CN112553263A - 一种利用模拟移动床色谱提取l-组氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于L‑组氨酸的生产技术领域，公开了一种利用模拟移动床色谱提取L‑组氨酸的方法，其包括发酵工序和提取工序。本方法可以实现L‑组氨酸的连续化生产，具有发酵效率高、生产周期短、生产成本低、污染少、提取收率高等优点。

Description

一种利用模拟移动床色谱提取L-组氨酸的方法
技术领域
本发明涉及L-组氨酸生产技术领域，具体涉及到一种利用模拟移动床色谱提取L-组氨酸的方法。
背景技术
L－组氨酸是分子中含有咪唑核的碱性氨基酸，是一种半必需氨基酸，对成人非必须氨基酸，但对于婴幼儿及动物的成长尤其重要，在人体中合成较慢。它具有多种生理功能，可作为生化试剂和药剂，还可用于治疗心脏病，贫血，风湿性关节炎等的药物。此外，组氨酸还是一些医药中间体合成的必备原材料之一。由于其显著的营养功效，市场前景广阔，尤其在医学研究中的作用日益受到重视。
目前国内主要是从猪血粉水解液中以离子交换工艺提取L－组氨酸，也可以从脱脂大豆的水解产物中提取，由于成本较高，水解损失率高，造成环境污染，不适合产业化大生产。而本提取方法可以实现L-组氨酸的连续化生产，具有生产周期短、生产成本低、污染少、提取收率高等优点，它与蛋白质水解提取法相比具有非常多的优势。
发明内容
为解决上述问题，克服现有技术的不足之处，本发明提供了一种利用模拟移动床色谱提取L-组氨酸的方法，本提取方法可以实现L-组氨酸的连续化生产，具有生产周期短、生产成本低、污染少、提取收率高等优点。
本发明的目的是通过下述技术方案实现的。
一种利用模拟移动床色谱提取L-组氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下发酵工序和提取工序。
具体地，所述发酵工序包括如下：
1）将粘质沙雷氏菌种子液接入含有发酵培养基的发酵培养罐中，控制发酵培养罐中液体体积为50L，控制发酵培养条件温度33℃，pH7.0、转速80rpm、压力0.05MPa；
2）整个发酵过程中，流加磷酸氢二钾水溶液，流加流速为20ml/h，直至发酵结束；发酵培养6h后，开始流加发酵促进剂，流加流速为0.5L/h，直至发酵结束，收集组氨酸发酵液；发酵总时间为52h。
具体地，所述提取工序包括如下：步骤1）陶瓷膜过滤，步骤2）模拟移动床色谱，步骤3）一次脱色，步骤4）浓缩回溶，步骤5）二次脱色，步骤6）精制浓缩，步骤7）结晶、离心。
进一步地，所述发酵促进剂包含葡萄糖100-1000g/L，乙酸钙10-100mg/L。
进一步地，所述发酵培养基成分为：葡萄糖70g/L、酵母粉5g/L、甜菜碱1.5g/L、磷酸氢二钾5g/L、玉米浆40ml/L、硫酸铵4g/L、硫酸镁0.5g/L、生物素0.15mg/L、维生素B10.15mg/L。
进一步地，所述磷酸氢二钾水溶液的浓度为100g/L
进一步地，所述提取工序包括如下：
步骤1）陶瓷膜过滤：组氨酸发酵液的温度控制至70-80℃，调pH至5.0-5.5，经陶瓷膜过滤，收集陶瓷膜清液；
步骤2）模拟移动床色谱：将步骤1）所得陶瓷膜清液经装有阳离子交换树脂的模拟移动床色谱，用氨水洗脱，得L-组氨酸洗脱液；
步骤3）一次脱色：将步骤2）所得L-组氨酸洗脱液经脱色膜除去部分色素及小分子杂质，得脱色液；
步骤4）浓缩回溶：将步骤3）所得脱色液经四效蒸发器浓缩至L-组氨酸的含量为220-250g/L，用冷凝水降温至10℃，育晶6h，启动离心机离心，收集所得母液和组氨酸粗品，将组氨酸粗品重新溶解，pH调节至6.5-7.0，收集溶液；
步骤5）二次脱色：将步骤4）所得溶液用活性炭进行脱色处理，脱色温度50℃，脱色时间60min，过滤收集滤液；
步骤6）精制浓缩：将步骤5）所得滤液经四效蒸发器浓缩至组氨酸含量为220-250g/L，用冷凝水降温至10℃，育晶6h，过滤得湿成品；
步骤7）结晶、离心：将步骤6）所得湿成品离心，经低温真空燥得L-组氨酸成品。
更进一步地，所述发酵促进剂包含葡萄糖100-1000g/L，乙酸钙10-100mg/L，丙二酸10-50mg/L。
优选地，所述发酵促进剂的组分为：葡萄糖500g/L，乙酸钙100mg/L，丙二酸50mg/L。
附图说明
图1：乙酸钙对发酵液中组氨酸产量的影响；
图2：丙二酸对发酵液中组氨酸产量的影响。
本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于下几个方面：
采用本发明经过活化培养的粘质沙雷氏菌进行组氨酸生产，发酵过程通过流加葡萄糖以及磷酸氢二钾，有效补充了氮源以及菌株生长所需要的营养物质，维持了菌株的生长活力，发酵产酸性能大幅提升减少菌体繁殖消耗葡萄糖，增加糖酸转化率，经检测，该方法组氨酸的产量和糖酸转化率大幅提高。
不同菌株的产酸机制以及对刺激因子的耐受程度差异较大，并不具备借鉴意义，尽管现有技术对谷氨酸的产酸机制作了较多研究，例如在发酵培养基中添加适量的柠檬酸钠能够提高谷氨酸棒杆菌产组氨酸的量，但是柠檬酸钠对粘质沙雷氏菌并无明显刺激效果。
组氨酸的发酵过程并不依赖TCA途径，适当弱化TCA途径能够提高进入组氨酸合成途径的代谢流，但是TCA循环维持菌体细胞的正常增殖和代谢，并不能过度削弱。丙二酸可作为TCA循环的抑制剂，通过弱化TCA循环，能够提高组氨酸合成途径代谢流，进而提高组氨酸的产量。
L-组氨酸是HMP途径的中间产物，HMP途径同样会产生乙酸类副产物，从而造成碳代谢流的浪费，通过添加乙酸钙，对副产物产生一定的抑制作用，从而使得HMP途径更多的代谢流进入组氨酸合成途径，为组氨酸的生物合成提供更多的前提物质，从而提升了组氨酸的产量。
本发明选择在发酵中期开始流加，这是因为是组氨酸的大量合成发生在发酵中期，而且，发酵初期以菌株增殖为主，此时弱化TCA途径会降低菌株活力。
本发明采用模拟移动床色谱分离技术提取L-组氨酸，在色谱上柱及洗脱截留时采用显色反应，减少截留损失，提高色谱收率，利用不同离子通过色谱树脂的时间不同，进行物理吸附的原理，对组氨酸发酵液中产生的其他杂质进行分离，从而提高组氨酸的纯度。
本发明可一次性有效去除发酵液中的其他杂酸及杂质，提高产品质量，同时，减少了酸碱的用量，降低了废水排放量，实现了清洁生产、节能环保的目的。
本发明采用四效蒸发器，蒸发过程在真空作用下，既保证了物料的卫生要求，同时保证了环保要求，同时大大降低了蒸发温度，具有节能降耗、蒸汽耗量低、冷却水循环量低的优点。
本发明两次脱色，一次脱色使用脱色膜，未使用活性炭，活性炭用量减少，固定废弃物产生量随之减少，减少了对环境的污染。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本技术方案进行完整地描述。
实施例1
一种利用模拟移动床色谱提取L-组氨酸的方法，其包括如下工序：
1、发酵工序：
1）将粘质沙雷氏菌（ATCC31026）放入活化培养基，恒温培养箱保持温度在33℃恒温培养24h，活化培养基配方为无水葡萄糖1g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、氯化钠2.5g/L、琼脂条20g/L，得到活化培养液。在移入菌株之前，对种子罐投料后加水定容，定容体积为5L，直接接入蒸汽加热至119-122℃，压力为0.13-0.14MPa，保温30min，进行灭菌处理。
2）将所得的活化培养液通过压差法接入灭菌完成后的种子培养罐中，液体体积为5L，保持控制培养条件初始温度33℃、pH7.0、搅拌电机转速80rpm、风量70m3/h、压力0.05MPa，连续培养16h。控制料液成分为葡萄糖35g/L、酵母粉5g/L、甜菜碱1.5g/L、磷酸氢二钾1.5g/L、玉米浆30ml/L、硫酸铵5g/L、硫酸镁0.4g/L、生物素0.15mg/L、维生素B10.15mg/L。
3）在发酵开始时对磷酸氢二钾于发酵进行流加，磷酸氢二钾的浓度为100g/L，流加流速为1.5ml/h，在发酵培养5h后葡萄糖开始流加，葡萄糖浓度为500g/L，流加流速为0.1L/h，直至发酵结束，连续培养16h。
4）经检测种子灌OD值达到20.3后进行移种，按照10%的接种量接入发酵培养罐。发酵培养罐中液体体积为50L，控制发酵培养条件温度33℃，pH7.0、搅拌电机转速80rpm,、风量400m3/h、压力0.05MPa。
5）控制发酵培养基成分葡萄糖70g/L、酵母粉5g/L、甜菜碱1.5g/L、磷酸氢二钾5g/L、玉米浆40ml/L、硫酸铵4g/L、硫酸镁0.5g/L、生物素0.15mg/L、维生素B1 0.15mg/L。在发酵开始时对磷酸氢二钾于发酵进行流加，磷酸氢二钾的浓度为100g/L，流加流速为20ml/h，在发酵培养6h，然后开始流加发酵促进剂（葡萄糖500g/L，乙酸钙100mg/L，丙二酸50mg/L），流加流速为0.5L/h，直至发酵结束，发酵总时间为52h，得到的L-组氨酸发酵液中组氨酸产量达到38.7g/L；
2、提取工序：
1）陶瓷膜过滤：L-组氨酸发酵液温度控制至70-80℃，用硫酸调pH至5.0-5.5，加水量60%，搅拌均匀，经陶瓷膜过滤，除去菌体蛋白和其它颗粒杂质，收集陶瓷膜清液；
2）模拟移动床色谱：将陶瓷膜清液经装有阳离子交换树脂的模拟移动床色谱，用一定浓度的氨水洗脱，得L-组氨酸洗脱液；
3）一次脱色：将所得L-组氨酸洗脱液经脱色膜除去部分色素及小分子杂质，得脱色液，脱色膜采用300-500分子量膜孔径；
4）浓缩回溶：将所得脱色液经四效蒸发器浓缩至L-组氨酸的含量为220-250g/L，用冷凝水降温至10℃，育晶6h后，启动离心机离心，收集所得母液和粗品，母液回收再利用，粗品折纯后按60g/L进行回溶，pH调节至6.5-7.0，收集所得溶液；
5）二次脱色：将所得回溶液用活性炭进行脱色处理，脱色温度50℃，脱色时间60min，经活性炭脱色后料液透光98%，收集滤液；
6）精制浓缩：将所得滤液经四效蒸发器浓缩至组氨酸含量为220-250g/L，用冷凝水降温至10℃，育晶6h后，过滤得湿成品；
7）结晶、离心：将所得湿成品离心，经低温真空干燥得L-组氨酸成品；经检测，纯度达到97%以上。
综上所述，本发明提出的一种利用模拟移动床色谱提取L-组氨酸的方法，利用陶瓷膜过滤除菌，脱色膜除杂脱色，模拟移动床色谱分离等技术改善产品的质量，进一步提高收率，增加产量，为L-组氨酸市场提供高性价比的产品，同时减少污水的排放，减少对环境的污染，增加了社会效益，该技术具有很大的市场推广前景。
对比例1
一种利用模拟移动床色谱提取L-组氨酸的方法，其包括如下工序：
1、发酵工序：
1）将粘质沙雷氏菌（ATCC31026）放入活化培养基，恒温培养箱保持温度在33℃恒温培养24h，活化培养基配方为无水葡萄糖1g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、氯化钠2.5g/L、琼脂条20g/L，得到活化培养液。在移入菌株之前，对种子罐投料后加水定容，定容体积为5L，直接接入蒸汽加热至119-122℃，压力为0.13-0.14MPa，保温30min，进行灭菌处理；
3）将所得的活化培养液通过压差法接入灭菌完成后的种子培养罐中，液体体积为5L，保持控制培养条件初始温度33℃、pH7.0、搅拌电机转速80rpm、风量70m3/h、压力0.05MPa，连续培养16h。控制料液成分为葡萄糖35g/L、酵母粉5g/L、甜菜碱1.5g/L、磷酸氢二钾1.5g/L、玉米浆30ml/L、硫酸铵5g/L、硫酸镁0.4g/L、生物素0.15mg/L、维生素B10.15mg/L。
4）在发酵开始时对磷酸氢二钾于发酵进行流加，磷酸氢二钾的浓度为100g/L，流加流速为1.5ml/h，在发酵培养5h后葡萄糖开始流加，葡萄糖浓度为500g/L，流加流速为0.1L/h，直至发酵结束，连续培养16h。经检测种子灌OD值达到20.3后进行移种，按照10%的接种量接入发酵培养罐。
发酵培养罐中液体体积为50L，控制发酵培养条件温度33℃，pH7.0、搅拌电机转速80rpm,、风量400m3/h、压力0.05MPa。
4）控制发酵培养基成分葡萄糖70g/L、酵母粉5g/L、甜菜碱1.5g/L、磷酸氢二钾5g/L、玉米浆40ml/L、硫酸铵4g/L、硫酸镁0.5g/L、生物素0.15mg/L、维生素B1 0.15mg/L。在发酵开始时对磷酸氢二钾于发酵进行流加，磷酸氢二钾的浓度为100g/L，流加流速为20ml/h，在发酵培养6h，然后开始流加发酵促进剂（葡萄糖500g/L），流加流速为0.5L/h，直至发酵结束，发酵总时间为52h，组氨酸产量达到22.1g/L。
2、提取工序同实施例1。
实施例2
1．工艺同对比例1，在对比例1的基础上对发酵促进剂进行优化，设置不同浓度的乙酸钙（横坐标），分别为0，20，40，60，80，100，120，140，单位为mg/L，如图1所示，随着乙酸钙浓度的增加，发酵液中组氨酸含量（纵坐标，g/L）也随之提高，当乙酸钙浓度达到100mg/L时，组氨酸浓度达到峰值，继续增加乙酸钙浓度对组氨酸产量没有明显影响，糖酸转化率和组氨酸的趋势一致，说明乙酸钙主要是通过提高粘质沙雷氏菌的糖酸转化率来提升组氨酸的产量，可能原因是，L-组氨酸是HMP途径的中间产物，HMP途径同样会产生乙酸类副产物，从而造成碳代谢流的浪费，通过添加合适浓度的乙酸钙，对副产物产生一定的抑制作用，从而使得HMP途径更多的代谢流进入组氨酸合成途径，为组氨酸的生物合成提供更多的前提物质，从而提升了组氨酸的产量；而且钙离子也是组氨酸合成中所需酶的激活剂。
2.选择乙酸钙的浓度为100mg/L，继续评价丙二酸对发酵液中组氨酸产量的影响。设置不同浓度的乙酸钙，分别为0，10，20，30，40，50，60，70，单位为mg/L，如图2所示，随着丙二酸浓度的增加，发酵液中组氨酸含量也随之提高，当乙酸钙浓度达到50mg/L时，组氨酸浓度接近峰值，继续增加乙酸钙对组氨酸产量没有实质的影响，糖酸转化率和组氨酸的趋势也基本保持一致，可能原因是，组氨酸的发酵过程并不依赖TCA途径，适当弱化TCA途径能够提高进入组氨酸合成途径的代谢流，但是TCA循环维持菌体细胞的正常增殖和代谢，并不能过度削弱，因此需要选择在发酵中期开始流加，这是因为是组氨酸的大量合成发生在发酵中期，而且在发酵初期主要以菌株增殖为主，此时弱化TCA途径会降低菌株活力。适量丙二酸可作为TCA循环的抑制剂，通过弱化TCA循环，能够提高组氨酸合成途径代谢流，进而提高糖酸转化率和组氨酸的产量。
上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了介绍，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，这对本领域技术人员而言应该很明确，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明保护的范围。

Claims (10)

1.一种利用模拟移动床色谱提取L-组氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括发酵工序和提取工序。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵工序包括如下：
1）将粘质沙雷氏菌种子液接入含有发酵培养基的发酵培养罐中进行发酵，控制发酵培养罐中液体体积为50L；
2）整个发酵过程中，流加磷酸氢二钾水溶液，流加流速为20ml/h，直至发酵结束；发酵培养6h后，开始流加发酵促进剂，流加流速为0.5L/h，直至发酵结束，收集组氨酸发酵液；发酵总时间为52h。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述提取工序包括如下：步骤1）陶瓷膜过滤，步骤2）模拟移动床色谱，步骤3）一次脱色，步骤4）浓缩回溶，步骤5）二次脱色，步骤6）精制浓缩，步骤7）结晶、离心。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵促进剂包含葡萄糖100-1000g/L，乙酸钙10-100mg/L。
5. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基成分为：葡萄糖70g/L、酵母粉5g/L、甜菜碱1.5g/L、磷酸氢二钾5g/L、玉米浆40ml/L、硫酸铵4g/L、硫酸镁0.5g/L、生物素0.15mg/L、维生素B1 0.15mg/L。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述磷酸氢二钾水溶液的浓度为100g/L。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述提取工序包括如下：
步骤1）陶瓷膜过滤：组氨酸发酵液的温度控制至70-80℃，调pH至5.0-5.5，经陶瓷膜过滤，收集陶瓷膜清液；
步骤2）模拟移动床色谱：将步骤1）所得陶瓷膜清液经装有阳离子交换树脂的模拟移动床色谱，用氨水洗脱，得组氨酸洗脱液；
步骤3）一次脱色：将步骤2）所得组氨酸洗脱液经脱色膜除去部分色素及小分子杂质，得脱色液；
步骤4）浓缩回溶：将步骤3）所得脱色液经四效蒸发器浓缩至组氨酸的含量为220-250g/L，用冷凝水降温至10℃，育晶6h，启动离心机离心，收集所得母液和组氨酸粗品，将组氨酸粗品重新溶解，pH调节至6.5-7.0，收集溶液；
步骤5）二次脱色：将步骤4）所得溶液用活性炭进行脱色处理，脱色温度50℃，脱色时间60min，过滤收集滤液；
步骤6）精制浓缩：将步骤5）所得滤液经四效蒸发器浓缩至组氨酸含量为220-250g/L，用冷凝水降温至10℃，育晶6h，过滤得湿成品；
步骤7）结晶、离心：将步骤6）所得湿成品离心，经低温真空燥得L-组氨酸成品。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵促进剂包含葡萄糖100-1000g/L，乙酸钙10-100mg/L，丙二酸10-50mg/L。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵促进剂的组分为：葡萄糖500g/L，乙酸钙100mg/L，丙二酸50mg/L。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述脱色膜的膜孔径为300-500分子量。
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