CN115469105B - 一种一步法非洲猪瘟elisa抗体快速检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种一步法非洲猪瘟ELISA抗体快速检测试剂盒，本试剂盒在预包被的微孔中同时加入检测样品和酶标抗原‑HRP，通过样本抗体捕获抗原，再和酶标抗原形成抗原‑抗体‑酶标抗原复合物，底物与之反应即可放大酶的催化作用显色，通过酶标仪读取测试值；同时在样品稀释液中加入PEG6000，增加了固相抗原与抗体及酶标抗原复合物结合的机会，加快免疫复合物形成，增加液相与固相反应的临界浓度，减少钩状效应；与传统ELISA相比，本试剂盒将一抗孵育和酶标结合合并为一步，减少了一步洗涤和一步孵育，使检测时间缩短了近50分钟；本试剂盒敏感性、特异性、稳定性均良好，优于商品化试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及一种一步法酶联免疫吸附试验检测试剂盒，具体涉及非洲猪瘟P30蛋白抗体检测，是一种基于抗原抗体反应、酶对底物的放大作用检测样本中抗体的免疫分析方法。
背景技术
酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，简写ELISA）指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即：用于检测抗体的间接法、用于检测抗原的双抗体夹心法以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。
非洲猪瘟病毒（Africa swine fever virus，ASFV）可引起不同年龄的猪高热、全身脏器广泛性出血、脾脏急性肿大，病死率高达100%。至今该病仍无有效疫苗可用，仍是通过生物安全防控和临床检测精准清除达到疫病的防控。目前通过检测方法上分别采用荧光定量PCR和酶联免疫吸附法进行抗原抗体并联检测筛查感染猪，抗体检测试剂盒的灵敏性方便性便成为重要的应用指标。
非洲猪瘟抗原蛋白P72、P30、P62和 P54检测ASFV抗体已被证明是有效的，但是现有ELISA方法检测时间长，操作复杂，对人员要求较高，不利于非洲猪瘟的防控。因此，改进现有的诊断技术，使之更高效更便捷，对于非洲猪瘟血清学检测是必要的，并且是缓解ASFV防控压力的急切需求。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明实施例的目的在于提供一种一步法非洲猪瘟ELISA抗体快速检测试剂盒，本发明通过双抗原夹心法的原理进行检测；本发明通过将非洲猪瘟P30重组蛋白结合到聚苯乙烯固相载体上，同时加入血清样本和酶标抗原，重组蛋白P30和酶标抗原均可结合样本抗体，且有多个可结合位点；同时优化反应体系，在样品稀释液中加入PEG6000，增加了固相抗原与抗体及酶标抗原复合物结合的机会，可以加快免疫复合物形成，增加液相与固相反应的临界浓度，减少钩状效应，保证方法的敏感性和特异性。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种一步法非洲猪瘟ELISA抗体快速检测试剂盒，包括反应板，所述反应板为预包被非洲猪瘟重组抗原的包被板；以及样品稀释液、酶标抗原、底物液、终止液、洗涤液、阴性对照和阳性对照。
作为本发明进一步的方案，所述反应板中加入样本和酶标抗原，样本中的抗体与偶联HRP的检测抗原结合，孵育后形成抗原-抗体-酶标抗原复合物。
作为本发明进一步的方案，所述的酶标抗原为HRP标记的P30重组蛋白，可以特异性的结合非洲猪瘟抗体，所述的P30重组蛋白包被浓度为50-120ng/孔，所述酶标抗原使用浓度为50-120ng/孔，血清样本稀释度为1:40。
作为本发明进一步的方案，所述样品稀释液的成分为：在PBS缓冲液中加入终浓度为1%BSA、1.5%吐温20和3%PEG 6000，充分溶解、混合均匀。包被板预先包被P30重组蛋白制成固定相，将稀释后的样本加入包被抗原的微孔中，再加入HRP 标记的 ASFV 抗原，酶标抗原与抗体的其他位点结合，形成抗原-抗体-酶标抗原复合物，经过洗涤后加底物TMB显色，在预包被的微孔中同时加入血清将样本和HRP 标记的 ASFV 抗原，将一抗孵育和酶标结合合并为一步。
作为本发明进一步的方案，所述P30重组蛋白的最佳包被条件是4℃包被过夜，最佳封闭条件为使用1%的酪蛋白37℃封闭2小时。
作为本发明进一步的方案，所述洗涤液为含有0.5%Tween-20的PBS缓冲液，所述底物液为TMB显色液，所述终止液为2mol/L硫酸。
作为本发明进一步的方案，所述阴性对照为不含目的抗体的血清，所述阳性对照为含目的抗体的血清，本发明预先包被ASFV P30重组蛋白制成固定相，将样本加入包被抗原的微孔中，再加入HRP标记的ASFV抗原，形成抗原-抗体-酶标抗原复合物，经过洗涤后加底物TMB显色。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明应用双抗原夹心法测定样本中是否含有ASFV抗体。包被板预先包被重组ASFV抗原制成固定相，将样本和HRP标记的ASFV抗原加入包被抗原的微孔中，形成抗原-抗体-酶标抗原复合物，经过洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的终止作用下转化成黄色。颜色越深，样品中所含的ASFV抗体含量越多，颜色的深浅和样品中的ASFV抗体含量呈正相关。使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过 OD 值计算S/P值判断样本中是否含有ASFV抗体。
2、本发明检测试剂盒，检测样品和酶标抗原-HRP同时加入，减少了操作步骤，将一抗孵育和酶标结合合并为一步；缩短了操作时间，减少了一步洗涤一步孵育，至少缩短了50分钟；与传统ELISA相比，一步法非洲猪瘟抗体ELISA快速检测试剂盒包被板包含了捕获抗原，检测时可同时加入样品和酶标抗原，酶标抗原是特异性的，只识别样本中的目的抗体，通过捕获抗原获得，形成抗原-抗体-酶标抗原复合物，底物与之反应即可放大酶的催化作用显色，通过酶标仪读取测试值。整个试验时间只需要1小时，动手操作时间在20分钟以内，同时可避免人为稀释操作误差，是准确性高、重复性高，省时高效的非洲猪瘟ELISA抗体检测试剂盒的理想之选。
3、本发明检测试剂盒，减少操作时间：一抗孵育时间；标准品稀释时间；二抗配制时间；反复的洗涤时间等。降低人为操作失误的几率。减少批间差异，提高了精确性和重复性。
为更清楚地阐述本发明的结构特征和功效，下面结合附图与具体实施例来对本发明进行详细说明。
附图说明
图1是常规ELISA检测试剂盒操作流程图。
图2是本发明ELISA检测试剂盒操作流程图。
图3是本发明中提到的SDS-PAGE示意图。
具体实施方式
下面将结合附图和有关知识对本发明作出进一步的说明，进行清楚、完整地描述，显然，所描述的应用仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
参照图1-图3所示，本发明提供的一种一步法非洲猪瘟ELISA抗体快速检测试剂盒，其包括反应板，样品稀释液、酶标抗原、底物液、终止液、洗涤液、阴性对照和阳性对照；本发明基于双抗原夹心法，反应板为预包被非洲猪瘟重组抗原的包被板。进一步优选，预包被的反应板中加入样本和酶标抗原即可使样本中的抗体与偶联HRP的检测抗原结合，孵育后可形成抗原-抗体-酶标抗原复合物。
其中，酶标抗原是具有特异性的结合非洲猪瘟抗体的HRP标记的非洲猪瘟抗原，可特异性地与样本中的目标抗体结合。
在本发明中，样品稀释液为：含有BSA、吐温20和PEG 6000的磷酸盐缓冲液；洗涤液为：含有Tween-20的PBS缓冲液；底物液为：TMB显色液；终止液为：2mol/L硫酸；阴性对照为不含目的抗体的血清；阳性对照为含目的抗体的血清。
本发明采用双抗原夹心法检测非洲猪瘟抗体；酶标抗原和固定抗原是同一种抗原，可以同时结合样本抗体。
以下提供本发明的具体实施例
实施例1
本发明ELISA检测试剂盒组成，如表1所示
表1
具体过程包括：
1.非洲猪瘟病毒P30重组蛋白的制备和纯化
1.1.重组表达载体的构建与鉴定
同时用Xho I和Bam H I对回收的P30目的基因片段与p ET-57载体进行双酶切，回收相应片段，进行连接，连接反应体系为：T4 DNA Ligase Buffer 1μl、T4 DNA Ligase 0.5μl、目的DNA片段6.5μl和载体片段2μl；16℃连接2 h后，转化入E. coli BL21（DE3）感受态细胞，涂布于含卡那霉素平板上，37℃培养12~16 h，挑取单个白色菌落接种于含卡那霉素的液体培养基中，37℃ 220 r/min振荡培养，提取质粒DNA，经菌液PCR鉴定正确后，提取重组质粒于16℃进行Xho I / Bam H I 双酶切过夜，酶切产物进行核酸凝胶电泳检测。鉴定为阳性的重组质粒命名为pET-57-P30，并进行测序。
1.2 P30重组蛋白的表达与纯化
将测序正确的质粒p ET-57-P30 转化至大肠杆菌 BL21（DE3）感受态细胞，涂板培养，挑取单菌落接种于卡那霉素抗性的 LB 培养基中，37℃ 220 r/min振荡培养，培养至OD600达到 0.6 时，加入终浓度为 1 mmol/L的 IPTG，37℃ 220 rpm条件下诱导6 h。2000rpm/min 离心 10 min，收集菌体，超声破碎，10000 r/min 离心10 min 收集上清和沉淀进行SDS-PAGE分析。将超声离心获得的沉淀分别经过洗液Ⅰ（2 mol/L 尿素、0.1% Triton100、50 mmol/L NaCl、0.2 mmol/L EDTA）和洗液Ⅱ（2 mol/L 尿素、0.1% Triton 100）清洗离心后，最终使用8 mol/L的尿素（8 mol/L尿素、0.5 mol/L NaCl、20 mmol/LNa2HPO4、20mmol/L Na H2PO4）溶解纯化后的P30蛋白，利用BCA试剂盒测定纯化后的蛋白浓度，经SDS-PAGE和Western Blot分析鉴定后分装保存，备用。
2.酶标抗原的制备：
采用碳二亚胺（EDC）法制备酶标抗原，步骤为: ①非洲猪瘟的重氮化：称取25 mg非洲猪瘟溶于4 mL预冷的1mol /L盐酸中；逐滴加入0.3 mol /L NaNO2 溶液，采用淀粉碘化钾试纸进行检测，待其为深紫色时停止滴加NaNO2溶液；4℃冰浴避光反应45 min。②称取15 mg酪氨酸溶于0.5 ml 、1mol /L氢氧化钠溶液中，用pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释至2ml；将步骤①中重氮化的非洲猪瘟重组蛋白缓慢逐滴加入到酪氨酸溶液中，不断搅拌，同时用1mol/L NaOH溶液调整pH值使其保持在9.0至9.6之间；将反应液置于4℃冰箱中缓慢搅拌12 h，之后用0.22 μm的微孔滤膜过滤，得到非洲猪瘟重组蛋白的重氮化衍生物。③酶标抗原的偶联：取2mL非洲猪瘟重氮化衍生物溶液，依次加入14.3 mg碳二亚胺和2.4 mg琥珀酸亚胺，室温搅拌反应2 h；再加入10mg辣根过氧化物酶，将混合反应液放入4 ℃冰箱内缓慢搅拌12 h；4 ℃透析除去游离的碳二亚胺、琥珀酸亚胺、非洲猪瘟及非洲猪瘟重氮化衍生物等小分子；封闭游离的活性基团后，采用直接 ELISA 法对偶联液进行鉴定合格后使用。
3.本发明涉及到的各溶液的制备方法为：
包被缓冲液：碳酸盐缓冲溶液（0.05M，pH＝9.6），称取1.59gNa2CO3，2.94gNaHCO3，用蒸馏水溶解并定容至1000mL，主要用于包被抗原的稀释。
封闭液：1wt％酪蛋白溶液：称取100mg酪蛋白溶解于10mL 0.01M，pH＝7.4的PBS中。
PBS溶液（0.01M，pH＝7.4）：称取8.0g NaCl，0.1g KCl，0.29g NaH2PO4·2H2O，2.96g Na2HPO4·12H2O用蒸馏水溶解并定容至1000mL。
20×浓缩洗涤液：PBST溶液（0.01M，pH＝7.4），1000mL PBS缓冲液中加入500μL吐温-20。
底物显色液：商品化TMB溶液。
终止液：2M硫酸溶液，量取21.7mL浓硫酸加入到200mL纯化水中，边加入边搅拌使其混合均匀。
实施例1
一种一步法非洲猪瘟ELISA抗体快速检测试剂盒，检测过程包括以下步骤：
制备包被板，预包被非洲猪瘟P30抗原，具体包括以下步骤：包被：将非洲猪瘟P30包被抗原用碳酸盐缓冲液稀释成100ng/孔包被96孔酶标板，于4℃冰箱内过夜；之后用PBST洗涤液洗涤酶标板3次，最后一次拍干；封闭：加入质量分数1％的酪蛋白封闭液，200μL/孔，37℃温育2h；之后用 PBST洗涤液洗涤酶标板3次，最后一次拍干；
加样本和酶标：每孔加入50μL的1:40稀释的血清样品，50μL酶标抗原，37℃孵育30min；
洗板：配制1×洗涤液洗涤酶标板，每孔300μL，共4次，最后一次拍干；
显色：每孔加入100μL底物TMB，于室温显色15min；
终止：每孔加入50μL H2SO4终止反应；
读数：在酶标仪上测定各孔在450nm处的吸光值（OD值）。
实施例2
一种一步法非洲猪瘟ELISA抗体快速检测试剂盒，检测流程包括以下步骤：
制备包被板，预包被非洲猪瘟P30抗原，具体包括以下步骤：包被：将非洲猪瘟P30包被抗原用碳酸盐缓冲液稀释成1μg/mL包被96孔酶标板，并于4℃冰箱内过夜；之后用PBST洗涤液洗涤酶标板3次，最后一次拍干；封闭：加入质量分数1％的酪蛋白封闭液，200μL/孔，37℃温育2h；之后用 PBST洗涤液洗涤酶标板3次，最后一次拍干；
加样本和酶标：样品孔每孔加入50μL1:40稀释的血清样品，50μL酶标抗原；标准品孔位每孔加入50μL样品稀释液和50μL酶标抗原，37℃孵育30min；
洗板：配制1×洗涤液洗涤酶标板，每孔300μL，共4次，最后一次拍干；
显色：每孔加入100μL底物TMB，于室温显色15min；
终止：每孔加入50μL H2SO4终止反应；
读数：在酶标仪上测定各孔在450nm处的吸光值（OD值）。
以ASFV标准液浓度的对数为横坐标，吸光值为纵坐标建立标准曲线，得到标准曲线的线性方程。根据线性关系代入吸光值即可计算出待测ASFV抗体的浓度。
本发明检测试剂盒，减少操作时间：标准品稀释时间；一抗孵育时间；二抗繁琐的配制时间；反复的洗涤时间等。降低人为操作失误的几率。减少批间差异，提高了精确性和重复性。评价试剂盒的性能指标主要包括敏感性，特异性和重复性，现就这三个指标对本发明试剂盒和商品化试剂盒进行评估和比对，判断依据和比对结果如下。
1.判断依据
1）商品化试剂盒判断结果：阳性对照OD450nm平均值＞0.85；阴性对照OD450nm平均值＜0.15；该检验结果判为有效。
S/P=（样品OD450nm值-阴性对照 OD450nm均值）/（阳性对照 OD450nm均值-阴性对照OD450nm均值）
结果判断：S/P≥0.4，阳性；0.3＜S/P＜0.4，可疑；S/P≤0.3阴性。
2）本试剂盒判断结果：阳性对照OD450nm平均值＞1.0；阴性对照OD450nm平均值＜0.25；该检验结果判为有效。
S/P=（样品OD450nm值-阴性对照 OD450nm均值）/（阳性对照 OD450nm均值-阴性对照OD450nm均值）
结果判断：S/P≥0.3，阳性； S/P＜0.3，阴性。
2.比对结果
1）敏感性实验
选择本发明试剂盒和商品化试剂盒对10份已知背景的阳性血清（阳性样品盘）及20份弱阳性血清（临床免疫血清）开展诊断敏感性研究（表2-表4）。
表2 本发明试剂盒对已知阳性血清不同稀释倍数检测结果
表3 商品化试剂盒对已知阳性血清不同稀释倍数检测结果
表4 本发明试剂盒和商品化试剂盒对临床样品的检测结果
10份已知背景的阳性血清分别稀释100倍、200倍、500倍后，本发明试剂盒500倍稀释10份血清均为阳性，商品化试剂盒200倍稀释时均为阳性，500倍稀释时3份为可疑，1份为阴性；20份临床血清检测结果，本发明试剂盒和商品化试剂盒检测均为阳性，故本发明试剂盒诊断敏感性高于商品化试剂盒。
）特异性实验
选择本发明试剂盒和商品化的非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒，分别检测了特异性质控血清和已经背景的阴性血清10份（表5-表6）。
表5 两批试剂盒特异性检验结果
表6 10份非洲猪瘟病毒阴性血清检验结果
结果显示，本发明试剂盒未出现假阳性检测结果，临床阴性样品商品化试剂盒阴性率90%，有一个样品检出可疑，说明本试剂盒的特异性优于此商品化试剂盒。
）重复性实验
将实验室制备的3批试剂盒，每批选择3个试剂盒对5份非洲猪瘟病毒阴性血清（1-5）、5份非洲猪瘟弱阳性血清（6-10）、及5份非洲猪瘟强阳性血清（11-15）进行4次重复测定，进行批内重复性研究。使用实验室制备的3批试剂盒对上述已知阴性、弱阳性、强阳性样品重复4次检测，进行批间重复性研究。
表7 批内重复性检测结果
表8 批间重复性检测结果
结果显示本试剂盒重复性较好。批内变异系数在2.96%～11.73%之间，批间变异系数在4.01%～12.53%之间。本试剂盒批间和批内的变异系数在S/P值较小时，变异系数偏高，而当S/P值较大时，变异系数较低。
从试剂盒性能方面的指标来看本发明试剂盒性能优于市售商品化试剂盒。
从操作流程方面本试剂盒具有步骤少，时间短，操作方便的优势，商品化试剂盒完成实验需要122分钟，本发明试剂盒只需要75分钟，节约了47分钟。（表9）。
表9 本发明试剂盒和商品化试剂盒操作流程和时间
本发明应用双抗原夹心法测定样本中是否含有ASFV抗体。包被板预先包被重组ASFV 抗原制成固定相，将样本加入包被抗原的微孔中，再加入HRP 标记的 ASFV 抗原，形成抗原-抗体-酶标抗原复合物，经过洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在硫酸的终止作用下转化成黄色。颜色越深，样品中所含的ASFV抗体含量越多，颜色的深浅和样品中的ASFV抗体含量呈正相关。使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过 OD 值计算S/P值判断样本中是否含有ASFV抗体。
本发明检测试剂盒，检测样品和酶标抗原-HRP同时加入，减少了操作步骤，将一抗孵育和酶标结合合并为一步；缩短了操作时间，减少了一步洗涤一步孵育，缩短了近50分钟；无需额外准备稀释试剂稀释标准品，与传统ELISA相比，一步法非洲猪瘟抗体ELISA快速检测试剂盒包被板包含了捕获抗原，检测时可同时加入样品和酶标抗原，酶标抗原是特异性的，只识别样本中的目的抗体，通过捕获抗原获得，形成抗原-抗体-酶标抗原复合物，底物与之反应即可放大酶的催化作用显色，通过紫外分光光度计读取测试值。
以上结合具体实施例描述了本发明的技术原理，仅是本发明的优选实施方式。本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。本领域的技术人员不需要付出创造性的劳动即可联想到本发明的其它具体实施方式，这些方式都将落入本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种一步法非洲猪瘟ELISA抗体快速检测试剂盒，其特征在于，包括反应板，所述反应板为预包被非洲猪瘟P30重组蛋白的包被板；以及样品稀释液、酶标抗原、底物液、终止液、洗涤液、阴性对照和阳性对照，包被板预先包被P30重组蛋白制成固定相，将稀释后的样本加入包被抗原的微孔中，再加入HRP 标记的 ASFV 抗原，酶标抗原与抗体的其他位点结合，形成抗原-抗体-酶标抗原复合物，经过洗涤后加底物TMB显色，在预包被的微孔中同时加入血清将样本和HRP 标记的 ASFV 抗原，将一抗孵育和酶标结合合并为一步。
2.如权利要求1所述的一种一步法非洲猪瘟ELISA抗体快速检测试剂盒，其特征在于，所述酶标抗原为HRP标记的P30重组蛋白，所述P30重组蛋白与抗体有多个结合位点。
3.如权利要求1所述的一种一步法非洲猪瘟ELISA抗体快速检测试剂盒，其特征在于，所述P30重组蛋白包被浓度为50-120ng/孔，所述酶标抗原使用浓度为50-120ng/孔，血清样本稀释度为1:40。
4.如权利要求1所述的一种一步法非洲猪瘟ELISA抗体快速检测试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液的成分为：在PBS缓冲液中加入终浓度为1%BSA、1.5%吐温20和3%PEG 6000，充分溶解、混合均匀。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: A one-step ELISA kit for rapid detection of African swine fever antibodies Granted publication date: 20230324 Pledgee: Jiangsu Taicang Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Yuewang Branch Pledgor: LONGKUO (SUZHOU) BIOLOGICAL ENGINEERING Co.,Ltd. Registration number: Y2024980021654 |