CN112578119A - 一种甲氧基肾上腺素发光免疫检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种甲氧基肾上腺素发光免疫检测试剂盒。该试剂盒包括样本前处理试剂和检测试剂；样本前处理试剂包含：酸化液、酰化缓冲液、酰化剂溶液；酰化剂溶液中的酰化剂为乙酸酐、琥珀酸酐、丁酸酐、己酸酐、辛酸酐、乙酰氯、冰醋酸中的一种或几种；检测试剂包含：包被有甲氧基肾上腺素的磁微粒混悬液，甲氧基肾上腺素的特异性抗体溶液，含有辣根过氧化物酶标记抗抗体的酶结合物溶液，校准品；或者：包被有甲氧基肾上腺素的磁微粒混悬液，含有辣根过氧化物酶标记的特异性抗体的酶结合物溶液，校准品。本发明试剂盒大幅提高检测效率；本发明具有更高的灵敏度和特异性，大大提高临床符合率。

Description

一种甲氧基肾上腺素发光免疫检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种甲氧基肾上腺素发光免疫检测试剂盒。
背景技术
目前甲氧基肾上腺素(MN)的市场主流检测方法主要包括高效液相色谱法(HPLC)、酶联免疫吸附测定(ELISA)等，但HPLC耗时比较久、试剂盒仪器成本高、对操作人员的技术要求高且较难实现批量测定，而酶联免疫测定法缺乏准确性和再现性，同时自动化程度低、反应速率慢、检测时间长、易受环境影响，灵敏度较低。
近年来，随着磁微粒偶联技术及化学发光技术的普及，对于甲氧基肾上腺素的检测也开始采用全自动化学发光免疫分析法，即将磁微粒偶联技术、免疫反应技术和化学发光技术相结合，实现了自动化检测，具有高灵敏度、高特异性、高准确度，高稳定性的特点。
磁性微球是一类直径在纳米或微米级的球形复合材料。磁性微球的核心有四氧化三铁或三氧化二铁等超顺磁性材料构成，***包覆聚苯乙烯或葡聚糖等高分子材料。核心物质具有超顺磁性，使磁珠可以在外加磁场作用下向磁场方向移动达到分离的目的；***高分子材料可以通过物理或化学的方法活化产生氨基(NH2-)、羧基(COOH-)或环氧基(—CH(O))等基团，可以与蛋白等生物活性分子偶联。偶联后的磁珠广泛应用于生物标记、生物分子的分离、蛋白的纯化、抗体纯化、分子诊断等领域。化学发光免疫分析中包含两个部分，即免疫反应技术和化学发光技术。其基本原理是免疫反应总的酶作用于发光底物，使之发生化学反应并释放出大量的能量，产生激发态的中间体。这种激发态中间体回到稳定的基态时，可同时发射出光子。利用发光信号检测仪器即可测量出光量子产额，该光量子产额与样品中的待测物质的量成正比，由此可以建立标准曲线并计算样品中待测物质的含量。化学发光免疫分析技术常采用双抗体夹心法、竞争法及间接法等反应模式。
公开号为CN109444415A专利中公开了一种甲氧基肾上腺素发光免疫检测试剂盒，包括检测***和样品前处理***，所述的检测***包括直接或间接包被有甲氧基肾上腺素抗体的固相载体，甲氧基肾上腺素抗体溶液，亲和素连接示踪物溶液和校准品；或者所述的检测***包括直接或间接包被有甲氧基肾上腺素的磁微粒混悬液，含有辣根过氧化物酶标记的甲氧基肾上腺素特异性抗体的酶结合物溶液，校准品。所述样品前处理***包括酸化液，酰化剂和碱性缓冲液。但该检测试剂盒的精密度、灵敏度、检测梯度等方面的产品性能还有待提升。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种甲氧基肾上腺素发光免疫检测试剂盒。本发明的提供一种更快速的检测试剂盒，首个结果检测需要30min，大幅提高检测效率；本发明具有更高的灵敏度和特异性，大大提高临床符合率。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种甲氧基肾上腺素发光免疫检测试剂盒，包括样本前处理试剂和检测试剂；
样本前处理试剂包含：酸化液、酰化缓冲液、酰化剂溶液；酰化剂溶液中的酰化剂为乙酸酐、琥珀酸酐、丁酸酐、己酸酐、辛酸酐、乙酰氯、冰醋酸中的一种或几种；
检测试剂包含：包被有甲氧基肾上腺素的磁微粒混悬液，甲氧基肾上腺素的特异性抗体溶液，含有辣根过氧化物酶标记抗抗体的酶结合物溶液，校准品；
或者，检测试剂包含：包被有甲氧基肾上腺素的磁微粒混悬液，含有辣根过氧化物酶标记的甲氧基肾上腺素特异性抗体的酶结合物溶液，校准品。
本发明采用竞争法的原理，即磁微粒包被抗原和样本中的抗原竞争性结合抗体溶液中的抗体，竞争结果为固相化抗原-抗体复合物，然后加入酶标记的抗抗体，最后加入酶促化学发光底物。或者：磁微粒包被抗原和样本中的抗原竞争性结合酶结合物溶液中的酶标记抗体，竞争结果为固相化抗原-酶标抗体复合物，最后加入酶促化学发光底物。底物在酶作用下被催化裂解，形成不稳定的激发态中间体，当激发态中间体会到基态时便发出光子，形成发光反应通过光量子阅读***记录光子能量，并通过计算机处理***将光能量强度在标准曲线上转换为待测抗原的浓度，并报告结果。
本发明采用特殊的样本前处理***，先对尿液或血浆中甲氧基肾上腺素酸化、酰化前处理，采取酸酐、有机酸或酯的酰化剂酰化方案，使酰化后的甲氧基肾上腺素与固相化的甲氧基肾上腺竞争性结合抗体，固相化的抗体被酶标记的抗抗体结合的方法，提高试剂盒的灵敏度和特异性。其原理是生物体内MN是一种小分子激素，分子量200左右，属于半抗原；生物体血液或尿液中的MN多以磺酸化状态存在；通过酸化、酰化的前处理可以提高MN分子的反应原性。
作为优选，酸化液为pH<2、含有酚红指示剂的强酸溶液，强酸为盐酸、硫酸中的一种，浓度为0.1～0.5M。
优选地，酸化液中强酸的浓度为0.25M。
作为优选，酸化液中酚红指示剂的含量为0.0001vt％～0.01vt％。
优选地，酸化液中酚红指示剂的含量为0.001vt％。
作为优选，酰化缓冲液为Bis-Tris、Tris、PBS中的一种，浓度为0.1～10M，pH8.0～9.0。
优选地，酰化缓冲液地浓度为1M。
作为优选，酰化剂溶液中的溶剂为DMF、DMSO、无水乙醇中的一种或几种；酰化剂溶液中的溶剂与酰化剂的体积比为(50～70)：1。
优选地，酰化剂溶液中的溶剂与酰化剂的体积比为60：1。
本发明中包被有甲氧基肾上腺素的磁微粒，所用的固相化甲氧基肾上腺素(metanepHrine，MN)抗原包括但不限于MN分子、衍生化的MN分子。
作为优选，甲氧基肾上腺素的特异性抗体溶液中，甲氧基肾上腺素的特异性抗体的体积百分浓度为0.001％～1％。
优选地，甲氧基肾上腺素的特异性抗体的体积百分浓度为0.01％。
作为优选，甲氧基肾上腺素的特异性抗体溶液中，所用的抗体稀释液由稀释缓冲液、保护蛋白、防腐剂组成；抗体稀释液中稀释缓冲液的浓度为0.01～0.1M，保护蛋白的质量体积百分比为0.5％～5％，防腐剂的体积百分含量为0.01％～1％；
优选地，抗体稀释液中稀释缓冲液的浓度为0.05M，保护蛋白的质量体积百分比为2％，防腐剂的体积百分含量为0.1％；
稀释缓冲液为Bis-Tris、Tris-NaCl、PBS中的一种，pH3.0～8.0；
保护蛋白为牛血清白蛋白、牛血清、人血清、明胶、酪蛋白中的一种或两种；
防腐剂为ProClin300、BRONIDOX、MIT、NaN3的任意组合。
作为优选，酶结合物溶液由辣根过氧化物酶标记的抗抗体或辣根过氧化物酶标记的甲氧基肾上腺素特异性抗体中的一种、以及酶稀释液组成，酶稀释液由稀释缓冲液、保护蛋白组成；
作为优选，稀释缓冲液为Bis-Tris、Tris-NaCl、PBS中的一种，pH3.0～8.0；
作为优选，保护蛋白的质量体积百分比为0.5％～5％，保护蛋白为牛血清白蛋白、牛血清、人血清、明胶、酪蛋白中的一种或两种。
作为优选，包被有甲氧基肾上腺素的磁微粒混悬液制备时所使用的甲氧基肾上腺素偶联有载体蛋白，载体蛋白为牛血清白蛋白、钥孔血蓝蛋白、卵清白蛋白中的一种或几种；
作为优选，磁微粒混悬液制备时所使用的甲氧基肾上腺素浓度为0.3～5μg/mL。
优选地，磁微粒混悬液制备时所使用的甲氧基肾上腺素浓度为0.3μg/mL。
作为优选，校准品为含有甲氧基肾上腺素的PBS溶液，校准品中甲氧基肾上腺素的浓度为0～5000ng/mL。
优选地，校准品中甲氧基肾上腺素的浓度为0～2000ng/mL。
作为优选，校准品中PBS溶液的pH控制在2～4。
作为优选，采用样本前处理试剂进行发光免疫检测的步骤为：
取待测样本，加入酸化液，混匀后在80～100℃孵育20～40min；孵育结束后，待酸化样本冷却至室温，加入酰化缓冲液，混匀；再加入酰化剂，混匀后室温静置至少15min。
在本发明提供的具体实施例中，采用样本前处理试剂进行发光免疫检测的步骤为：
取待测样本，加入酸化液，混匀后在90℃孵育30min；孵育结束后，待酸化样本冷却至室温，加入酰化缓冲液，混匀；再加入酰化剂，混匀后室温静置至少15min。
作为优选，待测样本、酸化液、酰化缓冲液、酰化剂的体积比为(50～150)：(200～300)：(200～300)：(20～30)。
在本发明提供的具体实施例中，待测样本、酸化液、酰化缓冲液、酰化剂的体积比为100：250：250：25。
本发明提供了一种甲氧基肾上腺素发光免疫检测试剂盒。该试剂盒包括样本前处理试剂和检测试剂；样本前处理试剂包含：酸化液、酰化缓冲液、酰化剂溶液；酰化剂溶液中的酰化剂为乙酸酐、琥珀酸酐、丁酸酐、己酸酐、辛酸酐、乙酰氯、冰醋酸中的一种或几种；检测试剂包含：包被有甲氧基肾上腺素的磁微粒混悬液，甲氧基肾上腺素的特异性抗体溶液，含有辣根过氧化物酶标记抗抗体的酶结合物溶液，校准品；或者，检测试剂包含：包被有甲氧基肾上腺素的磁微粒混悬液，含有辣根过氧化物酶标记的甲氧基肾上腺素特异性抗体的酶结合物溶液，校准品。本发明具有的技术效果如下：
1、本发明具有检测时间短、灵敏度高的优点；
2、本发明采用两步法的反应模式，首个样本加完样后，30min报告结果；配合配套仪器可实现每小时200个检测，可节省临床检验大量时间。
3、本发明试剂盒配套安图全自动免疫检测仪，仪器采用特殊的清洗方式，降低了常见的干扰因素，提高了检测灵敏度。
4、本发明的前处理***中酸化液的PH范围进一步精确到<2，提高了样本前处理效率。
5、本发明通过固相载体上包被抗原选择、样本前处理***中酰化剂类型的选择，以保证包被抗原与处理后的样本之间的竞争性最大，相较于CN109444415A，本申请的精密度、灵敏度、检测梯度等方面的产品性能有了明显改善。
附图说明
图1本发明试剂盒与HPLC-MS/MS相关性。
具体实施方式
本发明公开了一种甲氧基肾上腺素发光免疫检测试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
中英文对照：
Bis-Tris：双(2-羟甲基)氨基-三(羟甲基)甲烷；
Tris-NaCl：三羟甲基氨基甲烷-氯化钠；
PBS：磷酸盐缓冲液；
DMF：N,N-二甲基甲酰胺；
DMSO：二甲基亚砜；
甲氧基肾上腺素：metanepHrine，MN；
BRONIDOX：5-溴-5硝基-1,3-二恶烷；
MIT：2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮盐酸盐；
NaN3：叠氮化钠。
本发明提供的甲氧基肾上腺素发光免疫检测试剂盒中所用试剂或仪器均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
一、试剂盒组成：
本发明中包含样本前处理***和检测***。
1、样本前处理***包含：酸化液、酰化缓冲液、酰化剂溶剂和酰化剂。
1、样本前处理***包含：酸化液、酰化缓冲液、酰化剂。
①酸化液为含有0.001％酚红指示剂的盐酸，浓度为0.25M，pH<1；
②酰化缓冲液为Tris，其pH8.0～9.0；
③酰化剂为含有乙酸酐的DMSO溶液(DMSO与乙酸酐体积比60:1)。
2、检测***包含：包被有甲氧基肾上腺素(MN)抗原的磁微粒、MN分子的特异性抗体溶液、含有辣根过氧化物酶标记抗抗体的酶结合物溶液，含有MN分子的校准品。
本发明中所用的抗体稀释液为含有牛血清白蛋白、ProClin300的Tris-NaCl，其pH7.4；
二、制备方法
1、制备磁微粒混悬液：将粒径1～3μm，磁含量为40％的的磁微粒原液充分混匀后，取出30μL，加入300μL的磷酸盐缓冲液清洗5次，每次清洗5min，清洗时需使用磁铁将磁微粒吸附固定弃去上清；洗涤后，加入100μL醋酸钠缓冲液溶解的EDC(碳化亚二胺)、NHS(琥珀酰亚胺酯)活化剂，活化剂浓度20mg/mL，混匀震荡活化1h；活化结束后加入300μL醋酸钠缓冲液洗涤2次，每次洗涤5min，然后加入一定量(一般为0.3μg/mL，0.1mL)的偶联有BSA分子的MN抗原，混匀震荡包被2h，包被结束后，加入300μL含有2％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液封闭4次，最后使用含有2％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液定容至3mL，2～8℃保存。
2、制备抗体溶液：向配制好的Tris-NaCl缓冲液(0.05M的Tris，含有0.85％的NaCl、0.1％Proclin 300)中加入2％牛血清白蛋白，混合后即为抗体溶液稀释液，将MN分子的特异性抗体按照1:10000(1:100-1:100000均可)的比例加入混匀，2～8℃保存。
3、制备酶结合物溶液：向配制好的Tris-NaCl缓冲液中加入2％牛血清白蛋白，混合后即为酶稀释液，将HRP(辣根过氧化物酶)标记的抗抗体按照1:5000(1:100-1:100000均可)的比例加入混匀，2～8℃保存。
4、制备校准品：配制好的PBS(pH3～4)缓冲液即为校准品稀释液，用校准品稀释液将MN抗原稀释成6个梯度，0ng/mL、20ng/mL、60ng/mL、200ng/mL、600ng/mL、2000ng/mL，分装成1mL/瓶，2～8℃保存。
5、配制样本前处理***的酸化液：用纯化水将浓盐酸稀释至0.25M，加入0.001％的酚红指示剂。
6、配制样本前处理***的酰化缓冲液：配制1M的Tris缓冲液，用10M的NaOH调节pH至8-9即可。
7、配制酰化剂：酰化剂溶剂选择DMSO，DMSO与乙酸酐按照60:1的比例混合后，即为酰化剂。
三、检测方法
1、样本前处理***的操作步骤：
取100μL待测样本，加入250μL酸化液，混匀后置于90℃水浴锅内孵育30min；孵育结束后，待酸化样本冷却至室温，每份样本中加入250μL酰化缓冲液，混匀；每份样本中加入25μL配置好的酰化剂，混匀后室温静置至少15min，即可检测。
2、检测步骤：
将前处理步骤获取的校准品或样本全部转移至反应杯中，使用AutoLumo全自动检测分析仪进行检测。每孔分别加入磁微粒混悬液20μl，样品50μl，抗体溶液50μl，混匀后37℃温育15min，洗液洗涤6次。每孔加入酶结合物100μl，混匀后37℃温育17min，洗液洗涤6次，每孔分别加入底物A液和底物B液各50μl，混匀后1～5min内检测发光值，通过校准品曲线回算出样本的浓度值。
实施例2本试剂盒的性能验证
1、分析灵敏度检测
根据《EP17A—确定检出限制和定量限值的协议》进行分析灵敏度考核，准备5份接近0值的临床血浆样本，每个样本重复3次，总共做4天，得到60个结果非负数的数据，若不足60个，需要按要求实验并补足60个，计算分析灵敏度。
表1灵敏度检测结果
Figure BDA0002830462180000081
Figure BDA0002830462180000091
从表1结果可以看出，本发明试剂盒的分析灵敏度<3.4pg/mL。
2、精密度检测
根据《EP05A2-定量检测方法的精密度评估》进行精密度评估，取两批试剂使用配套高/中/低值质控品，各测20次计算测定浓度的变异，测定结果如表2所示。
表2本发明试剂盒精密性检测
Figure BDA0002830462180000092
Figure BDA0002830462180000101
表2数据结果表明：本发明试剂盒的变异系数均小于6％。
3、临床比对
用本发明试剂盒和HPLC-MS/MS同时测定47例临床诊断肾上腺皮质增生、高血压、嗜铬细胞瘤、原发性甲状旁腺机能亢进等尿液样本，与HPLC相关性见图1：y＝0.9922x+11.182，r2＝0.985，说明本试剂盒可以用来对嗜铬细胞瘤的及时诊断和治疗提供帮助。
实施例3与现有试剂盒的对比
本申请的方案和CN109444415A实施例1相比的技术效果如下：
1、灵敏度的提升(5份接近0值的临床血浆样本)
表3
Figure BDA0002830462180000102
Figure BDA0002830462180000111
2、检测梯度的提升
表4
Figure BDA0002830462180000112
3、精密性提升
表5
Figure BDA0002830462180000113
Figure BDA0002830462180000121
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种甲氧基肾上腺素发光免疫检测试剂盒，其特征在于，包括样品前处理试剂和检测试剂；
所述样本前处理试剂包含：酸化液、酰化缓冲液、酰化剂溶液；所述酰化剂溶液中的酰化剂为乙酸酐、琥珀酸酐、丁酸酐、己酸酐、辛酸酐、乙酰氯、冰醋酸中的一种或几种；
所述检测试剂包含：包被有甲氧基肾上腺素的磁微粒混悬液，甲氧基肾上腺素的特异性抗体溶液，含有辣根过氧化物酶标记抗抗体的酶结合物溶液，校准品；
或者，所述检测试剂包含：包被有甲氧基肾上腺素的磁微粒混悬液，含有辣根过氧化物酶标记的甲氧基肾上腺素特异性抗体的酶结合物溶液，校准品。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述酸化液为pH<2、含有酚红指示剂的强酸溶液，所述强酸为盐酸、硫酸中的一种，浓度为0.1～0.5M；酸化液中酚红指示剂的含量为0.0001vt％～0.01vt％。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述酰化缓冲液为Bis-Tris、Tris、PBS中的一种，浓度为0.1～10M，pH8.0～9.0。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述酰化剂溶液中的溶剂为DMF、DMSO、无水乙醇中的一种或几种；所述酰化剂溶液中的溶剂与酰化剂的体积比为(50～70)：1。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述甲氧基肾上腺素的特异性抗体溶液中，甲氧基肾上腺素的特异性抗体的体积百分浓度为0.001％～1％。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，甲氧基肾上腺素的特异性抗体溶液中，所用的抗体稀释液由稀释缓冲液、保护蛋白、防腐剂组成；抗体稀释液中稀释缓冲液的浓度为0.01～0.1M，保护蛋白的质量体积百分比为0.5％～5％，防腐剂的体积百分含量为0.01％～1％；
所述稀释缓冲液为Bis-Tris、Tris-NaCl、PBS中的一种，pH3.0～8.0；
所述保护蛋白为牛血清白蛋白、牛血清、人血清、明胶、酪蛋白中的一种或两种；
所述防腐剂为ProClin300、BRONIDOX、MIT、NaN3的任意组合。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述酶结合物溶液由辣根过氧化物酶标记的抗抗体、酶稀释液组成；
或者，所述酶结合物溶液由辣根过氧化物酶标记的甲氧基肾上腺素特异性抗体、酶稀释液组成；
所述酶稀释液由稀释缓冲液、保护蛋白组成；
所述稀释缓冲液为Bis-Tris、Tris-NaCl、PBS中的一种，pH3.0～8.0；
所述保护蛋白的质量体积百分比为0.5％～5％，保护蛋白为牛血清白蛋白、牛血清、人血清、明胶、酪蛋白中的一种或两种。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述包被有甲氧基肾上腺素的磁微粒混悬液制备时所使用的甲氧基肾上腺素偶联有载体蛋白，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、钥孔血蓝蛋白、卵清白蛋白中的一种或几种；
磁微粒混悬液制备时所使用的甲氧基肾上腺素浓度为0.5～5μg/mL；
所述校准品为含有甲氧基肾上腺素的PBS溶液，校准品中甲氧基肾上腺素的浓度为0～5000ng/mL；校准品中PBS溶液的pH控制在2～4。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的试剂盒，其特征在于，采用所述样本前处理试剂进行发光免疫检测的步骤为：
取待测样本，加入酸化液，混匀后在80～100℃孵育20～40min；孵育结束后，待酸化样本冷却至室温，加入酰化缓冲液，混匀；再加入酰化剂，混匀后室温静置至少15min。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，待测样本、酸化液、酰化缓冲液、酰化剂的体积比为(50～150)：(200～300)：(200～300)：(20～30)。
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