CN112458021B - 一种生防荧光假单胞菌及其培养方法和应用 - Google Patents

一种生防荧光假单胞菌及其培养方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种生防荧光假单胞菌及其培养方法和应用，上述荧光假单胞菌MF11的保藏编号为CGMCC No.20594，其应用具体可为荧光假单胞菌MF11在防治根结线虫病或蔬菜苗期猝倒病方面的应用。本发明提供的生防细菌‑荧光假单胞菌MF11(Pseudomonas fluorescens)，可以有效防治根结线虫病和蔬菜苗期猝倒病，同时也表现出了广谱的植物抗病能力，对人畜无毒，不污染环境，无残留，有利于生态环境的可持续发展，也为研究开发新的环境友好型生防菌剂提供优质的生物资源。

Description

一种生防荧光假单胞菌及其培养方法和应用
技术领域
本发明涉及农作物生物防治技术领域，尤其涉及一种生防细菌-荧光假单胞菌及其培养方法和在防治植物病害方面的应用。
背景技术
根结线虫(Meloidogyne spp.)是世界性分布的威胁农业生产的主要病原物之一，侵染后可导致植物组织发生变化，致使寄主更易受到青枯、枯萎、根腐等病原菌的侵染，造成复合病害，从而加快发病速度，加重这些土传性病害的发生严重度。由于寄主广泛，不同生态环境下根结线虫的发生流行规律存在差异，从而导致作物根结线虫病的防控十分困难。
腐霉菌(Pythium spp.)是多种植物重要的病原，其病害种类繁多(楼兵干，2002)。腐霉的寄主有葫芦科、茄科、豆科和禾本科等植物，给寄主植物造成严重危害(张博等，2008)。近几年来，腐霉作为许多农作物苗期病害的重要致病菌而被广泛报道。腐霉可以引起苗期猝倒、立枯、根腐、茎腐、果腐等(向新华，2012)，其给农业生产带来严重的损失。而瓜果腐霉菌引起的幼苗猝倒、根茎和瓜果腐烂最为严重。腐霉猝倒病是难以防治的病害，常高发于瓜类、豆类、辣椒和茄子等瓜果类蔬菜，尤其对黄瓜和番茄危害最为严重(DimitriosF，2011)，其发病症状主要在植物胚茎基部或中部呈现水浸状后，导致子叶尚未凋萎即猝倒(王向东等，2006)。
使用化学药剂是目前作物生产中根结线虫和苗期猝倒病防控的主要手段，但由于高毒化学药剂的误用和滥用造成土壤和水体的污染对人、畜安全造成威胁，因此需要开发一些高效、低毒、低残留、高选择性的药剂，以控制根结线虫病和苗期猝倒病的发生危害。
生物防治因其对环境友好、对非靶标生物无毒无害等优点，成为人们关注的热点。利用环境有益微生物来控制病害的发生以及诱导提高作物抗逆能力是近些年来研究的热点，尤其这些微生物对环境无污染，能克服化学药剂防治带来的缺陷，引起了科学家们利用生物防治手段控制病害、以及应对不良环境的兴趣；特别是，在农业生产中具有较高的经济效益和环境效益，符合保护生态环境和维护人类健康安全的发展趋势，可为我国国民经济及未来农业的可持续发展提供广阔前景。
因此，探寻一种安全、经济兼之有效的防治根结线虫和腐霉病害的方法显得尤为重要，更迫切的是需要筛选出能对根结线虫病或作物苗期猝倒病进行有效防治的微生物以符合绿色农业的要求。
发明内容
为了克服现有技术中的缺陷，本发明筛选了一种生防细菌-荧光假单胞菌，并优化了其培养方法，且通过测定温室盆栽防效，对生防菌进行测试，研究其对瓜果腐霉病的控病效果；同时对其他植物病原菌进行平板拮抗测试，初步了解其拮抗菌谱，为其在防治植物病害中的推广应用奠定坚实基础。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个方面是提供一种生防细菌，所述生防细菌为荧光假单胞菌MF11，其分类命名为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，其保藏编号为CGMCC No.20594，保藏日期为2019年09月03日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
本发明的第二个方面是提供一种菌药制剂，其包括荧光假单胞菌MF11或由其发酵获得的无菌发酵液。
进一步地，上述菌药制剂还包括农药学上可接受的助剂，包括但不限于：分散剂、稳定剂、载体等。上述菌药制剂的剂型包括但不限于：液体制剂、固体制剂(如粉剂)等。
本发明的第三个方面是提供一种生防细菌的培养方法，其包括步骤：将荧光假单胞菌MF11的菌种进行活化培养，再将活化后的菌株依次进行一次发酵培养、二次发酵培养、离心获得无菌发酵液。
进一步地，在上述培养方法中，所述活化培养的步骤包括：将菌种在LB培养基上生长，25～30℃恒温培养箱中黑暗培养0.5-3天，获得活化后的菌株；优选，28℃恒温培养箱中黑暗培养1-2天，获得活化后的菌株。
进一步地，在上述培养方法中，所述一次发酵培养步骤包括：将活化后的菌株于LB培养基中进行一次发酵获得种子液，培养条件为：温度为25～30℃，转速为120～240r/min下振荡发酵培养18～30h；优选，培养条件为：温度为28～30℃，转速为170-200r/min下振荡发酵培养18～24h；更优选，培养条件为：温度为28℃，转速为180r/min下振荡发酵培养24h。
进一步地，在上述培养方法中，所述二次发酵培养步骤包括：将所述一次发酵培养获得的种子液以4～12wt％的接种量接种于LB培养基中进行二次发酵获得培养液，培养条件为：温度为25～30℃，转速为120～240r/min下振荡发酵培养18～30h；优选，接种量为6～10wt％，培养条件为：温度为28～30℃，转速为170-200r/min下振荡发酵培养18～24h；更优选，接种量为8wt％，培养条件为：温度为28℃，转速为180r/min下振荡发酵培养24h。
进一步地，在上述培养方法中，所述离心步骤包括：将所述二次发酵培养获得的培养液在转速为4000～6000r/min下进行离心，取上清发酵液经过0.1～0.3μm的细菌过滤器过滤，制得无菌发酵液；其中，无菌发酵液中活菌浓度为5×109～1×1010CFU/mL。优选，将二次发酵培养获得的培养液在转速为5000r/min下进行离心，取上清发酵液经过0.2μm的细菌过滤器过滤，制得无菌发酵液。
进一步地，在上述培养方法中，所述LB培养基的配制步骤包括：1000ml LB培养基使用胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，调节pH至6.0～7.5，用蒸馏水定容至1000ml，在110～130℃条件下灭菌15～30min；优选，调节pH至7.2，在121℃条件下灭菌20min。其中，所述活化培养步骤采用LB固态培养基，其配制过程中加入琼脂10～15g；所述一次发酵培养、二次发酵培养均采用LB液态培养基。
本发明的第四个方面是提供一种防治植物病害的方法，其采用生防细菌-荧光假单胞菌MF11或由荧光假单胞菌MF11制得的菌药制剂对农作物进行灌根处理。
进一步地，在上述防治植物病害的方法中，所述灌根处理的步骤包括：将由生防细菌发酵获得的菌药制剂，在农作物移栽当天进行灌根处理；在农作物发病之前，根据作物的生长周期，每隔30-45d将菌药制剂对移栽的农作物进行灌根。优选，上述菌药制剂可为无菌发酵液或无菌发酵液与助剂的组合物，上述无菌发酵液在灌根前需稀释，优选稀释100～200倍。
本发明的第五个方面是提供一种生防细菌-荧光假单胞菌MF11或由荧光假单胞菌MF11制得的菌药制剂在防治植物病害方面的应用。
进一步地，在上述防治植物病害的方法或在防治植物病害方面的应用中，所述植物病害包括根结线虫、寡雄腐霉、林栖腐霉、瓜果腐霉、华丽腐霉、柑橘褐腐疫霉、立枯丝核菌或尖孢镰刀菌导致的植物病害。
进一步地，在上述应用中，所述植物病害为根结线虫病或作物苗期猝倒病。
与现有技术相比，本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：
本发明提供的生防细菌CGMCC No.20594(荧光假单胞菌Pseudomonasfluorescens)，可以有效防治根结线虫病和苗期猝倒病，同时也表现出了广谱的植物抗病能力，对人畜无毒，不污染环境，无残留，有利于生态环境的可持续发展，也为研究开发新的环境友好型生防细菌菌剂提供优质的生物资源。
附图说明
图1是本发明一实施例中生防细菌-荧光假单胞菌MF11处理番茄根后线虫在根尖的聚集情况的结果示意图；
图2是本发明一实施例中生防细菌-荧光假单胞菌MF11处理番茄根后线虫进入根部情况的结果示意图。
图3是本发明一实施例中生防细菌-荧光假单胞菌MF11对根结线虫生防效果及生殖能力影响的结果示意图。
上述生防细菌-荧光假单胞菌MF11已进行保藏，其分类命名为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，其保藏编号为CGMCC No.20594，保藏日期为2019年09月03日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。下面具体实施方式中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到；其中，未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社)或按照产品说明书进行。
实施例1
本实施例为生防细菌MF11(荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens)的筛选及鉴定过程(从自然环境中分离筛选)。
一、生防细菌MF11的筛选
(1)分离存在于植物体外的潜在的生防菌
1)土壤悬浮液的制备：称量10g土壤样品(来源于江苏省南京市六合区竹镇番茄大棚番茄根际土)置于盛有90ml无菌的0.85％NaCl的三角瓶(含灭菌玻璃珠)中，于摇床150rpm下震荡培养30min；
2)10倍梯度稀释：静置5min，从三角瓶中取1ml土壤悬浮液置于盛有9ml无菌0.85％NaCl试管中(稀释10倍)并振荡混匀，再进一步梯度稀释，配制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的土壤稀释液；
3)涂平板培养：分别从上述的梯度稀释液中取0.1ml，均匀涂布于R2A培养基上(Reasoner&Geldreich，1985)，每个梯度3个重复，置于28℃倒置，培养2天左右；
4)选取菌落数在50～300之间的平板，计数并且挑取所有菌落，在固体LB培养基上纯化后，用接种环挑取单一菌落接种于盛有5ml LB培养基(液体)的试管中，28℃200rpm摇菌培养24～48h，取菌悬液与等体积80％甘油溶液混匀，存于-70℃保存备用(Berg et al.，2000)。
(2)产酶活性测定初步筛选生防菌株
具有产蛋白酶、几丁质酶、葡聚糖酶、纤维素酶等产酶活性的菌株常作为初筛生防菌的标准。牙签挑取处于生长旺盛期的菌株点于蛋白酶酶活测定培养基、以胶体状几丁质为唯一碳源的培养基(Chi-Ayers)、β-1,3-葡聚糖酶酶活测定培养基、纤维素酶酶活测定培养基上，接菌后28～30℃培养3天观察透明圈有无，分别记录透明圈的内径和外径。具有一种或多种以上产酶活性的菌株保留，待进一步筛选。
最终从番茄根际土壤中分离得到一菌株，经产酶活性检测及平板拮抗试验确认其为潜在生防菌株，命名为生防细菌MF11。
二、生防细菌MF11的鉴定
(1)形态学特征观察
利用插片法进行形态学特征观察，具体操作：将灭菌盖玻片以45度角斜***涂有上述筛选出来的菌株的LB培养基平板中，28℃恒温培养，期间观察培养性状和用光学显微镜观察形态特征。
形态学特征：单菌落为圆形，边缘光滑，表面光滑透明，呈淡黄色。
(2)生理生化性状分析
根据《常见细菌***鉴定手册》(东秀珠，2001)对筛选到的生防细菌进行生理生化性状分析。
1)革兰氏染色方法
取一块干净的载玻片并在载玻片上滴加一滴灭菌水，接着用无菌枪头挑取少量菌落涂于水滴四周后，涂片固定。草酸铵结晶紫染液染1分钟，用蒸馏水冲洗干净。再滴加碘液覆盖涂面染1分钟，水洗后并用吸水纸吸干水分。滴加数滴95％的酒精进行脱色，大约20秒后水洗，最后用番红染色液染1分钟后，干燥镜检。经镜检菌落染色为红色，为革兰氏阴性菌。
2)菌株生理生化特征鉴定
A.接触酶实验
用灭菌枪头挑取单菌落置于干净的载玻片上，并加一滴3％的H2O2于该菌落上；立即观察有无气泡产生。结果显示MF11接触酶反应呈阳性。
B.耐盐性实验
将100μl生防菌菌液分别接种在含有不同浓度的NaCl(0-10％)的10ml LB液体培养基中；并以不接菌的LB液体培养基作为对照，于摇床中28℃，180rpm培养1天后，观察菌株的生长情况。结果显示MF11能够在1％和4％NaCl培养液中正常生长，而在8％的NaCl的培养液中无法生长。
C.耐酸性实验
取2ml生防菌菌液分别接种至pH 5和pH 6的LB液体培养基中并以不接菌的LB液体培养基作为对照，28℃培养箱中恒温培养3-7天后，观察菌株的生长情况。结果显示MF11在pH值为5或6的液体培养基中均可以正常生长。
D.氧化酶实验
取小块滤纸沾取少量菌落，然后滴加适量1％四甲基对苯二胺盐酸盐溶液，若细菌与试剂接触10秒内呈深紫色，则为阳性，反则为阴性(梁正生等，2012)。结果显示MF11氧化酶反应呈阳性。
E.需氧型实验
NA培养基分装于试管中，接种环挑取待测细菌于试管底部进行穿刺接种后，试管置于28℃培养箱中培养2天并观察菌落的变化，若细菌沿着培养基穿刺线生长，为厌氧型细菌。沿着表面生长则为需氧型细菌。结果显示MF11为需氧型细菌。
(3)分子生物学鉴定
将筛选获得的生防菌MF11在高氏一号培养基上，28℃环境下培养至对数期，以5000转/分钟离心5分钟收集菌体。
采用康为世纪有限公司的细菌基因组DNA快速提取试剂盒提取所收集菌体的基因组总DNA。
再采用康为世纪有限公司的PCR扩增试剂盒扩增该生防MF11的16S rRNA序列和gyrB基因。以上述提取的基因组总DNA为模板，扩增所采用引物分别为16S rRNA通用引物27F/1492R(Yamamoto&Harayama，1995)和gyrB引物UP-1S/UP2Sr(Galkiewicz&Kellogg，2008)。具体PCR扩增操作按照试剂盒说明书进行。
PCR产物经过1％琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下观察，将有目标条带的PCR产物回收。再将连接、转化和扩增，将PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。
将所得测序结果提交到GenBank数据库进行BLAST分析比对。结果表明生防菌MF11的16S rRNA序列与荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens序列同源性达99.93％，同时结合该菌株的形态特征、培养特征和生理生化特征结果，最终将筛选获得的生防菌MF11鉴定为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)。
上述生防细菌MF11，属于荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏日期为2020年09月03日，其保藏编号为CGMCC No.20594。
实施例2
本实施例为实施例1筛选获得的荧光假单胞菌MF11的一较佳培养方法及菌剂制备方法，其具体步骤包括：
将生防细菌MF11在LB培养基(平板划线)上生长，28℃恒温培养箱中黑暗培养1-2天，待长出单菌落(获得活化的细菌菌株)。其中，LB培养基的配制方法为：每配制1000ml LB培养基使用胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，琼脂10-15g，调节pH至7.2，用蒸馏水定容至1000ml，在121℃条件下灭菌20min；
挑单菌落(活化的菌株)接入装有50ml LB培养基的250ml三角瓶中，温度为28℃，转速为180r/min下振荡发酵培养24h，获得种子液。该步骤所用发酵培养基的配制方法为LB培养基；
将上述获得的种子液以8wt％的接种量接种于LB培养基中进行二次发酵，发酵条件同上，获得培养液，4℃保存备用。
将上述获得的培养液在转速为5000r/min下进行离心，丢弃底部沉淀，取上清发酵液经过0.2μm的细菌过滤器过滤，制得无菌发酵液(活菌浓度大致为5×109～1×1010CFU/ml)，4℃保存备用。
实施例3
本实施例为实施例1筛选获得的荧光假单胞菌MF11在防治植物病害方面的方法其应用，其具体应用步骤包括：将实施例2获得的无菌发酵液稀释100～200倍，在农作物移栽当天进行灌根处理；此后，在农作物发病之前，根据作物的生长周期，每隔30-45d将实施例2获得的无菌发酵液稀释100～200倍对移栽的农作物进行灌根。上述应用过程中也可采用以荧光假单胞菌MF11为有效成分的菌药制剂，例如粉剂、液体制剂等，其具体的施用方式可根据具体的剂型配制进行相应的调整。
上述植物病害包括：根结线虫、寡雄腐霉、林栖腐霉、瓜果腐霉、华丽腐霉、柑橘褐腐疫霉、立枯丝核菌或尖孢镰刀菌导致的植物病害。
实施例4
本实施例为生防细菌-荧光假单胞菌MF11对植物病原菌的平板拮抗试验，具体试验方法包括：
将瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)、华丽腐霉(Pythium splendens)、林栖腐霉(Pythium sylvaticum)、柑橘褐腐疫霉(Phytophthora citrophthora)、寡雄腐霉(Pythium Oligandrum)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)和尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)分别在10％的V8固体培养基中培养1-4天备用。
上述10％的V8固体培养基按照1：100(w/v)的比例在V8蔬菜汁中加入CaCO3，然后5000r/min离心10min，取上清弃沉淀，在上清液中加入9倍体积的蒸馏水，配制成10％的V8蔬菜汁培养基，按照1.5％的比例加入琼脂，在121℃条件下灭菌20min，冷却后制得。
对于上述植物病原菌，各自取菌落中靠近边缘部分，用已灭菌的打孔器打取直径为6mm的菌碟，将菌碟的菌丝面朝下分别接种于10％的V8固体培养基平板的正中央，然后在距离平板边缘5mm处接种实施例2制得的MF11无菌发酵液10μl，超净工作台中吹干后将平板置于25℃黑暗培养1-5天，每组处理设置3个重复。用十字交叉法测量菌落直径，并用公式计算出菌丝生长的抑制率：
抑制率(％)＝(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/(对照组菌落直径-6)×100％。
上述试验结果参见下表：
Figure GDA0003498413700000091
从上表结果可以看出，上述生防细菌MF11对瓜果腐霉抑制率高达88％以上，具有明显的拮抗活性(抑制作用)。由此可知，实施例1中筛选的生防细菌MF11及其菌剂可以用于防治由瓜果腐霉导致的植物苗期猝倒病。
同时，从上表结果也可以看出，生防细菌MF11对于寡雄腐霉、林栖腐霉、华丽腐霉、柑橘褐腐疫霉、尖孢镰刀菌和立枯丝核菌都有高达60％以上的抑制率，这表明生防细菌MF11能够抑制这些腐霉和镰刀菌的生长。由此可推断，实施例1中筛选的生防细菌MF11及其菌剂也可以用于防治寡雄腐霉、林栖腐霉、华丽腐霉、柑橘褐腐疫霉、尖孢镰刀菌和立枯丝核菌导致的植物病害。
实施例5
本实施例为生防细菌-荧光假单胞菌MF11瓜果腐霉的盆栽防效测定，具体试验方法包括：
(1)瓜果腐霉菌游动孢子悬浮液的制备：将保存的瓜果腐霉菌株在10％V8培养基上活化生长，在25℃恒温培养箱中黑暗放置进行培养，一般培养的时间为1-2天备用；将备用的菌株用手术刀切成10mm×15mm大小的菌丝块(10-20块)置于15ml的灭菌自来水中，菌丝块的菌丝面朝上，每隔30min换一次水，重复3次；最后加8ml左右的灭菌自来水，25℃恒温培养箱中放置培养，培养24h左右即可诱导产生游动孢子，将游动孢子悬浮液用无菌水调节至浓度约为1×104个/ml。
(2)盆栽防效的测定：用生长1周的黄瓜苗，在根部灌入稀释100倍的生防细菌MF11无菌发酵液(实施例2制得)，每株黄瓜苗灌5ml(以根部位置灌入等体积的未接种细菌MF11的发酵培养基上清液的黄瓜苗为对照)。灌根3天后，再向黄瓜苗根部灌入瓜果腐霉菌的游动孢子，每株苗灌2ml，各处理重复3组，每组12株苗，共接种36株生姜苗。置于25℃恒温培养箱中培养，接种11天后统计植株的倒伏情况和计算防治效果。计算公式如下：
病情指数＝100×∑(各级病植株数×各级代表值)/(调查总植株数×最高级代表值)；
0＝植株保持绿色和健康；1＝叶鞘环变色并且下部叶片变黄；2＝植株存活，但叶片完全黄化或死亡；3＝整个植株死亡。
防治效果(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100
测定的结果参见下表。
Figure GDA0003498413700000101
Figure GDA0003498413700000111
其中，上述表中的病情指数结果，在0.01水平上有显著差异。
从上表结果可以看出，经实施例2制得的生防细菌MF11菌剂(发酵液)灌根处理黄瓜苗，其病情指数为13.15、防效为75.01％，这表明上述生防细菌MF11菌剂能用于对作物苗期猝倒病的防治。
实施例6
本实施例为生防细菌-荧光假单胞菌MF11对南方根结线虫二龄幼虫致死率的测定，具体试验方法包括：
将线虫侵染8周以上的番茄根洗去泥沙后剪碎装瓶，加入10％次氯酸钠，振荡3min，随即倒入分离筛，次序分别为20、170、500目，利用大量的清水洗去次氯酸钠后，收集500目标准筛上的虫卵。收集到的虫卵，利用35％蔗糖悬浮，收集上层虫卵，然后加入10％次氯酸钠溶液进行处理，振荡悬浮5min，离心收集虫卵，灭菌水洗3次除去次氯酸钠。室温无菌条件下孵化2-3天后，开始收集南方根结线虫二龄幼虫备用。
在24孔细胞培养板中依次加入1ml的实施例2制得的无菌发酵液和50头二龄幼虫，并将细胞培养板置于25℃恒温培养箱中；分别在2h、4h、8h、12h、24h后观察线虫活性，统计线虫死亡头数，以LB培养液和灭菌水处理作为对照，每个处理，重复3次。结果显示MF11对二龄幼虫的致死率为94％(见下表)，可用于防治根结线虫引起的植物病害。
Figure GDA0003498413700000112
实施例7
本实施例为生防细菌-荧光假单胞菌MF11对线虫趋化性影响测定，具体试验方法包括：
番茄种子(Moneymaker)用10％次氯酸钠溶液处理15min(Ho et al，1992)，进行表面消毒处理，剧烈振荡后于超净台中用灭菌水清洗5～6次；于灭菌平板保湿黑暗培养4-5天。待番茄根长约1.5cm～1.8cm取出使用，将番茄幼苗根分别浸入稀释100倍的生防菌MF11发酵液和LB培养液中，于摇床上180rpm，28℃振荡培养30min取出。
按照实施例6的方法获得20000头二龄线虫。在低温冰浴条件下，将线虫悬浮液浓缩至500头/ml加入Pluronic F-127凝胶中，将线虫凝胶液在低温下充分混匀(Morishitaet al.，2001)；取6cm细胞培养板置于冰上，移液枪吸取3ml Pluronic F-127凝胶(内含1500头二龄线虫)滴加在细胞培养板中，使凝胶充满培养板底部，小心去除多余气泡。将处理过的幼苗放入含Pluronic F-127凝胶的细胞培养板中，每孔放两根苗，放置好幼苗将细胞培养板室温放置；每个处理3次重复；在体视显微镜下分别于1h、4h、12h、18h、24h、48h观察生防菌MF11处理番茄根后南方根结线虫在根部的聚集情况。
同时，将根取出经过染色、脱色处理后，统计进入番茄根尖的线虫数量。该实验重复3次。配制染色液母液：称取3.5g酸性品红粉末，将其加入250ml冰醋酸中，添加灭菌水定容至1000ml并将溶液搅拌均匀。根组织脱色液的配制：冰醋酸：丙三醇：灭菌水进行1:1:1体积比混配。
实验结果如图1和图2所示，图1为生防菌MF11处理番茄根后线虫在根尖的聚集情况，图2为生防菌MF11处理番茄根后线虫进入根部情况。上述实验结果表明：与对照处理相比，细菌MF11的发酵液处理番茄植株后，可以显著降低根结线虫在番茄根部的聚集，且进入番茄根部的数量显著下降，48h的统计结果显示，与对照相比减少了80.65％。
实施例8
本实施例为生防细菌-荧光假单胞菌MF11防治根结线虫温室防效测定，具体试验方法包括：
番茄苗(Moneymaker)发芽后移栽至装有细沙的盆砵中，置于25℃，16h光照、8h黑暗条件下生长。待番茄苗生长至三周龄时，向番茄根部接种生防菌MF11菌液10ml，一周后接种500头J2悬浮液。在J2接种后三周，统计根结数，8周后统计卵块数。每个处理18株苗，重复3次。
卵块染色方法：称取100mg亮蓝粉末溶于100ml灭菌水中制备母液；用量筒量取10ml母液加入含有500ml自来水的大烧杯中并搅拌混匀；所得溶液即为工作液；将番茄根部用水洗净沙土，根部放入工作液中染色15min后，可统计卵块数目。
实验结果如图3所示，图3为生防菌MF11对根结线虫生防效果及生殖能力影响。上述实验结果表明：与对照处理相比，细菌MF11的发酵液处理番茄植株后，可以显著降低根结数86.53％，卵块数降低了70.52％，说明生防菌MF11可以用于防治根结线虫。
实施例9
本实施例为生防细菌-荧光假单胞菌MF11防治根结线虫大田防效测定，具体试验方法包括：
将实施例2制备的无菌发酵液稀释到2×107CFU/ml备用，每株苗灌根200ml。对照药剂为10％噻唑膦。将试验田划分为面积相同的9个小区，每小区8㎡，每小区栽种32棵番茄苗。设置3个处理：10％噻唑膦(化学药剂对照组)，清水对照组，生防菌MF11处理组，每处理3次重复，相邻小区之间设保护行，完全随机排列。
40天后，对所有小区番茄进行分级(Bridge，1980)调查病情：
0级：根系无虫瘿，无发病；
1级：根系有少量虫瘿；
3级：三分之二根系布满虫瘿；
5级：根系布满小虫瘿并有次生虫瘿；
7级：根系形成须根团。
根据公式(Xue Q，2009)计算病情指数和相对防效：
病情指数＝100×∑(各级病植株数×各级代表值)/(调查总植株数×最高级代表值)
防治效果(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100
Figure GDA0003498413700000131
Figure GDA0003498413700000141
由上表的实验结果可知，田间防效结果显示：生防细菌MF11处理的番茄植株病情指数显著低于清水对照、与10％噻唑膦处理效果无显著差异；MF11处理的番茄病情指数为19.09，相对防效为66.71％，田间防效较好，可用于根结线虫的田间防治。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (10)

1.一种生防细菌，其特征在于，所述生防细菌为荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）MF11，其保藏编号为CGMCC No. 20594。
2.一种菌药制剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的生防细菌或由其培养获得的发酵液。
3.根据权利要求2所述的菌药制剂，其特征在于，还包括农药学上可接受的助剂。
4.一种如权利要求1所述的生防细菌的培养方法，其特征在于，包括步骤：将荧光假单胞菌MF11的菌种进行活化培养，再将活化后的菌株依次进行一次发酵培养、二次发酵培养、离心获得发酵液。
5. 根据权利要求4所述的生防细菌的培养方法，其特征在于，所述活化培养的步骤包括：将菌种在LB培养基上生长，25~30℃恒温培养箱中黑暗培养0.5-3 天，获得活化后的菌株；和/或，
所述一次发酵培养步骤包括：将活化后的菌株于LB培养基中进行一次发酵获得种子液，培养条件为：温度为25~30 ℃，转速为120~240 r/min下振荡发酵培养18~30 h；和/或，
所述二次发酵培养步骤包括：将所述一次发酵培养获得的种子液以4~12 wt%的接种量接种于LB培养基中进行二次发酵获得培养液，培养条件为：温度为25~30 ℃，转速为120~240 r/min下振荡发酵培养18~30 h；和/或，
所述离心步骤包括：将所述二次发酵培养获得的培养液在转速为4000~6000 r/min下进行离心，取上清液经过0.1~0.3 μm的细菌过滤器过滤，制得发酵液；其中，发酵液中活菌浓度为5×109~1×1010 CFU/mL。
6. 根据权利要求5所述的生防细菌的培养方法，其特征在于，所述LB培养基的配制步骤包括：1000 ml LB培养基使用胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，调节pH至6.0~7.5，用蒸馏水定容至1000 ml，在110~130℃条件下灭菌15~30 min。
7.一种防治植物病害的方法，其特征在于，采用如权利要求1所述的生防细菌或如权利要求2或3所述的菌药制剂对农作物进行灌根处理；
其中，所述植物病害为根结线虫、寡雄腐霉、林栖腐霉、瓜果腐霉、华丽腐霉、柑橘褐腐疫霉、立枯丝核菌或尖孢镰刀菌导致的植物病害。
8.根据权利要求7所述的防治植物病害的方法，其特征在于，所述灌根处理的步骤包括：将由生防细菌发酵获得的菌药制剂，在农作物移栽当天进行灌根处理；在农作物发病之前，根据作物的生长周期，每隔30-45d将菌药制剂对移栽的农作物进行灌根。
9.一种如权利要求1所述的生防细菌或如权利要求2或3所述的菌药制剂在防治植物病害方面的应用，其特征在于，所述植物病害包括根结线虫、寡雄腐霉、林栖腐霉、瓜果腐霉、华丽腐霉、柑橘褐腐疫霉、立枯丝核菌或尖孢镰刀菌导致的植物病害。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述植物病害为根结线虫病或作物苗期猝倒病。
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