CN112553261A - 一种木质纤维素高固酶解的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种木质纤维素高固酶解的方法，包括步骤(1)选料：选用王棕叶鞘原料，先将其洗净，并切成长度不超过20mm、厚度不超过5mm的薄片，得到王棕叶鞘薄片；步骤(2)NSSC蒸煮；步骤(3)疏解；步骤(4)分级；步骤(5)干燥；步骤(6)酶解：将步骤(5)得到的薄壁组分颗粒、纤维素酶、0.04％四环素、pH4.8柠檬酸缓冲液置于12ml锥形瓶中，密封后置入恒温振荡箱中进行酶解反应；反应条件：温度50℃，转速150rpm，反应时间72h。本发明能够有效解决木质纤维素高固酶解需要干燥的原料，但是干燥引起角质化作用，降低纤维素酶的效率的问题。
Description
技术领域
本发明涉及木质纤维素高固酶解领域，尤其涉及一种木质纤维素高固酶解的方法。
背景技术
纤维素乙醇是新一代可再生清洁能源，在实现碳排放减量目标、替代第一代糖质和淀粉乙醇、维护粮食能源安全等方面一直被寄予厚望[1]。纤维素乙醇的原料以农林木质废弃物为主，一般经过预处理、酶解和发酵三个步骤，生产出乙醇浓度约5％～6％(v/v，约40～48g/L)的发酵液，再经过减压蒸馏和分子筛处理得到体积浓度达到99.5％以上的无水乙醇，用以进一步生产供混配汽油用的燃料乙醇。纤维素乙醇产业化至今仍面临多个技术瓶颈，其中最突出的是高固含量酶解难题。
目前国内外已投入中试的装置和技术，普遍采用第一代乙醇的成熟生产设施和技术，其中蒸馏操作要求发酵液乙醇浓度至少达到40g/L[3]，如果要尽可能地降低减压蒸馏的能量消耗，就需要提升发酵液乙醇浓度至8-10％ (v/v，相当于64-80g/L)。由此反推，酶解液累积的葡萄糖浓度不低于 125-157g/L，相应地，单批次酶解起始固体底料要达到20-40％(w/w，固料/ 水)的固含量。按此条件进行高固酶解，首先要克服流变问题——即酶解底料因黏度过高失去流动性，传质困难，纤维素酶效率降低。Zhang等人从提高原料纤维素含量和改进反应器两方面入手，以溶剂法处理的杨木(纤维素占80％)为底料，在自制的带搅拌反应器中进行20wt％高固含量酶解，48 h后酶解液葡萄糖浓度达到158g/L。华东理工大学鲍杰团队从预处理阶段就采用高固含量条件，开发了干式稀酸预处理技术，从秸秆原料制成了101.1 g/L(或12.8％v/v)超高乙醇浓度发酵液。更多研究者在酶解控制方面进行改进，通过分批进料方式使酶解反应混合物保持低粘度。Elliston等人使用特制的高剪切混合生物反应器，研究了废复印纸分批进料式半同步糖化发(SSSF)，结果分批进料至总底物固含量相当于65％(w/w)，仅需要总酶用量3.7FPU /g底物，就可生产高浓度乙醇(11.6％，v/v)。此外，也有研究团队从酶制剂出发开展研究，如采用不含纤维素结合域(CBM)的热稳定型纤维素酶作催化剂。由此可见，改进原料特性(纤维素含量)、预处理方法、酶解设备、酶解程序、酶制剂都是克服高固条件下流变障碍，实现纤维素高固转化，最终提高产物蒸馏效率的可行途径。
然而，仅解决“流变”问题还不够，“角质化”问题也是造成高固酶解技术难以大规模投产的重要原因。无论是单批次投料，还是分批进料，都必须准备较高干物质浓度的底料，这就需要对预处理后湿料进行压力干燥、风干或者烘干。干燥过程可能导致木质底料颗粒内部孔隙塌陷，称为“角质化”，角质化往往是不可逆的，会显著降低底物对酶的可及性，最终影响纤维素酶解反应的速率和转化率。
发明内容
本发明的目的是提供是一种木质纤维素高固酶解的方法，解决现有木质纤维素高固酶解需要干燥的原料，但是干燥引起角质化作用，降低纤维素酶的效率的问题。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种木质纤维素高固酶解的方法，包括如下步骤：
步骤(1)选料：选用王棕叶鞘原料，先将其洗净，并切成长度不超过20mm、厚度不超过5mm的薄片，得到王棕叶鞘薄片；
步骤(2)NSSC蒸煮：将王棕叶鞘薄片放入蒸煮器，用中性亚硫酸盐蒸煮，液固比4:1；蒸煮时，先升温60min，再保温30min；保温温度为150～170℃；
步骤(3)疏解：将蒸煮后的王棕叶鞘薄片放入疏解器，疏解5000 转；
步骤(4)分级：将疏解后的王棕叶鞘薄片放入标准保尔筛分仪中进行纤维分级，从纤维束中分离出薄壁细胞组分；
步骤(5)干燥：将分离出的薄壁细胞组分干燥至含水率降至10％以下，得到长度小于2mm的不规则颗粒状的薄壁组织颗粒；
步骤(6)酶解：将步骤(5)得到的薄壁组织颗粒、纤维素酶、0.04％四环素、PH4.8柠檬酸缓冲液置于12ml锤形瓶中，密封后置入恒温震荡箱中进行酶解反应；反应条件：温度50℃，转速150rpm，反应时间72 h；
其中，进料方式：采用多次、等比例、等时间间隔进料的方式进料，总反应时长为72h，干燥后的薄壁组织颗粒的总进料量为36％～45％；同时，每次进料按10FPU/g固料纤维素酶补充纤维素酶。
进一步的，步骤(6)酶解中采用三次进料方式，初始一次进料，反应24h二次进料，反应48h三次进料，反应72h完成；每次进干燥后的薄壁组织颗粒含量12％～15％，每次进料按10FPU/g固料纤维素酶补充酶液。
进一步的，步骤(6)酶解中，还在锤形瓶中加入0.7％～0.9％的Tween 80。
进一步的，疏解器为奥地利PTI公司的PTI95568疏解器，蒸煮器为日本笠原理化卧式旋转蒸煮器。
进一步的，步骤(5)干燥时，自然风干或105℃烘箱中烘干至含水率降至10％以下。
进一步的，步骤(2)NSSC蒸煮时的保温温度为170℃。
一种用于高固纤维素酶解的原料的制备方法，包括如下步骤：
步骤(1)选料：选用王棕叶鞘原料，先将其洗净，并切成长度不超过20mm、厚度不超过5mm的薄片，得到王棕叶鞘薄片；
步骤(2)NSSC蒸煮：将王棕叶鞘薄片放入蒸煮器，用中性亚硫酸盐蒸煮，液固比4:1；蒸煮时，先升温60min，再保温30min；保温温度为150～170℃；
步骤(3)疏解：将蒸煮后的王棕叶鞘薄片放入疏解器，疏解5000 转；
步骤(4)分级：将疏解后的王棕叶鞘薄片放入标准保尔筛分仪中进行纤维分级，从纤维束中分离出薄壁细胞组分；
步骤(5)干燥：将分离出的薄壁细胞组分干燥至含水率降至10％以下，得到长度小于2mm的不规则颗粒状的薄壁组织颗粒。
本发明的有益效果：本方法通过王棕叶鞘原料提取的薄壁组分干燥制成的薄壁组织颗粒，通过多次进料方式进行酶解，酶解液含糖量能达到150g/L～170g/L，有效解决现有木质纤维素高固酶解需要干燥的原料，但是干燥引起角质化作用，降低纤维素酶的效率的问题。
说明书附图
图1为不同蒸煮条件得到的王棕叶鞘纤维与薄壁组分的比例。
图2为不同蒸煮条件得到的王棕叶鞘薄壁组分的纤维素酶解率。
图3为干燥角质化作用对薄壁和纤维组分影响图。
图4为薄壁组分酶解进程曲线图。
图5为润湿料酶解率回归线分析图。
图6为磨碎过200目筛纤维组分酶解进程曲线图。
图7为不同进料方式达到总固含量36％时，王棕叶鞘薄壁组分烘干料的单次和多次进料酶解曲线图。
图8为总固含量45％与36％王棕叶鞘薄壁组分烘干料的单次和多次进料酶解曲线杜比图。
具体实施方式
实施例，一种木质纤维素高固酶解的方法，包括如下步骤：
步骤(1)选料：选用王棕叶鞘原料，先将其洗净，并切成长度不超过20mm、厚度不超过5mm的薄片，得到王棕叶鞘薄片；
步骤(2)NSSC蒸煮：将王棕叶鞘薄片放入蒸煮器，用中性亚硫酸盐蒸煮，液固比4:1；蒸煮时，先升温60min，再保温30min；保温温度为150～170℃；
步骤(3)疏解：将蒸煮后的王棕叶鞘薄片放入疏解器，疏解5000 转；
步骤(4)分级：将疏解后的王棕叶鞘薄片放入标准保尔筛分仪中进行纤维分级，从纤维束中分离出薄壁细胞组分；
步骤(5)干燥：将分离出的薄壁细胞组分干燥至含水率降至10％以下，得到长度小于2mm的不规则颗粒状的薄壁组织颗粒；
薄壁组分烘干料比润湿料更适合高固酶解。润湿料吸水力强，酶解体系混合后物料黏度很大，在振荡培养箱中液化慢，而且反应不均匀，底部存在粘聚的团块。干燥料则不然，初期干燥颗粒不能有效吸水，与水分层，加入酶液之后液化很快(8h)。而且由于湿料中含有大量水分，实际操作中很难用于高固酶解。
步骤(6)酶解：将步骤(5)得到的薄壁组织颗粒、纤维素酶、0.04％四环素、PH4.8柠檬酸缓冲液置于12ml锤形瓶中，密封后置入恒温震荡箱中进行酶解反应；反应条件：温度50℃，转速150rpm，反应时间72 h；
其中，进料方式：采用多次、等比例、等时间间隔进料的方式进料，总反应时长为72h，干燥后的薄壁组织颗粒的总进料量为36％～45％；同时，每次进料按10FPU/g固料纤维素酶补充纤维素酶。
疏解器为奥地利PTI公司的PTI95568疏解器，蒸煮器为日本笠原理化卧式旋转蒸煮器。
步骤(5)干燥时，自然风干或105℃烘箱中烘干至含水率降至10％以下。
步骤(2)NSSC蒸煮时的保温温度为170℃。
实施例2，步骤(6)酶解中采用三次进料方式，初始一次进料，反应24h二次进料，反应48h三次进料，反应72h完成；每次进干燥后的薄壁组织颗粒含量12％～15％，每次进料按10FPU/g固料纤维素酶补充酶液。其余同实施例1。
实施例3，步骤(6)酶解中，还在锤形瓶中加入0.7％～0.9％的Tween 80。其余同实施例2。
一种用于高固纤维素酶解的原料的制备方法，包括如下步骤：
步骤(1)选料：选用王棕叶鞘原料，先将其洗净，并切成长度不超过20mm、厚度不超过5mm的薄片，得到王棕叶鞘薄片；
步骤(2)NSSC蒸煮：将王棕叶鞘薄片放入蒸煮器，用中性亚硫酸盐蒸煮，液固比4:1；蒸煮时，先升温60min，再保温30min；保温温度为150～170℃；
步骤(3)疏解：将蒸煮后的王棕叶鞘薄片放入疏解器，疏解5000 转；
步骤(4)分级：将疏解后的王棕叶鞘薄片放入标准保尔筛分仪中进行纤维分级，从纤维束中分离出薄壁细胞组分；
步骤(5)干燥：将分离出的薄壁细胞组分干燥至含水率降至10％以下，得到长度小于2mm的不规则颗粒状的薄壁组织颗粒。
蒸煮温度越高，总固体得率越低，将蒸煮保温温度从150℃提高至180℃，总固体得率从70％左右下降到50％左右。通过分级计量可以看出，薄壁组分(P200)的得率大体维持在20％～23％之间，不用化学药剂时，得率随温度的增加先上升后下降，170℃得率较高(23.4％)；添加6％碳酸钠蒸煮，则160℃得率较高(25.9％)；使用NSSC方法蒸煮，薄壁组分得率随温度的增加而略有降低，从150℃时的23.4％降低至180℃时的20.6％。与薄壁组分相比，纤维组分(R14)受蒸煮条件影响更显著，温度从150℃提高至180℃，纤维组分得率降幅超过30％，从综合生物炼制的角度来看，薄壁组分适宜生物转化，纤维组分适宜制浆造纸，应尽可能地避免纤维组分的降解损失。此外，中间组分(P14R200)即通过14目筛但被200目筛截留的那部分，混杂了纤维和未分散的薄壁组织，该组分得率越低，表明蒸煮对植物不同类型细胞分离越彻底，从附图2来看，170℃进行的NSSC蒸煮得到的中间组分含量最少(得率2％)，而温度180℃时中间组分更多，则反映了部分纤维束分解，尺寸降低，这与R14组分下降是一致的。
NSSC蒸煮比水或碳酸钠蒸煮更有利于纤维素的生物转化，170℃进行NSSC蒸煮后，薄壁组分酶解CED值达到94.6％，更高的蒸煮温度如180℃，CED与之持平，而160℃蒸煮得到的CED为90.3％。
预处理、分级后得到的王棕叶鞘纤维和薄壁组分仍是润湿状态，须干燥才能用于高固酶解，采用105℃烘干处理固料，然后进行4％固含量常规酶解，72h后测得反应产物葡萄糖的浓度并计算出CED。图3 展示了烘干引起的角质化作用，显然，相同酶用量条件下，烘干料比润湿料更难酶解。在较低的纤维素酶用量范围(5～10FPU/g固料)内，烘干引起的角质化作用降低了薄壁和纤维组分的CED值。但薄壁组分明显比纤维组分更能抵抗角质化作用，利用回归线分析3，干燥后薄壁组分和纤维组分的72h CED分别保留了97.2％和71.0％。充足的酶和时间可以减轻干燥引起薄壁组分CED降低作用，用15FPU/g固料纤维素酶解72h，烘干的薄壁组分的CED(91.9％)与湿对照样品的CED (93.3％)接近。参照附图3/4/5.与薄壁组分不同，烘干引发的王棕纤维角质化作用随酶用量增加愈加显著。把纤维组分研磨至与P200相近尺寸得到酶解进程曲线如图6所示，降低尺寸改善了酶对底物的可及性，无论是湿样还是干样，CED提升约一倍。但研磨纤维不能像薄壁组分那样最终克服角质化作用。
干燥角质化引发的纤维素酶受抑制现象可归因为固料吸水性能的不可逆变化，首先是木质纤维细胞微孔结构发生坍塌，孔道封闭，干料进入酶解反应体系后无法有效吸水，酶不能随着水分子扩散进固料颗粒内部，纤维素酶的可及性降低，酶解率下降。保水值(WRV)通常用来量化木质纤维中不可逆的吸水率损失。如表所示，烘箱干燥后，薄壁和纤维组分的WRV有所降低，变化趋势与水解结果非常吻合。其中，薄壁组分的WRV降低约50％，相应地，使用5FPU/g固料纤维素酶时， 2h后的CED降低了44.9％(图4)，即使用足量的纤维素酶(如15FPU /g固料)，CED的降低在酶解起始阶段仍然显着(图4)，但最终随着薄壁组分颗粒结构的破坏，角质化抑制作用随酶解时间的延长而逐渐被克服。WRV与干燥固料酶解初期CED对应，WRV越高，初始阶段酶解速率越高，但酶解后期在酶量充足的情况下，角质化作用能够被克服，如干燥和润湿的薄壁组分，WRV与终点的CED值不完全对应。
表1王棕叶鞘固料样品的保水值。
烘箱干燥引起的角质化降低了王棕叶鞘纤维和薄壁组分的纤维素酶解率(CEDs)，但在足够的酶和时间条件下，薄壁组分能克服这种角质化作用。尽管烘干的薄壁组分在酶解体系中难以恢复保水性能(WRV 值)，其酶解率仍然可以与润湿料接近。而纤维组分与之不同，即使研磨至与薄壁组分相近尺寸也仍然受干燥角质化引发的酶解抑制作用。
薄壁组分烘干料比润湿料更适合高固酶解。润湿料吸水力强，酶解体系混合后物料黏度很大，在振荡培养箱中液化慢，而且反应不均匀，底部存在粘聚的团块。干燥料则不然，初期干燥颗粒不能有效吸水，与水分层，加入酶液之后液化很快(8h)。而且由于湿料中含有大量水分，实际操作中很难用于高固酶解。
以王棕叶鞘薄壁组分烘干料为原料，采用单次进料、分两批进料(每次18％固含量)和分三批进料(每次12％固含量)的方式，每次进料按10FPU/g固料纤维素酶补充酶液，最终实现总固体含量36％的酶解。结果如附图1表明，用三种不同方式进料，反应足够长时间(120h)，最终都能产生含葡萄糖浓度150g/L以上的酶解液。但是从效能来看，分批进料有利于克服“流变学”难题，使酶解进程提早进入高糖度水平。如附图1中从24h采样点可以看出，按36％固含量单次进料产出的葡萄糖跟18％固含量两次酶解的24h产出相差不大，底料高黏性阻碍了产物的扩散和酶的移动。采用两次进料的策略，酶解72h积累的葡萄糖糖液浓度就达到了150.3g/L，在此结束酶解可以节约2天时间。采用三次进料也是在72h进入高糖度水平(144.5g/L)。
进一步提高总固含量至45％，能获得糖浓度更高的酶解液。参照附图2对比了两种分次进料策略——按每次固含量12％进三次料和按 15％进三次料，从酶解结果可以看出，后者用料量提高至总固含量45％，相当于45g烘干料与100g含酶的液体混合，按表1中薄壁组分干料保水值2.12g/g来计算，固料本身就能吸收95.4g水。如果单次进料，无法实现有效酶解。用薄壁组分烘干料分批进料解决了上述问题，最终得到含葡萄糖171.4g/L的酶解液，从这个结果也可以看出，充分利用干燥角质化作用可以解决高固酶解“流变学”难题。
预处理过的非木材薄壁组分烘干料是最终实现高固纤维素酶解及其下游乙醇发酵产业化的优势原料。
以上实施例并不是从限定的观点，而是从说明性的观点考虑。本发明的范围是依据权利要求范围而定，而不是所述说明而定，而且应解释为与其等同范围内的所有差异点皆包含在本发明。只要是采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性的改进；或未经改进，将本发明的上述构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种木质纤维素高固酶解的方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤(1)选料：选用王棕叶鞘原料，先将其洗净，并切成长度不超过20mm、厚度不超过5mm的薄片，得到王棕叶鞘薄片；
步骤(2)NSSC蒸煮：将王棕叶鞘薄片放入蒸煮器，用中性亚硫酸盐蒸煮，液固比4:1；蒸煮时，先升温60min，再保温30min；保温温度为150～170℃；
步骤(3)疏解：将蒸煮后的王棕叶鞘薄片放入疏解器，疏解5000转；
步骤(4)分级：将疏解后的王棕叶鞘薄片放入标准保尔筛分仪中进行纤维分级，从纤维束中分离出薄壁细胞组分；
步骤(5)干燥：将分离出的薄壁细胞组分干燥至含水率降至10％以下，得到长度小于2mm的不规则颗粒状的薄壁组分颗粒；
步骤(6)酶解：将步骤(5)得到的薄壁组分颗粒、纤维素酶、0.04％四环素、pH4.8柠檬酸缓冲液置于12ml锥形瓶中，密封后置入恒温振荡箱中进行酶解反应；反应条件：温度50℃，转速150rpm，反应时间72h；
其中，进料方式：采用多次、等比例、等时间间隔进料的方式进料，总反应时长为72h，干燥后的薄壁组分颗粒的总进料量为36％～45％；同时，每次进料按10FPU/g固料纤维素酶补充纤维素酶。
2.根据权利要求1所述的木质纤维素高固酶解的方法，其特征在于：步骤(6)酶解中采用三次进料方式，初始一次进料，反应24h二次进料，反应48h三次进料，反应72h完成；每次进干燥后的薄壁组分颗粒含量12％～15％，每次进料按10FPU/g固料纤维素酶补充酶液。
3.根据权利要求1或2所述的质纤维素高固酶解的方法，其特征在于：步骤(6)酶解中，还在锥形瓶中加入0.7％～0.9％的Tween 80。
4.根据权利要求3所述的木质纤维素高固酶解的方法，其特征在于：疏解器为奥地利PTI公司的PTI95568疏解器，蒸煮器为日本笠原理化卧式旋转蒸煮器。
5.根据权利要求4所述的木质纤维素高固酶解的方法，其特征在于：步骤(5)干燥时，自然风干或105℃烘箱中烘干至含水率降至10％以下。
6.根据权利要求5所述的木质纤维素高固酶解的方法，其特征在于：步骤(2)NSSC蒸煮时的保温温度为170℃。
7.一种用于高固纤维素酶解的原料的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤(1)选料：选用王棕叶鞘原料，先将其洗净，并切成长度不超过20mm、厚度不超过5mm的薄片，得到王棕叶鞘薄片；
步骤(2)NSSC蒸煮：将王棕叶鞘薄片放入蒸煮器，用中性亚硫酸盐蒸煮，液固比4:1；蒸煮时，先升温60min，再保温30min；保温温度为150～170℃；
步骤(3)疏解：将蒸煮后的王棕叶鞘薄片放入疏解器，疏解5000转；
步骤(4)分级：将疏解后的王棕叶鞘薄片放入标准保尔筛分仪中进行纤维分级，从纤维束中分离出薄壁细胞组分；
步骤(5)干燥：将分离出的薄壁细胞组分干燥至含水率降至10％以下，得到长度小于2mm的不规则颗粒状的薄壁组分颗粒。
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