具体实施方式
按照本发明,该方法包括蒸汽***含纤维素的原料;将得到的蒸汽***产物与酶混合、酶解;发酵得到的酶解产物,其中,所述将蒸汽***产物与酶混合的方法包括先将第一批蒸汽***产物与酶混合得到混合物,然后将剩余的蒸汽***产物连续加入与所述混合物混合,所述剩余的蒸汽***产物的加入速度使蒸汽***产物在反应体系中的浓度不高于150克/升;所述第一批与酶混合的蒸汽***产物的重量为全部蒸汽***产物重量的10-30重量%;所述含纤维素的原料的含水量为30-60重量%,优选为35-50重量%。
优选情况下,为了提高生产效率又同时能够保证蒸汽***产物与酶的充分混合、反应,得到较高的蒸汽***产物浓度以及较高水平的酶作用速度,所述剩余的蒸汽***产物的加入速度使蒸汽***产物在反应体系中的浓度优选为100-150克/升。
为了保证酶具有最佳的反应活性,在将第一批蒸汽***产物与酶混合前,调节蒸汽***产物的pH值为大于3小于7,优选为4.0-5.5,以使得蒸汽***产物与酶混合后,酶具有最佳的反应活性。由于酶解过程中pH值的波动不大,因此所述酶解的pH值可以按照本领域常用的方法在加入酶之前进行调节,所述调节反应物料pH值的方法可以采用本领域技术人员公知的各种方法。例如先将蒸汽***产物与水或培养基(加酶一般与水混合,加入产酶微生物一般与该微生物的培养基)混合,根据所得混合物的pH值,在该混合物中加入酸性物质或碱性物质。例如,所述酸性物质可以是硫酸、盐酸和磷酸中的一种或几种;所述碱性物质可以是氢氧化钠和/或氢氧化钾。
优选情况下,在将第一批蒸汽***产物与酶混合之后,将剩余的蒸汽***产物连续加入之前,还包括时间间隔,为了使第一批蒸汽***产物充分与酶接触并充分水解,提高糖的转化率,所述时间间隔优选为10-30分钟。
所述酶解时间从将酶与蒸汽***产物混合时开始计算,即,所述酶解时间指将蒸汽***产物与酶混合开始至将蒸汽***产物转化为糖后糖的含量不再增加时所用的时间,所述将剩余的蒸汽***产物连续加入与所述混合物混合的时间占酶解时间的15-35%,优选为20-30%。此外,按照本发明,所述在将第一批蒸汽***产物与酶混合之后,将剩余的蒸汽***产物连续加入之前的时间间隔也包括在所述酶解时间之内。
为了使酶与反应原料混合的更均匀,所述蒸汽***产物的酶解优选在水存在的条件下进行,更优选在含有水与含纤维素的原料的悬浮液中进行。也就是说,本发明优选先将第一批蒸汽***产物与水混合制备悬浮液后,再将酶解所需全部酶与悬浮液混合,然后再按照本发明的方法继续连续的加入剩余的蒸汽***产物。对所加入的水的量没有特别限定,优选情况下,所述水的加入量与全部蒸汽***产物的重量比为1-4∶1。更优选情况下,以第一批蒸汽***产物、水和酶混合后得到的混合物为基准,以蒸汽***产物的干重计,第一批蒸汽***产物的含量至少为1重量%,优选为1-20重量%,更优选为1.2-10重量%。在现有的由蒸汽***产物制备乙醇的方法中,在酶解时,由于蒸汽***产物的浓度太稀,导致生产周期长,生产效率低。而本发明的发明人发现,在酶解时控制第一批蒸汽***产物、水与酶混合后得到的混合物中蒸汽***产物的浓度,以第一批蒸汽***产物、水与酶混合后得到的混合物为基准,以蒸汽***产物的干重计,使蒸汽***产物的含量至少为1重量%,优选为1-20重量%,更优选为1.2-10重量%,既能够保证酶解的周期短,同时进一步保证具有高的生产效率,即单糖的产率高。
按照本发明,所述蒸汽***产物在反应体系中的浓度是指,未被液化(未与酶反应)的蒸汽***产物的重量与反应体系中固液总重量的比值×100%。
不同来源的含纤维素的原料含水量差异很大,比如不同时期收购的玉米秸秆原料的含水量差异就很大,收割不超过一周的新鲜秸秆含水量达80重量%以上,但是经过晾晒风干的存储秸秆含水量可能只有10%。现有方法对于不同含水量的含纤维素的原料都一律采用同样条件水浸处理,造成含纤维素的原料的含水量过大,在蒸汽***条件下,泄压时含纤维素的原料内部的水分以液体形式冲出,达不到由内向外破坏含纤维素的原料中包埋纤维素和半纤维素的木质素鞘的作用。
根据本发明提供的方法,可以通过各种方式获得含水量为30-60重量%的含纤维素的原料。对于含水量存在差异的不同批次含纤维素的原料,可以进行不同的处理,比如对于含水量高的秸秆原料,可以45-90℃烘干部分水分,使之含水量降低到30-60重量%;对于含水量低的秸秆原料,可以采用控制水浸时间的方法,增加秸秆原料的含水量到30-60重量%;对于含水量正好在到30-60重量%的秸秆原料,可以直接进行蒸汽***。优选所述用于蒸汽***的含纤维素的原料的含水量为35-50重量%。除非特殊说明,本发明所述含纤维素的原料的含水量均是指含纤维素原料的初始重量W1与在70-100℃下烘干至恒重的含纤维素原料的干计重量W2之差,与含纤维素原料的初始重量W1的重量百分比,即含水量(重量%)=(W1-W2)/W1×100%。
由于本发明仅涉及对蒸汽***产物加料方式的改进以及所述含纤维素的原料的含水量的限定,因此对用含纤维素的原料制备乙醇的方法的其它步骤没有特别的限制。
根据本发明所述采用含纤维素的原料制备乙醇的方法,可以采用现有技术常规的蒸汽***条件完成对含纤维素的原料的蒸汽***,例如,所述蒸汽***的温度可以为180-200℃,所述蒸汽***的压力可以为1.4-2.0兆帕,所述蒸汽***压力的维持时间可以为3-7分钟。更优选所述蒸汽***的温度为185-195℃,所述蒸汽***的压力为1.5-1.8兆帕,所述蒸汽***压力的维持时间为4-5分钟。在上述蒸汽***条件下都能充分破坏秸秆包埋纤维素和半纤维素的木质素鞘,实现本发明的目的。
所述酶解使用的酶包括纤维素酶。所述纤维素酶可以通过各种方式获得,例如商购得到,或者通过使用产酶微生物分泌得到。
由于使用产酶微生物分泌得到的酶会含有各种副产物,因此优选直接加入酶。所述酶的用量越多越好,出于成本考虑,优选以每克蒸汽***产物的干重计,所述纤维素酶的用量为8-20酶活力单位,更优选为10-15酶活力单位。本发明所述纤维素酶的酶活力按照美国国家可再生能源实验室(NationalRenewable Energy Laboratory,NREL)提供的标准方法——纤维素酶活力测定NREL LAP-006测定,所述纤维素酶的酶活力单位为在该标准方法规定的测定条件下,1分钟内将1克Whatman No.1滤纸转化为葡萄糖所需酶的微克数。
所述酶解的温度可以为纤维素酶的任何最适作用温度,一般为45-55℃,更优选为48-52℃。所述酶解的时间理论上越长越好,但是,由于本发明在第一次加料后采用连续补料的方法保证了原料与酶的均匀混合,因此,能够有效缩短酶解时间,又能够保证糖转化率,因此,所述酶解的时间优选为30-40小时。
按照本发明的一个优选的实施方式,所述将蒸汽***产物酶解的方法包括先将第一批蒸汽***产物与水混合后加入酶解罐中,调节蒸汽***产物的pH值为大于3至小于7,并升温至48-52℃以达到酶的最佳反应活性条件,然后,在搅拌下,向酶解罐中加入酶,搅拌10-30分钟后,再连续加入剩余的蒸汽***产物,所述剩余的蒸汽***产物的加入速度使含蒸汽***产物在反应体系中的浓度不高于150克/升。所述水的量与全部蒸汽***产物的重量比为1-4∶1;所述第一批与酶混合的蒸汽***产物的量为全部蒸汽***产物重量的10-30%。且以第一批蒸汽***产物、水与酶混合后得到的混合物为基准,以蒸汽***产物的干重计,第一批蒸汽***产物的含量为1.2-10重量%。
所述纤维素酶为复合酶,至少包括C1型纤维素酶、Cx型纤维素酶和纤维二糖酶三种酶。
C1酶可以使结晶的纤维素转变为非结晶的纤维素。
Cx型纤维素酶又分为Cx1型纤维素酶和Cx2型纤维素酶两种。Cx1型纤维素酶为内切型纤维素酶,可以从水合非结晶纤维素分子内部作用于β-1,4-糖苷键,生成纤维糊精和纤维二糖。Cx2型纤维素酶是一种外切型纤维素酶,可以从水合非纤维素分子的非还原端作用于β-1,4-糖苷键,逐一切断β-1,4-糖苷键生成葡萄糖。
纤维二糖酶则作用于纤维二糖,生成葡萄糖。
优选所述酶解使用的酶还包括半纤维素酶。因为半纤维素酶可以降解半纤维素成为溶于水的木糖,所以酶解使用的酶包括半纤维素酶,一方面可以更充分地暴露纤维素,增加纤维素与纤维素酶的接触几率,另一方面半纤维素降解产物木糖能够被树干毕赤酵母发酵生成乙醇,两方面作用都可以增加乙醇产率。以每克蒸汽***产物的干重计,所述半纤维素酶的用量为4.4-8.8酶活力单位。
本发明所述半纤维素酶的酶活力单位(U)为在50℃、pH=4.8条件下,每分钟分解浓度为1重量%木聚糖溶液产生1微克还原糖(以木糖计)所需的酶量。
本发明所述半纤维素酶的活力指每克半纤维素酶所具有的活力单位。所述半纤维素酶的活力利用半纤维素酶在50℃、pH为4.8的条件下水解1重量%木聚糖产生还原糖(以木糖计),所得还原糖与过量3,5-二硝基水杨酸(DNS)发生颜色反应,用分光光度计测得反应液550纳米的光吸收值与还原性糖(以木糖计)的生成量成正比关系测定。具体测定方法如下:
准确称取1.000克木聚糖,用0.5毫升pH=4.8的0.1摩尔/升乙酸-乙酸钠缓冲溶液溶解,然后用去离子水定容到100毫升,得到1重量%木聚糖溶液;
称取30克四水合酒石酸钾钠放入500毫升锥形瓶内,加16克NaOH后,加50毫升去离子水,以5℃/分钟的速度水浴加热至固体物质溶解,加入1克3,5-二硝基水杨酸,至溶解,冷却至室温,用去离子水定容至100毫升,可得3,5-二硝基水杨酸(DNS)溶液;
将木糖80℃烘干至恒重,准确称取1.000克溶于1000毫升水中,加10毫克叠氮化钠防腐,得到1毫克/毫升的标准木糖溶液;
准确称取1.000克固体半纤维素酶或移取1毫升液体半纤维素酶原液,用0.5毫升pH=4.8的0.1摩尔乙酸-乙酸钠缓冲溶液溶解,然后用去离子水定容到100毫升,得到稀释100倍的待测酶液;
分别将在50℃水浴加热60分钟的2毫升木糖梯度标准溶液(0.1毫克/毫升、0.2毫克/毫升、0.3毫克/毫升、0.4毫克/毫升和0..5毫克/毫升,所述木糖梯度标准溶液用去离子水与1毫克/毫升的标准木糖溶液混合制备)或去离子水(木糖空白对照),与2毫升DNS混合沸水浴5分钟,冷却,去离子水定容15毫升后,用分光光度计在550纳米下分别测定反应后木糖梯度标准溶液的光吸收值,以光吸收值为横坐标,木糖浓度为纵坐标绘制标准曲线。由该标准曲线可得回归方程y=bx+a,其中,x为光吸收值,y为木糖浓度,a为所得直线方程的截距,b为所得直线方程的斜率;
取0.2毫升待测酶液与1.8毫升所述1重量%木聚糖溶液或pH=4.8的0.1摩尔/升乙酸-乙酸钠缓冲溶液(木聚糖空白对照),按照与上述木糖梯度标准溶液相同的步骤测试光吸收值。并按照下式计算半纤维素酶的活力:
式中x为待测酶液的光吸收值,b和a与木糖浓度对光吸收值的回归方程中的b和a一致,n为酶的稀释倍数,60表示为酶促反应的时间为60分钟,5为取样倍数(这里从1毫升待测酶液中取出了0.2毫升进行测试)。
根据上述方法可以测定出具体的半纤维素酶的活力,进而计算出半纤维素酶的用量。
能够发酵戊糖和/或己糖的微生物都可以用于本发明的发酵过程,由于酿酒酵母是酿酒工业上普遍应用的耐酒精、副产物少、乙醇产率高的发酵己糖的微生物;树干毕赤酵母为既可以发酵戊糖也可以发酵己糖的微生物(参见“树干毕赤酵母连续发酵戊糖己糖生成酒精”,季更生等,南京林业大学学报自然科学版,第28卷第3期,第9-13页,2004年),因此优选所述发酵所使用的酵母为树干毕赤酵母和/或酿酒酵母。以每克酶解产物计,所述发酵所使用的酵母的接种量为103-108菌落形成单位,更优选104-106菌落形成单位。本发明发酵所使用的酵母可以为商购酵母固体制剂(比如干酵母粉)或酵母菌种(比如ATCC编号2601的啤酒酵母)。所述酵母的菌落形成单位可以通过本领域公知的方法测定,比如亚甲基蓝染色活菌计数法。亚甲基蓝染色活菌计数法的具体方法如下:
将1克干酵母粉溶于10毫升无菌水中,或将1毫升菌种活化液用无菌水稀释至10毫升,加入0.5毫升0.1重量%亚甲基蓝,在35℃下保温30分钟。在10倍光学显微镜下,用血球计数板计数保温后的溶液中活菌的数目(死菌染色,活菌不染色),可得1克干酵母或1毫升菌种活化液中活菌的数目,即菌落形成单位数。
所述酵母可以采用常规的方法接种,例如向酶解产物中加入5-15体积%的种子液。所述种子液可以为干酵母的水溶液或培养基溶液,也可以为干酵母或商购菌种的活化种子液。所述发酵的温度可以为任何适于酵母生长的温度,优选为30-36℃,更优选为32-35℃。所述发酵的时间可以为从接种开始至酵母生长的衰亡期出现(即发酵时间为迟滞期、对数期加上稳定期)的时间,优选发酵的时间为32-48小时,更优选32-40小时。发酵产物乙醇可以用常规的方法,根据不同工业产品的要求(比如燃料酒精要求乙醇的纯度达99%以上)分离并精制,比如蒸馏、浓缩、除水。
另外,蒸汽***的压力和温度可以灭菌。为防止在酶解过程中杂菌(主要是细菌)污染产生影响酶活力的毒素,并防止在发酵过程中杂菌污染影响酵母的生长,优选在酶解之前加入诸如工业青霉素的细菌抗生素,所述抗生素对酵母没有作用但可以抑制杂菌的生长。以每毫升酶解液或发酵液为基准,所述抗生素的加入量为1-10单位。所述酶解液包括蒸汽***产物、酶以及水,所述发酵液包括酶解产物和接种的酵母。
由于在蒸汽***的高温高压条件下,含纤维素的原料中的半纤维素会产生诸如糠醛、呋喃之类的抑制物,所述抑制物会降低酶的活力和发酵菌的活性,因此所述方法还包括在蒸汽***含纤维素的原料之后,酶解得到的蒸汽***产物之前,水洗所述蒸汽***产物。所述水洗是将蒸汽***产物与水混合,搅拌,使上述抑制物溶解在水中,然后离心分离蒸汽***产物,从而从蒸汽***产物中除去抑制物。理论上所述水洗的温度越高,能够溶解的抑制物越多,考虑到能耗,优选所述水洗的温度至少为60℃,更优选为60-80℃。由于水洗所加入的水越多,则溶解抑制物的溶剂越多,但是考虑到离心分离的能耗,优选以每克含纤维素的原料的干重计,所述水洗的加水量为2-10克,更优选为2-3克。
由于含纤维素的原料中可能会含有沙石杂质以及铁杂质,对蒸汽***设备会造成损害,因此本发明的制备乙醇的方法,可以包括在蒸汽***之前对含纤维素的原料进行除石除铁常规操作,比如以“风送”含纤维素的原料并磁铁吸引的方法进行除石除铁。沙石由于质量大,不能被风送到蒸汽***设备中,铁杂质由于磁铁的吸引也不会随原料进入蒸汽***设备中,从而可以完成除石除铁。此外,由于含纤维素的原料本身容易缠结而堵塞设备管路,因此,在进入蒸汽***设备前,优选使所述含纤维素的原料的大小为0.5-3厘米×0.2-1厘米×0.2-1厘米,更优选使所述含纤维素的原料的大小为1-2厘米×0.4-0.6厘米×0.5-1厘米。
下面结合实施例对本发明进行更详细的说明。
实施例1
本实施例用于说明本发明的采用含纤维素的原料制备乙醇的方法。
(1)蒸汽***
测试如图1所示的玉米秸秆原料,按照上述的方法测得玉米秸秆的含水量为20重量%,将原料切成1.5厘米×0.2厘米×0.5厘米的小段,用立式浸渍器(山东汶瑞机械有限公司)与重量为所述玉米秸秆原料重量的三分之一的水混合后,可得含水量40重量%的玉米秸秆。取1000克含水量为40重量%的玉米秸秆,在195℃下以1.8兆帕的压力维持5分钟,然后泄压,完成蒸汽***。将所得蒸汽***产物与70℃的水按照重量比1∶3搅拌混合30分钟,然后用LW400型卧螺离心机(张家港华大离心机制造有限公司)在900转/分钟转速下进行固液分离,共得到2000克固体蒸汽***产物(含水量为70重量%)。
所得固体蒸汽***产物中纤维素总重量和半纤维素总重量的测定:
取5克所述水洗后的蒸汽***产物在45℃下烘干至恒重1.5克,称量300.0毫克该干燥后的蒸汽***产物,放置于重80克的100毫升干燥三角烧瓶内。向所述三角烧瓶加入3.00毫升浓度为72重量%的硫酸溶液,搅拌1分钟。然后将三角烧瓶在30℃水浴中加热60分钟,每隔5分钟用搅拌一次以确保均匀水解。水浴结束后,用去离子水使硫酸的浓度稀释到4重量%。用布氏漏斗过滤所述稀释后的蒸汽***产物酸水解液,共得到滤液84毫升。将20毫升滤液转移至干燥50毫升的三角瓶中。使用2.5克碳酸钙调节该滤液的pH值至5.5,静置5小时,收集上层清液。0.2微米滤膜过滤收集的上层清液,所得上层清液的滤液用Biorad Aminex HPX-87P高效液相色谱(HPLC)分析。HPLC条件:进样量20微升;流动相为0.2微米滤膜过滤,并且超声振荡脱气的HPLC超纯水;流速为0.6毫升/分钟;柱温80-85℃;检测器温度80-85℃;检测器为折光率检测器;运行时间为35分钟。以0.1-4.0毫克/毫升浓度范围的D-(+)葡萄糖和0.1-4.0毫克/毫升浓度范围D-(+)木糖作为标准样品。HPLC分析得到蒸汽***产物酸水解液中葡萄糖浓度为1.77毫克/毫升,计算可得1克所述水洗后的蒸汽***产物酸水解能得到重量为0.149克的葡萄糖,因为浓度为72重量%的硫酸溶液可以将蒸汽***的产物的纤维素全部水解成葡萄糖,因此所得葡萄糖的重量是蒸汽***产物中纤维素的重量的1.11倍,即1克所述水洗后的蒸汽***产物中含纤维素0.134克,则2000克蒸汽***产物中共含纤维素267克。HPLC分析得到蒸汽***产物酸水解液中木糖浓度为0.49毫克/毫升,计算可得1克所述水洗后的蒸汽***产物酸水解能得到重量为0.041克的木糖,因为浓度为72重量%的硫酸溶液可以将蒸汽***的产物中半纤维素全部水解成木糖,因此所得木糖的重量是蒸汽***产物中半纤维素的重量的1.14倍,即1克蒸汽***产物中含半纤维素0.036克,则2000克蒸汽***产物中共含半纤维素72克。
(2)酶解
向酶解罐中加入水,并在搅拌下,加入第一批步骤(1)取样测试后剩余的水洗蒸汽***产物,第一批加入的水洗蒸汽***产物的量为步骤(1)取样测试后剩余的全部水洗蒸汽***产物重量的15%,然后调节pH值为4,加热至52℃后,以每克蒸汽***产物的干重计,加入20酶活力单位的酶计算,全部蒸汽***产物的干重为600克,共加入12000酶活力单位(约80克)的纤维素酶(和氏璧生物技术有限公司),并在52℃下保温混合20分钟;然后连续加入剩余的水洗蒸汽***产物,所述剩余的水洗蒸汽***产物的加入速度使水洗蒸汽***产物在反应体系中的浓度为140克/升,加料结束后,在52℃下保温酶解至加酶后36小时(连续加入剩余的水洗蒸汽***产物的时间占酶解时间的30%),得到酶解产物。所述水的加入量与全部水洗蒸汽***产物的重量比为2∶1。将酶解产物用布氏漏斗过滤,将20毫升滤液转移至干燥50毫升的三角瓶中,静置5小时,收集上层清液。0.2微米滤膜过滤收集的上层清液,按照上述步骤(1)所述高效液相条件,测定并计算出酶解产物中的葡萄糖共279.6克。所述酶解得到的葡萄糖重量除以1.11,即蒸汽***产物中被酶解的纤维素的重量共251.9克,按照下式计算纤维素转化率和单糖产率,计算结果见表1。每小时酶解的纤维素的量为7.0克。(以蒸汽***产物的干重计,以得到的混合物的总重量为基准,第一批蒸汽***产物的含量为2.1重量%。)
纤维素转化率=100%×被酶解的纤维素的重量/纤维素的总重量
单糖产率=100%×酶解得到的葡萄糖重量/秸秆干重
(3)发酵
使酶解产物的温度降至35℃,以每克酶解产物的重量计,接种105菌落形成单位的酿酒酵母(安琪超级酿酒高活性干酵母,湖北安琪酵母股份公司),所得混合物在32℃下于发酵罐中搅拌培养40小时。在100℃蒸馏所得发酵产物,所得蒸馏馏分在78.3C下二次蒸馏可得乙醇143克,按照下式计算乙醇产率,计算结果见表1。
乙醇产率=100%×乙醇重量/秸秆干重
对比例1
本对比例说明采用含纤维素的原料制备乙醇的参比方法。
按照实施例1的方法制备乙醇,不同的是,按照文献“对植物秸秆酒精生产工艺的介绍”(张学峰、兰玉成,酿酒,第29卷第4期,第37-38页,2002年7月)所公开的方法,将秸秆原料在蒸汽***前先用水浸泡40分钟,测得浸泡后的玉米秸秆原料的含水量达到83重量%。然后取3530克该含水量为83重量%的玉米秸秆按照实施例1的条件进行蒸汽***,并水洗后得到4300克蒸汽***产物(含水量为86%)。按照实施例1所述HPLC分析硫酸水解的蒸汽***产物的方法,测得4300克蒸汽***产物中共含纤维素267克,半纤维素70克。在酶解步骤(2)中将步骤(1)取样测试后剩余的水洗蒸汽***产物一次全部加入到含水的酶解罐中,然后与酶混合均匀(水的量与全部水洗蒸汽***产物的重量比为2∶1),酶解时间需要42小时;按照实施例1步骤(1)所述高效液相条件,测定并计算出酶解产物中的葡萄糖共221.2克。所述酶解得到的葡萄糖重量除以1.11,即蒸汽***产物中被酶解的纤维素的重量共199.3克,每小时酶解的纤维素的量为4.75克;二次蒸馏得到乙醇113.1克。并按照实施例1的方法和公式计算纤维素转化率、单糖产率和乙醇产率,计算结果见表1。
对比例2
本对比例说明采用含纤维素的原料制备乙醇的参比方法。
按照实施例1的方法制备乙醇,不同的是,用750克含水量为20重量%玉米秸秆直接进行蒸汽***,并水洗后得到1500克蒸汽***产物(含水量为60%)。按照实施例1所述HPLC分析硫酸水解的蒸汽***产物的方法,测得1500克蒸汽***产物中共含纤维素266克,半纤维素72克。并按照对比例1的方法酶解蒸汽***产物,发酵酶解产物;按照实施例1步骤(1)所述高效液相条件,测定并计算出酶解产物中的葡萄糖共217.9克。所述酶解得到的葡萄糖重量除以1.11,即蒸汽***产物中被酶解的纤维素的重量共196.3克,每小时酶解的纤维素的量为4.67克;二次蒸馏得到乙醇111.4克。并按照实施例1的方法和公式计算纤维素转化率、单糖产率和乙醇产率,计算结果见表1。
电镜观察结果:
用JSM-35CF扫描电镜放大1000倍观察对比例1、对比例2和实施例1的蒸汽***产物,结果分别如图2、图3和图4所示。从图2可以看出,由于秸秆原料内部没有水分可以气化成水蒸汽,因此蒸汽***不能由内向外充分破坏秸秆原料;从图3可以看出,对比例2玉米秸秆蒸汽***的效果并不好,纤维素仍然呈束状,并且纤维素表面残留有木质素鞘;而如图4所示的实施例1的蒸汽***效果很好,可以看到游离的纤维素。
实施例2
本实施例用于说明本发明的采用含纤维素的原料制备乙醇的方法。
按照实施例1的方法制备乙醇,不同的是,取1000克含水量为50重量%的玉米秸秆,切成1.3厘米×0.4厘米×0.8厘米的小段,在190℃下以1.8兆帕的压力维持4分钟,然后泄压,完成蒸汽***,将所得蒸汽***产物与65℃的水按照质量比1∶2搅拌混合40分钟,然后用离心泵LW400型卧螺离心机(张家港华大离心机制造有限公司)在900转/分钟转速下进行固液分离,共得到2000克蒸汽***产物(含水量为75重量%)。
按照实施例1所述HPLC分析硫酸水解的蒸汽***产物的方法,测得2000克蒸汽***产物中共含纤维素220克,半纤维素60克。
并按照实施例1的方法对蒸汽***产物进行酶解和发酵,酶的用量约为65克,按照实施例1步骤(1)所述高效液相条件,测定并计算出酶解产物中的葡萄糖共226.9克。所述酶解得到的葡萄糖重量除以1.11,即蒸汽***产物中被酶解的纤维素的重量共204.4克,每小时酶解的纤维素的量为5.7克(以蒸汽***产物的干重计,以得到的混合物的重量为基准,第一批蒸汽***产物的含量为1.7重量%);二次蒸馏得到乙醇107.9克。并按照实施例1的方法和公式计算纤维素转化率、单糖产率和乙醇产率,计算结果见表1。
实施例3
本实施例用于说明本发明的采用含纤维素的原料制备乙醇的方法。
按照实施例1的方法制备乙醇,不同的是,取1000克含水量为35重量%的玉米秸秆,切成1.2厘米×0.4厘米×0.7厘米的小段,在200℃下以1.7兆帕的压力维持6分钟,然后泄压,完成蒸汽***。将所得蒸汽***产物与75℃的水按照重量比1∶2.5搅拌混合50分钟,然后用离心泵LW400型卧螺离心机(张家港华大离心机制造有限公司)在900转/分钟转速下进行固液分离,共得到2000克固体蒸汽***产物(含水量为67.5重量%)。
按照实施例1所述HPLC分析硫酸水解的蒸汽***产物的方法,测得2000克蒸汽***产物中共含纤维素288克,半纤维素78克。
并按照实施例1的方法对蒸汽***产物进行酶解和发酵,酶的用量约为85克,按照实施例1步骤(1)所述高效液相条件,测定并计算出酶解产物中的葡萄糖共293.4克。所述酶解得到的葡萄糖重量除以1.11,即蒸汽***产物中被酶解的纤维素的重量共264.3克,每小时酶解的纤维素的量为7.3克(以蒸汽***产物的干重计,以得到的混合物的重量为基准,第一批蒸汽***产物的含量为2.2重量%);二次蒸馏得到乙醇149.0克。并按照实施例1的方法和公式计算纤维素转化率、单糖产率和乙醇产率,计算结果见表1。
实施例4
本实施例用于说明本发明的采用含纤维素的原料制备乙醇的方法。
按照实施例1的方法制备乙醇,不同的是,取1400克含水量为55重量%的玉米秸秆,切成2.0厘米×0.6厘米×0.8厘米的小段,在190℃下以1.55兆帕的压力维持7分钟,然后泄压,完成蒸汽***。共得到1700克固体蒸汽***产物(含水量为63重量%)。
按照实施例1所述HPLC分析硫酸水解的蒸汽***产物的方法,测得1700克蒸汽***产物中共含纤维素280克,半纤维素75.5克。
并按照实施例1的方法对蒸汽***产物进行酶解和发酵,酶的用量约为84克,按照实施例1步骤(1)所述高效液相条件,测定并计算出酶解产物中的葡萄糖共279.1克。所述酶解得到的葡萄糖重量除以1.11,即蒸汽***产物中被酶解的纤维素的重量共251.4克,每小时酶解的纤维素的量为7.0克(以蒸汽***产物的干重计,以得到的混合物的重量为基准,第一批蒸汽***产物的含量为2.5重量%。);二次蒸馏得到乙醇135.1克。并按照实施例1的方法和公式计算纤维素转化率、单糖产率和乙醇产率,计算结果见表1。
实施例5
本实施例用于说明本发明的采用含纤维素的原料制备乙醇的方法。
按照实施例1的方法制备乙醇,不同的是,在酶解步骤中,第一批加入的蒸汽***产物的量为取样测试后剩余的全部蒸汽***产物重量的20%,调节pH值为4,加热至52℃后,加入纤维素酶后,连续加入剩余的水洗蒸汽***产物,所述剩余的水洗蒸汽***产物的加入速度使蒸汽***产物在反应体系中的浓度为100克/升,加料结束后,在52℃下保温酶解至加酶后38.5小时(连续加入剩余的水洗蒸汽***产物的时间占酶解时间的13%),得到酶解产物。按照实施例1步骤(1)所述高效液相条件,测定并计算出酶解产物中的葡萄糖共278.2克。所述酶解得到的葡萄糖重量除以1.11,即蒸汽***产物中被酶解的纤维素的重量共250.6克,每小时酶解的纤维素的量为6.5克(以蒸汽***产物的干重计,以得到的混合物的重量为基准,第一批蒸汽***产物的含量为2.7重量%。);发酵步骤同实施例1,二次蒸馏得到乙醇142.2克。并按照实施例1的方法和公式计算纤维素转化率、单糖产率和乙醇产率,计算结果见表1。
实施例6
本实施例用于说明本发明的采用含纤维素的原料制备乙醇的方法。
按照实施例1的方法制备乙醇,不同的是,在酶解步骤中,第一批加入的水洗蒸汽***产物的量为取样测试后剩余的全部蒸汽***产物重量的30%,调节pH值为5,加热至50℃后,加入纤维素酶后,在50℃下保温混合30分钟后;连续加入剩余的水洗蒸汽***产物,所述剩余的水洗蒸汽***产物的加入速度使蒸汽***产物在反应体系中的浓度为130克/升,加料结束后,在52℃下保温酶解至加酶后37.5小时(连续加入剩余的水洗蒸汽***产物的时间占酶解时间的25%),得到酶解产物。按照实施例1步骤(1)所述高效液相条件,测定并计算出酶解产物中的葡萄糖共276克。所述酶解得到的葡萄糖重量除以1.11,即蒸汽***产物中被酶解的纤维素的重量共248.7克,每小时酶解的纤维素的量为6.6克(以蒸汽***产物的干重计,以得到的混合物的重量为基准,第一批蒸汽***产物的含量为3.8重量%);在发酵步骤中,不同的是,使酶解产物的温度降至32℃,以每克酶解产物的重量计,接种106菌落形成单位的酿酒酵母(安琪超级酿酒高活性干酵母,湖北安琪酵母股份公司),所得混合物在32℃下于发酵罐中搅拌培养36小时;在100℃蒸馏所得发酵产物,所得蒸馏馏分在78.3℃下二次蒸馏可得乙醇141.2克。并按照实施例1的方法和公式计算纤维素转化率、单糖产率和乙醇产率,计算结果见表1。
实施例7
本实施例用于说明本发明的采用含纤维素的原料制备乙醇的方法。
按照实施例1的方法制备乙醇,不同的是,向酶解罐中加入水,并在搅拌下,加入第一批步骤(1)取样测试后剩余的水洗蒸汽***产物,第一批加入的水洗蒸汽***产物的量为步骤(1)取样测试后剩余的全部水洗蒸汽***产物重量的10%,然后调节反应物料的pH值为5,并加热至50℃后,以每克蒸汽***产物的干重计,加入12酶活力单位的纤维素酶,5酶活力单位的半纤维素酶计算,全部蒸汽***产物的干重为600克,共加入7200酶活力单位(约50克)的纤维素酶(和氏璧生物技术有限公司)和3000酶活力单位(约40克)的半纤维素酶(北京化学试剂公司),并在50℃下保温混合25分钟;然后连续加入剩余的水洗蒸汽***产物,所述剩余的水洗蒸汽***产物的加入速度使蒸汽***产物在反应体系中的浓度为150克/升,加料结束后,在52℃下保温酶解至加酶后38小时(连续加入剩余的水洗蒸汽***产物的时间占酶解时间的20%),得到酶解产物。所述水的加入量与全部水洗蒸汽***产物的重量比为3.5∶1。并按照实施例1步骤(1)所述高效液相条件,测定并计算出酶解产物中的葡萄糖共278.7克,所述酶解得到的葡萄糖的重量除以1.11,即蒸汽***产物中被酶解的纤维素的重量共251.1克,测定并计算出酶解产物中的木糖共53.4克,所述酶解得到的木糖的重量除以1.14,即蒸汽***产物中被酶解的半纤维素的重量共46.8克,每小时酶解的纤维素和半纤维素的总重量为7.8克(以蒸汽***产物的干重计,以得到的混合物的总重量为基准,第一批蒸汽***产物的含量为0.8重量%。);并按照下述公式计算纤维素、半纤维素转化率和单糖产率,计算结果见表1。
纤维素转化率=100%×被酶解的纤维素的重量/纤维素的总重量
半纤维素转化率=100%×被酶解的半纤维素的重量/半纤维素的总重量
单糖产率=100%×(酶解得到的葡萄糖重量+酶解得到的木糖重量)/秸秆干重
(3)发酵
使酶解产物的温度降至34℃,以每克酶解产物的重量计,接种为104菌落形成单位的酿酒酵母(安琪超级酿酒高活性干酵母,湖北安琪酵母股份公司)和104菌落形成单位的树干毕赤酵母,所得混合物在33℃下于发酵罐中搅拌培养37小时。在100℃蒸馏所得发酵产物,所得蒸馏馏分在78.3℃下二次蒸馏可得乙醇169.8克,并按照实施例1的公式计算乙醇产率,计算结果见表1。
表1
实施例或对比例 |
纤维素转化率(%) |
半纤维素转化率(%) |
单糖产率(%) |
乙醇产率(%) |
实施例1 |
94.3 |
- |
46.6 |
23.8 |
对比例1 |
74.6 |
- |
36.9 |
18.9 |
对比例2 |
73.8 |
- |
36.3 |
18.6 |
实施例2 |
92.9 |
- |
45.4 |
21.6 |
实施例3 |
91.8 |
- |
45.1 |
22.9 |
实施例4 |
89.8 |
- |
44.3 |
21.4 |
实施例5 |
93.9 |
- |
46.4 |
23.8 |
实施例6 |
93.1 |
- |
46.0 |
23.5 |
实施例7 |
94.0 |
65.0 |
55.4 |
28.3 |
从上表1中的数据可以看出,采用本发明的含纤维素的原料制备乙醇的方法得到的乙醇的产率以及单糖的产率比对比例1和对比例2的方法均有明显提高。且本发明的方法酶解效率高,每小时可酶解纤维素或纤维素和半纤维素的混合物5.7-7.8克。