CN111298197A - 抗菌软组织支架及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗菌软组织支架及其制备方法。本发明的抗菌软组织支架包括支撑层以及修复层，所述支撑层连接在所述修复层上，所述修复层呈多孔结构，所述修复层含有细胞生长因子、多糖以及活性蛋白中的至少一种，所述支撑层以及修复层均含有抗菌剂。本发明的抗菌软组织支架既可以为软组织修复提供足够的体积支撑，又能够为软组织愈合提供三维支架，同时能够预防伤口感染甚至可直接应用于已感染的受损软组织修复，促进缺损软组织愈合。

Description

抗菌软组织支架及其制备方法
技术领域
本发明涉及医疗器械领域，特别是涉及一种抗菌软组织支架及其制备方法。
背景技术
近年来，先天性畸形、慢性疾病、感染、肿瘤切除或外伤引起的软组织损伤每年都在增加，导致医疗费用和患者发病率也随之增加。对于软组织损伤，理想的手术治疗是先完全切除缺损组织，然后通过全器官移植或自体移植来替代缺损组织并重建缺损组织的结构和功能。传统治疗手段中，因缺乏可用性移植软组织，组织匹配相对复杂，并且供体部位存在发病率高的风险，使得全器官移植或自体移植治疗软组织缺损实施起来相对困难。因此在临床需求的驱动下，许多基于细胞外基质的移植物，包括同种异体移植物和异种移植物，已经发展成为器官移植的替代方法，大量相关产品不断被批准上市用于各种临床疾病的治疗。脱细胞外基质因其保存完好的原始组织的三维超微结构、生物相容性、机械完整性、组成以及最终的生物活性而在许多临床应用中取得了良好的临床治疗效果。
目前脱细胞基质应用于缺损软组织修复还有一些包括如下问题需要解决。
(1)、目前软组织修复材料多为胶原海绵类，胶原海绵力学强度差，因此对于修复处的软组织体积保持能力差，愈后的软组织不符合临床预期。目前对胶原海绵的增强改性主要分为两方面，一是对胶原海绵进行物理或化学交联改性，物理交联的效果相对较差也不稳定，而化学交联需要引入交联剂对胶原海绵支架的安全性与相容性有一定的影响，另一方面是通过金属片构建双层支架结构，金属片增强支架的空间支撑力，目前用金属片主要为不可降解的钛合金，需要二次手术取出，增加感染风险与患者负担。
(2)、胶原海绵无抗菌性，易感染细菌或微生物，且不能用于易感染的创口，因此有必要进行与抗菌剂复合赋予其抗菌性能。目前常用的抗菌剂主要有抗生素类药物、纳米银等金属离子抗菌剂、天然高分子壳聚糖及其衍生物等。抗生物类药物抗菌剂易产生耐药性细菌，目前临床上应控制其使用范围。金属离子抗菌剂广谱高效，但是存在重金属中毒的风险。壳聚糖及其衍生物也属于动物源的医疗器械，使用起来也存在其他风险与限制。
(3)、脱细胞基质具有天然的三维支架结构，并且含有细胞生长因子、活性多糖及蛋白，有利于细胞与组织的生长。但是脱细胞基质无法塑型，在大量软组织缺损时单层脱细胞基质无法提供足够的体积保持。
发明内容
基于此，有必要提供一种既可以为软组织修复提供足够的体积支撑，又能够为软组织愈合提供三维支架，同时能够预防伤口感染甚至可直接应用于已感染的受损软组织修复，促进缺损软组织愈合的抗菌软组织支架及其制备方法。
一种抗菌软组织支架，包括支撑层以及修复层，所述支撑层连接在所述修复层上，所述修复层呈多孔结构，所述修复层含有细胞生长因子、多糖以及活性蛋白中的至少一种，所述支撑层以及修复层均含有抗菌剂。
在其中一个实施例中，所述抗菌剂为聚六亚甲基双胍。
一种抗菌软组织支架的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备支撑层：取动物组织预处理后依次进行病毒灭活处理、脱细胞处理、清洗处理后平铺于模具中进行冷冻干燥，得到第一脱细胞基质；
将所述第一脱细胞基质浸没于质量浓度为0.01％-1.0％的抗菌剂溶液中，吸收至饱和后，置于模具中预冷后进行二次冷冻干燥，获得含抗菌剂的第二脱细胞基质；
将一层或多层叠放的所述第二脱细胞基质进行压片处理，得到支撑层；
(2)制备修复层：取动物组织制备第三脱细胞基质，将所述第三脱细胞基质制备成脱细胞基质粉末；
取所述脱细胞基质粉末与抗菌剂加入到质量浓度为0.1％-1.0％的胶原溶液中，搅拌均匀得到混合溶液，所述混合溶液中所述脱细胞基质粉末的质量：抗菌剂的质量：胶原的质量比例为(60-95)：(0.1-0.5)：(5-40)；
将所述混合溶液浇注到模具中预冷后进行冷冻干燥获得修复层；
(3)复合：将所述支撑层置于模具中，在所述支撑层的表面涂覆质量浓度为0.5-1.0％胶原溶液，将所述修复层置于胶原溶液上并粘在胶原溶液中得到预复合层，对所述预复合层进行冷冻干燥处理，得到抗菌软组织支架。
在其中一个实施例中，步骤(1)及步骤(2)中的所述动物组织为猪源组织或牛源组织，所述猪源组织包括猪真皮、猪心包膜以及猪腹膜中的一种或几种，所述牛源组织包括牛真皮、牛心包膜以及牛腹膜中的一种或几种。
在其中一个实施例中，步骤(1)中的预处理包括如下步骤：将所述动物组织清洗后去除杂质，分割成预定大小。
在其中一个实施例中，所述病毒灭活处理包括如下步骤：将预处理后的动物组织放入容器中，加入质量浓度为0.5％-4％碱溶液处理1h-12h，加入的碱溶液的体积与动物组织单侧表面积的比例为(0.2-0.5):1。
在其中一个实施例中，所述脱细胞处理包括如下步骤：将病毒灭活处理后的动物组织依次用质量浓度为0.25％-2.5％碱溶液处理4-24h、质量浓度为0.1％-1.0％酸溶液处理1h-12h、质量浓度为5.0-10％高渗盐溶液处理2h-6h，加入的碱溶液的体积与动物组织单侧表面积的比例为(0.2-0.5):1，加入的酸溶液的体积与动物组织单侧表面积的比例为(0.2-0.5):1，加入的高渗盐溶液的体积与动物组织单侧表面积的比例为(0.2-0.5):1。
在其中一个实施例中，所述清洗处理包括如下步骤：将脱细胞处理得到的脱细胞组织用质量浓度为0.1％-2％弱碱盐溶液清洗1h-24h，用纯水清洗至脱细胞组织表面pH值为5-7。
在其中一个实施例中，所述压片处理时包括如下步骤：采用压片机对一层或多层叠放的所述第二脱细胞基质进行压片处理，压片处理的压力为5Mpa-50Mpa，保压时间30min-720min。
在其中一个实施例中，所述抗菌剂为聚六亚甲基双胍。
在其中一个实施例中，步骤(3)中的所述冷冻干燥处理包括如下步骤：将所述预复合层置于-40℃—-80℃中，冷冻2h-24h。
所述的抗菌软组织支架的制备方法制备得到的抗菌软组织支架。
本发明的抗菌软组织支架具有双层结构，上层的支撑层具有致密且具有一定的刚度，能够为软组织修复提供必要的空间支撑，利于软组织塑型；下层的修复层为多孔疏松的天然三维结构，有利于修复受损组织周围的细胞与组织长入，同时修复层的结构含有多种利于细胞粘附与生长的细胞生长因子、多糖以及活性蛋白，能够加速受损软组织的愈合。此外该支架上下层均含有一定量的抗菌剂，上层能有有效防止外界细菌的感染，而修复层中的抗菌剂能够抑制并杀死伤口及周围的细菌，为伤口的愈合提供良好的环境。
本发明的抗菌剂选用聚六亚甲基双胍，聚六亚甲基双胍(Polyhexamethylenebiguanidine hydrochloride，PHMB)是一种环保型广谱抗菌剂，具有优越的杀菌活性，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、酵母菌等均有杀灭作用。另外聚六亚甲基双胍具有有良好的生物相容性，且无已知的耐受性报道，当聚六亚甲基双胍用于创伤护理时具有以下效果：快速有效地减轻伤口疼痛；减少创伤恶臭；提高肉芽组织的形成；增强角质细胞和成纤维细胞的活性；减少创伤内的腐肉；减少MMP引发的伤口开裂；有助去除坏死组织。本发明采用聚六亚甲基双胍这一广谱、高效、安全的抗菌剂，不仅能够使得抗菌软组织支架具有抗菌性能，还能促进伤口愈合，脱细胞基质与PHMB复合能够赋予其抗菌性能，扩大了本发明的抗菌软组织支架的临床使用范围。
附图说明
图1为本发明实施例4制得的抗菌软组织支架微观结构示意图；
图2为本发明实施例5制备的抗菌软组织修复支架与小鼠成纤维细胞、人血管内皮细胞共培养3天、7天后的共聚焦荧光显微镜照片图。
附图标记说明
100：支撑层；200：修复层；300：聚六亚甲基双胍颗粒。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
需要说明的是，当一个元件被认为是“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或者可能同时存在居中元件。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1
本实施例提供了一种抗菌软组织支架。
参见图1所示，一种抗菌软组织支架包括支撑层100以及修复层200。支撑层100连接在所述修复层200上，修复层200呈多孔结构，修复层200含有细胞生长因子、多糖以及活性蛋白中的至少一种，支撑层100以及修复层200均含有抗菌剂。
抗菌剂为聚六亚甲基双胍，参见图1所示，聚六亚甲基双胍颗粒300分布于支撑层100上。
本发明的抗菌软组织支架具有双层结构，上层的支撑层100具有致密且具有一定的刚度，能够为软组织修复提供必要的空间支撑，利于软组织塑型；下层的修复层200为多孔疏松的天然三维结构，有利于修复受损组织周围的细胞与组织长入，同时修复层200的结构含有多种利于细胞粘附与生长的细胞生长因子、多糖以及活性蛋白，能够加速受损软组织的愈合。此外该支架上下层均含有一定量的抗菌剂，上层能有有效防止外界细菌的感染，而修复层200中的抗菌剂能够抑制并杀死伤口及周围的细菌，为伤口的愈合提供良好的环境。
实施例2
本实施例提供了一种抗菌软组织支架的制备方法。
一种抗菌软组织支架的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备支撑层100：取动物组织预处理后依次进行病毒灭活处理、脱细胞处理、清洗处理后平铺于模具中冷冻干燥，得到第一脱细胞基质。
将第一脱细胞基质浸没于质量浓度为0.01％-1.0％的抗菌剂溶液中，吸收至饱和后，置于模具中预冷后进行二次冷冻干燥，获得含抗菌剂的第二脱细胞基质。
将一层或多层叠放的第二脱细胞基质进行压片处理，得到支撑层100。
(2)制备修复层200：取动物组织制备第三脱细胞基质，将第三脱细胞基质制备成脱细胞基质粉末。
取脱细胞基质粉末与抗菌剂加入到质量浓度为0.1％-1.0％的胶原溶液中，搅拌均匀得到混合溶液，混合溶液中脱细胞基质粉末的质量：抗菌剂的质量：胶原的质量比例为(60-95)：(0.1-0.5)：(5-40)。
将混合溶液浇注到模具中预冷后进行冷冻干燥获得修复层200。
(3)复合：将支撑层100置于模具中，并在支撑层100的表面涂覆质量浓度为0.5-1.0％胶原溶液，将修复层200置于胶原溶液上并粘在胶原溶液中得到预复合层，对预复合层进行冷冻干燥处理，得到抗菌软组织支架。
本发明的抗菌剂选用聚六亚甲基双胍，聚六亚甲基双胍(Polyhexamethylenebiguanidine hydrochloride，PHMB)是一种环保型广谱抗菌剂，具有优越的杀菌活性，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、酵母菌等均有杀灭作用。另外聚六亚甲基双胍具有有良好的生物相容性，且无已知的耐受性报道，当聚六亚甲基双胍用于创伤护理时具有以下效果：快速有效地减轻伤口疼痛；减少创伤恶臭；提高肉芽组织的形成；增强角质细胞和成纤维细胞的活性；减少创伤内的腐肉；减少MMP引发的伤口开裂；有助去除坏死组织。本发明采用聚六亚甲基双胍这一广谱、高效、安全的抗菌剂，不仅能够使得抗菌软组织支架具有抗菌性能，还能促进伤口愈合，脱细胞基质与PHMB复合能够赋予其抗菌性能，扩大了本发明的抗菌软组织支架的临床使用范围。
实施例3
本实施例提供了一种抗菌软组织支架的制备方法。
一种抗菌软组织支架的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备支撑层100：取动物组织预处理后依次进行病毒灭活处理、脱细胞处理、清洗处理后平铺于模具中冷冻干燥，得到第一脱细胞基质。预处理包括如下步骤：将动物组织清洗后去除杂质，分割成预定大小。其中，动物组织为猪源组织或牛源组织，猪源组织包括猪真皮、猪心包膜以及猪腹膜中的一种或几种，牛源组织包括牛真皮、牛心包膜以及牛腹膜中的一种或几种。
病毒灭活处理包括如下步骤：将预处理后的动物组织放入容器中，加入质量浓度为0.5％-4％碱溶液(如氢氧化钠、氢氧化钾)处理1h-12h(优选0.5-4h)，加入的碱溶液的体积与动物组织单侧表面积的比例为(0.2-0.5):1。
脱细胞处理包括如下步骤：将病毒灭活处理后的动物组织依次用质量浓度为0.25％-2.5％碱溶液处理4-24h、质量浓度为0.1％-1.0％酸溶液(如盐酸)处理1h-12h、质量浓度为5.0-10％高渗盐溶液处理2h-6h，加入的碱溶液的体积与动物组织单侧表面积的比例为(0.2-0.5):1，加入的酸溶液的体积与动物组织单侧表面积的比例为(0.2-0.5):1，加入的高渗盐溶液的体积与动物组织单侧表面积的比例为(0.2-0.5):1。
清洗处理包括如下步骤：将脱细胞处理得到的脱细胞组织用质量浓度为0.1％-2％弱碱盐溶液(如碳酸钠、碳酸氢钠)清洗1h-24h，用纯水或注射水清洗至脱细胞组织表面pH值为5-7。
将第一脱细胞基质浸没于质量浓度为0.01％-1.0％的抗菌剂溶液中，吸水至饱和后，置于模具中预冷后进行二次冷冻干燥，获得含抗菌剂的第二脱细胞基质。抗菌剂为聚六亚甲基双胍。
将一层或多层第二脱细胞基质叠放后进行压片处理，得到支撑层100。压片处理时包括如下步骤：采用压片机对一层或多层第二脱细胞基质叠放进行压片处理，压片处理的压力为5Mpa-50Mpa，保压时间30min-720min。
(2)制备修复层200：取动物组织制备第三脱细胞基质，将第三脱细胞基质利用机械粉碎机或冷冻研磨机制备成脱细胞基质粉末。动物组织为猪源组织或牛源组织，猪源组织包括猪真皮、猪心包膜以及猪腹膜中的一种或几种，牛源组织包括猪真皮、猪心包膜以及猪腹膜中的一种或几种。
取脱细胞基质粉末与抗菌剂加入到质量浓度为0.1％-1.0％的胶原溶液中，搅拌均匀得到混合溶液，混合溶液中脱细胞基质粉末的质量：抗菌剂的质量：胶原的质量比例为(60-95)：(0.1-0.5)：(5-40)。抗菌剂为聚六亚甲基双胍。
将混合溶液浇注到模具中预冷后进行冷冻干燥获得修复层200。
(3)复合：将支撑层100置于模具中，并在支撑层100的表面涂覆合适厚度的质量浓度为0.5-1.0％胶原溶液，将修复层200置于胶原溶液上并粘在胶原溶液中得到预复合层，将预复合层置于-40℃—-80℃中，冷冻2h-24h进行冷冻干燥处理，得到抗菌软组织支架，参见图1所示。
实施例4
本实施例提供了一种抗菌软组织支架的制备方法。
一种抗菌软组织支架的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备支撑层100：取牛皮肤组织，去除表皮组织与皮下脂肪后取牛真皮组织分割成合适大小后放入适当的容器中，预处理后依次进行病毒灭活处理、脱细胞处理、清洗处理后平铺于模具中冷冻干燥，得到第一脱细胞基质。
病毒灭活处理包括如下步骤：向容器中加入质量浓度为4％氢氧化钠溶液处理1h，加入的氢氧化钠溶液的体积(ml)与牛真皮组织单侧表面积(cm2)的比例为0.5:1。
脱细胞处理包括如下步骤：病毒灭活处理完成后倒出碱液，取出牛真皮组织进行脱细胞处理。牛真皮组织置入2.5％氢氧化钠溶液中浸泡处理4h，之后倒出氢氧化钠溶液，牛真皮组织用大量纯水清洗3-5遍后，随后转入1.0％盐酸中浸泡处理1h，处理完成后再次用大量纯水清洗3-5遍，最后将处理后的牛真皮组织转入10％高渗盐溶液处理2h。加入的氢氧化钠溶液的体积与牛真皮组织单侧表面积的比例为0.5:1，加入的盐酸的体积与牛真皮组织单侧表面积的比例为0.5:1，加入的高渗盐溶液的体积与牛真皮组织单侧表面积的比例为0.5:1。
清洗处理包括如下步骤：将脱细胞处理得到的脱细胞组织用质量浓度为0.1％碳酸氢钠进行清洗24h，用纯水或注射水清洗至脱细胞组织表面pH值为5-7。
将第一脱细胞基质浸没于质量浓度为1.0％的PHMB溶液中，吸水至饱和后，置于模具中预冷后进行二次冷冻干燥，获得含PHMB的第二脱细胞基质。
将两层第二脱细胞基质叠放后进行压片处理，得到支撑层100。压片处理时包括如下步骤：采用压片机对两层第二脱细胞基质叠放进行压片处理，压片处理的压力为5Mpa，保压时间30min。
(2)制备修复层200：取牛心包膜组织参照专利CN108261564A中方法制备第三脱细胞基质，将第三脱细胞基质利用机械粉碎机或冷冻研磨机制备成脱细胞基质粉末。
取脱细胞基质粉末与PHMB加入到质量浓度为1.0％的胶原溶液中，搅拌均匀得到混合溶液，混合溶液中脱细胞基质粉末的质量：PHMB的质量：胶原的质量比例为60：0.5：40。
将混合溶液浇注到模具中预冷后进行冷冻干燥获得修复层200。
(3)复合：将支撑层100置于模具中，并在支撑层100的表面涂覆合适厚度的质量浓度为1.0％胶原溶液，将修复层200置于胶原溶液上并粘在胶原溶液中得到预复合层，将预复合层置于-80℃低温冰箱中，冷冻2h，得到抗菌软组织支架，制得的抗菌软组织支架的微观结构图如图1所示。
本实施例制备得到的抗菌软组织支架能有有效防止外界细菌的感染，而修复层200中的抗菌剂能够抑制并杀死伤口及周围的细菌，为伤口的愈合提供良好的环境。
实施例5
本实施例提供了一种抗菌软组织支架的制备方法。
一种抗菌软组织支架的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备支撑层100：取猪皮肤组织，去除表皮组织与皮下脂肪后取猪真皮组织分割成合适大小后放入适当的容器中，预处理后依次进行病毒灭活处理、脱细胞处理、清洗处理后平铺于模具中冷冻干燥，得到第一脱细胞基质。
病毒灭活处理包括如下步骤：向容器中加入质量浓度为0.5％氢氧化钠溶液处理12h，加入的氢氧化钠溶液的体积(ml)与猪真皮组织单侧表面积(cm2)的比例为0.2:1。
脱细胞处理包括如下步骤：病毒灭活处理完成后倒出碱液，取出猪真皮组织进行脱细胞处理。猪真皮组织置入0.25％氢氧化钠溶液中浸泡处理24h，之后倒出氢氧化钠溶液，猪真皮组织用大量纯水清洗3-5遍后，随后转入1.0％盐酸中浸泡处理12h，处理完成后再次用大量纯水清洗3-5遍，最后将处理后的猪真皮组织转入5％高渗盐溶液处理6h。加入的氢氧化钠溶液的体积与猪真皮组织单侧表面积的比例为0.2:1，加入的盐酸的体积与猪真皮组织单侧表面积的比例为0.2:1，加入的高渗盐溶液的体积与猪真皮组织单侧表面积的比例为0.2:1。
清洗处理包括如下步骤：将脱细胞处理得到的脱细胞组织用质量浓度为2％碳酸氢钠进行清洗1h，用纯水或注射水清洗至脱细胞组织表面pH值为5-7。
将第一脱细胞基质浸没于质量浓度为0.01％的PHMB溶液中，吸水至饱和后，置于模具中预冷后进行二次冷冻干燥，获得含PHMB的第二脱细胞基质。
将两层第二脱细胞基质叠放后进行压片处理，得到支撑层100。压片处理时包括如下步骤：采用压片机对两层第二脱细胞基质叠放进行压片处理，压片处理的压力为5Mpa，保压时间720min。
(2)制备修复层200：取猪心包膜组织参照专利CN108261564A中方法制备第三脱细胞基质，将第三脱细胞基质利用机械粉碎机或冷冻研磨机制备成脱细胞基质粉末。
取脱细胞基质粉末与PHMB加入到质量浓度为0.5％的胶原溶液中，搅拌均匀得到混合溶液，混合溶液中脱细胞基质粉末的质量：PHMB的质量：胶原的质量比例为95：0.1：5。
将混合溶液浇注到模具中预冷后进行冷冻干燥获得修复层200。
(3)复合：将支撑层100置于模具中，并在支撑层100的表面涂覆合适厚度的质量浓度为0.5％胶原溶液，将修复层200置于胶原溶液上并粘在胶原溶液中得到预复合层，将预复合层置于-40℃低温冰箱中，冷冻24h，得到抗菌软组织支架。
本实施例制备的抗菌软组织修复支架与小鼠成纤维细胞、人血管内皮细胞共培养3天、7天后的共聚焦荧光显微镜照片参见图2所示。小鼠成纤维细胞、人血管内皮细胞两种细胞在支架软组织修复支架上均表现良好的生长状态，说明该支架具有良好的细胞相容性。
本实施例制备得到的抗菌软组织支架能有有效防止外界细菌的感染，而修复层200中的抗菌剂能够抑制并杀死伤口及周围的细菌，为伤口的愈合提供良好的环境。
实施例6
本实施例提供了一种抗菌软组织支架的制备方法。
一种抗菌软组织支架的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备支撑层100：取猪心包膜组织，去除表皮组织与皮下脂肪后取猪真皮组织分割成合适大小后放入适当的容器中，预处理后依次进行病毒灭活处理、脱细胞处理、清洗处理后平铺于模具中冷冻干燥，得到第一脱细胞基质。
病毒灭活处理包括如下步骤：向容器中加入质量浓度为2％氢氧化钠溶液处理6h，加入的氢氧化钠溶液的体积(ml)与猪真皮组织单侧表面积(cm2)的比例为0.35:1。
脱细胞处理包括如下步骤：病毒灭活处理完成后倒出碱液，取出猪真皮组织进行脱细胞处理。猪真皮组织置入1％氢氧化钠溶液中浸泡处理12h，之后倒出氢氧化钠溶液，猪真皮组织用大量纯水清洗3-5遍后，随后转入0.5％盐酸中浸泡处理6h，处理完成后再次用大量纯水清洗3-5遍，最后将处理后的猪真皮组织转入7％高渗盐溶液处理4h。加入的氢氧化钠溶液的体积与猪真皮组织单侧表面积的比例为0.35:1，加入的盐酸的体积与猪真皮组织单侧表面积的比例为0.35:1，加入的高渗盐溶液的体积与猪真皮组织单侧表面积的比例为0.35:1。
清洗处理包括如下步骤：将脱细胞处理得到的脱细胞组织用质量浓度为1％碳酸氢钠进行清洗12h，用纯水或注射水清洗至脱细胞组织表面pH值为5-7。
将第一脱细胞基质浸没于质量浓度为0.5％的PHMB溶液中，吸水至饱和后，置于模具中预冷后进行二次冷冻干燥，获得含PHMB的第二脱细胞基质。
将五层第二脱细胞基质叠放后进行压片处理，得到支撑层100。压片处理时包括如下步骤：采用压片机对五层第二脱细胞基质叠放进行压片处理，压片处理的压力为20Mpa，保压时间300min。
(2)制备修复层200：取猪腹膜组织参照专利CN108261564A中方法制备第三脱细胞基质，将第三脱细胞基质利用机械粉碎机或冷冻研磨机制备成脱细胞基质粉末。
取脱细胞基质粉末与PHMB加入到质量浓度为0.75％的胶原溶液中，搅拌均匀得到混合溶液，混合溶液中脱细胞基质粉末的质量：PHMB的质量：胶原的质量比例为80：0.1：20。
将混合溶液浇注到模具中预冷后进行冷冻干燥获得修复层200。
(3)复合：将支撑层100置于模具中，并在支撑层100的表面涂覆0.5mm-2.5mm
厚度的质量浓度为0.75％胶原溶液，将修复层200置于胶原溶液上并粘在胶原溶液中得到预复合层，将预复合层置于-60℃低温冰箱中，冷冻12h，得到抗菌软组织支架。
本实施例制备得到的抗菌软组织支架能有有效防止外界细菌的感染，而修复层200中的抗菌剂能够抑制并杀死伤口及周围的细菌，为伤口的愈合提供良好的环境。
对比例
本对比例提供一种抗菌软组织支架的制备方法。
一种抗菌软组织支架的制备方法，包括如下步骤：
(1)：制备支撑层100：
病毒灭活处理：取牛皮肤组织，去除表皮组织与皮下脂肪后取牛真皮组织分割成合适大小后放入适当的容器中，加入适量的4％氢氧化钠溶液，加入的碱溶液液体体积(ml)与动物组织单侧表面积(cm2)比为0.5：1，进行病毒灭活处理1h。
脱细胞处理：病毒灭活处理完成后倒出碱液，取出牛真皮组织进行脱细胞处理。先将牛真皮组织置入2.5％氢氧化钠溶液中浸泡处理4h，之后倒出氢氧化钠溶液，牛真皮组织用大量纯水清洗3-5遍后，随后转入1.0％盐酸中浸泡处理1h，处理完成后再次用大量纯水清洗3-5遍，最后将处理后的牛真皮组织转入10％高渗盐溶液处理2h。加入的氢氧化钠溶液的体积与牛真皮组织单侧表面积的比例为0.5:1，加入的盐酸的体积与牛真皮组织单侧表面积的比例为0.5:1，加入的高渗盐溶液的体积与牛真皮组织单侧表面积的比例为0.5:1。
清洗处理：脱细胞处理完成后先用0.1％碳酸氢钠进行清洗24h，然后用纯水或注射水进行清洗至牛真皮脱细胞组织表面pH为5-7为止。
冷冻干燥：将上述牛真皮脱细胞组织平铺于定制的模具中，预冷后进行冷冻干燥，获得第一脱细胞基质。
取双层第一脱细胞基质叠放后用压片机进行压片，压力50Mpa，保压时间30min，获得支撑层100。
(2)制备修复层200：
制备脱细胞基质粉末：参照专利CN108261564A中方法，取牛心包膜组织制备第三脱细胞基质。将获得的第三脱细胞基质利用机械粉碎机或冷冻研磨机制备成脱细胞基质粉末。
取一定质量的脱细胞基质粉末加入到质量浓度为1.0％的胶原溶液中，搅拌均匀，最获得混合溶液中脱细胞基质粉末质量：胶原质量比例为60：40。
将混合溶液浇注到定制的模具中预冷后进行冷冻干燥获得修复层200。
(3)：复合
将制备好的支撑层100置于定制模具中，表面涂覆合适厚度的质量浓度为1.0％胶原溶液，再将修复层200置于胶原溶液上，稍用力压使修复层200粘在胶原溶液中，迅速置于-80℃低温冰箱中冷冻2h，随后在进行冷冻干燥，获得双层结构的抗菌软组织修复支架。
将实施例4-6以及对比例四种方法制得的抗菌软组织修复支架对金黄色葡萄球菌与大肠杆菌的抗菌测试结果如表1所示，对比例未添加抗菌剂无抗菌效果，实施例添加抗菌剂后抗菌效果显著提高，并且抗菌效果的大小与所添加抗菌剂的量直接相关。
表1
Figure BDA0002385203020000131
Figure BDA0002385203020000141
综上，本发明的抗菌软组织支架具有如下优点：
(1)本发明制备了双层复合结构的抗菌软组织支架，支撑层100具有较一定致密度与刚度的胶原硬膜，能够为创口软组织修复提供必要的体积支撑。修复层200以脱细胞基质粉末制备多孔的海绵体，支撑层100、修复层200以胶原复合制备多层软组织修复支架，既可以为软组织修复提供足够的体积支撑，又能够为软组织愈合提供三维支架，加速组织愈合。
(2)本发明的双层复合结构引入具有广谱抗菌效果的聚阳离子抗菌剂PHMB，能够提供稳定、高效抗菌的性能，同时不会产生任何耐药性，可以应用于各种已感染的软组织修复，可大了胶原海绵支架材料的临床应用范围。
(3)本发明的双层复合结构具有天然的三维网络结构，并含有一定量的细胞生长因子等活性物质，有利于细胞在支架材料上的粘附与生长。
(4)本发明的双层复合结构的制备方法利用机械剪切或研磨将脱细胞支架制备成一定粒径的粉末，不会脱细胞基质的微观三维结构。以一定浓度胶原溶液作为粘结剂，将脱细胞基质粉末均匀分散在胶原溶液中然后冷冻干燥可获得不用厚度不同形状的脱细胞基质海绵。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种抗菌软组织支架，其特征在于，包括支撑层以及修复层，所述支撑层连接在所述修复层上，所述修复层呈多孔结构，所述修复层含有细胞生长因子、多糖以及活性蛋白中的至少一种，所述支撑层以及修复层均含有抗菌剂。
2.根据权利要求1所述的抗菌软组织支架及其制备方法，其特征在于，所述抗菌剂为聚六亚甲基双胍。
3.一种抗菌软组织支架的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备支撑层：取动物组织预处理后依次进行病毒灭活处理、脱细胞处理、清洗处理后平铺于模具中进行冷冻干燥，得到第一脱细胞基质；
将所述第一脱细胞基质浸没于质量浓度为0.01％-1.0％的抗菌剂溶液中，吸收至饱和后，置于模具中预冷后进行二次冷冻干燥，获得含抗菌剂的第二脱细胞基质；
将一层或多层叠放的所述第二脱细胞基质进行压片处理，得到支撑层；
(2)制备修复层：取动物组织制备第三脱细胞基质，将所述第三脱细胞基质制备成脱细胞基质粉末；
取所述脱细胞基质粉末与抗菌剂加入到质量浓度为0.1％-1.0％的胶原溶液中，搅拌均匀得到混合溶液，所述混合溶液中所述脱细胞基质粉末的质量：抗菌剂的质量：胶原的质量比例为(60-95)：(0.1-0.5)：(5-40)；
将所述混合溶液浇注到模具中预冷后进行冷冻干燥获得修复层；
(3)复合：将所述支撑层置于模具中，在所述支撑层的表面涂覆质量浓度为0.5-1.0％胶原溶液，将所述修复层置于胶原溶液上并粘在胶原溶液中得到预复合层，对所述预复合层进行冷冻干燥处理，得到抗菌软组织支架。
4.根据权利要求3所述的抗菌软组织支架的制备方法，其特征在于，步骤(1)及步骤(2)中的所述动物组织为猪源组织或牛源组织，所述猪源组织包括猪真皮、猪心包膜以及猪腹膜中的一种或几种，所述牛源组织包括牛真皮、牛心包膜以及牛腹膜中的一种或几种。
5.根据权利要求3所述的抗菌软组织支架的制备方法，其特征在于，步骤(1)中的预处理包括如下步骤：将所述动物组织清洗后去除杂质，分割成预定大小。
6.根据权利要求3所述的抗菌软组织支架的制备方法，其特征在于，所述脱细胞处理包括如下步骤：将病毒灭活处理后的动物组织依次用质量浓度为0.25％-2.5％碱溶液处理4-24h、质量浓度为0.1％-1.0％酸溶液处理1h-12h、质量浓度为5.0-10％高渗盐溶液处理2h-6h，加入的碱溶液的体积与动物组织单侧表面积的比例为(0.2-0.5):1，加入的酸溶液的体积与动物组织单侧表面积的比例为(0.2-0.5):1，加入的高渗盐溶液的体积与动物组织单侧表面积的比例为(0.2-0.5):1。
7.根据权利要求3所述的抗菌软组织支架的制备方法，其特征在于，所述清洗处理包括如下步骤：将脱细胞处理得到的脱细胞组织用质量浓度为0.1％-2％弱碱盐溶液清洗1h-24h，用纯水清洗至脱细胞组织表面pH值为5-7。
8.根据权利要求3所述的抗菌软组织支架的制备方法，其特征在于，所述压片处理时包括如下步骤：采用压片机对一层或多层叠放的所述第二脱细胞基质进行压片处理，压片处理的压力为5Mpa-50Mpa，保压时间30min-720min。
9.根据权利要求3所述的抗菌软组织支架的制备方法，其特征在于，所述抗菌剂为聚六亚甲基双胍。
10.权利要求3-9任意一项所述的抗菌软组织支架的制备方法制备得到的抗菌软组织支架。
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