CN113450877B - 一种基于多重免疫组化技术的生物标志物分析方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基于多重免疫组化技术的生物标志物分析方法及其应用。其中该生物标志物分析方法利用图像识别***肿瘤组织样本的组织形态学、细胞表型以及相应的空间坐标信息，并通过双阳性细胞评分、肿瘤‑免疫抑制相对距离比这两种生物标志物对肿瘤免疫微环境进行自动分析。本发明还提供用于实施该方法的装置和设备，以及相应的计算机可读介质。通过本发明可以更加准确高效地表征肿瘤免疫微环境的空间联系状态，使肿瘤免疫微环境相关指标能够更有效地对免疫治疗疗效进行评估，满足临床病理工作以及科学研究中通过多重免疫组化技术进行肿瘤免疫微环境分析的需求。

Description

一种基于多重免疫组化技术的生物标志物分析方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物检测分析领域，具体涉及一种基于多重免疫组化技术的生物标志物分析方法及其应用。

背景技术

免疫组织化学(Immunohistochemistry)又称免疫组化，它是用标记的特异性抗体(或抗原)对组织内抗原(或抗体)的分布进行组织和细胞原位检测技术。作为一种成熟、可靠，经济性强且广泛应用的技术手段，目前在临床病理诊断及科学研究中应用广泛，对于肿瘤组织来源的判断、肿瘤风险的评估、治疗方法的选择，以及各种实验中观测组织、细胞抗体(或抗原)表达的水平及分布范围具有不可替代的作用。免疫组织化学通常包括传统免疫组化以及多重免疫组化：

传统的免疫组化，一次只能标记一种抗体(或抗原)，对于同一个细胞或者同一块区域的不同抗体(或抗原)的标记及表达对比，以及研究它们的之间的相关性带来了相当的难度。而对比不同抗体(或抗原)标记在同一部位或者同一细胞当中的表达，在临床病理诊断以及众多科学实验场景中是非常必须和必要的，因此，如何能够对抗体(或抗原)多重标记及进行可靠的定量分析成为当前研究的热点；

多重免疫组化(multiple Immunohistochemistry，mIHC)是现在应用比较好的一种方式，它具有可以同时标记多种抗体(或抗原)的能力，其原理就是根据阳性表达部位和阳性表达区域不同所建立的一种直观的多色定位的染色方法。其标记的对象是多种细胞部位，包括膜、浆型、核型的各种不同组合。利用mIHC技术可以通过在同一张肿瘤病理组织切片上同时或先后采用不同颜色的荧光色素或酶促产物，来原位示踪组织或细胞内不同的抗原大分子物质。与大规模细胞检测和单细胞转录分析相比，mIHC技术不仅可以使肿瘤样本在更好的分辨率下显示肿瘤细胞与肿瘤微环境的关系，而且其技术原理相对成熟且操作便捷，在目前的临床医学研究中具有独到的优势。

肿瘤微环境(Tumor Microenvironment，TME)是一个复杂的综合***，主要由肿瘤细胞、周围的免疫细胞、肿瘤相关成纤维细胞、附近的间质组织、微血管、各种细胞因子和趋化因子等构成。肿瘤细胞与其所处的微环境作为一个功能整体，两者相互影响、共同进化，所以肿瘤的发生、发展不仅与肿瘤细胞本身相关，同样与肿瘤微环境密切相关。肿瘤中免疫细胞的活化/抑制状态、免疫细胞密度、肿瘤细胞之间的空间位置等都将对免疫治疗的应答评估产生重要影响，研究肿瘤微环境对癌症治疗具有重要的意义。

但目前对于免疫肿瘤学研究多集中在特定免疫细胞亚群在其空间环境中的作用，例如，通过多路成像、质谱流式细胞术及单细胞RNA测序等方式进行研究，但它们并未充分利用空间坐标数据等信息，无法很好地解释肿瘤细胞与周围各要素之间的空间关系。因此，现有技术还有待发展。

发明内容

本发明结合空间信息对肿瘤-免疫微环境的特征进行量化，开发一种与肿瘤免疫微环境相关的生物标志物分析方法。

根据第一方面，本发明提供一种基于多重免疫组化技术的生物标志物分析方法，包括以下步骤：

S1：获取数据步骤，获取肿瘤组织样本中目标区域的组织形态学、细胞表型以及对应的坐标数据，记为标准数据S；

S2：提取关键信息列步骤，提取标准数据S中的组织形态学分类列、细胞表型列、以及X坐标列和Y坐标列；所述组织形态学分类列包括tumor和non-tumor；

S3：识别肿瘤边界细胞步骤，通过Delaunay三角剖分算法构造Delaunay三角网，当其中任意两点之间的一端为肿瘤细胞，另一端为非肿瘤细胞，即识别为肿瘤边界细胞；

S4：提取肿瘤边界细胞步骤，将步骤S3中识别的肿瘤边界细胞提取作为子集，映射至坐标系中；

S5：定义肿瘤边缘细胞步骤，将步骤S4中提取的肿瘤边界细胞作为数据集A，将步骤S1中获取的标准数据S作为数据集B，基于欧几里得距离算法获取数据B在数据A自定义半径范围内的细胞索引值，根据细胞索引值确定肿瘤边缘细胞；

S6：注释细胞类型步骤，将肿瘤边缘细胞注释为“Margin”标签，将组织形态列为“Tumor”且非“Margin”细胞注释为“Intra”标签，其余注释为“Other”标签，并将注释列添加至标准数据S中；

S7：定量计算生物标志物步骤，通过计算双阳性细胞评分、肿瘤-免疫抑制相对距离比中至少一种生物标志物实现对肿瘤组织样本的分析；其中，所述双阳性细胞评分是指对两种特定标记物阳性的免疫效应细胞分别在“Margin”标签区域和“Intra”标签区域中的占比进行评分；所述肿瘤-免疫抑制相对距离比是指计算在“Margin”标签区域和“Intra”标签区域中，免疫效应细胞与肿瘤细胞的相对距离、和免疫效应细胞与免疫抑制细胞的相对距离的比值。免疫效应细胞是指在免疫应答中参与清除异物抗原和行使效应功能的免疫细胞，在本申请中，免疫效应细胞能有效杀伤肿瘤细胞，具体包括CD8+T细胞(即CD8+)、M1巨噬细胞(如CD68+)、DC细胞(如CD11c+)等。而免疫抑制细胞是指对于免疫应答具有抑制作用的细胞，具体包括Treg细胞(如FoxP3+)、M2巨噬细胞(如CD163+)、MDSC(如CD11b+)等。

目前组织图像分析***常用的inForm、QuPath、HALO等病理成像分析***，这些***能够通过机器学习算法实现智能化的组织形态学识别和细胞表型鉴定，并且对相应细胞表型表面抗体标记进行定量分析。基于(但不限于)以上病理成像***的细胞表型分析结果以及定量数据，并不足以为表征肿瘤免疫微环境的空间联系状态，因此，需要结合空间信息对肿瘤-免疫微环境的的特征进行量化，开发肿瘤免疫微环境相关的生物标志物分析方法。本发明正是基于这种背景下提出的一种新的生物标志物分析方法及其应用。

本发明中所述的生物标志物特指双阳性细胞评分、肿瘤-免疫抑制相对距离比这两种指标，通过计算分析这两个生物标志物中的至少一种，可以更加全面地表征肿瘤免疫微环境的空间联系。其中，双阳性细胞评分利用两种特定标记物阳性的免疫效应细胞在肿瘤内部区域和肿瘤边缘区域的占比统计进行评分，通过评分的高低确定该免疫效应细胞在这两个区域的浸润程度，此处的免疫效应细胞包括CD8+、CD68+和CD11c+细胞等。而肿瘤-免疫抑制相对距离比是指判断如CD8+、CD11c+细胞中任一种免疫效应细胞，其距离肿瘤细胞较近、或者距离免疫抑制细胞(如FoxP3+、CD163+或CD11b+细胞)较近，从而分析出该种免疫效应细胞是在更大程度上实现杀伤肿瘤细胞还是被免疫抑制细胞所抑制。

在具体实施方案中，肿瘤组织样本来自于动物或人，本发明的目的在于通过利用生物标志物，结合空间坐标信息对动物或人体肿瘤组织中的肿瘤微环境进行量化分析，确定肿瘤免疫微环境的相关指标，以便更准确地评估肿瘤情况，对症进行治疗。

多重免疫组化技术具有可以同时标记多种抗体(或抗原)的能力，通过染色，使不同的阳性表达部位和阳性表达区域呈现出多色定位。在本发明中，通过多重免疫组化技术进行生物标记，可以直观看出不同的特定标记物阳性细胞在肿瘤组织样本中的分布情况，以便后续对其进行分析。需要说明的是，本发明中所说的特定标记物阳性细胞是指经过荧光标记染色，并基于荧光信号强度，通过inForm、QuPath等软件深度学习算法训练识别的阳性细胞。在优选实施例中，本发明中的特定标记物阳性细胞包括免疫效应细胞、免疫抑制细胞和肿瘤细胞，其中，免疫效应细胞包括但不限于CD8+、CD68+和CD11c+细胞，免疫抑制细胞包括但不限于FoxP3+、CD163+和CD11b+细胞，而肿瘤细胞包括但不限于PanCK+细胞。

步骤S1具体包括以下步骤：

对肿瘤组织样本进行多重免疫组化检测，通过扫描仪扫描获取相应的免疫组化显微全景图；将免疫组化显微全景图中的目标区域导入病理图像识别***，并进行组织形态学与细胞表型识别分析，获得目标区域相应的组织形态学、细胞表型以及对应的空间坐标数据。

在步骤S1中，需要先获取来自每一受试者(动物或人)的肿瘤组织样本，其该肿瘤组织样本进行多重免疫组化检测，再通过扫描仪获取相应的免疫组化显微全景图。将免疫组化显微全景图中感兴趣区域作为目标区域，导入病理图像识别***，如inForm、QuPath等进行组织形态学与细胞表型识别分析，获得相应的组织形态学、细胞表型和对应的坐标数据。该步骤S1中的扫描仪、病理图像识别***均为本领域现有技术通常使用和理解的仪器。本发明的重点在于对获取数据后的深度处理，以更有效地评估肿瘤微环境相关情况。

步骤S2中，在获取的数据中进一步提取关键信息列，关键信息列即为数据中的关键信息，后续通过读取关键信息列，可以快速找到相关信息。例如，关键信息列包括组织形态学列、细胞表型列、X坐标列以及Y坐标列。

在本发明中，所述组织形态学包括tumor(指肿瘤区)和non-tumor(指非肿瘤区)，通过组织形态学可以准确有效地选取目标区域进行分析评估。细胞表型是指细胞的表现形式和特征，通过不同的细胞表型，可以将本发明中的特定标记物阳性细胞分为肿瘤细胞、免疫效应细胞和免疫抑制细胞(其中，免疫效应细胞和免疫抑制细胞可以统称为免疫细胞)。而对应的坐标数据是指获取这些特定标记物阳性细胞映射在坐标系时的空间位置，并用坐标数据[i,j]进行标识，其中i代表X轴坐标数值，j代表Y轴坐标数值，通过对应的空间坐标数据可以建立目标区域范围内的细胞索引值。

步骤S3中，识别肿瘤边界细胞时，可以通过Delaunay三角剖分算法构造Delaunay三角网，用于识别细胞(点)与细胞(点)的边界，其中任意两点之间一端为肿瘤细胞，另一端为非肿瘤细胞，即识别为肿瘤边界细胞。步骤S4是将肿瘤边界细胞映射至坐标系中，即通过空间坐标数据直观标识出肿瘤边界细胞的位置。肿瘤边界细胞即位于肿瘤细胞与周围其他组织细胞之间的边界细胞，它的范围大于肿瘤边缘细胞(肿瘤边缘细胞是指肿瘤细胞边缘的细胞层)，识别肿瘤边界细胞便于进一步识别肿瘤边缘细胞。需要说明的是，本发明实施例中所说的坐标系是指二维坐标系，即包含X轴坐标和Y轴坐标，将肿瘤边界细胞映射至坐标系中时，可以获得肿瘤边界细胞在坐标系中的X轴、Y轴坐标数据，直观得出位置关系。

步骤S5中，在肿瘤边界细胞范围内定义肿瘤边缘细胞。将步骤S4中所提取的肿瘤边界细胞作为数据集A，步骤S1中所获取的标准数据S作为数据集B，基于欧几里得距离算法获取数据B在数据集A自定义半径范围内的细胞索引值(即获取数据集A范围中的所有数据B的空间坐标数据，以[i,j]表示)，根据细胞索引值确定肿瘤边缘细胞。其中，自定义半径范围可以根据实际需求进行选择，通常为10～300μm，具体以目标区域的肿瘤组织大小而定。对于肿瘤组织较大范围的目标区域，可以选择100μm、200μm或300μm等，对于肿瘤组织较小的范围，可以选择20μm、30μm、40μm等。本发明中自定义半径范围默认为30μm。

欧几里得距离函数表达式如下：

其中，X为点B(x1,y1)和点A(x2,y2)之间的欧几里得距离(这里的点B来自于集合B中的任一点，点A来自于集合A中的任一点)。

步骤S6是对不同的细胞类型进行注释，用以区分。例如，通过步骤S5所获得的细胞索引值对肿瘤边缘细胞进行注释，将其注释为“Margin”标签(即注释为肿瘤边缘)；将组织形态列为“Tumor”(指肿瘤区)且非“Margin”细胞注释为“Intra”标签(即注释为肿瘤内部)，其余注释为“Other”标签，将注释列添加至标准数据S中，保证数据的完整性，便于后续数据的提取和分析。

步骤S7是对生物标志物进行定量数值计算，包括双阳性细胞评分、肿瘤-免疫抑制相对距离比这两种方法中的至少一种，下面具体介绍这两种方法。

(1)双阳性细胞评分：即计算特定标记物阳性的两种免疫效应细胞(如CD68+和CD8+细胞)在肿瘤内部(Intra)和肿瘤边缘(Margin，又称肿瘤浸润边缘)区域的占比，超过预定高细胞占比阈值则记为1分，否则记为0分。需要说明的是，细胞占比是特定标记物阳性的免疫效应细胞个数占总体细胞个数的占比，在本发明实施例中，所述预定高细胞占比阈值为1％～50％，例如可选1％、5％、25％、50％等，优选地，一种具体实施例中，预定高细胞占比阈值设定为1％。

然后将两种特定标记物阳性的免疫效应细胞(如CD68+和CD8+细胞)分别在Intra和Margin区域所获得的评分相加求和，得到双阳性细胞评分，分值范围0～4分。双阳性细胞评分分值越高，表示在两个区域(肿瘤内部和/或肿瘤浸润边缘)中，特定标记物阳性的免疫效应细胞的浸润程度越高。

(2)肿瘤-免疫抑相对距离比(re-Dist)：即计算免疫效应细胞(如CD8+)与肿瘤细胞(如PanCK+细胞)的相对距离、和免疫效应细胞(如CD8+细胞)与免疫抑制细胞(如FoxP3+细胞)的相对距离这两个相对距离的比值。

以具体例子进行说明，提取两组细胞类型(CD8+与PanCK+、CD8+与FoxP3+)的数据集，基于欧几里得距离算法计算两组数据集的欧几里得距离矩阵，分别取欧几里得距离的中位值作为两个数据集的相对距离；计算CD8+细胞与PanCK+细胞、和CD8+细胞与FoxP3+细胞两组数据的相对距离的比值，比值<1表示CD8+细胞与肿瘤细胞(如PanCK+细胞)更接近，而比值>1表示CD8+细胞与免疫抑制细胞(如FoxP3+细胞)更接近。

当CD8+细胞与肿瘤细胞更接近，代表CD8+细胞与肿瘤细胞之间产生相互作用的可能性越大，即CD8+细胞杀伤肿瘤细胞可能性越大；同理可得，CD8+细胞与免疫抑制细胞更接近，代表CD8+细胞与免疫抑制细胞之间产生相互作用的可能性越大，即CD8+细胞被免疫抑制细胞抑制可能性越大。

根据第二方面，本发明提供一种基于多重免疫组化技术的生物标志物分析装置，包括以下模块：

获取数据模块，用于获取肿瘤组织样本中目标区域的组织形态学、细胞表型以及对应的坐标数据，记为标准数据S；

提取关键信息列模块，用于提取标准数据S中的组织形态学分类列、细胞表型列、以及X坐标列和Y坐标列；所述组织形态学分类列包括tumor和non-tumor；

识别肿瘤边界细胞模块，用于通过Delaunay三角剖分算法构造Delaunay三角网，当其中任意两点之间的一端为肿瘤细胞，另一端为非肿瘤细胞，即识别为肿瘤边界细胞；

提取肿瘤边界细胞模块，用于将肿瘤边界细胞提取作为子集，映射至坐标系中；

定义肿瘤边缘细胞模块，用于将肿瘤边界细胞作为数据集A，将标准数据S作为数据集B，基于欧几里得距离算法获取数据B在数据A自定义半径范围内的细胞索引值，根据细胞索引值确定肿瘤边缘细胞；

注释细胞类型模块，用于将肿瘤边缘细胞注释为“Margin”标签，将组织形态列为“Tumor”且非“Margin”细胞注释为“Intra”标签，其余注释为“Other”标签，并将注释列添加至标准数据S中；

定量计算生物标志物模块，用于通过计算双阳性细胞评分、肿瘤-免疫抑制相对距离比中至少一种生物标志物实现对肿瘤组织样本的分析；其中，所述双阳性细胞评分是指对两种特定标记物阳性的免疫效应细胞分别在“Margin”标签区域和“Intra”标签区域中的占比进行评分；所述肿瘤-免疫抑制相对距离比是指计算在“Margin”标签区域和“Intra”标签区域中，免疫效应细胞与肿瘤细胞的相对距离、和免疫效应细胞与免疫抑制细胞的相对距离的比值。

需要说明的是，该生物标志物分析装置用于实现第一方面所述生物标志物分析方法，因此其包含分析方法中所应具备的全部功能模块。

根据第三方面，本发明提供一种计算机可读存储介质，该计算机可读存储介质中存储有被编程或配置以执行第一方面所述生物标志物分析方法的计算机程序。

根据第四方面，本发明还提供一种用于实施第一方面所述生物标志物分析方法的设备，包括：用于存储计算机程序指令的存储器，和用于执行所述计算机程序指令的处理器，其中当所述计算机程序指令被所述处理器执行时，所述设备运行第一方面所述的生物标志物分析方法。

有益效果：本发明提供一种新的生物标志物分析方法，即利用现有仪器所获取的数据进行开发，通过两种相关的生物标志物自动识别并对肿瘤微环境进行评估，解决了现有技术中肿瘤免疫治疗疗效评估缺乏足够生物标志物标记物的技术问题，使得肿瘤免疫微环境相关指标能够在更大规模更大范围内对免疫治疗疗效进行评估；同时，通过自动分析计算，可以有效减去医务人员和科研人员进行手动人工计算分析的繁杂工作，高效辅助医生和科研人员完成免疫组化多重标记后的各项免疫组化指标的分析。

附图说明

图1为本发明实施例中所述基于多重免疫组化技术的生物标志物分析方法流程图；

图2为一种实施例中通过三角剖分算法获取的肿瘤细胞边界信息图；

图3为一种实施例中基于图2所获取的肿瘤边界细胞示意图；(其中，

代表非肿瘤区“non-tumor”，+代表肿瘤区“tumor”)；

图4为一种实施例中基于图3所获取的肿瘤边缘信息图；(其中，●代表肿瘤内部“intra”；▲代表肿瘤边缘“margin”；■代表其他“other”)。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。其中不同实施方式中类似元件采用了相关联的类似的元件标号。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。

另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。

如图1所示，在本发明一种实施例中，该基于多重免疫组化技术的生物标志物分析方法用于非治疗诊断目的，具体包括以下步骤：

1.获取来自于每一受试者的肿瘤组织样本，对所述肿瘤组织样本进行多重免疫组化检测，通过扫描仪扫描获取相应的免疫组化显微全景图；

2.对每一张免疫组化显微全景图选择感兴趣区域作为目标区域，导入病理图像识别***，如inForm、QuPath等进行组织形态学与细胞表型识别分析，获得相应的组织形态学、细胞表型和对应空间坐标数据；

3.对每一受试者的免疫组化显微全景图目标区域的空间坐标数据进行生物标志物分析计算，得到每一受试者的生物标志物定量性数据，其包括以下步骤：

(1)开发环境：Rstudio，R(v3.6.1)

(2)加载R包：计算涉及以下R包，deldir,rtree,dplyr,data.table,plotrix,gridExtra,ggpubr,ggplot2,RColorBrewer,philentropy,flexclust,matrixStats,tidyverse,janitor，需安装完成加载R包；

(3)输入数据：以每一受试者的单一目标区域文件作为独立输入文件，其中包含组织形态学分类、细胞表型、XY轴坐标等数据，导入到Rstudio装置中，即获得标准数据S；

(4)提取关键信息列：包括组织形态学分类列(tumor和non-tumor，即肿瘤区和非肿瘤区)、细胞表型列(如免疫效应细胞(CD8+、CD68+、CD11c+)、免疫抑制细胞(FoxP3+、CD163+、CD11b+)和肿瘤细胞(PanCK+)细胞等)、X坐标列、Y坐标列；

(5)识别肿瘤细胞边界：基于Delaunay三角剖分算法构造Delaunay三角网，用于识别细胞(点)与细胞(点)的边界，其中两点之间一端为肿瘤细胞，另一端为非肿瘤细胞，即识别为边界细胞；

(6)提取肿瘤边界细胞：将步骤(5)识别的肿瘤边界细胞(点)单独提取作为新的子集，映射至坐标系，进行边界图例(如图3)展示；

(7)定义肿瘤边缘细胞：以步骤(6)提取的肿瘤边界细胞作为数据集A，标准数据S作为数据集B，基于欧几里得距离算法获取数据B在数据集A自定义半径范围(默认半径为30μm，可选半径建议在：10～300μm，具体以目标区域的肿瘤组织大小而定)内的细胞索引值，并根据细胞索引值获取肿瘤边缘细胞；

欧几里得距离函数表达式如下：

其中，X为点B(x1,y1)和点A(x2,y2)之间的欧几里得距离。

(8)注释细胞类型：根据步骤(7)获得的边缘区域细胞索引值进行肿瘤边缘细胞类型注释，将肿瘤边缘细胞注释为“Margin”标签(肿瘤边缘)，将组织形态列为“Tumor”且非“Margin”细胞注释为“Intra”标签(肿瘤内部)，其余注释为“Other”标签，将注释列添加至标准数据S中；

(9)进行生物标志物定量数值计算：

①双阳性细胞评分：即计算特定标记物阳性的两种细胞(如CD3+和CD8+细胞)在肿瘤内部(Intra)和肿瘤边缘(Margin)区域的占比，高细胞占比(默认超过1％为高占比)记为1分，否则记为0分。然后将两种特定标记物阳性的细胞分别在Intra和Margin的评分相加求和，得到双阳性细胞评分，分值范围0～4分。双阳性细胞评分分值越高，表示在两个区域(肿瘤内部和/或肿瘤浸润边缘)特定标记物阳性细胞的浸润程度越高。

②肿瘤-免疫抑制相对距离比(即re-Dist)：即CD8+T细胞与肿瘤细胞(PanCK+)的相对距离、和CD8+细胞和Treg细胞(FoxP3+)的相对距离的比值。提取两组细胞类型(CD8+T与PanCK+和CD8+与FoxP3+)的数据集，基于欧几里得距离算法计算两组数据集的欧几里得距离矩阵，分别取欧几里得距离的中位值作为两个数据集的相对距离；计算CD8+和PanCK+细胞与CD8+和FoxP3+细胞的相对距离的比值即为re-Dist，值<1表示CD8+T细胞与肿瘤细胞更接近，而值>1表示CD8+T细胞与Tregs细胞更接近。当CD8+T细胞与肿瘤细胞更接近，代表CD8+T细胞与肿瘤细胞之间产生相互作用的可能性越大，即CD8+T细胞杀伤肿瘤细胞可能性越大；同理可得，CD8+T细胞与Tregs细胞更接近，代表CD8+T细胞与Tregs细胞之间产生相互作用的可能性越大，即CD8+T细胞被Tregs细胞抑制可能性越大。

下面通过具体实施例对本申请技术方案进一步阐述。

实施例1：

本实施例中使用的样本是在本实验室检测的1例临床肺癌病人(Patient1)肿瘤组织样本。已完成对该患者肿瘤组织样本的多重免疫组织化学染色(如用于肺癌的7色MOTiF^TMPD-1/PD-L1 Panel试剂盒，包含靶向FoxP3、PD-L1、PanCK、PD-1、CD8、CD68的6种抗体)，用于标记荧光阳性细胞，并经过VECTRA POLARIS***进行全片扫描获取免疫组化显微全景图。通过Phenochart选取目标区域(包含肿瘤内部细胞、肿瘤边界细胞和基质细胞的区域)，导入inForm***，使用官方预定义的基于规则的肺癌算法获取组织形态学分类和细胞表型，导出数据用于生物标志物分析计算。

生物标志物分析步骤如下：

1.读取数据：导入“*cell_seg_data.txt”数据至Rstudio；

2.提取数据：提取关键信息列(包括：组织形态学分类列、细胞表型列、X坐标列、Y坐标列，对应列为"Tissue.Category","Phenotype","Cell.X.Position","Cell.Y.Position")作为标准数据S；数据示例如下所示：

3.识别肿瘤边界细胞：基于Delaunay三角剖分算法构造Delaunay三角网(如图2所示)，用于识别细胞(点)与细胞(点)的边界，其中任意两点之间一端为肿瘤细胞，另一端为非肿瘤细胞，即识别为肿瘤边界细胞，其空间坐标数据结果如下所示：

4.提取肿瘤边界细胞：将步骤3识别的肿瘤边界细胞(点)单独提取作为新的子集，映射至坐标系，进行边界图例展示(如图3所示)；

5.定义肿瘤细胞边缘区域：以步骤4提取的肿瘤边界细胞作为数据集A，标准数据S作为数据集B，基于欧几里得距离算法获取数据集B在数据集A半径30μm范围内的细胞索引值，根据细胞索引值获取肿瘤边缘细胞；

6.注释细胞类型：根据步骤5获得的细胞索引值进行肿瘤边缘细胞类型注释，将肿瘤边缘细胞注释为“Margin”(即肿瘤边缘)标签，将组织形态型列为“Tumor”(即肿瘤区)且非“Margin”细胞注释为“Intra”(即肿瘤内部)标签，其余注释为“Other”标签，将注释列添加至标准数据S中，如下表所示的肿瘤边界细胞坐标信息示例；另外将不同细胞类型进行图例展示(如图4所示)。

7.计算生物标志物数值：计算双阳性细胞评分，其中，双阳性细胞选取CD8+和CD68+细胞，计算CD8+和CD68+细胞二者分别在肿瘤内部(Intra)和肿瘤边缘(Margin)区域的占比，占比高于1％即记1分，评分结果如下所示，CD8+细胞在肿瘤内部区域和肿瘤边缘区域的占比均大于1，记2分，CD68+细胞在肿瘤内部区域和肿瘤边缘区域的占比也均大于1，记2分，因此最后双阳性细胞评分为4分，属于最高分，说明该患者的双阳性细胞(CD8+和CD68+)在肿瘤的浸润程度较高。

实施例2：

本实施例中使用的样本是在本实验室检测的另1例临床肺癌病人(Patient2)肿瘤组织样本。已完成对该患者肿瘤组织样本的多重免疫组织化学染色(7色6标：FoxP3,PD-L1,PanCK,PD-1,CD8,CD68)，并经过VECTRA POLARIS***进行全片扫描获取免疫组化显微全景图。通过Phenochart选取目标区域(包含肿瘤内部细胞、肿瘤边界细胞和基质细胞的区域)，导入inForm***，使用官方预定义的基于规则的肺癌算法进行组织形态学分类和细胞分型，导出数据用于生物标志物分析计算。

生物标志物分析步骤如下：

1.读取数据：导入“*cell_seg_data.txt”数据至Rstudio；

2.提取数据：提取关键信息列(包括：组织形态学分类列、细胞表型列、X坐标列、Y坐标列，对应列为"Tissue.Category","Phenotype","Cell.X.Position","Cell.Y.Position")作为标准数据S；关键信息列数据示例如下所示：

3.识别肿瘤边界细胞：基于Delaunay三角剖分算法构造Delaunay三角网(见图2)，用于识别细胞(点)与细胞(点)的边界，其中任意两点之间一端为肿瘤细胞，另一端为非肿瘤细胞，即识别为边界细胞；

4.提取肿瘤边界细胞：将步骤3识别的肿瘤边界细胞(点)单独提取作为新的子集，映射至坐标系，进行边界图例展示；

5.定义肿瘤细胞边缘区域：以步骤4提取的肿瘤边界细胞作为数据集A，标准数据S作为数据集B，基于欧几里得距离算法获取数据集B在数据集A半径为30范围内的细胞索引值，根据索引值获取边缘区域细胞；

6.注释细胞类型：根据步骤5获得的边缘区域细胞索引值进行肿瘤边缘细胞类型注释，将肿瘤边缘细胞注释为“Margin”标签，将组织形态型列为“Tumor”且非“Margin”细胞注释为“Intra”标签，其余注释为“Other”标签，将注释列添加至标准数据S中；

7.计算生物标志物数值：

1)计算双阳性细胞评分：其中，双阳性细胞选取CD8+和CD68+细胞，计算CD8+和CD68+细胞二者分别在肿瘤内部(Intra)和肿瘤边缘(Margin)区域的占比，占比高于1％即记1分，评分结果如下所示，CD8+细胞在肿瘤内部区域和肿瘤边缘区域的占比均大于1，记2分，CD68+细胞在肿瘤内部区域和肿瘤边缘区域的占比也均大于1，记2分，因此最后双阳性细胞评分为4分，属于最高分，说明该患者的双阳性细胞在肿瘤的浸润程度较高。

2)计算肿瘤-免疫抑制相对距离比即re-Dist：如下所示，re-Dist为1.13(re-Dist>1)，表示CD8+与肿瘤细胞(PanCK+)距离(CD8+/PanCK+距离为＝350.42)更远，与免疫抑制细胞(FoxP3+)距离(CD8+/FoxP3+距离为＝380.09)更接近，表明CD8+细胞更可能与免疫抑制细胞发生相互作用。

本领域技术人员可以理解，上述实施方式中各种方法的全部或部分功能可以通过硬件的方式实现，也可以通过计算机程序的方式实现。当上述实施方式中全部或部分功能通过计算机程序的方式实现时，该程序可以存储于一计算机可读存储介质中，存储介质可以包括：只读存储器、随机存储器、磁盘、光盘、硬盘等，通过计算机执行该程序以实现上述功能。例如，将程序存储在设备的存储器中，当通过处理器执行存储器中程序，即可实现上述全部或部分功能。另外，当上述实施方式中全部或部分功能通过计算机程序的方式实现时，该程序也可以存储在服务器、另一计算机、磁盘、光盘、闪存盘或移动硬盘等存储介质中，通过下载或复制保存到本地设备的存储器中，或对本地设备的***进行版本更新，当通过处理器执行存储器中的程序时，即可实现上述实施方式中全部或部分功能。

以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

Claims (11)

1.一种基于多重免疫组化技术的生物标志物分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：获取数据步骤，获取肿瘤组织样本中目标区域的组织形态学、细胞表型以及对应的坐标数据，记为标准数据S；

S2：提取关键信息列步骤，提取标准数据S中的组织形态学分类列、细胞表型列、以及X坐标列和Y坐标列；所述组织形态学分类列包括Tumor和non-Tumor，所述Tumor指肿瘤区，所述non-Tumor指非肿瘤区；

S3：识别肿瘤边界细胞步骤，通过Delaunay三角剖分算法构造Delaunay三角网，当其中任意两点之间的一端为肿瘤细胞，另一端为非肿瘤细胞，即识别为肿瘤边界细胞；

S4：提取肿瘤边界细胞步骤，将步骤S3中识别的肿瘤边界细胞提取作为子集，映射至坐标系中；

S5：定义肿瘤边缘细胞步骤，将步骤S4中提取的肿瘤边界细胞作为数据集A，将步骤S1中获取的标准数据S作为数据集B，基于欧几里得距离算法获取数据B在数据A自定义半径范围内的细胞索引值，根据细胞索引值确定肿瘤边缘细胞；

S6：注释细胞类型步骤，将肿瘤边缘细胞注释为“Margin”标签，将组织形态列为“Tumor”且非“Margin”细胞注释为“Intra”标签，其余注释为“Other”标签，并将注释列添加至标准数据S中；

S7：定量计算生物标志物步骤，通过计算双阳性细胞评分、肿瘤-免疫抑制相对距离比中至少一种生物标志物实现对肿瘤组织样本的分析；其中，所述双阳性细胞评分是指对两种特定标记物阳性的免疫效应细胞分别在“Margin”标签区域和“Intra”标签区域中的占比进行评分，具体是指对第一种特定标记物阳性的免疫效应细胞在“Margin”标签区域中的占比、在“Intra”标签区域中的占比，以及第二种特定标记物阳性的免疫效应细胞在“Margin”标签区域中的占比、在“Intra”标签区域中的占比进行评分；所述肿瘤-免疫抑制相对距离比是指计算在“Margin”标签区域和“Intra”标签区域中，免疫效应细胞与肿瘤细胞的相对距离和免疫效应细胞与免疫抑制细胞的相对距离的比值。

2.根据权利要求1所述基于多重免疫组化技术的生物标志物分析方法，其特征在于，所述双阳性细胞评分具体包括：分别计算CD8+、CD68+和CD11c+细胞中的任意两种免疫效应细胞分别在“Margin”标签区域和“Intra”标签区域中的占比，当超过预定细胞占比阈值时记1分，否则记0分，再将评分相加求和，得到双阳性细胞评分，分值为0~4分，分值越高说明这两种免疫效应细胞在“Margin”标签区域和“Intra”标签区域中的浸润程度越高；所述预定细胞占比阈值为1%~50%。

3.根据权利要求2所述基于多重免疫组化技术的生物标志物分析方法，其特征在于，所述免疫效应细胞包括CD8+、CD68+和CD11c+细胞中的至少一种；所述免疫抑制细胞包括FoxP3+、CD163+和CD11b+细胞中的至少一种。

4.根据权利要求3所述基于多重免疫组化技术的生物标志物分析方法，其特征在于，所述肿瘤-免疫抑制距离比具体包括：提取在“Margin”标签区域和“Intra”标签区域内的免疫效应细胞与肿瘤细胞、免疫效应细胞与免疫抑制细胞这两组细胞类型的数据集，基于欧几里得距离算法计算数据集的欧几里得距离矩阵，分别取欧几里得距离的中位值作为两个数据集的相对距离，计算免疫效应细胞与肿瘤细胞的相对距离和免疫效应细胞与免疫抑制细胞的相对距离的比值，比值大于1说明免疫效应细胞更靠近免疫抑制细胞，与免疫抑制细胞相互作用，比值小于1说明免疫效应细胞更靠近肿瘤细胞，与肿瘤细胞相互作用；其中，所述肿瘤细胞为PanCK+细胞。

5.根据权利要求1所述基于多重免疫组化技术的生物标志物分析方法，其特征在于，在步骤S5中，所述自定义半径范围为10~300μm。

6.根据权利要求5所述基于多重免疫组化技术的生物标志物分析方法，其特征在于，所述自定义半径为30μm。

7.根据权利要求1所述基于多重免疫组化技术的生物标志物分析方法，其特征在于，在步骤S1中，获取数据具体包括以下步骤：

对肿瘤组织样本进行多重免疫组化检测，通过扫描仪扫描获取相应的免疫组化显微全景图；

将免疫组化显微全景图中的目标区域导入病理图像识别***，并进行组织形态学与细胞表型识别分析，获得目标区域相应的组织形态学、细胞表型以及对应的坐标数据。

8.根据权利要求4所述基于多重免疫组化技术的生物标志物分析方法，其特征在于，所述细胞表型列中的细胞包括肿瘤细胞、免疫效应细胞和免疫抑制细胞；其中，所述肿瘤细胞为PanCK+细胞，所述免疫效应细胞包括免疫效应细胞包括CD8+、CD68+和CD11c+细胞中的至少一种，所述免疫抑制细胞包括FoxP3+、CD163+和CD11b+细胞中的至少一种；所述坐标系是指二维坐标系。

9.一种基于多重免疫组化技术的生物标志物分析装置，其特征在于，包括以下模块：

获取数据模块，用于获取肿瘤组织样本中目标区域的组织形态学、细胞表型以及对应的坐标数据，记为标准数据S；

提取关键信息列模块，用于提取标准数据S中的组织形态学分类列、细胞表型列、以及X坐标列和Y坐标列；所述组织形态学分类列包括Tumor和non-Tumor，所述Tumor指肿瘤区，所述non-Tumor指非肿瘤区；

识别肿瘤边界细胞模块，用于通过Delaunay三角剖分算法构造Delaunay三角网，当其中任意两点之间的一端为肿瘤细胞，另一端为非肿瘤细胞，即识别为肿瘤边界细胞；

提取肿瘤边界细胞模块，用于将肿瘤边界细胞提取作为子集，映射至坐标系中；

定义肿瘤边缘细胞模块，用于将肿瘤边界细胞作为数据集A，将标准数据S作为数据集B，基于欧几里得距离算法获取数据B在数据A自定义半径范围内的细胞索引值，根据细胞索引值确定肿瘤边缘细胞；

注释细胞类型模块，用于将肿瘤边缘细胞注释为“Margin”标签，将组织形态列为“Tumor”且非“Margin”细胞注释为“Intra”标签，其余注释为“Other”标签，并将注释列添加至标准数据S中；

定量计算生物标志物模块，用于通过计算双阳性细胞评分、肿瘤-免疫抑制相对距离比中至少一种生物标志物实现对肿瘤组织样本的分析；其中，所述双阳性细胞评分是指对两种特定标记物阳性的免疫效应细胞分别在“Margin”标签区域和“Intra”标签区域中的占比进行评分，具体是指对第一种特定标记物阳性的免疫效应细胞在“Margin”标签区域中的占比、在“Intra”标签区域中的占比，以及第二种特定标记物阳性的免疫效应细胞在“Margin”标签区域中的占比、在“Intra”标签区域中的占比进行评分；所述肿瘤-免疫抑制相对距离比是指计算在“Margin”标签区域和“Intra”标签区域中，免疫效应细胞与肿瘤细胞的相对距离的相对距离和免疫效应细胞与免疫抑制细胞的相对距离的比值。

10.一种计算机可读存储介质，其特征在于，所述计算机可读存储介质中存储有被编程或配置以执行权利要求1～8中任一项所述生物标志物分析方法的计算机程序。

11.一种用于实施根据权利要求1~8中任一项所述生物标志物分析方法的设备，其特征在于，所述设备包括：

用于存储计算机程序指令的存储器，和

用于执行所述计算机程序指令的处理器，

其中当所述计算机程序指令被所述处理器执行时，所述设备运行根据权利要求1~8中任一项所述的生物标志物分析方法。

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