을 통해 무세포 진피를 수득하며, 황화나트륨 용액에의 처리 및 생체유래 고분자 용액에의 침지를 통해 부드러운 특성이 부여된 무세포화 피부대체재를 제조할 수 있다.

Description

수화형태 무세포화 피부대체재 및 그 제조방법{PREHYDRATED-TYPE ACELLULAR SKIN SUBSTITUTE AND METHOD OF MAKING THE SAME}
본 발명은 수화형태의 무세포화 피부대체재 및 그 제조방법에 관한 것이다.
무세포 진피(Acellular Dermal Matrix, ADM)란, 사람 내지 동물 피부로부터 무세포화 기술을 통해 얻어지는 진피층 기질로서, 순수한 콜라겐 및 엘라스틴 등으로 구성되는 세포외기질(Extracellular Matrix, ECM) 형태의 생체유래 피부대체재를 의미한다. 이러한 생체유래 피부대체재는 이식용 장기와는 달리 면역거부반응이 상대적으로 낮은 것으로 알려져 있다. 사람유래 피부대체재와 동물유래 피부대체재의 이식 시 면역거부반응 정도의 차이가 있기도 하나, 일반적으로 사람유래 피부대체재가 생물학적 성능 및 안전성에 대해서 동물유래 피부대체재 보다 우수한 것으로 보고되어 있다. 다만, 사람유래 피부대체재는 사후 기증자로부터 피부조직을 기증받아야 하므로, 원료수급 면에서는 제한이 있을 수 있다.
반면, 수술을 요하는 대부분의 의료분과에서 사람 유래인 인체조직의 수요가 날로 증가하는 추세이고, 특히 피부에 관한 수요가 가파르게 상승 중이며, 원재료 및 인체조직 완제품의 수입의존도가 91.5%에 이르는 것으로 보고되었다. 건강보험심사평가원 자료에 따르면, 2016년 human ADM 국내시장(보험급여 기준, 비급여 제외) 규모는 단일품목으로 약 100~200 억원 정도로 추산되고 있다. 이러한 추세에 따라, 인공피부 또는 창상피복재 등의 의료기기 개발이 활발하게 이루어지고는 있으나, 실제 human ADM의 생물학적 성능을 뛰어넘을 만한 피부대체재는 아직까지 보고된 바 없다. 이러한 의료기기 피부대체재의 세계시장규모는 2016년 18억 달러 규모로 평가되고 있다.
무세포 진피를 얻는 과정은 크게 2 단계로 알려져 있다. 1 단계는 준비된 피부 조직으로부터 표피층을 제거하는 단계로서, 표피층과 진피층을 분리한다. 피부의 표피층은 단백질 분해 효소를 이용하여 진피층과 분리시켜 제거할 수 있는데, 통상적으로 진피층과 표피층을 분리하는데 다양한 단백질 분해효소를 사용한다. 효소를 사용하는 경우, 사용 농도가 낮거나 처리시간이 너무 짧으면 분리가 잘 이루어지지 않고, 농도가 높거나 처리시간이 너무 길면 세포나 조직에 손상을 일으키게 된다. 또 다른 방법으로는 용액의 이온강도를 변화시켜 조직의 두 층을 분리하기도 하는데, 이 방법도 역시 이온강도와 처리시간, 처리온도 등의 조건에 따라 효율이 달라진다. 예를 들어, 1몰 이상의 염화나트륨 용액으로 37℃에서 14∼32시간 동안 처리하면 진피층과 표피층을 분리할 수 있다.
2 단계는 1 단계의 표피층 분리 후, 진피층의 세포를 제거하는 단계이다. 면역반응은 주로 세포막에 존재하는 막단백질에 의해 야기되는데, 세포를 제거하면 면역반응을 최소화할 수 있다. 상기 단계는 세포와 세포외기질과의 물리화학적 특성 차이를 이용하여 조직의 손상없이 세포만 선별적으로 제거하는 방법을 이용한다. 세포막의 주성분은 인지질로 여러 가지 계면활성제를 이용하면 조직의 손상없이 세포를 제거할 수 있다. 일반적으로 계면활성제로 소듐도데실설페이트(SDS)와 같은 이온성 계면활성제, 또는 트리톤엑스-100, 트윈20, 트윈40, 트윈60, 트윈80, 노니데트피-10(NP-10), 노니데트피-40(NP-40) 등과 같은 비이온성 계면활성제 등이 이용된다.
그러나, 무세포 진피를 얻기 위한 제조방법 중, 단백질 분해효소를 사용하는 방법은 진피층 자체를 손상시킬 수 있고, 효소가 잔류하여 체내에 이식되는 경우, 환자의 본래 조직에 손상을 줄 수 있으며 심각한 경우엔 면역반응을 일으켜 이식이 거부될 수도 있다. 또한, 일반적으로 사용되는 계면활성제를 이용한 무세포화 방법은 계면활성제의 잔류를 최소화 시키기 위해, 막대한 양의 세척 시간 및 비용 등을 투입해야 하는 단점이 있다. 뿐만 아니라, 계면활성제의 잔류 역시 체내에서 세포 및 조직 독성을 나타내는 원인이 될 수 있다.
따라서, 본 발명에서는 무세포 진피를 수득하는 새로운 방법으로써, 세척이 매우 용이한 염기성 수용액을 이용하여 무세포화 과정을 수행하는 방법을 제공하고자 한다. 또한, 본 발명에서는 무세포화가 완료된 진피 조직에 물리적으로 부드러운 특성을 부여할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.
1. 한국등록특허 제10-0791502호
본 발명은 수화형태의 무세포화 피부대체재 및 그 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
더욱 상세하게는, 본 발명은 계면활성제 및 효소의 사용을 배제한 표피층/진피층 분리 및 무세포화 공정을 통해 얻어지는 무세포 진피를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 무세포 진피의 체내 면역반응을 최소화하는 한편, 황화나트륨 용액의 처리 및 생체유래 고분자 용액에의 침지를 통해 물리적으로 부드러운 특성이 부여된 무세포화 피부대체재를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 a) 피부 조직에서 지질 성분을 제거하는 단계;
b) 상기 지질 성분이 제거된 피부 조직에서 세포를 제거하는 단계;
c) 상기 세포가 제거된 피부 조직을 황화나트륨 용액으로 처리하는 단계;
d) 상기 황화나트륨 용액으로 처리된 피부 조직을 환원하는 단계; 및
e) 상기 환원된 피부 조직을 생체유래 고분자 용액에 침지하여 수화하는 단계를 포함하는 무세포화 피부대체재의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 전술한 제조 방법에 의해 제조된 무세포화 피부대체재를 제공한다.
본 발명에서는 계면활성제 및 효소의 사용을 배제한 무세포화 공정을 통해 무세포 진피를 수득하며, 황화나트륨 용액의 처리 및 생체유래 고분자 용액에의 침지 공정을 통해 무세포화 피부대체재를 제조할 수 있다.
이러한 공정을 통해 제조되는 무세포화 피부대체재는 체내 면역반응을 최소화하는 한편, 상기 피부대체재에 물리적으로 부드러운 특성을 부여할 수 있다.
본 발명에 따른 무세포화 피부대체재는 체내 이식 후 지지체(scaffold)로 작용하여 이식자의 세포들이 이동하여 생장할 수 있는 생리적 공간으로 작용할 수 있다. 또한, 무세포화 피부대체재는 신혈관형성(angiogenesis)으로 시간이 흐름에 따라 이식자의 조직이 되므로, 손상된 조직의 수복 및 성형 용도의 피부대체재로 활용이 가능하다.
도 1은 탈지질 용액을 처리한 후 콜라겐 섬유의 손상여부를 확인하기 위해 SEM으로 촬영한 결과를 나타낸다.
도 2는 탈세포 용액을 처리한 후 콜라겐 섬유의 변형이나 손상을 확인하기 위해 SEM으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 모근 제거를 위해 황화나트륨(Na2S) 용액을 처리한 후 콜라겐 섬유의 변형이나 손상이 없음을 TEM으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 탈지질 용액 처리 후 피부 조직에서 지방이 제거된 것을 Oil Red O 염색을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 탈세포 용액 처리 후 피부 조직에서 표피 및 세포가 제거된 것을 확인하기 위해, 표피와 세포 핵을 각각 면역조직화학염색 및 DAPI 염색한 후 광학현미경 및 형광현미경에서 관찰한 결과를 나타낸다.
도 6은 탈세포 용액 처리 후 피부 조직에서 DNA를 추출하여 정량한 결과를 나타낸다.
도 7은 황화나트륨 용액을 처리한 무세포 진피에서 털 및 모근이 제거된 것을 H&E 염색을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 8은 황화나트륨 용액 처리에 따른 무세포 진피의 유연성 증가를 압점 시험을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 9는 생체유래 고분자 용액에 침지된 무세포 진피의 유연성을 확인하기 위해, 본 발명의 생체유래 고분자 용액에 침지된 무세포 진피와 타사 제품(생체유래 고분자 용액을 사용하지 않음)의 인장강도를 측정한 결과를 나타낸다.
도 10은 황화나트륨 용액과 생체유래 고분자 용액의 사용에 따른 피부의 유연성을 확인하기 위해, 각 피부의 인장강도를 측정한 결과를 나타낸다.
본 발명은 a) 피부 조직에서 지질 성분을 제거하는 단계;
b) 상기 지질 성분이 제거된 피부 조직에서 세포를 제거하는 단계;
c) 상기 세포가 제거된 피부 조직을 황화나트륨 용액으로 처리하는 단계;
d) 상기 황화나트륨 용액으로 처리된 피부 조직을 환원하는 단계; 및
e) 상기 환원된 피부 조직을 생체유래 고분자 용액에 침지하여 수화하는 단계를 포함하는 무세포화 피부대체재의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 실시예에서는 피부 조직의 지방 제거 과정과 세포 제거 과정 중에 사용되는 시약에 의한 피부 조직의 변형 및 손상 정도를 확인하였으며, 무세포화 결과를 나타내었다. 또한, 황화나트륨(Na2S) 용액과 생체유래 고분자 용액을 이용하여 피부에 유연성을 제공한 결과를 확인하였다.
이하, 본 발명에 따른 무세포화 피부대체재의 제조 방법을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에서 무세포화 피부대체재는, 본 발명에 따른 제조 방법에 따라 피부 조직을 처리하여 제조된 생성물을 의미한다. 상기 무세포화 피부대체재는 무세포 진피(Acellular Dermal Matrix, ADM)와 동일한 분야에서 사용될 수 있다.
본 발명에서는 본 발명의 각 단계를 용이하게 구별하기 위하여, 단계 b)까지 수행한 후의 피부 조직을 무세포 진피로 표현하였으며, 단계 e)까지 수행한 후의 피부 조직을 무세포화 피부대체재로 표현하였다.
본 발명에서 피부 조직은 동종 또는 이종의 피부 조직일 수 있다. 상기 동종은 인간을 의미하며, 이종은 인간 이외의 동물, 즉, 돼지, 소, 말 등의 포유류를 의미할 수 있다.
즉, 본 발명에서는 동종 또는 이종 유래의 피부 조직을 사용하여 본 발명의 제조 방법에 따라 무세포화 피부대체재를 제조할 수 있다.
본 발명에서는 단계 a)를 수행하기 전에 피부 조직을 전처리하는 단계(이하, 전처리 단계)를 추가로 수행할 수 있다.
상기 전처리 단계는 피부 조직을 세척하는 단계; 스크래퍼(scrapper)를 사용하여 진피에 붙어있는 근막 조직, 지방 조직 및 기타 이물질을 제거하는 단계; 및 가위와 핀셋을 사용하여 남아 있는 불필요한 조직을 제거하는 단계; 중 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 전처리 단계는 피부 조직에서 진피 부분이 보일 때까지 근막 조직, 지방 조직 및 기타 이물질 등을 제거할 수 있다.
본 발명에서 단계 a)는 피부 조직에서 지질 성분을 제거하는 단계로, 피부 조직을 탈지방화할 수 있다. 상기 탈지방화(delipidation)는 피부 조직으로부터 지질 성분을 제거하는 것을 의미한다.
일 구체예에서, 탈지방화는 탈지질 용액을 사용하여 수행할 수 있다. 상기 탈지질 용액은 극성 용매, 비극성 용매 또는 이들의 혼합 용매를 포함할 수 있다. 상기 극성 용매로는 물, 알코올 또는 이들의 혼합 용액을 사용할 수 있으며, 알코올로는 메탄올, 에탄올 또는 이소프로필 알코올을 사용할 수 있다. 또한, 비극성 용매로는 헥산, 헵탄, 옥탄, 또는 이들의 혼합 용액을 사용할 수 있다. 구체적으로, 본 발명에서는 탈지질 용액으로 이소프로필 알코올(IPA) 및 헥산(Hexane)의 혼합 용액을 사용할 수 있다. 이때, 이소프로필 알코올 및 헥산의 혼합 비율은 20:80 내지 80:20일 수 있다.
상기 탈지질 용액의 처리 시간은 1 내지 8 시간일 수 있다.
본 발명에서 단계 b)는 단계 a)에 의해 지질 성분이 제거된 피부 조직에서 세포를 제거하는 단계로, 피부 조직을 탈세포화할 수 있다. 탈세포화(decellularization)는 피부 조직으로부터 세포외기질을 제외한 다른 세포 성분, 예를 들면 핵, 세포막, 헥산 등을 제거하는 것을 의미한다. 본 발명에서는 탈지방화 및 탈지질화를 거친 피부 조직을 무세포 진피로 표현할 수 있다.
일 구체예에서, 탈세포화는 탈세포 용액을 사용하여 수행할 수 있다. 상기 탈세포 용액으로 염기성 용액을 사용할 수 있으며, 구체적으로, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 칼슘카보네이트, 수산화마그네슘, 수산화칼슘 및 암모니아로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다. 본 발명에서는 탈세포 용액으로 수산화나트륨(NaOH)을 사용할 수 있다. 종래에는 계면활성제 또는 효소를 사용하여 탈세포화를 수행하였다. 그러나, 효소를 사용하는 경우 진피층 자체에 손상을 줄 수 있고, 효소가 잔류하여 체내에 이식되는 경우 환자의 본래 조직에 손상을 줄 수 있으며 심각한 경우엔 면역반응을 일으키는 문제가 있었다. 또한, 계면활성제를 사용하는 경우 상기 계면활성제의 잔류를 최소화시키기 위해 세척 작업이 필요하며, 계면활성제의 잔류는 체내에서 세포 및 조직 독성을 나타내는 원인이 될 수 있었다. 따라서, 본 발명에서는 탈세포화시 탈세포 용액을 사용하여 전술한 문제점을 해결할 수 있으며, 또한, 세포 독성이 없다는 장점을 가진다.
일 구체예에서, 탈세포 용액의 농도는 0.05 내지 0.5 M일 수 있다. 상기 농도 범위에서 세포의 제거가 용이하다.
또한, 일 구체예에서, 탈세포화 단계는 30 분 내지 10 시간 동안 수행될 수 있다. 상기 시간 범위에서 세포의 제거가 용이하다.
본 발명에서 단계 c)는 단계 b)에 의해 세포가 제거된 피부 조직, 즉, 무세포 진피를 황화나트륨 용액으로 처리하는 단계이다. 상기 단계를 통해, 무세포 진피 중의 모근을 제거할 수 있으며, 또한 무세포 진피 및 최종 제조되는 무세포화 피부대체재에 유연성을 제공할 수 있다.
일 구체예에서, 황화나트륨(Na2S) 용액에서 황화나트륨의 농도는 1 내지 7 중량%일 수 있다.
일 구체예에서, 황화나트륨 용액의 함량은 피부 조직이 황화나트륨 용액에 침지될 수 있다면 특별히 제한되지 않는다. 본 발명에서는 황화나트륨 용액을 피부 조직 부피 대비 1 내지 7 배의 부피로 사용할 수 있다.
일 구체예에서, 단계 c)는 60 내지 480 분 동안 수행될 수 있다.
본 발명에서 단계 d)는 단계 c)에 의해 황화나트륨 용액으로 처리된 피부 조직(무세포 진피)을 환원하는 단계이다. 단계 c)에서 사용된 황화나트륨에 의해 피부 조직은 산화된다. 따라서, 본 발명에서는 상기 환원 단계를 통해 산화된 조직을 중화할 수 있다. 이에 따라, 본 발명은 중성 pH를 가지는 피부대체재를 제공할 수 있으며, 또한 본 단계를 통해 피부 조직의 표백 효과 및 박테리아 제거 효과를 나타낼 수 있다.
상기 단계는 피부환원 처리 용액을 사용하여 수행할 수 있다.
일 구체예에서, 피부환원 처리 용액으로 과산화수소를 사용할 수 있으며, 1 내지 10% 과산화수소를 사용할 수 있다.
일 구체예에서, 단계 d)는 1 내지 24 시간 동안 수행될 수 있다.
본 발명에서 단계 e)는 단계 d)에 의해 환원된 피부 조직(무세포 진피)을 생체유래 고분자 용액에 침지하여 수화하는 단계이다. 상기 단계를 통해 무세포화 피부대체재를 제조할 수 있으며, 상기 피부대체재에 유연성을 부여할 수 있다.
일 구체예에서, 생체유래 고분자 용액에서 생체유래 고분자는 히알루론산(hyaluronic acid), 키토산(chitosan), 콜라겐(collagen), 무세포화된 세포외기질(decellularized extracellular matrix), 피브린/피브리노겐(fibrin/fibrinogen), 젤라틴(gelatin) 및 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 생체유래 고분자로 히알루론산을 사용할 수 있다.
일 구체예에서, 생체유래 고분자 용액에서 상기 생체유래 고분자는 0.01 내지 5 중량%로 포함될 수 있다.
일 구체예에서, 생체유래 고분자 용액의 함량은 무세포 진피가 생체유래 고분자 용액에 침지될 수 있다면 특별히 제한되지 않는다. 본 발명에서는 생체유래 고분자 용액의 함량이 무세포 진피 부피 대비 1 내지 14 배의 부피로 사용할 수 있다.
일 구체예에서, 단계 e)는 6 내지 20 시간 동안 수행될 수 있다.
또한, 본 발명에서는 단계 e)를 수행한 후, 포장 및 멸균하는 단계를 추가로 수행할 수 있다.
일 구체예에서, 포장은 포장재에 무세포화 피부대체재와 함께 단계 e)에서 사용된 생체유래 고분자 용액을 첨가하는 방식으로 수행할 수 있다.
일 구체예에서, 멸균은 방사선을 조사하여 수행할 수 있으며, 방사선의 조사 범위는 10 내지 30 kGy일 수 있다.
또한, 본 발명은 전술한 제조 방법에 의해 제조된 무세포화 피부대체재에 관한 것이다.
본 발명에 따른 제조 방법에 의해 제조된 무세포화 피부대체재는 체내 면역반응을 최소화할 수 있으며, 부드러운 특성을 가질 수 있다.
이러한 무세포화 피부대체재는 체내 이식 후 지지체(scaffold)로 작용하여 이식자의 세포들이 이동하여 생장할 수 있는 생리적 공간으로 작용할 수 있다. 또한, 무세포화 피부대체재는 신혈관형성(angiogenesis)으로 시간이 흐름에 따라 이식자의 조직이 되므로, 손상된 조직의 수복 및 성형 용도의 피부대체재로 활용이 가능하다.
하기 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명의 범주는 하기 실시예에 한정되는 것이 아니며 첨부된 특허청구범위에 기재된 사항에 의해 도출되는 기술적 사항을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형, 수정 또는 응용이 가능하다는 것을 당업자는 이해할 수 있을 것이다.
실시예
실시예 1. 무세포화 피부대체재 제조
(1) 피부 전처리 과정
피부 조직(조직은행으로부터 비영리 목적의 환자 치료를 위해 기증받은 시신으로부터 채취)을 준비하였다.
세척이 완료된 피부 조직을 멸균대에 올려 놓고 멸균된 스크래퍼(scrapper)를 이용하여 진피에 붙어있는 근막 조직, 지방 조직 및 기타 이물질 등을 진피 부분이 보일 때까지 제거하였다. 멸균된 스크래퍼를 이용하여 진피에 남아있는 지방을 최대한 제거하고 멸균된 가위와 핀셋을 이용하여 남아있는 불필요한 조직을 제거하였다. 멸균 증류수로 수회 세척하였다.
(2) 지방 제거 과정
IPA:Hexane의 혼합비가 2:8 내지 8:2가 되도록 혼합하여 탈지질 용액을 제조하였다.
탈지질 용액 및 전처리된 피부 조직을 4L 광구병에 넣고, 상온에서 2시간, 150rpm 범위에서 교반하였다. 교반 진행 중 혹은 완료된 피부 조직은 꺼내어 스크래퍼로 지방을 물리적으로 제거하였다. 지방이 제거된 피부 조직을 증류수를 활용해 수회 세척한 후, 상온, 150rpm 범위에서 증류수를 사용해 2시간 동안 추가 교반 세척하여 잔여 탈지질 용액을 제거하였다.
(3) 세포 제거 과정
탈세포 용액으로 0.05 내지 0.5M NaOH 용액을 사용하였다.
탈세포 용액에 지방이 제거된 피부 조직을 넣고 상온에서 1 내지 6시간 동안 교반하였다. 교반이 완료된 피부 조직을 꺼내어 스크래퍼로 표피 및 잔해(debris) 등을 제거하였다. 표피 및 세포가 제거된 피부 조직은 증류수로 10회 세척하고, 증류수를 넣고 상온에서 150rpm 범위에서 1~6시간 교반 세척하였다(무세포 진피 제조).
(4) 모근 제거 과정
세포가 제거된 피부 재료, 즉, 무세포 진피를 1~7% Na2S 용액에 넣고 상온에서 1 내지 3시간 동안 교반하였다. 교반이 완료된 후, 피부를 꺼내어 스크래퍼를 이용해 잔류 모근을 제거하였다. 증류수를 이용해 10회 이상 세척하고, 증류수를 넣고 상온에서 150rpm 범위에서 1~6시간 교반 세척하였다.
(5) 피부 환원 과정
피부환원 처리 용액으로 1~10% 과산화수소(Hydrogen peroxide, H2O2)를 사용하였다.
모근이 제거된 무세포 진피를 피부환원 처리 용액에 넣고 상온에서 교반하며 환원시켰다. 환원이 완료된 무세포 진피를 증류수에 넣고 150 rpm 범위에서 교반하며 10회 이상 세척하였다.
(6) 생체유래 고분자 용액 침지 과정
생체유래 고분자 용액으로 히알루론산(HA)의 농도가 0.05 내지 0.5%가 되도록 조정한 생리식염수를 사용하였다.
생체유래 고분자 용액에 환원이 완료된 무세포 진피를 넣고 150 rpm 범위에서 12시간 이상 교반하며 HA가 무세포 진피에 침지되도록 하였다(무세포화 피부대체재 제조).
(7) 포장 및 멸균
세척이 완료된 무세포화 피부대체재에 생체유래 고분자 용액을 넣고 밀봉 포장하였다. 포장이 완료된 무세포화 피부대체재는 감마선 10 내지 30 kGy를 활용해 멸균을 진행하였다.
실험예 1. 각 단계별 콜라겐 섬유의 손상 확인
실시예 1의 각 단계 이후, 피부 조직의 콜라겐 섬유 손상을 확인하였다.
(1) 지방 제거 과정 후의 콜라겐 섬유의 손상 확인
실시예 1의 (2) 지방 제거 과정을 수행한 후, 피부 조직을 주사전자현미경(SEM)으로 촬영하였다.
도 1은 탈지질 용액을 처리한 후 콜라겐 섬유의 손상여부를 확인하기 위해 SEM으로 촬영한 결과를 나타낸다.
도 1에 나타난 바와 같이, 탈지질 용액을 사용하여 지방 제거 과정을 거친 피부(IPA/Hexane)는 피부 원재료(raw skin)와 같이 조직의 변형이나 콜라겐 섬유의 손상이 관찰되지 않은 것을 확인할 수 있다.
(2) 세포 제거 과정 후의 콜라겐 섬유의 손상 확인
실시예 1의 (3) 세포 제거 과정을 수행한 후, 피부 조직을 SEM으로 촬영하였다.
도 2는 탈세포 용액에 피부를 처리한 후, 콜라겐 섬유의 변형이나 손상을 확인하기 위해 SEM으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 2에 나타난 바와 같이, 피부 원재료(Raw skin)와 마찬가지로 탈세포 용액을 처리한 후의 피부(NaOH)에서도 조직의 변형이나 손상은 관찰되지 않은 것을 확인할 수 있다.
즉, 탈세포 용액 처리 후 피부 조직에 손상이 가해지지 않는다는 점을 확인할 수 있다.
(3) 모근 제거 과정 후의 콜라겐 섬유의 손상 확인
실시예 1의 (4) 모근 제거 과정을 수행한 후, 피부 조직(무세포 진피)을 투과전자현미경(TEM)으로 촬영하였다.
도 3은 모근 제거 및 피부 유연성을 제공하기 위해 황화나트륨(Na2S)을 처리한 후 무세포 진피에서 콜라겐 섬유의 변형이나 손상이 없음을 TEM을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 3에 나타난 바와 같이, 황화나트륨 처리 후 피부(Na2S)의 조직의 변형이나 손상은 관찰되지 않음을 확인할 수 있다.
실험예 2. 지방 제거 과정 후의 지방 제거 유무 확인
실시예 1의 (2) 지방 제거 과정을 수행한 후, Oil Red O 염색을 수행하여 지방 제거 유무를 확인하였다.
구체적으로, (2) 지방 제거 과정이 완료된 후, Oil Red O 염색을 위해 피부 조직을 10% 포르말린으로 고정하였다. 고정이 완료된 후, OCT 블록을 제작하고, 염색을 위해 OCT 블록을 10 um 두께로 슬라이드를 제작하였다. 제작한 슬라이드를 자연 건조하여 잔여 수분을 완전히 제거하고, absolute propylene glycol을 5 분 동안 처리하였다. 따뜻한 Oil Red O 용액을 처리하여 60℃에서 10 분 동안 염색한 후, 85% propylene glycol 용액을 이용하여 5 분 동안 발현시킨 후, 증류수로 씻어내고 커버글라스(cover glass)로 마운팅하고 현미경으로 관찰하였다.
도 4는 탈지질 용액 처리 후 지방이 제거된 것을 Oil Red O 염색을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 4에 나타난 바와 같이, 피부 원재료(Raw skin)에서는 지방이 붉게 염색된 것과 대비하여, 탈지질 용액을 사용하여 지방 제거 과정을 거친 피부(IPA/Hexane)에서는 붉게 염색된 부분이 보이지 않은 것을 확인할 수 있다.
실험예 3. 세포 제거 과정 후의 세포의 유무 확인
실시예 1의 (3) 세포 제거 과정을 수행한 후, 피부 조직 내의 세포의 유무를 확인하였고, 또한, DNA를 정량하였다.
먼저, 피부 조직 내의 세포의 유무를 확인하기 위해, 표피와 세포 핵을 각각 면역조직화학염색 및 DAPI 염색하였다.
구체적으로, 면역조직화학염색을 진행하기 위해, (3) 세포 제거 과정이 완료된 피부 조직을 파라핀 블록으로 제작하여 슬라이드를 제작하였다. 제작된 슬라이드에서 파라핀을 제거한 후, antigen retrivel을 진행하여 순차적으로 1차 및 2차 항원을 붙인 후 광학 현미경을 이용하여 확인하였다.
또한, 세포의 유무를 확인하기 위해 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)를 이용하여 세포의 핵을 염색하였다.
도 5는 탈세포 용액 처리 후 피부에서 표피 및 세포가 제거된 것을 확인하기 위해, 표피와 세포 핵을 각각 면역조직화학염색 및 DAPI 염색한 후 광학현미경 및 형광현미경에서 관찰한 결과를 나타낸다.
피부 원재료(Raw skin)에서 표피는 갈색으로 염색되며, 세포의 핵은 파란색으로 염색된다. 상기 도 5에 나타난 바와 같이, 피부 원재료(Raw skin)에는 파란색의 DAPI가 많이 발현되는 것을 확인할 수 있다. 그와 반대로, 탈세포화 용액을 처리한 조직에서는 세포가 제거됨에 따라 파란색으로 발현되는 부분이 거의 나타나지 않은 것을 확인할 수 있다. 즉, 피부 원재료(Raw skin)에서 보이는 표피와 세포가 탈세포 용액 처리 이후(NaOH) 제거되었음을 확인할 수 있다.
한편, DNA 정량하기 위해, (3) 세포 제거 과정이 완료된 피부 조직을 잘게 잘랐다. 상기 잘게 자른 피부 조직을 단백질 분해효소(protease K)로 처리하고 overnight 동안 56℃에서 가열하여 완전히 녹이고, 동량의 페놀(phenol)-클로로포름(chloroform)을 처리하였다. 4℃에서 원심분리한 후, 상층액을 수득하여 상층액의 1/10 부피의 소듐 아세테이트(sodium acetate)와 100% 에탄올(ethanol)을 섞어 -20℃에서 30분 보관하였다. 이후, 원심분리를 이용하여 DNA 펠렛(pellet)을 제작하고 상층액을 버리고 70% 에탄올을 넣고 다시 원심분리하여 DNA pellet을 세척하여 순도 높은 DNA를 수득하였다. 에탄올을 모두 자연 건조한 후, 증류수에 녹이고 Nanodrop을 사용하여 DNA를 정량하였다.
도 6은 탈세포 용액 처리 후 피부 조직에서 DNA를 추출하여 정량한 결과를 나타낸다.
도 6에 나타난 바와 같이, 피부 원재료(Raw skin)에 비해 탈세포 용액을 처리한 후 피부에서 DNA의 양이 현저히 감소한 것을 확인할 수 있다. 즉, 탈세포 용액 처리 후 피부에서 세포가 제거된 것을 확인할 수 있다.
실험예 4. 모근 제거 과정 후의 모근 제거 유무 확인
실시예 1의 (4) 모근 제거 과정을 수행한 후, H&E 염색을 수행하여 모근 제거 유무를 확인하였다.
도 7은 황화나트륨 용액을 처리한 무세포 진피에서 털 및 모근이 제거된 것을 H&E 염색을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 7에 나타난 바와 같이, 황화나트륨 처리 후 모근이 제거되었음을 확인할 수 있다.
실험예 5. 유연성 확인
(1) 황화나트륨 용액의 처리에 따른 피부 조직의 유연성 확인
황화나트륨 용액의 처리에 따른 무세포화 피부대체재의 유연성을 확인하기 위해 압점 시험을 진행하였다.
압전 시험은 황화나트륨 용액을 사용한 경우와 사용하지 않은 경우의 피부 조직(피부대체재) 위에 동일한 무게의 추(50 g)를 올린 후, 눌린 정도 및 눌린 높이를 측정하는 방법으로 진행하였다.
이때, 황화나트륨 용액을 사용한 경우는 실시예 1의 (1) 피부 전처리 과정, (2) 지방 제거 과정, (3) 세포 제거 과정, (4) 모근 제거 과정 및 (5) 피부 환원 과정을 거친 피부 조직(피부대체재)를 의미하며, 황화나트륨 용액을 사용하지 않은 경우는 상기 과정 중 (4)를 수행하지 않은 것을 의미한다.
도 8은 황화나트륨 용액 처리에 따른 피부 조직의 유연성 증가를 압점 시험을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 8에 나타난 바와 같이, 황화나트륨 용액을 사용하지 않은 경우에 비해 사용한 경우 피부에서 단단한 정도가 확연히 감소하여 더 유연해지는 것을 확인할 수 있다.
(2) 생체유래 고분자 용액에 침지 후의 피부 조직의 유연성 확인
실시예 1의 (6) 생체유래 고분자 용액 침지 과정을 수행한 후, 무세포 진피의 유연성을 확인하기 위해 인장강도를 측정하였다.
구체적으로, 인장강도는 직사각형으로 자른 피부 조직을 장비(Universal testing machine, UTM)의 지그(zig)로 조직의 양끝을 고정시킨 후, 지그 간의 거리를 늘리면서 피부 조직에 가해지는 힘을 측정하였다. 결과는 측정된 힘을 피부 조직의 단면적으로 나누어 정량화하였다.
도 9는 생체유래 고분자 용액에 침지된 무세포 진피의 유연성을 확인하기 위해, 상기 생체유래 고분자 용액에 침지된 무세포 진피와 타사 제품(DermACELL)의 인장강도를 측정한 결과를 나타낸다(5회 측정).
도 9에 나타난 바와 같이, 타사 제품에 비해 생체유래 고분자 용액에 침지한 경우 인장강도가 유의하게 감소한 것을 확인할 수 있다.
또한, 생체유래 고분자 용액의 침지 시간에 대해서는, 짧은 시간(10 시간)에 비해 긴 시간(20 시간) 침지하였을 경우 인장강도가 더 감소하였으나 유의한 차이는 없었다.
이에 따라, 황화나트륨 용액과 생체유래 고분자 용액의 사용에 따른 유연 효과를 확인하였다.
도 10은 황화나트륨 용액과 생체유래 고분자 용액의 사용에 따른 피부의 유연성을 확인하기 위해 각 피부의 인장강도를 측정한 결과를 나타낸다.
도 10에서는 각 용액(황화나트륨 용액만 사용한 그룹(ADM+Na2S), 생체유래 고분자 용액만 사용한 그룹(ADM+HA) 및 황화나트륨 용액 및 생체유래 고분자 용액을 함께 사용한 그룹(ADM+Na2S+HA)) 사용 조건별 무세포 진피에서 인장강도를 측정하였다.
이때, 황화나트륨 용액 및 생체유래 고분자 용액을 함께 사용한 그룹(ADM+Na2S+HA)은 실시예 1의 (1) 내지 (6)을 수행하여 제조된 피부대체재를 의미하고, 황화나트륨 용액만 사용한 그룹(ADM+Na2S)은 상기 과정 중 (6) 생체유래 고분자 용액 침지 과정을 수행하지 않고 제조된 피부대체재를 의미하며, 생체유래 고분자 용액만 사용한 그룹(ADM+HA)은 상기 과정 중 (4) 모근 제거 과정을 수행하지 않고 제조된 피부대체재를 의미한다.
ADM+Na2S, ADM+HA 및 ADM+Na2S+HA 그룹은 무처리 그룹(ADM)에 비해 인장강도가 유의하게 감소한 것을 확인할 수 있다. 그 중 두 가지 용액을 함께 사용한 그룹에서 가장 낮은 인장강도를 보임으로써, 두 용액을 각각 사용하였을 때 보다 더 우수한 유연 효과를 나타냄을 확인할 수 있다.

Claims (10)

  1. a) 피부 조직에서 지질 성분을 제거하는 단계;
    b) 상기 지질 성분이 제거된 피부 조직에서 세포를 제거하는 단계;
    c) 상기 세포가 제거된 피부 조직을 황화나트륨 용액으로 처리하는 단계;
    d) 상기 황화나트륨 용액으로 처리된 피부 조직을 환원하는 단계; 및
    e) 상기 환원된 피부 조직을 생체유래 고분자 용액에 침지하여 수화하는 단계;를 포함하고,
    단계 c)에서 황화나트륨 용액의 처리 시간은 1 내지 5 시간이고,
    단계 e)에서 생체유래 고분자 용액에의 침지 시간은 10 내지 20 시간인 무세포화 피부대체재의 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    피부 조직은 동종 또는 이종의 피부 조직인 것인 무세포화 피부대체재의 제조 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    단계 a)는 탈지질 용액을 사용하여 수행하며,
    상기 탈지질 용액은 극성 용매, 비극성 용매, 또는 이들의 혼합 용매를 포함하는 것인 무세포화 피부대체재의 제조 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    단계 b)는 탈세포 용액을 사용하여 수행하며,
    탈세포 용액은 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 칼슘카보네이트, 수산화마그네슘, 수산화칼슘 및 암모니아로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것인 무세포화 피부대체재의 제조 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    단계 c)에서 황화나트륨 용액에서 황화나트륨의 농도는 1 내지 7 중량%인 무세포화 피부대체재의 제조 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    단계 d)는 피부환원 처리 용액을 사용하여 수행하며,
    상기 피부환원 처리 용액은 과산화수소인 것인 무세포화 피부대체재의 제조 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    단계 e)에서 생체유래 고분자는 히알루론산(hyaluronic acid), 키토산(chitosan), 콜라겐(collagen), 무세포화된 세포외기질(decellularized extracellular matrix), 피브린/피브리노겐(fibrin/fibrinogen), 젤라틴(gelatin) 및 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것인 무세포화 피부대체재의 제조 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    단계 e)에서 생체유래 고분자 용액에서 생체유래 고분자의 함량은 0.01 내지 5 중량%인 무세포화 피부대체재의 제조 방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    단계 e)를 수행한 후, 포장 및 멸균하는 단계를 추가로 수행하는 것인 무세포화 피부대체재의 제조 방법.
  10. 제 1 항에 따른 제조 방법에 의해 제조되는 무세포화 피부대체재.
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