CN101479382B - 用于改善乳糖不耐症的乳酸菌 - Google Patents

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Abstract

本发明可提供对改善乳糖不耐症有效的乳酸菌。本发明涉及具有乳糖不耐症改善能力的乳酸菌的筛选方法，以及由该方法得到的乳酸菌，其特征在于：从乳杆菌属乳酸菌中筛选肠道粘附性和乳糖分解酶活性均增强的菌。

Description

用于改善乳糖不耐症的乳酸菌
技术领域
本发明涉及对改善乳糖不耐症有效的乳酸菌及其应用。
背景技术
“乳糖不耐症”是由于摄取的乳液中的乳糖消化不良，容易发生腹泻或腹痛等不适的消化道症状的体质。该乳糖不耐症通常随着年龄的增长而变得显著，不过在婴幼儿期也可见。为了减轻乳糖不耐症的症状，必须避免含有乳糖的制品的摄取，但无法摄取作为良好的钙源的乳制品，这会提高老年人的骨质疏松症的风险，在营养方面成为很大问题。骨质疏松症是威胁随着老龄化急速发展的日本的最大疾病之一，从降低老年人骨质疏松症风险的角度看，促进乳制品的积极摄取尤其重要。
乳糖通常通过在小肠内层的细胞中产生的乳糖分解酶进行分解、吸收。已知乳酸菌等各种微生物产生乳糖分解酶，分解乳糖。含有活乳酸菌或酵母的酸乳酪或乳酸菌饮料中，部分乳糖被分解，因此比较难以发生乳糖不耐症的症状，并且，通过持续地口服摄取，可以使肠内这些菌缓慢增殖，肠内乳糖分解能力增强，结果可能改善乳糖不耐症本身。
以往已知，在乳酸菌的乳糖的代谢中，有β-半乳糖苷酶(β-gal)和磷酸-β-半乳糖苷酶(P-β-gal)两种乳糖分解酶参与，并且本发明人等明确了第三种乳糖分解酶-乳酸菌所具有的磷酸-β-葡糖苷酶(P-β-glc)的存在(非专利文献1)。这些乳糖分解酶活性高的乳酸菌对于减轻乳糖不耐症的症状有效。但是，我们认识到：在非肠道***乳酸菌中也有具有高的乳糖分解活性的乳酸菌，但通常无法在人肠道内存活。对于上述乳酸菌，无法在人肠道内持续生产乳糖酶，无法寄望于比口服摄取更高的乳糖酶活性(非专利文献2)。因此，为了通过口服给予乳酸菌来改善乳糖不耐症，不只是乳糖酶活性高，还必须有可在肠内持续分解乳糖的乳酸菌，但上述乳酸菌的研究尚未有较大进展。
然而，已知肠道***乳酸菌中存在肠道粘附性高的菌。作为研究上述肠道粘附性高的菌的方法，例如有：通过测定与人肠道粘蛋白的结合能力，筛选适合人的各种血液型的肠道粘附性高的乳酸菌的方法(专利文献1)。该方法根据乳酸菌为了对人初期感染并定居于肠道内，与肠道上皮细胞表面粘附是必不可少的；以及高桥等人的使用大肠粘蛋白(RCM)进行的乳酸菌筛选的报告[使用涂有大肠粘蛋白(RCM)的聚苯乙烯珠筛选嗜酸乳杆菌组乳酸菌株时，来自与该RCM强烈结合的乳酸菌株的表层蛋白质(SLP)也与人大肠粘液层结合的报告。非专利文献3等]；构成人大肠粘蛋白的糖链的化学结构根据ABO式血液型而不同的报告(例如非专利文献4)等构建的。但是，该筛选方法是否适用适合各血液型的乳酸菌在研究以外的用途，尚未见有研究。
专利文献1：日本特开2004-101249号公报
非专利文献1：齋藤忠夫、伊藤敞敏、舘野義男、山崎由紀子，ヒト腸管起源の Lactobacillus gasseri)(ガセリ菌)におけるラクト一ス資化系の新経路の発見(人肠道起源的加氏乳杆菌中的乳糖利用***的新途径的发现)，生物工学会誌，(2001)，79(6)，172～173页
非专利文献2：Marteau P，Minekus M，Havenaar R，Huis in′t Veld JH.，Survival of lactic acid bacteria in a dynamic model of the stomach andsmall intestine：validation and the effects of bile.，J Dairy Sci，(1997)80(6)，1031～1037页
非专利文献3：Takahashi N，Saito T，Ohwada S，Ota H，Hashiba H，ItohT.，“A new screening method for the selection of Lactobacillusacidophilus group lactic acid bacteria with high adhesion to humancolonic mucosa.”，Biosci Biotechnol Biochem.，(1996).，60(9).，1434～1438页
非专利文献4：天野纯子，消化管ムチン上の血液型糖鎖耩造-细菌感染のメカニズム解明に向けて(消化道粘蛋白上的血液型糖链结构-细菌感染机理研究进展)，生化学，社団法人日本生化学会，(1999)71(4)，274～277页
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于提供具有改善乳糖不耐症的能力的乳酸菌。
解决课题的手段
本发明人等为解决上述课题进行了深入的研究，结果发现：在一部分的乳杆菌属乳酸菌中，其肠道粘附性和乳糖分解酶活性均增强，并基于该认识完成了本发明。
即，本发明包含以下内容。
筛选具有乳糖不耐症的改善能力的乳酸菌的方法，其特征在于：从乳杆菌属乳酸菌中筛选肠道粘附性和乳糖分解酶活性均增强的菌。
该方法中，更优选在该菌的筛选中，使用表面等离子体共振分析来测定乳酸菌与人A型肠道粘蛋白、人B型肠道粘蛋白和人O型肠道粘蛋白中的至少一种的结合能力，将表示该结合能力的RU值为100RU以上的菌作为肠道粘附性增强的菌进行筛选。
该方法中，通过筛选的菌而增强的乳糖分解酶活性优选为β-半乳糖苷酶、磷酸-β-半乳糖苷酶和磷酸-β-葡糖苷酶中的至少一种乳糖酶活性。
该方法中，优选进行筛选的乳杆菌属乳酸菌是加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)或粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)。
乳酸菌，其是由上述[1]所述的方法获得的、肠道粘附性和乳糖分解酶活性均增强的乳酸菌。
乳酸菌，其为加氏乳杆菌OLL2836株(保藏号NITE BP-241)、加氏乳杆菌OLL2948株(保藏号NITE BP-242)和粘膜乳杆菌OLL2848株(保藏号MTE BP-243)中的任意一种乳酸菌。
乳糖不耐症改善剂，该改善剂至少含有一种上述[3]所述的乳酸菌。
该乳糖不耐症改善剂更优选至少含有加氏乳杆菌OLL2836株(保藏号MTE BP-241)、加氏乳杆菌OLL2948株(保藏号NITE BP-242)和粘膜乳杆菌OLL2848株(保藏号NITE BP-243)的三种乳酸菌。
饮食品，该饮食品至少含有一种上述[3]所述的乳酸菌。
该饮食品更优选至少含有加氏乳杆菌OLL2836株(保藏号NITEBP-241)、加氏乳杆菌OLL2948株(保藏号NITE BP-242)和粘膜乳杆菌OLL2848株(保藏号NITE BP-243)的三种乳酸菌。
该饮食品优选为婴儿食品、幼儿食品、哺乳妇女食品、老年人食品、病人食品、保健功能食品、膳食补充剂、发酵乳或乳酸菌饮料。
该饮食品尤其适合作为改善乳糖不耐症用的饮食品。
发明效果
根据本发明的筛选方法，可以高效地筛选对乳糖不耐症的改善有作用的乳酸菌株。使用本发明的乳酸菌株，还可以制备对乳糖不耐症的改善有效的药物或各种饮食品。
本说明书包含作为本发明优先权主张的基础的日本国特许出愿第2006-175897号的公开内容。
附图简述
图1表示对于肠道粘附性高的代表性菌株进行P-β-gal活性试验的结果。
图2表示对于肠道粘附性高的代表性菌株进行P-β-gLc活性试验的结果。
图3表示对于肠道粘附性高的代表性菌株进行β-gal活性试验的结果。
实施发明的最佳方式
以下，详细说明本发明。
1.筛选具有乳糖不耐症改善能力的乳酸菌的方法
本发明涉及通过从乳杆菌属乳酸菌中筛选肠道粘附性和乳糖分解酶活性均增强的菌，来筛选具有乳糖不耐症改善能力的乳酸菌的方法。
本发明的方法中，供给筛选的“乳杆菌属乳酸菌”是指按照常规的分类学方法被分类为乳杆菌属(Lactobacillus)或属于乳杆菌属的任意细菌种类的细菌。对该分类学方法并没有特别限定，包含已知的在乳杆菌属菌的分类中所使用的基于以往形态学分类方法或生理、生化学性状的分类方法，例如对于未进行菌种鉴定的细菌，采用基于用16SrDNA序列、特别是V3区的核苷酸序列进行的同源性分析的分子***学的分类方法，这可以明确分类，更为优选。属于乳杆菌属乳酸菌的细菌种类的具体例子有：保加利亚乳杆菌(保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、或德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckii subsp.Bulgaricus))、德氏乳杆菌(德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckii)、或德氏乳杆菌德氏亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.Delbrueckii))、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、乳乳杆菌(Lactococcus lactis)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)等，但并不限于此。本发明的方法中，作为乳杆菌属乳酸菌优选肠道***乳酸菌，尤其优选加氏乳杆菌和粘膜乳杆菌。本方法中，供给筛选的“乳杆菌属乳酸菌”可以是含有多种乳杆菌属乳酸菌细胞的细胞集团或细胞混合物，也可以是乳杆菌属乳酸菌的个别菌株的集合。
本发明中，对于上述乳杆菌属乳酸菌，测定肠道粘附性和乳糖分解酶活性，筛选它们均增强的菌。
这里，“肠道粘附性”是指乳酸菌与受试体的肠上皮细胞表面的结合能力。在本发明涉及的乳酸菌的肠道粘附性测定中，代表性的是测定乳酸菌与人A型肠道粘蛋白、人B型肠道粘蛋白、以及人O型肠道粘蛋白中的至少一种肠道粘蛋白的结合能力，可以使用所得的测定值作为表示肠道粘附性的值。乳酸菌与肠道粘蛋白的结合能力的测定例如可通过利用专利文献1和国际申请WO2006/067940中记载的表面等离子体共振分析的方法进行。采用表面等离子体共振分析时，优选将表示乳酸菌与肠道粘蛋白结合能力的RU值为100RU以上的菌作为肠道粘附性增强的菌、作为筛选乳酸菌株的候选菌株。
以下，进一步具体说明与该肠道粘蛋白的结合能力的测定***。首先，为了制备不同血液型的人肠道粘蛋白，从各血液型(A型、B型和O型)的人肠道中采集表层部分，使用盐酸胍等增溶剂进行凝胶过滤，以蛋白质吸收(280nm的吸光度)和中性糖含量高为指标，采集目标组分并纯化。该凝胶过滤纯化的详细内容例如可参考PurushothamanS.S.等人，“Adherence of Shigella dysenteriae 1 to Human ColonicMucin.”Curr.Miorobiol.，42(6)，381～387页(2001)中记载的人大肠粘蛋白的纯化方法。纯化后，更优选使用抗血液型抗原抗体，来确认在制备的人肠道粘蛋白上表达血液型抗原。具体例子可例举实施例中记载的方法。血液型抗原可以使用市售的糖链探针(例如生化学工业制备)或拟糖蛋白·Blood Group A Trisaccaride-BSA(例如Calbiochem公司)或拟糖蛋白·Blood Group B Trisaccaride-BSA(例如Calbiochem公司)等。以其作为抗原，可以按照本领域公知的各种抗体制备方法制备抗血液型抗原抗体。
本发明的筛选方法中，以人A型肠道粘蛋白、人B型肠道粘蛋白、人O型肠道粘蛋白的各自人肠道粘蛋白作为探针，进行表面等离子体共振谱分析，由此可以测定乳酸菌与这些人肠道粘蛋白的结合能力。表面等离子体共振谱分析中可以使用作为生物传感器(生物体分子间相互分析装置)的BIACORE***(BIACORE公司)，例如可使用BIACORE1000。
BIACORE***是根据表面等离子体共振谱(SPR)的原理，无需使用标记，即可以实时监控生物体分子之间的相互作用(结合和解离)的分析装置。具体来说是测定配体(以下也称为探针)和被分析物之间的分子间相互作用。本发明中，分别使用乳酸菌作为被分析物，使用人大肠粘蛋白(A型、B型、O型)作为配体。关于表面等离子体共振的原理，其详细说明书已有很多公开发行的报道。简单地说明该装置所采用的原理，则是：使物质在金膜上结合/解离，测定由于该结合/解离导致的金膜上的质量变化所伴随的反射光折射率的变化，由此计算与金膜结合的物质的量。更具体地说，该装置中，粘贴有被称为传感芯片的金膜的玻璃基板设置在流经试样或试剂的流路的中途，并与该流动液体接触，在该流路中使试样等流过，同时通过棱镜等将760nm的偏光以楔形集光在传感芯片上，在金膜上反射，监控该反射光的折射率，则表面等离子体共振谱的角度变化与金膜上物质结合量的变化成比例显示。这里，BIACORE***中，首先使探针流过流路，预先将探针固定在传感芯片的金膜上，接着封闭探针未结合的部位，然后将要研究与探针结合/解离反应的物质(被分析物)流入流路，在不同时间监控反射光的折射率，由此可以由该变化量计算探针与被分析物的结合量。该***中，将表面等离子体共振谱的角度0.1°的变化定义为1000共振单位(RU)，根据以该共振单位作为单位的值(RU值)表示反射光的折射率变化。这里，1共振单位(RU)相当于传感芯片表面上的1pg/1mm2的质量变化。即，物质与传感芯片金膜上的结合量可以由物质结合前(添加前)时和结合完成时的RU值的差计算。使用BIACORE***，则可以求出探针(本发明为各人肠道粘蛋白)与被分析物(本发明中为乳酸菌)的结合量作为1mm2传感芯片的质量变化(pg)，即RU值，该结合量(RU值)相当于被分析物与探针的结合能力。
需要说明的是，在BIACORE***中使用的传感芯片根据与该传感芯片固定的物质(探针)、固定方法、使用目的等而有几种，例如除最标准的CM5(玻璃面上粘贴金膜(典型的为50nm)，其表面上具备羧基甲基葡聚糖层(典型的为100nm)。经由该羧甲基葡聚糖层所具有的羧基、以及配体所具有的氨基、硫醇基、醛基或羧基，将配体(探针)固定在传感芯片上)之外，还有CM4、CM3、C1、SA、NTA、L1、HPA等。
本发明中，将肠道粘蛋白作为探针固定在传感芯片上时，例如可按照BIACORE***的制造商的使用说明书实施。固定方法例如可以是物理吸附的方法或通过共价键吸附的方法。其中的一个例子是：如果使用CM5(BIACORE公司)作为传感芯片，优选首先将N-乙基-N’-3-二甲基氨基丙基-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)按1∶1混合，将该混合试剂(EDC/NHF)流入流路，使传感芯片上的羧甲基葡聚糖中的羧基活化，然后制备向固定用乙酸缓冲液(pH 4.0)中加入人肠道粘蛋白溶液(分别使用A-HCM、B-HCM、O-HCM)所得的混合溶液，进一步流入到流路中，通过胺偶联反应，人肠道粘蛋白与传感芯片上的羧基部位共价结合。并且，使用乙醇胺盐酸盐-NaOH(pH8.5)，封闭探针未结合的传感芯片上的羧基部位，制成固定肠道粘蛋白(HCM)的传感芯片。本发明中，对HCM在传感芯片上的固定量没有特别限定，但优选为1000～2000RU。
接着，将含有乳酸菌菌体的试样(被分析物溶液)流入流路中，计算固定各HCM的传感芯片上的HCM(探针)与被分析物溶液中的乳酸菌菌体(被分析物)的结合量。可在该分析中使用的BIACORE1000的测定条件的一个例子如下所示，但并不限于此。
电泳缓冲液：HBS-EP缓冲液(pH 7.4)
被分析物溶液(样品)的添加量：20μL
流速：3μL/分钟
反应温度：25℃
再生溶液：1M胍盐酸盐溶液5μL
根据上述测定得到的结合/解离曲线，可以使用由被分析物结合后的RU值减去被分析物结合前的RU值所得RU值作为表示被分析物乳酸菌与作为探针的各肠道粘蛋白的每1mm2的结合量(pg)，即，该乳酸菌与肠道粘蛋白的结合能力的值。本发明中，乳酸菌与肠道粘蛋白的结合能力相对于人A型肠道粘蛋白、B型肠道粘蛋白、O型肠道粘蛋白的至少一个显示100RU以上的值时，则可判断“肠道粘附性增强”或“肠道粘附性高”。
需要说明的是，RU值可根据BIACORE***的测定条件而变化。本发明的温度条件例如20～40℃，优选20～30℃，更优选23～28℃。本方法中优选的被分析物溶液(样品)的浓度为0.1～0.5mg/mL，本方法中优选的流速为3～10μL/分钟。如果在上述范围内，则即使改变上述各条件，RU值也不会变动，因此可以以“100RU”为基准判断肠道粘附性是否高。并且，即使被分析物溶液的浓度的各条件在上述范围外变化时，换算为上述条件下的RU值时如果显示与100RU同等的结合能力，则该乳酸菌的肠道粘附性增强。并且，本发明的筛选方法中，RU值高的菌则肠道粘附性也高，即，可以说肠道粘附性比通常的乳酸菌增强。本发明中，优选筛选对至少一种人肠道粘蛋白的结合能力显示为100RU以上、更优选300RU以上、特别优选1000RU以上的RU值的乳酸菌作为肠道粘附性增强的菌。
并且，本发明的筛选方法中，对于上述乳杆菌属乳酸菌进行β-半乳糖苷酶(β-gal)、磷酸-β-半乳糖苷酶(P-β-gal)和磷酸-β-葡糖苷酶(P-β-glc)中的至少一种乳糖分解酶的乳糖酶活性(乳糖分解酶活性)的测定，筛选该活性增强的菌株。
具体来说，按照Fisher法，将冻干菌体悬浮于0.05M磷酸缓冲液中，将其加入甲苯-丙酮混合液(1∶9(v/v))，剧烈搅拌，如果是用于测定β-gal的乳糖酶活性，则向该悬浮液中加入添加有邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPGal)的磷酸缓冲液，如果是用于测定P-β-gal的乳糖酶活性，则向该悬浮液中加入添加有邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷-6-磷酸酯(ONPGal-6P)的磷酸缓冲液，或者如果是用于测定P-β-glc的乳糖酶活性，则向该悬浮液中加入添加有邻硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷-6-磷酸酯(ONPGlc-6P)的磷酸缓冲液，在37℃下反应15分钟。反应后加入0.5 M碳酸钠溶液，中止反应，通过离心(6,000×rpm，10分钟，4℃)除去菌体成分，通过吸光光度计(例如Multiskan MS-UV(Labsystems，赫尔辛基，芬兰))测定上清的405nm的吸光度。将1μmol游离1分钟的邻硝基苯酚(ONP)定义为1单位，换算为活性值。由该活性值分别计算每1mg菌体的活性值和培养上清中所含的每1mg蛋白质的活性值。
需要说明的是，蛋白质的定量可以是利用根据BCA法的MicroBCA蛋白测定试剂盒(Pierce，Rockford，伊利诺伊，美国)，在反应2小时后，使用吸光光度计(例如Multiskan MS-UV)测定540nm下的吸光度。校正曲线可以使用牛血清白蛋白(BSA)作成。可以根据该校正曲线计算上清中所含的蛋白质的量。
可以由上述计算的每1mg菌体的β-gal、P-β-gal、和P-β-glc的活性值和培养上清中所含的每1mg蛋白质的活性值筛选该乳糖酶活性特别高的乳酸菌(乳糖分解酶活性比通常的乳酸菌增强)。
特别优选筛选培养上清中的每1mg蛋白质中例如β-gal的乳糖酶活性(本发明中也称为β-gal活性)为15单位以上、优选100单位以上的菌株，但并不限于此。还特别优选筛选培养上清中的每1mg蛋白质中P-β-gal的乳糖酶活性(本发明中也称为P-β-gal活性)显示为15单位以上、优选45单位以上的菌株。并且特别优选筛选培养上清中的每1mg蛋白质中P-β-glc的乳糖酶活性(本发明中也称为P-β-glc活性)显示为25单位以上、优选50单位以上的菌株。
本发明的方法中，如上所述，对于上述乳杆菌属乳酸菌(更优选加氏乳杆菌或粘膜乳杆菌)分别测定肠道粘附性和乳糖分解酶活性，结果可以高效地筛选肠道粘附性和乳糖分解酶活性均增强的乳酸菌株。本发明也涉及上述筛选的乳酸菌株。上述得到的乳杆菌属乳酸菌在肠道内良好增殖并定居，保有可非常高效地分解乳糖的能力，因此对于乳糖不耐症的改善非常有效。本发明中，“乳糖不耐症的改善”是指摄取含有乳糖的饮食品(乳制品等)时，乳糖不耐症的不适的消化道症状(腹痛、腹泻、腹部咕噜咕噜感等)出现的频率降低或者完全抑制发病，或者使症状的严重程度减轻。另外，“乳糖不耐症的改善能力”是指乳酸菌如上所述具有可以改善乳糖不耐症的能力。
本发明中，通过采用上述筛选方法，可以实际获得肠道粘附性和乳糖分解酶活性均显著增强的三种菌株的乳杆菌属乳酸菌。这三种乳酸菌是加氏乳杆菌OLL2836株(以下也称为OLL2836株)、加氏乳杆菌OLL2948株(以下也称为OLL2948株)和粘膜乳杆菌OLL2848株(以下也称为OLL2848株)。这些乳酸菌株保藏在独立行政法人制品评价技术基盘机构特许微生物寄托中心。有关它们的保藏信息如下。
(1)保藏机构名：独立行政法人制品评价技术基盘机构特 许微生物寄托中心
(2)保藏机构的连络地址：日本国千叶县木更津市かずさ鎌足2-5-8
(3)保藏日(原保藏日)：2006年6月9日
(4)保藏号和接收号：
·加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)OLL2836株：
保藏号NITE BP-241(原保藏的接收号NITE AP-241)
·加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)OLL2948株：
保藏号NITE BP-242(原保藏的接收号NITE AP-242)
·粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)OLL2848株：
保藏号NITE BP-243(原保藏的接收号NITE AP-243)
保藏的这些OLL2836株、OLL2948株和OLL2848株具有以下表1所示的性质。
[表1]
Figure G2007800237640D00121
表1中的乳酸菌MRS肉汤(Lactobacilli MRS Broth：MRS培养基，例如Difco，Ref.NO.288160)是可适合用于这些乳酸菌株培养的培养基。MRS培养基的典型组成如表2所示。
[表2]
Figure G2007800237640D00122
表1所示的三种菌株其乳糖不耐症的改善能力特别高，因此特别有利于在本发明中利用。
2.本发明的含有乳酸菌的乳糖不耐症改善剂
本发明的乳酸菌通过口服给予，可以在存活状态下到达肠，定居在肠上，发挥强烈的乳糖分解酶活性，结果可以改善乳糖不耐症。另外，在使用本发明的乳酸菌制备的发酵物中，由于高乳糖分解活性而使乳糖的分解效率提高。
因此，本发明涉及乳糖不耐症改善剂，该乳糖不耐症改善剂含有由使用上述筛选方法得到的、肠道粘附性和乳糖分解酶活性均显著增强的乳杆菌属乳酸菌(本发明的乳酸菌)。本发明的乳糖不耐症改善剂通过对显示乳糖不耐症或者有其可疑性的受试体给予，可以得到改善乳糖不耐症的效果，即，可以使乳糖不耐症的不适的消化道症状(腹痛、腹泻、腹部咕噜咕噜感等)出现的频率降低，或者完全抑制发病，或者可以减轻乳糖不耐症的症状的严重程度。本发明的乳糖不耐症改善剂也具有预防乳糖不耐症的发病的效果。
本发明的乳糖不耐症改善剂至少含有一种(一个菌株以上)本发明的乳酸菌。本发明的乳糖不耐症改善剂优选含有选自加氏乳杆菌OLL2836株(保藏号NITE BP-241)、加氏乳杆菌OLL2948株(保藏号NITE BP-242)和粘膜乳杆菌OLL2848株(保藏号NITE BP-243)的至少一种作为本发明的乳酸菌。特别优选的实施方案中，本发明的乳糖不耐症改善剂至少含有加氏乳杆菌OLL2836株(保藏号NITE BP-241)和加氏乳杆菌OLL2948株(保藏号NITE BP-242)、粘膜乳杆菌OLL2848株(保藏号NITE BP-243)的三种乳酸菌。将该三种乳酸菌组合含有的乳糖不耐症改善剂还可以与具有A型、B型、O型的任意血液型抗原的肠道粘蛋白结合，因此对于广泛的受试体有效。
本发明的乳糖不耐症改善剂可以是含有本发明的乳酸菌的纯化菌体的组合物，也可以是含有使用该乳酸菌制备的发酵物、培养物、或它们的浓缩物的组合物。本发明的乳糖不耐症改善剂所含的本发明的乳酸菌可以是活菌体也可以是死菌体，可以是湿润菌体也可以是干燥菌体。但是，更优选的实施方案中，本发明的乳糖不耐症改善剂是以存活状态含有本发明的乳酸菌的组合物。本发明的乳糖不耐症改善剂可以是液体状、凝胶状、粉末状、颗粒状、固体状、胶囊状、或片状等任何形态，但并不限于此。
本发明的乳糖不耐症改善剂通过适量添加，可以使饮食品或药物组合物具有乳糖不耐症改善作用。本发明的乳糖不耐症改善剂除作为有效成分的本发明的乳酸菌或其培养物、发酵物或它们的浓缩物等之外，也可以含有药物制剂上可接受的载体或添加物。上述载体和添加物的例子有：水、药物可接受的有机溶剂、胶原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧基乙烯基聚合物、褐藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、占吨胶、***树胶、酪蛋白、明胶、琼脂、甘油、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蜡、硬脂基醇、硬脂酸、人血清白蛋白、甘露糖醇、山梨醇、羧甲基纤维素、可用作药物添加物的表面活性剂等，除此之外还有脂质体等人工细胞结构物等。使用的添加物可根据制剂的剂型适当或者组合选择。
本发明的乳糖不耐症改善剂可以口服或非口服(例如胃内给予或肠内给予等)给予，但特别优选口服给予。口服给予的本发明的乳糖不耐症改善剂可以是片剂、颗粒剂、散剂、丸剂、胶囊剂等固体制剂，凝胶剂或者溶液剂、混悬剂、糖浆剂等液体制剂等剂型。以液体制剂使用时，使用本发明的乳糖不耐症改善剂时可以以可再溶解的干燥物的形式供给。
上述剂型中，口服用固体制剂可以含有制药学上通常使用的粘结剂、赋形剂、润滑剂、崩解剂、湿润剂等添加剂。口服用液体制剂可以含有制药学上通常使用的稳定剂、缓冲剂、矫味剂、保存剂、芳香剂、着色剂等添加剂。
本发明的乳糖不耐症改善剂的给予量根据给予对象的年龄和体重、给予途径、给予次数而不同，可根据本领域人员的认识在大范围内变更。例如口服给予时，本发明的乳糖不耐症改善剂中所含的本发明的乳酸菌的给予量为1～1000mg/kg/天较为适当。本发明的乳糖不耐症改善剂可以单次给予，但也可以以6～8小时的间隔反复给予。
对给予本发明的乳糖不耐症改善剂的对象没有限定，但优选为包含人、家禽、宠物动物、实验(试验)动物等的哺乳动物。并且，为乳糖不耐症或有其可疑性的婴幼儿期、成年期、老年期的哺乳动物也优选作为本发明的受试体。更优选由于老年或患病等而导致的乳糖分解能力低的哺乳动物、或者具有乳糖不耐症的遗传因素或环境因素的哺乳动物也作为给予本发明的乳糖不耐症改善剂的受试体。本发明的乳糖不耐症改善剂副作用少，因此可以在连续利用方面非常有效地使用。
3.含有本发明的乳酸菌的饮食品
本发明也涉及饮食品，该饮食品含有用上述筛选方法得到的肠道粘附性和乳糖分解酶活性均显著增强的乳杆菌属乳酸菌。本发明的饮食品特别适合用于改善乳糖不耐症的饮食品，但并不限于此。“用于改善乳糖不耐症”是指以显示乳糖不耐症或者有其可疑性的受试体作为给予对象，目的在于使乳糖不耐症的不适的消化道症状(腹痛、腹泻、腹部咕噜咕噜感等)出现的频率降低、或者完全阻止发病、或者使乳糖不耐症的症状严重程度减轻。
本发明中的“饮食品”没有限定，对于包含饮料、食品和功能性食品的含有本发明的乳酸菌的饮食品的种类没有特别限定。例如，作为含有本发明的乳酸菌的饮料可例举发酵乳(酸乳酪等)、乳酸菌饮料、乳饮料(咖啡牛乳、水果牛乳等)、茶类饮料(绿茶、红茶和乌龙茶等)、水果/蔬菜系饮料(包含橙、苹果、葡萄等的果汁或番茄、胡萝卜等蔬菜汁的饮料)、酒精性饮料(啤酒、发泡酒、葡萄酒等)、碳酸饮料和清凉饮料等饮料。各种饮料的制备方法等可以参考已有的参考书、例如“最新软饮料”(2003)(株式会社光琳)等。
对含有本发明的乳酸菌的食品没有特别限定，可以是生鲜食品也可以是加工食品，但特别优选的食品例如有：可以以存活的状态将本发明的乳酸菌送达至肠的发酵乳或乳酸菌饮料。含有本发明的乳酸菌的食品可以是制备酸乳酪或干酪等乳制品、发酵乳的引子(starter)。
另外，含有本发明的乳酸菌的饮食品尤其优选作为功能性食品。本发明的“功能性食品”是指对生物体具有一定功能性的食品，例如包含特定保健用食品(包含附条件的日本特保[特定保健用食品])和包含营养功能食品的保健功能食品、特别用途食品、营养辅助食品、健康辅助食品、膳食补充剂(例如片剂、包覆剂、糖衣片、胶囊和溶液剂等各种剂型)和美容食品(例如减肥食品)等所谓的全体健康食品。本发明的功能性食品还包含适用于符合CODEX(FAO/WHO联合食品法典委员会)的食品规格的健康强调标识(健康声称，Health claim)的健康食品。
作为本发明的功能性食品，优选的更具体例子有：病人食品、孕产妇/哺乳期妇女粉乳、婴儿配方粉乳、老年人食品等特别用途食品。本发明的乳酸菌可以以温和的作用逐渐改善肠内环境，使肠内的乳糖分解能力提高，改善乳糖不耐症，也可以减轻其症状，因此特别适合婴幼儿配方粉乳或液体配方乳在治疗体力弱的婴幼儿乳糖不耐症中的应用(例如可以添加到通常的婴幼儿配方乳的原料中)，或哺乳期妇女粉乳等的孕妇用或哺乳期妇女用的食品，以及老年人食品或病人食品在体力低下的老年人或病人的乳糖不耐症治疗中的应用。
作为本发明的优选的功能性食品，还可以进一步例举：用于先天性或后天性因素显示乳糖不耐症的受试体的婴幼儿膳食补充剂、孕产妇/哺乳期妇女膳食补充剂、老年人膳食补充剂和病人膳食补充剂。
含有本发明的乳酸菌的功能性食品的优选例子有保健功能食品。保健功能食品制度是基于国内外动向、与以往的特定保健用食品制度的整合性，不只考虑通常的食品，也以制成片剂、胶囊等形状的食品为对象设置。在该制度下，保健功能食品包含特定保健用食品(个别许可型)和营养功能食品(规格基准型)两种类型。并且，也包含附条件特保[特定保健用食品]等新的类型。
本发明的功能性食品优选可将本发明的乳酸菌导入肠内并定居，使肠内乳糖分解能力(优选持续性)提高，结果具有改善乳糖不耐症的效果。本发明的功能性食品还可以以乳糖不耐症改善以外的用途作为第一目的。本发明的功能性食品(优选特定保健用食品或附条件的特保[特定保健用食品])可以对提高肠内乳糖分解能力、由此改善乳糖不耐症或其症状的效果予以记载或标记。上述记载或标记可根据保健功能食品制度中的规定得到标记认可。例如，本发明的功能性食品中，应可以记载“适合需要调节腹部状态者”“良好保持腹部状态”“调节肠内环境”“适合不宜饮牛乳者”等记载，但并不限于此。
本发明的功能性食品可以是片剂、颗粒剂、散剂、丸剂、胶囊剂等固体制剂，溶液剂、混悬剂、糖浆剂等液体制剂，或者凝胶剂等制剂的形状，可以是通常的饮食品的形状(例如发酵乳、饮料、粉末状茶叶、点心等)。
对本发明的乳酸菌在饮食品中的配合量没有特别限定，可以根据各情形而不同。具体的配合量可以考虑饮食品的种类或所需口味或口感，由本领域人员适当确定。但是，通常本发明的乳酸菌的总量以0.001～100％(重量)、特别是0.1～100％(重量)的配比量较为适当。
本发明的乳酸菌可通过本领域可利用的任意的适当方法在饮食品中含有。例如，可以将本发明的乳酸菌直接混合在饮食品的原料中。本发明的乳酸菌可以涂布、包覆、渗透或喷涂在饮食品上。本发明的乳酸菌可以均匀地分散在饮食品中，也可以局部存在。也可以制成加入了本发明的乳酸菌的胶囊等的制剂。可以用可食用薄膜或食用包衣剂等包裹本发明的乳酸菌。本发明的乳酸菌中加入适当的赋形剂等后，可以成型为片剂等形状。含有本发明的乳酸菌的饮食品可以进一步加工，上述加工品也包含在本发明的范围内。并且特别优选含有使用本发明的乳酸菌制备的乳发酵物的饮食品。总之，本发明的饮食品尤其优选以存活状态含有本发明的乳酸菌，但并不限于此。
本发明的饮食品的制备中，可以使用饮食品中常用的各种添加物。对添加物没有限定，可以进一步添加显色剂(亚硝酸钠等)、着色剂(栀子染料、红102等)、香料(橙香料等)、甜味剂(甜叶菊、阿斯巴甜等)、防腐剂(乙酸钠、山梨酸等)、乳化剂(软骨素硫酸钠、丙二醇脂肪酸酯等)、抗氧化剂(EDTA二钠、维生素C等)、pH调节剂(柠檬酸等)、化学调味剂(肌苷酸钠等)、增稠剂(占吨胶等)、膨胀剂(碳酸钙等)、消泡剂(磷酸钙)、粘结剂(聚磷酸钠等)、营养强化剂(钙强化剂、维生素A等)等。并且还可以进一步添加人参提取物、刺五加提取物、桉提取物、杜仲茶提取物等功能性材料。
本发明的饮食品至少含有一种(一个菌株以上)本发明的乳酸菌。本发明的饮食品中，作为本发明的乳酸菌，优选含有选自加氏乳杆菌OLL283 6株(保藏号NITE BP-241)、加氏乳杆菌OLL2948株(保藏号NITE BP-242)和粘膜乳杆菌OLL2848株(保藏号NITE BP-243)的至少一种。特别优选的实施方式中，本发明的饮食品至少均含有加氏乳杆菌OLL2836株(保藏号NITE BP-241)、加氏乳杆菌OLL2948株(保藏号NITE BP-242)和粘膜乳杆菌OLL2848株(保藏号NITE BP-243)的三种乳酸菌。将该三种乳酸菌组合含有的饮食品还可以与具有A型、B型、O型任意血液型抗原的肠道粘蛋白结合，因此对广泛的受试体有效。
对摄取或给予本发明的饮食品的受试体并没有特别限定，优选为包含人、家畜(猪、马等)、宠物动物(狗、猫等)、实验(试验)动物(小鼠、大鼠等啮齿动物或兔等)的哺乳动物。并且，还优选为乳糖不耐症或有其可疑性的婴幼儿期、成年期、老年期的哺乳动物作为本发明的受试体，另外，由于老年和患病等而导致乳糖分解能力低的哺乳动物、或者具有乳糖不耐症的遗传因素或环境因素的哺乳动物也优选作为摄取或给予本发明的饮食品的受试体。
实施例
以下，采用实施例进一步具体说明本发明。但本发明的技术范围并不限于这些实施例。
[实施例1]供试乳酸菌的培养和制备
以下所使用的供试乳酸菌使用了接受明治乳业株式会社提供的来自人的乳酸菌株、由美国典型培养物保藏中心(ATCC)、理化学研究所微生物***保存设施(JCM)、农林水产省畜产实验场(NIAI)、和英国食品菌菌种保藏中心(NCFB)获得的乳酸菌株，以及本发明人等使用改性LBS琼脂，由幼儿粪便分离的共104株菌株。这些供试乳酸菌除属于保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)、乳乳杆菌(Lactococcus lactis)、加氏乳杆菌(Lactobacillusgasseri)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)和粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)的各种菌株之外，也包含菌种未鉴定的菌株。需要说明的是，菌株名记载为OLL或MEP的菌株表示为明治乳业株式会社所保有的菌株。
各供试乳酸菌的菌体分散于灭菌的10％(w/v)脱脂乳培养基(雪印乳业株式会社，札幌)中，在使用之前在深度冷冻中、在-80℃下保存。
培养中，各菌株在MRS培养基(Difco，底特律，密歇根州，美国)中继代培养三次(37℃，24小时)，然后在MRSL培养基(将2％葡糖糖置换为乳糖所得的MRS培养基)中继代培养两次(37℃，24小时)。接着，将所得菌体培养液以1％接种于新制备的MRSL培养基中，然后在37℃下培养18小时。这样制备的该培养液进行离心(6,000×g，20分钟，4℃)，将收集的菌体用0.05M磷酸缓冲液(pH 6.8)清洗，然后悬浮于蒸馏水中，然后进行冷冻干燥。
[实施例2]肠道粘附性菌株的筛选
采用由本发明人等所开发的用于研究与肠道粘蛋白的结合能力的测定***，由上述供试乳酸菌株中筛选肠道粘附性高(RU值为100以上)的菌株，所使用的测定***详细记载于国际申请WO2006/067940中。
具体来说，通过使用生物传感器BIACORE1000(BIACORE公司)，对乳酸菌与人A型肠道粘蛋白、人B型肠道粘蛋白、人O型肠道粘蛋白的结合能力进行表面等离子体共振谱分析来进行测定。
1.被分析物溶液的制备
起菌后，首先将各菌株在MRS培养基中继代三次，在37℃下培养12小时，然后以500μL分注于1.5mL容量的离心管中。将该培养液进行离心(6,000rpm，4℃，10分钟)，除去上清，将所得菌体用PBS缓冲液(pH 7.2)清洗两次，然后悬浮于蒸馏水中，冷冻干燥。将该菌体用HBS-EP缓冲液(0.01M HEPES(pH7.4)、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％表面活性剂P20)制备成0.1mg/mL浓度，作为被分析物溶液。
2.人肠道粘蛋白(HCM)的制备和固定有HCM的传感芯片的制作
进行人肠道粘蛋白的制备和人肠道粘蛋白在传感芯片上的固定。人A型肠道(来自血液型为A型的人的大肠)、人B型肠道(来自血液型为B型的人的大肠)和人O型肠道(来自血液型为O型的人的大肠)是作为标本采集试样，接受日本东北大学大学院医学系研究科的分送。需要说明的是，该试样的采集经日本东北大学大学院医学系研究科的伦理委员会批准后实施，并且已获得患者的同意。通过表层刮取法，由他们的肠道的大肠正常部位采集粘液粘蛋白层。粘液粘蛋白层通过Folch溶剂(氯仿-甲醇混合液(2∶1(v/v))；J.Folch等人.，：J.Biol.Chem.(1957)226，497～500页)和二***进行脱脂后干燥，用4 M盐酸胍溶液在37℃下提取2小时。接着对于该提取物通过凝胶过滤进行纯化。凝胶过滤纯化法是根据Purushothaman S.S.等人，“Adherence ofShigella dysenteriae 1 to Human Colonic Mucin.”Curr.Miorobiol.，42(6)，381～387页(2001)所记载的人大肠粘蛋白的纯化方法进行实施。流动层使用4 M盐酸胍溶液，凝胶过滤色谱用的柱使用Toyopearl HW-65F(90cm×2.6cm，Tosoh.Tokyo.Japan)。对于所得柱提取液，通过苯酚硫酸法(反应后测定490nm的吸光度)测定中性糖，通过280nm的吸光度测定蛋白质，结果，选择有蛋白质吸收(280nm的吸光度)且中性糖含量最高的峰，进一步以凝胶过滤色谱中分子量约200万以上为指标，分取大肠粘蛋白组分。这样得到的纯化物与来源的人的血液型对应，分别制成人A型肠道粘蛋白、人B型肠道粘蛋白、人O型肠道粘蛋白。以下，这些人肠道粘蛋白(human colon muci：HCM)中，将A型肠道粘蛋白称为A-HCM，将B型肠道粘蛋白称为B-HCM，将O型肠道粘蛋白称为O-HCM。对于所得各HCM，通过抗原抗体反应确认各血液型的人血液型基质抗原性。
上述得到的各HCM在BIACORE用传感芯片上的固定是在生物传感器BIACORE1000(BIACORE公司)中，通过胺偶联法进行。首先，向预先导入了羧甲基葡聚糖基的传感芯片CM5(BIACORE公司)中通入将50μL(75.0mg/mL)N-乙基-N’-3-二甲基氨基丙基-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和50μL(11.5mg/mL)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合而成的混合试剂(EDC/NHS)，使羧甲基葡聚糖中的羧基活化。接着，向120μL的固定用乙酸缓冲液(10mM，pH 4.0)中加入30μL上述纯化的任意的HCM溶液(A-HCM、B-HCM、O-HCM)，制备混合溶液，流入传感芯片，通过胺偶联反应使HCM与传感芯片上的羧基共价结合。并且，使用1M乙醇胺盐酸盐-NaOH(pH 8.5)，进行未结合探针的传感芯片上的部位的残留活性基团的封闭。使用HBS-EP缓冲液作为电泳缓冲液。以导入EDC/NHS之前与添加乙醇胺溶液之后的显示数据(reportpoint)的差表示的HCM固定量为1000～2000RU。接着，将这样得到的固定有HCM的传感芯片用于上述被分析物溶液的试验。
3.表面等离子体共振谱分析
进一步使用生物传感器BIACORE1000(BIACORE公司)，对各固定有HCM的传感芯片上的HCM和上述被分析物溶液中的乳酸菌菌体的结合量进行分析。该分析中使用的BIACORE1000的测定条件如下所示。
电泳缓冲液：HBS-EP缓冲液(pH 7.4)
被分析物溶液(样品)的添加量：20μL
流速：3μL/分钟
反应温度：25℃
再生溶液：1M胍盐酸盐溶液5μL
在通过BIACORE***进行的分析中，被分析物与探针的结合量(相互作用)是通过以共振单位(RU)为单位的值表示。1共振单位(RU)是指每1mm2传感芯片表面上结合有1pg物质。即，根据由该分析得到的结合/解离曲线，由结合后的RU值减去结合前的RU值所得的值相当于作为被分析物的各乳酸菌与作为探针的每1mm2各肠道粘蛋白的结合量。该结合量相当于该乳酸菌与各肠道粘蛋白的结合能力。
该分析结果中，从104株供试乳酸菌中筛选与至少一种肠道粘蛋白的结合能力显示100RU以上的值的菌株。可以说筛选的菌株中，肠道粘附性比其它平均的乳酸菌株增强(肠道粘附性高)。筛选的菌株的代表性例子及其分析结果如图1～3所示。
[实施例3]P-β-glc活性测定中使用的ONPGlc-6P的合成和纯化
以下，尝试进一步筛选具有肠道粘附性高、且高乳糖分解酶活性的菌株。这里，本实施例中，首先进行该活性测定中使用的ONPGlc-6P的制备。
1.ONPGlc-6P的化学合成
按照Hengstenberg和Morse的合成方法(Hengstenberg，W.和M.L.Morse.，Synthesis of o-Nitrophenyl-beta-D-galactopyranoside 6-phosphate，Carbohydr.Res.，10，463～465页(1969))的改良方法化学合成在磷酸-β-葡糖苷酶(P-β-glc)活性测定中使用的邻硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷-6-磷酸酯(ONPGlc-6P)。具体来说，首先将0.9g邻硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷(ONPGlc，Sigma、圣路易斯、美国)溶解于预先在冰上冷却、然后混合的含有54μL蒸馏水和840μL***的7.5mL磷酸三甲酯中。接着将该混合液在冰上搅拌5小时，进行反应。反应后加入冰片(蒸馏水)，一边滴加浓氨水一边用pH计中和溶液(pH 7.0)，终止反应。
2.ONPGlc-6P的纯化
对于上述中使反应中止的溶液，使用旋转蒸发器(东京理科机械，东京)反复进行在40℃下的浓缩干燥固化，除去反应中生成的邻硝基苯基(ONP)。接着，将浓缩的反应液与50g活性碳混合，在4℃下静置2小时，由此使化学合成的ONPGlc-6P和未反应的ONPGlc吸附在活性碳上，然后将其用20倍量的蒸馏水(2L)洗涤，进行脱盐。吸附在活性碳上的ONPGlc-6P的洗脱是使用吡啶∶水∶乙醇混合液(1∶1∶1(v/v/v)，600mL)进行。洗脱液在40℃下通过旋转蒸发器反复浓缩，除去吡啶。接着，供给制备纸层析(PPC)。即，使用100μL微量移液管，将上述粗纯化的ONPGlc-6P成直线状涂布在PPC用滤纸上(Whatman，3MM，46×57cm，梅德斯通，英格兰)，使用丁醇∶吡啶∶水(6∶4∶3(v/v/v))作为展开溶剂，通过上升法进行单向展开。展开需要2天时间，展开结束后，在通风室内使该滤纸干燥，然后用UV透射仪(302nm，FUNAKOSHI，东京)确认ONPGlc-6P和ONPGlc的条带，只切取ONPGlc-6P的条带。将切取的滤纸浸泡到蒸馏水中，在4℃下搅拌过夜，由此进行ONPGlc-6P的提取。提取后除去滤纸，通过旋转蒸发器浓缩水层，然后使用以蒸馏水作为移动相的TOYOPEARL HW40S柱(2.6φ×90cm，東ソ一，东京)，通过凝胶过滤除去混合存在的反应副产物。凝胶过滤后对各洗脱组分使用薄层层析(TLC，硅胶60，10×10cm，Merck，Darmstadt，德国)，回收ONPGlc-6P组分。TLC的展开溶剂中使用丁醇∶2-丙醇∶水(3∶12∶4(v/v/v))进行单向展开。风干后，向薄层板上均匀地喷雾5％(v/v)硫酸-甲醇溶液，在加温至150℃的干燥器(Yamato，东京)内加热3分钟进行检测。进行回收的ONPGlc-6P组分的冷冻干燥，制成纯化ONPGlc-6P。对于该纯化品通过TLC确认纯度，通过1H-NMR进行结构的确认。
[实施例4]β-gal、P-β-gal和P-β-glc活性的测定
对于实施例1中制备的1 04株供试乳酸菌，使用Fisher法进行β-gal、P-β-gal和P-β-glc的乳糖酶活性的测定。即，对各菌株，将0.5mg冻干菌体悬浮于1.0mL 0.05M磷酸缓冲液(pH 6.8)中，加入50μL甲苯-丙酮混合液(1∶9(v/v))，剧烈搅拌3分钟。向25μL该悬浮液中加入100μL含有邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPGal)、邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷-6-磷酸酯(ONPGal-6P)或上述制备的邻硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷-6-磷酸酯(ONPGlc-6P)的0.05M磷酸缓冲液(pH 6.8)，在37℃下反应15分钟。反应后加入125μL 0.5M碳酸钠溶液中止反应，通过离心(6,000×rpm，10分钟，4℃)除去菌体成分，使用MultiskanMS-UV(Labsystems，赫尔辛基，芬兰)测定上清的405nm的吸光度。以1分钟内游离的1μmol邻硝基苯酚(ONP)定义为1单位，以该单位为单位，分别计算每1mg菌体的活性值和培养上清中所含的每1mg蛋白质的活性值。
需要说明的是，蛋白质的定量是使用基于BCA法的Micro BCA蛋白测定试剂盒(Pierce，Rockford，伊利诺伊，美国)，在反应2小时后，使用Multiskan MS-UV测定540nm的吸光度。校正曲线是使用牛血清白蛋白(BSA)作成，由此计算蛋白质的量。图1～3中给出了实施例2中筛选的菌株的代表例的乳糖酶活性测定的结果。
[实施例5]乳酸菌株的筛选
根据上述实施例中所示的肠道粘附生和β-gal、P-β-gal和P-β-glc活性的测定结果，进行肠道粘附性高、且乳糖酶活性也高的乳酸菌株的筛选。结果，作为肠道粘附性高、且β-gal、P-β-gal和P-β-glc中任意乳糖酶活性都显示显著高活性的菌株，筛选了三种乳酸菌株(OLL2836株、OLL2948株和OLL2848株)(图1～3)。而大部分乳糖酶活性比较高的乳酸菌株，其肠道粘附性低(对于A型、B型、O型的任意型人肠道粘蛋白，RU值均低于100RU)，因此被排除。
如图1～3所示，OLL2836株显示46.576单位/mg蛋白质的P-β-gal活性，OLL2948株显示50.194单位/mg蛋白质的P-β-glc活性，OLL2848株显示107.090单位/mg蛋白质的β-gal活性，但这些活性值与肠道粘附性高的其它乳酸菌株比较，分别显示很高的值。并且这些菌株的显示肠道粘附性的RU值也是显示非常高的值。具体来说，OLL2836株与人B型肠道粘蛋白和人O型肠道粘蛋白显示尤其强的结合能力，OLL2948株和OLL2848株与人A型肠道粘蛋白显示特别强的结合能力。
由以上结果显示，对于这些乳酸菌株，它们分别单独定居于肠道内，有望获得持续分解乳糖的效果，除此之外，通过将该三种菌株组合使用，在任何血液型的受试体中均显示了可以获得高的乳糖分解效果。
对OLL2836株、OLL2948株和OLL2848株进一步进行菌种鉴定试验，鉴定的结果显示：OLL2836株和OLL2948株属于加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)，OLL2848株属于粘膜乳杆菌(Lactobacillusmucosae)(参照后述实施例)。该三种乳酸菌株分别于2006年6月9日(原保藏日)申请保藏于独立行政法人制品评价技术基盘评价机构 特许微生物寄托中心(日本国千叶县木更津市かずさ鎌足2-5-8)。该保藏申请的接收号如下：OLL2836株为NITE AP-241，OLL2948株为NITEAP-242，OLL2848株为NITE AP-243；保藏号分别为：MTE P-241、NITE P-242、NITE P-243。这些保藏菌株于2007年3月27日转移为根据布达佩斯条约的保藏(国际保藏)，以2006年6月9日作为原保藏日保藏。该国际保藏号如下：OLL2836株为NITE BP-241，OLL2948株为NITE BP-242，OLL2848株为NITE BP-243。这些菌株的微生物学性质已确认为如上述表1所述。
如上所述，通过使用本发明的筛选方法，可以获得肠道粘附性高且乳糖酶活性也高的乳酸菌株。并且对β-gal、P-β-gal和P-β-glc测定乳糖酶活性，筛选三种乳糖分解酶分别显示显著高活性的菌株，通过将所得的菌株组合，还可以获得可适用于广泛的受试体的非常有效的乳酸菌组合。认为本发明的方法中得到的乳酸菌株定居于肠道内，作为可以持续降低乳糖的有效的益生菌乳酸菌株，可有效用于改善乳糖不耐症。
[实施例6]菌种鉴定
对于实施例5中筛选的三种乳酸菌株OLL2836株、OLL2948株、OLL2848株进行菌种鉴定。鉴定是基于V3区的扩增、序列确定，通过16S rDNA核苷酸序列分析来进行。以下，以用OLL2848株和OLL2948株进行的鉴定试验为例进行阐述，OLL2836株也基本同样地进行了鉴定。
1.通过直接PCR法检测筛选株的16S rDNA片段
将OLL2848株和OLL2948株在MRS培养基上如上所述进行继代培养，然后进行直接PCR。将0.6mL容量的微量管中分别注入4μLmilliQ水，将使用灭菌牙签刮取的菌体分别悬浮于其中。向该悬浮液中加入Taq DNA聚合酶(TaKaRa，京都)，10×PCR缓冲液、dNTP Mix(TaKaRa，京都)、一组引物，制成PCR反应液。一组引物是使用通用引物-27F(5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，SEQ ID NO.1)和518R(5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’，SEQ ID NO.2)。PCR条件是进行1个[95℃10分钟、55℃3分钟、72℃1分钟]循环，39个[95℃30秒、55℃30秒、72℃30秒]循环和1个[72℃1分钟]循环。
2.琼脂糖凝胶电泳
接着，将通过以上的PCR反应扩增的DNA片段进行电泳。电泳是以2％琼脂糖凝胶作为电泳凝胶，电泳缓冲液使用1×TBE缓冲液(90mM Tris-硼酸、2mM EDTA、pH 8.0)，在100V的恒定电压下进行。电泳装置使用Mupid-2(Cosmo Bio，东京)。分子量标记使用100b DNA(TaKaRa，京都)。电泳后的凝胶的染色是在溴乙锭(EB)溶液(0.5μg/mL)中浸泡10分钟来进行。
3.由琼脂糖凝胶中提取DNA
通过UV透射仪TM-20(FUNAKOSHI药品株式会社、东京)对琼脂糖凝胶电泳以及染色后的凝胶进行UV照射，确认目标DNA片段并切取。通过DNA片段纯化试剂盒MagExtractor(TOYOBO，大阪)提取DNA。即，将切取的琼脂糖凝胶转移至1.5mL容量的管中，然后加入400μL吸附液，加温至55℃，使之完全溶解。接着向该反应液中加入15μL的磁性珠进行搅拌，然后在室温下放置1分钟。离心(6,000rpm，5秒，4℃)，然后除去上清，加入500μL的洗涤液搅拌。再次离心(6,000rpm，5秒，4℃)，然后加入1mL的75％乙醇，搅拌，离心(15,000rpm，1分钟，4℃)，然后除去上清。加入15μL的蒸馏水并搅拌，然后将通过离心(15,000rpm，1分钟，4℃)回收的上清作为纯化DNA溶液。
4.DNA序列的确定和同源性分析
对于纯化的DNA，使用引物27F(5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，SEQ ID NO.3)进行核苷酸序列确定。核苷酸序列的确定由OPERONBAIOTEKUNOROJI株式会社进行。这样，对OLL2848株确定的16S rDNA的V3区的核苷酸序列为SEQ ID NO.4，对OLL2948株确定的16S rDNA的V3区的核苷酸序列为SEQ ID NO.5。对于这些核苷酸序列，在日本DNA数据库(DDBJ)的网站上通过程序BLASTN进行同源性分析。
结果，OLL2848株的V3区的核苷酸序列与粘膜乳杆菌的V3区的序列显示99.6％的同源性。而OLL2948株的V3区的核苷酸序列与加氏乳杆菌的V3区的序列显示99.2％的同源性。由此可以鉴定：OLL2848株属于粘膜乳杆菌，OLL2948株属于加氏乳杆菌。
产业实用性
本发明的方法可以用于高效筛选对改善乳糖不耐症有效的乳酸菌株。由本发明的方法得到的乳酸菌株可以简便地给予患者，并且可以作为可持续地改善乳糖不耐症的药物或功能性食品的有效成分有利地使用。
序列表自由文本
SEQ ID NO.1～3的序列为引物。
本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请的全体均通过参照引入到本说明中。
序列表
<110>财团法人粮食研究会
国立大学法人东北大学
<120>用于改善乳糖不耐症的乳酸菌
<130>PH-3099-PCT
<150>JP 2006-175897
<151>2006-06-26
<160>5
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的种类：引物
<220>
<223>发明人：Saito，Tadao；Kitazawa，Haruki
发明人：Kawai，Yasushi；Itoh，Hiroyuki
<400>1
gagtttgatc ctggctcag                                            19
<210>2
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的种类：引物
<400>2
attaccgcgg ctgctgg                                              17
<210>3
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的种类：引物
<400>3
gagtttgatc ctggctcag                                               19
<210>4
<211>559
<212>DNA
<213>粘膜乳杆菌
<400>4
tgggggaggg gggggggggg ggggccggcg gtgtgtctct atatacatgc aagtccgaac 60
gcgttggccc aactgattga acgtgcttgc acggaacttg acgttggttt accagcgagt 120
ggcggacggg tgagtaacac gtaggtaacc tgccccaaag cgggggataa catttggaaa 180
cagatgctaa taccgcataa caatttgaat cgcatgattc aaatttaaaa gatggcttcg 240
gctatcactt tgggatggac ctgcggcgca ttagcttgtt ggtagggtaa cggcctacca 300
aggctgtgat gcgtagccga gttgagagac tgatcggcca caatggaact gagacacggt 360
ccatactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccaca atgggcgcaa gcctgatgga 420
gcaacaccgc gtgagtgaag aagggtttcg gctcgtaaag ctctgttgtt agagaagaac 480
gtgcgtgaga gcaactgttc acgcagtgac ggtatctaac cagaaagtca cggctaacta 540
cgtgccagca gcccgcggt                                              559
<210>5
<211>524
<212>DNA
<213>加氏乳杆菌
<400>5
ggcgtgcctt atacatgcaa gccgagcgag cttgcctaga tgaattttgg tgcttgcacc 60
acgatgaaac tagatacaag cgagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg taacctgccc 120
aagagactgg gataacacct ggaaacagat gctaataccg gataacaaca ctagacgcat 180
gtctagagtt taaaagatgg ttctgctatc actcttggat ggacctgcgg tgcattagct 240
agttggtaag gtaacggctt accaaggcaa tgatgcatag ccgagttgag agactgatcg 300
gccacattgg gactgagaca cggcccaaac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc 360
cacaatggac gcaagtctga tggagcaacg ccgcgtgagt gaagaagggt ttcggctcgt 420
aaagctctgt tggtagtgaa gaaagataga ggtagtaact ggcctttatt tgacggtaat 480
tacttagaaa gtcacggcta actacgtgcc agcagcccgc ggta                  524

Claims (6)

1.乳杆菌属乳酸菌，其是肠道粘附性和乳糖分解酶活性均增强的加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)或粘膜乳杆菌(Lactobacillusmucosae)，所述的乳杆菌属乳酸菌使用表面等离子体共振分析来测定乳酸菌与人A型肠道粘蛋白、人B型肠道粘蛋白和人O型肠道粘蛋白中的至少一种的结合能力的RU值为300RU以上，并且具有选自下述的至少一种乳糖酶活性，其中所述的乳糖酶活性为：培养上清中的每1mg蛋白质中β-gal的乳糖酶活性显示为100单位以上的乳糖酶活性、培养上清中的每1mg蛋白质中P-β-gal的乳糖酶活性显示为45单位以上的乳糖酶活性，以及培养上清中的每1mg蛋白质中P-β-glc的乳糖酶活性显示为50单位以上的乳糖酶活性，其中所述的乳酸菌为保藏号为NITE BP-241的加氏乳杆菌OLL2836株、保藏号为NITEBP-242的加氏乳杆菌OLL2948株和保藏号为NITE BP-243的粘膜乳杆菌OLL2848株中的任意一种乳酸菌。
2.乳糖不耐症改善剂，该改善剂至少含有保藏号为NITE BP-241的加氏乳杆菌OLL2836株、保藏号为NITE BP-242的加氏乳杆菌OLL2948株和保藏号为NITE BP-243的粘膜乳杆菌OLL2848株中的任意一种的乳酸菌。
3.权利要求2所述的乳糖不耐症改善剂，该改善剂至少含有保藏号为NITE BP-241的加氏乳杆菌OLL2836株、保藏号为NITEBP-242的加氏乳杆菌OLL2948株和保藏号为NITE BP-243的粘膜乳杆菌OLL2848株的三种乳酸菌。
4.用于改善乳糖不耐症的饮食品，该饮食品至少含有保藏号为NITE BP-241的加氏乳杆菌OLL2836株、保藏号为NITE BP-242的加氏乳杆菌OLL2948株和保藏号为NITE BP-243的粘膜乳杆菌OLL2848株中的任意一种的乳酸菌。
5.权利要求4所述的饮食品，该饮食品至少含有保藏号为NITEBP-241的加氏乳杆菌OLL2836株、保藏号为NITE BP-242的加氏乳杆菌OLL2948株和保藏号为NITE BP-243的粘膜乳杆菌OLL2848株的三种乳酸菌。
6.权利要求4或5所述的饮食品，该饮食品选自婴儿食品、幼儿食品、哺乳妇女食品、老年人食品、病人食品、保健功能食品、膳食补充剂、发酵乳和乳酸菌饮料。
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