CN1124343C - 由脑组织获得的神经营养因子 - Google Patents

由脑组织获得的神经营养因子 Download PDF

Info

Publication number
CN1124343C
CN1124343C CN90108380A CN90108380A CN1124343C CN 1124343 C CN1124343 C CN 1124343C CN 90108380 A CN90108380 A CN 90108380A CN 90108380 A CN90108380 A CN 90108380A CN 1124343 C CN1124343 C CN 1124343C
Authority
CN
China
Prior art keywords
bdnf
thr
lys
arg
ser
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
CN90108380A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1052142A (zh
Inventor
卡罗琳·海曼
拉尔夫·奥尔德森
乔治·扬科普洛斯
伊夫斯-阿伦·巴尔德
汉斯·弗里德里希·厄尔温·特伦
安德烈斯·霍恩
弗里德里希·洛斯派希
罗纳德·M·林赛
马格达莱娜·霍弗
约阿希姆·莱布洛克
戴维·埃德加
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Regeneron Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US07/400,591 external-priority patent/US5180820A/en
Application filed by Regeneron Pharmaceuticals Inc filed Critical Regeneron Pharmaceuticals Inc
Publication of CN1052142A publication Critical patent/CN1052142A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1124343C publication Critical patent/CN1124343C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/48—Nerve growth factor [NGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • F—MECHANICAL ENGINEERING; LIGHTING; HEATING; WEAPONS; BLASTING
    • F02—COMBUSTION ENGINES; HOT-GAS OR COMBUSTION-PRODUCT ENGINE PLANTS
    • F02B—INTERNAL-COMBUSTION PISTON ENGINES; COMBUSTION ENGINES IN GENERAL
    • F02B75/00—Other engines
    • F02B75/02—Engines characterised by their cycles, e.g. six-stroke
    • F02B2075/022—Engines characterised by their cycles, e.g. six-stroke having less than six strokes per cycle
    • F02B2075/027—Engines characterised by their cycles, e.g. six-stroke having less than six strokes per cycle four
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4709—Amyloid plaque core protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明涉及编码了脑源神经营养因子(BDNF)的核酸序列以及用这些核酸顺序大量制得的BDNF蛋白及其片段和衍生物。此外，本发明还涉及BDNF的药物组合物及治疗用途。第一次为临床使用提供了产生足够数量的，基本纯净的BDNF。在一个具体的实施例中，可以用BDNF来促进黑多巴胺能神经元和前脑底部胆碱能神经元的存活，从而分别为帕金森症和早老性痴呆症提供了一种治疗方法。本发明还涉及针对BDNF或其片段的抗体，从而提供了一种产生足量免疫原的方法。此外，通过对BDNF和NGF的核酸序列进行比较，本发明还为BDNF和NGF之间核酸序列的同源区域提供了识别方法，从而定义了BDNF/NGF基因族；本发明还提供了用于识别和分离该基因族中其它成员的方法。

Description

由脑组织获得的神经营养因子
                    1.引言
本发明涉及编码了由脑组织获得的神经营养因子(BDNF)的核酸序列、由其大量生产的基本纯的蛋白质，肽片段或衍生物、以及针对BDNF蛋白质，肽片段或衍生物的抗体。此外，本发明涉及一些基因，它们是新定义的BDNF/NGF基因族的成员，以及它们的基因产物。本发明还涉及含有有效量的BDNF基因产物或者针对BDNF基因产物的抗体的药物组合物，并涉及诊断和治疗各种神经疾病和功能紊乱、包括早老年性痴呆症(Alzheimer′s disease)和帕金森病(Parkinson′s disease)的方法。特别是，本发明的BDNF基因产物在多巴胺能神经元疾病如帕金森病和感觉神经元疾病以及视网膜退化性疾病的诊断和治疗中具有价值。
                  2.发明的背景
2.1.在神经***发展中神经细胞的死亡以及神经营养因子的作用
在脊椎动物神经***的许多地方，早期发育过程中所具有的神经元比成年动物所具有的要多得多。早期发育阶段的特征是自然出现神经元细胞死亡的高低起伏(Carr and Simpson，1978，J.Comp.Neurol.，182：727-740；Cowan等人，1984，Science 225：1258-1265)。发育中的神经元的存活、分化和成熟可以受环境或“后天”的因素调节的，而不是受严格的先天性遗传基因程序控制的。例如，小鸡胚胎的实验处理表明，在小鸡发育的早期移植或摘除诸如肢芽或眼睛这样的外周“靶区”会分别引起该被增大或减小靶区附近的感觉神经元、交感神经元、付交感神经元或运动神经元数目的相应增加或减少(Hamburger，1934，J.Exp.Zool. 68：449；Hollyday and Hamburger，1976，J.Comp.Neurol.， 170：311-321；Landmesser and Pilar，1976，J.Cell.Biol.， 68：357-374)。一个靶区只能支持有限数目的神经元，所以发育过程的一个正常组成部分可能删除过量的神经元以便和靶组织的“神经营养”能力相适应。发现和分离出目前被称之为神经生长因子(NGF)的蛋白质导致了一种分子学假设，说明靶组织是怎样能够调节使该组织存活并神经支配该组织的神经元的数目的(Levi-Montalcini等人，1968，Physiol Rev.， 48：524-569；Thoenen andBarde，1980，Physiol Rev.， 60：1284-1335)。
现已明确，至少在外周神经***中，神经元靶组织合成并释放有限量的各种神经营养分子，这些分子对于特定类型神经元的生存是至关重要的(Korsching and Thoenen，1983，Proc.Natl.Acad.SciU.S.A. 80：3513-3516；Heumann等人，1984，EMBO J. 3：3183-3189；Shelton and Reichardt，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81：7051-7955；Korsching and Theonen，1985，Neurosci.Lett.54：201-205)。
                    2.2神经生长因子
神经生长因子(NGF)最突出的特征就是这些神经营养分子，并在体外和体内已被表明，它对于小鸡和大鼠早期发育期间交感神经元的神经嵴产生的感觉神经元的生存是必不可少的(Levi-Montalciniand Angeletti，1963，Develop.Biol. 7：653-659；Levi-Montalcini等人，1968，physiol.Rev. 48：524-569)。已经发现，向正在发育的小鸡胚胎中注射提纯的神经生长因子(NGF)会引起脊柱感觉神经元和交感神经元的大量增生和肥大(Levi-Montalcini and Booker，1960；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 46：373-384；Hamburger等人，1981，J.Neurosci. 1：60-71)。相反，通过对新生大鼠每天注射抗NGF抗体以去除或隔离内源性NGF会伴随引起交感神经***的严重破坏(Levi-Montalcini and Booker，1960，Proc.Natl.Acad.Sci，U.S.A. 46：384-391；Levi-Montalcini and.Angeletti.1966，pharmacol.Rev. 18：619-628)。甚至在发育的更早期，通过向子宫注射抗体或者通过母体抗体被动的经胎盘的转移而接触NGF抗体，也表明会引起神经嵴产生的感觉神经元如脊神经感觉神经元和脊内侧三叉神经元的大量损失(Goedert等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 81：1580-1584；Gorin and Johnson，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 76：5382-5386)。直至最近，几乎所有对NGF的研究都集中于它在外周神经***中的作用，而现在似乎是NGF也影响中枢神经***中特定神经元丛的发育和保持(Thoenen等人，1987，Rev.physiol.Biochem.pharmacol. 109：145-178；Whittemore and Seiger，1987，Brain Res.Rev. 12：439-464)
成年雄小鼠下颌下腺中大量NGF蛋白质的意外发现(Cohen，1960，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 46：302-311)，以及，更早的在蛇毒中发现高水平的NGF(Cohen and Levi-Montalcini，1956，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 42：571-574)意外地提供了足够量的NGF，以允许对NGF进行生理学、蛋白质化学以及最近的分子生物学(即NGF和它的受体的分子克隆)研究。成年雄性小鼠唾液腺中大量的NGF的功能仍然不知道；但似乎是这种丰富的NGF来源在外周或中枢神经***的发育或维持方面不会起任何作用。在受NGF敏感神经元(那些显示出依赖NGF而生存、具有高亲和能力的NGF受体并能使NGF内化并能高特异性地逆行转运NGF的神经元)支配的靶组织中，已经发现，NGF稳定状态的可测定水平极其低，其范围是每克组织几微微克或毫微克，相比之下在成年雄性小鼠唾液腺组织中含量要高出千倍以上。在血清中还未发现任何可觉察到的NGF含量，因此NGF似乎不是一种循环的生长因子或激素(Suda等人，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 75：4042-4046)。
除了在鼠下倾下腺中大量NGF来源的重要发现之外，敏感，可靠和有效的生物测定的发展在阐明NGF的生物学和生化学方面也起了很大的作用。发育鸡胚胎中的背侧根神经节DRG就是被表明是在体外对NGF应答的基本神经元类型之一。在血浆凝块中，E8-E12鸡DRG的移出培养物，以及最近的鸡背侧根神经节(DRG的分离的神经元富集培养物被表明在NGF活性的生物测定(如在纯化过程中)和NGF生物学体外研究方面是非常有用的(Levi-Mon-talcini et.al.，1954，Cancer Res.4：49-57；Levi-Montalciniand Angeletti 1963，Develop.Biol.1：653-659；Greene，1977，Develop.Biol.58：96； ibid 58：106)。从单独一个鸡胚胎中可以解剖出四十多个DRG，致使在很多实验室中广泛利用。
除了可获得大量的NGF蛋白质和有效的NGF测定体系外，非常有助于我们理解NGF生物学特性的第三个主要因素就是能够相对容易地在豚鼠、兔子、羊等动物中培养NGF的抗体；看起来小鼠的NGF是高度致免疫的，Cohen(1960，proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.46：302-311)培养出了他已经从鼠下颌下腺中纯化的NGF的抗体，并且他与Levi-Montalcini和Booker一起表明(1960，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.46：384-391)。当每天给新生鼠施用这些抗体时会引起交感神经节的破坏，或者说“免疫交感神经破坏”(Levi-Montalciniand Angeletti，1966，Pharmacol.Rev.18：619-628)。
充裕的NGF蛋白质可以允许通过比较常规的蛋白质化学方法确定其基本序列(Angeletti and Bradshaw，1971，Proc.Natl.Acad.Sci.68：2417-2420)目前通过使用基本上是规范的分子生物学方法，根据可得到的小鼠NGF的蛋白质序列，设计合适的寡聚核苷酸探针，已经从许多种动物物种，包括小鼠(Scott et al.，1983，Nature302：538-540)人(Ullrich et al，1983，Nature 303：821-825)，牛和鸡(Meier et al.，1986.EMBO.J.5：1489-1493)，以及大鼠(Whittemore et al.，1988，J.Neurosci.Res.，20：402-410)中克隆去NGF基因、可获得充足的NGF也大大地促进了对NGF受体的研究，最终导致了人和大鼠NGF受体的分子克隆(Johnsonetal.，1986，Cell，47：545-554；Radeke.et al.，1987，Nature325：593-597)。
现在已经非常清楚NGF不是一种普遍存在的神经营养因子。正如体外和体内研究所确定的那样，在外周神经***中，NGF似乎不是副交感神经元、神经基板产生的感觉神经元或肠神经元的生存因子。而且，尽管运动神经元的确在发育过程中似乎确实表现出至少一种NGF受体的低亲合形式(Raivich et al.，1985，EMBO J.4：637-644)，但是NGF似乎也不是这些发育中的运动神经元的一种生存因子(Oppenheim，1982.J.Comp.Neurol 210：174-189)。NGF对于这些神经元类型不起作用，促使去探索其他的神经营养因子，尤其是能够维持脊髓运动神经元和/或睫状神经节中的交感神经元生存的因子。
              2.3.其他神经营养因子
在过去十年中，有许多关于在很多种不同组织的提取物中和在很多不同细胞类型的条件培养基中的神经营养活性的报导。不过几乎在所有的报导中，由于这种活性物质的极小量，即每克组织的微微克到毫微克的范围之间存在，这些活性成份的进一步纯化和特征分析被阻止不前。
再者，尽管对于外周神经元已经建立了适当的生物测定方法，但是设计出用于中枢神经***神经元的可靠的，可重复的和特异的测定方法仍然悬而未决。虽然各类型的外周神经元以分散的，容易分离的神经节形式存在，但中枢神经***(CNS)神经元在其分布中总是高度不均一的。因此，在识别和富集特定种类的中枢神经***(CNS)神经元时需要特异的标记物。产生这种标记物的方法中，如针对细胞表面或细胞骨架成份的抗体或特异性组织学染剂的进展是非常有限的。因此，要对那些(i)不如NGF丰富，(ii)难于测定，和(iii)不能以足以进行抗体生产的量获得的神经营养因子进行表征，已经证明是一种极其困难的过程。
2.3.1.脑源神经营养因子(BDNF)与神经生长因子的比较
在培养有大鼠C-6神经胶质瘤细胞的“条件培养基”中已识别出能够在体外维持胚胎鸡背侧根神经节神经元生存的神经营养活性(Barde et al.，1978，Nature 274：818)。这种活性不能被小鼠NGF的抗体所抵消，表明在这种条件培养基中存在着另外一种神经营养因子。之后，又有报导在正常成年大鼠脑的星形胶质细胞的培养物中(Lindsay，1979，Nature 282：80-82；Lindsay et al.，1982，Brain Res.243：329-343)和在发育中的及成年大鼠脑的提取物中(Barde.et al.，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77：1199-1203)以及在发育中的和成熟鸡脊柱索的提取物(Lindsay and Peters，1984，Neurosci.12：45-51)中存在有不能被NGF抗体阻断的相似活性。不过均没有分离或识别出这种活性因子，而且所发现的活性归于相同还是不同的因子仍然是一个问题。
使用猪脑做为起始材料，Barde等人(1982，EMBO J.1：549-553)报导了一种目前称之为脑源神经营养因子(BDNF)的因子，这种因子似乎对由E10/E11鸡胚胎得到的背侧根神经节神经元的存活有促进作用，发现这种神经营养活性存在于一种高碱性的蛋白质中(等电点，PI＞10.1)，它在硫酸十二烷基钠(SDS)凝胶电泳中表现为一个12.3KD分子量的单一迁移谱带。这种纯化因子估计是1.4×108，但是产量非常低，1.5公斤猪脑中仅提纯得到大约1μg的BDNF。再者，由于纯化过程的最后一步是制备凝胶电泳，由于存在有残余的硫酸十二烷基钠(SDS)，BDNF活性不能够完全地重新恢复活性(Barde.and Thoenen，1985，in“Hormones and Cell Regulation，”，Vol.9，Dumont.et al.，eds.Elsevier Science Publishers，PP.385-390)。已经注意到BDNF的这种强碱性和分子大小非常类似于NGF的单体，BDNF似乎具有不同于NGF的已知的性质的特性，因为(a)在鸡背侧根神经节的生物测定中，NGF的抗体对于BDNF的生物学活性没有明显的影响，(b)BDNF和NGF的作用似乎是叠加的；以及(c)不象NGF，发现BDNF对于E12鸡交感神经元的存活没有影响。除此以外，在用脑提取物的早期研究中发现，这种来源的神经营养活性似乎比与NGF相关的活性在发育的更后期对感觉神经元起作用。运用在一种多阳离子基质如聚赖氨酸或聚鸟氨酸上培养的鸡胚胎神经元的分离培养物，发现BDNF对多于30％的E10-11(胚胎期10或11天)背侧根神经节神经元的存活起支持作用，但是看起来，对于E6同样神经元的生存没有什么影响(Barde et al.，1980，Proc.Natl.Acad.U.S.A.77：1199-1203 Supra)。在相似条件下，NGF支持30-40％的E6DRG神经元的存活。有趣的是，后来发现当在一种用细胞外基质糖蛋白层覆盖的基质上培养时，NGF和BDNF二者都支持来自胚胎期E6-E12鸡胚胎大约51％的DRG神经元的存活。(Lindsay et al.，1985，Develop.Biol112：319-328)。在后来的研究中，发现当NGF和BDNF二者都以饱和浓度存在时，其作用是相加的。
Levi-Montalicni对于NGF的神经元特异性早期研究(1966The Harvey Lectures 60：217-259)指出，即使对于感觉神经元NGF也不是一种普遍存在的神经营养因子，因为，对于鸡的某些颅感觉神经节，尤其是第十颅神经的结状神经节的神经元，NGF似乎没有作用。后来体内研究(Johnson et al.，1980，Science 210：916-918；Pearson et al.，1983，Develop，Biol.96：32-36)表明，在胚胎发生过程中NGF的缺乏对于大鼠的大多数颅感觉神经节中神经元的存活没有影响，而同样的处理可以大大地减少了由神经脊得到的感觉神经节中神经元的数目。更为详细的体外研究(Lindsay and Rohrer，1985，Develop.Biol.112：30-48，Davies and Lindsay，1985，Develop.Biol.111：62-72；Lindsay et al.，1985，J.Cell.Sci.Suppl.3：115-129)清楚地表明，NGF对于大多数的神经脊产生的感觉神经元的存活有支持作用，但对于由神经基板得到的颅感觉神经元的存活没有明显的作用。
对于与NGF明显不同的BDNF神经元特异性的最早论证是：在体外证明了纯化的BDNF对于E6，E9或E12，鸡胚胎的神经基板得到的结状神经节中分离出的感觉神经元的40-50％有支持其存活的作用(Lindsay et al.，1985，J.Cell.Sci.Supp.3：115-129)。无论是用NGF本身或者与BDNF的结合，NGF这些神经元没有明显的作用。后来在移出培养研究中发现BDNF似乎对于其他神经基板产生的感觉神经节，包括岩神经节，膝状神经节和腹处侧三叉神经节的轴空长出和存活具有支持作用(Davies.et al.，1986，J.Neurosci.6：1987-1904)，而这此神经节中没有一个发现对NGF敏感。在上述所有研究中NGF的抗体对于所观察到的BDNF活性没有影响，除了对来自外周神经节的培养神经元有影响外，发现BDNF能刺激由鹌鹑神经脊培养出的细胞神经元的分化和生长。(Kal-cheim and Gendreau，1988，Develop.Brain Res.41：79-86)。
在本发明之前，由于不能够产生足够量的用于免疫接种的BDNF，阻止了生产抗BDNF的抗体，以便在它们对神经元群的作用上与抗NGF抗体相比较，也无法进行BDNF/NGF交叉中和实验。不过用BDNF进行的两项最近研究(Kalcheim et al.，1987，EMBOJ.6：2871-2873；Hofer and Barde，1988.Nature 331：261-262)已经表明了BDNF在鸟PNS发育中的一个生理作用。如果将一个机械屏障置于卵中E3/E4 DRG(胚胎3天或4天的背侧根神经节)和神经管中它们的中枢神经***(CNS)靶之间，观察到许多背侧根神经节(DRG)神经元死亡(Kalcheim and Le Douarin，1986，Develop.Biol.116：451-466)。据推测这种神经元的死亡是由于缺乏一种中枢神经***(神经管)产生的神经营养因子。之后发现连接到一种昆布氨酸覆盖的唾液腺膜(Sialastic membrane)上的BDNF可以防止这种细胞的死亡(Kalcheim et al.，1987.EMBOJ.6：2871-2873)。已经发现把BDNF注射到发育中的鸟蛋中可以减少在结状神经节中自然出现的细胞死亡，而NGF不具有这种作用(Hofer and Barde，1988，Nature 331：261-262)。BDNF除了对神经脊和神经板来源的外周感觉神经元有影响外，还发现它对发育中的中枢神经***(CNS)神经元的存活有支持作用。Johnson等人(1986，J.Neurosci 6：3031-3938)提供数据表明BDNF对由E17大鼠胚胎培养的视网膜神经节细胞的存活有支持作用。这和以前的研究所显示的由视网膜神经节细胞靶区制备的脑组织提取物和条件培养基对这些神经元的生长有支持作用是一致的(McCaffery etal.，1982，Ex.Brain Res.48：37-386；Sarthy et al.，1983，J.Neurosci.3：2532-2544；Turner et al.，1983，Dev.Brain Res.6：77-83).
除了在培养基中对发育中的神经元的生存有影响外，BDNF还显示出对于培养成熟的外周和中枢神经***神经元有作用。虽然成熟的感觉神经元似乎不需要神经营养因子可在体外维持3或4周，但是BDNF以及NGF已表明在培养基中刺激成熟的大鼠DRG神经元的轴突再生(Lindsay，1988，J.Neurosci.8：2394-2405)。而且在成熟大鼠视网膜的培养物中，发现BDNF可以促进视网膜神经节细胞的生存和轴突的伸长(Thanos et al.，1989，Eur.J.Neurosci.1：19-26)NGF和BDNF的生物学效应的比较见表I。
                    表I
BDNF和NGF生物学活性的比较*
                                       存活**
外周神经***                        BDNF    NGF(i) E6鸡背侧根神经节                   -      ++
E10鸡背侧根神经节                  -      ++
E12鸡交感神经元                    -      ++(ii)E6-E12鸡背侧根神经节              ++     ++
E6-E12鸡结状神经节                ++     -
E12鸡交感神经元                    -      ++
E12鸡睫状神经节                    -      -
(Lindsay et al.，1985，Supra.)(iii)E3-E14鸡：
颈静脉神经节                        +/++   ++
背内侧一三叉神经节                  +/++   ++
岩神经节                            +/++   -
膝状神经节                          +/++   -
腹外侧一三叉神经节                  ++     -
前庭神经节                          -      -
中脑神经节                             ++    -
(Davies et al.，1986 Supra)
(Barde et al.，1987.prog.Brain Res.，71：185-189).
中枢神经***
(i)E17鼠视网膜神经节细胞              ++    -
(Johnson et al.，1986，J.Neurosci.6：3031-3038)
*按照出版物日期先后顺序；体外试验的效果。
**无存活：(-)；中等存活(+)；良好存活(++)。
        2.3.2脑源神经营养因子的神经靶
已经发现外周神经节的感觉神经元是由两个截然不同的，过渡的胚胎结构即神经嵴和神经基板之一发育而来。神经嵴似乎可以产生自主神经节和脊神经感觉神经节即背侧根神经节(DRG)的神经元和卫星细胞，已经使用由Le Douarin设计的鸟/鸡嵌合体移植体系研究了神经嵴和神经基板对脑神经感觉神经节形成所起的作用(Le Doua-rin，1973，Develop Biol.20：217-222；Noden，1978，Develop.Biol.67：313-329；Narayanan and Narayanan，1980，Anat Rec.196：71-82；Ayer-Le Lievre and Le Douarin，1982，Develop.Biol.94：291-310；D′Amico-Maratel and Nodem，1983，Am.J.Anat.166：445-468)。正如Lindsay等人所指出的(1985，J.Cell.Sci.Supp.3：115-129)，目前相信，至少对于鸟类来说，第七，第九和第十脑神经的末梢神经节(分别为膝状神经节，岩神经节和结状神经节)的神经元和第八脑神经的前庭听神经结合体的神经元只是由神经基板产生的。第五脑神经的三叉神经节包含有源于神经嵴和神经板的神经元(在上下颌叶的腹外侧板上神经基板产生的神经元占优势)，而所有脑神经节的卫星细胞都被发现是源于神经嵴的。
通过使用脊神经和脑神经感觉神经元的移出物和分离的神经元富集培养物进行的体外实验发现，由神经嵴来源的感觉神经元对NGF有反应；相反，由神经基板产生的神经元(包括三叉神经节腹外侧部分的神经元和前庭神经节、膝状神经节，岩神经节和结状神经节的全部神经元群)在整个胚胎发育过程中对NGF基本上没有应答反应，对照它们的需要和对NGF的应答所表现出的差别，发现神经基板和神经嵴产生的感觉神经元(表I)对BDNF的存活和轴突促进活性都是敏感的(Lindsay，et al.，1985，J.Cell.Sci.Supp.3：115-129；Lindsay et al.，1985，Develop.Biol.112：319-328；Kal-cheim and Gendreau.1988.，(Develop.Brain Res.41：79-86)。Tebar和Barde(1988，J.Neurosci.8：3337-3342)研究了放射性标记的BDNF对鸡胚胎背侧根神经节神经元的结合参数；他们的研究结果与有两类BDNF受体存在是一致的。一类对BDNF表现出高亲合性，而另一类则表现出低亲和性。在交感神经元中没有发现高亲和性受体。
Barde等人对BDNF已知的神经元靶进行了进一步的论述(1987，Prog.Brain Res.71：185-189)。在本发明之前，由于缺乏专对BDNF特异的核酸或抗体探针，细胞合成BDNF的鉴定一直不是一件容易的事情，企图制备BDNF的多克隆或单克隆抗体一直没有成功。这种在获得抗体方面的失败阻碍了BDNF的分子克隆化、在体内去除发育中的BDNF神经元之生理学效应的测定、运用免疫测定法对组织中BDNF的定量测定，以及运用免疫细胞化学法对BDNF的定位。
                  表II
      BDNF应答和非应答神经元*概况：
A：应答神经元：
I：在以下各处的源于神经嵴的鸡感觉神经元。
 (a)背侧根神经节
 (b)颈静脉神经节
 (c)背内侧三叉神经节
 (d)中脑三叉神经节**
II：在以下各处的源于外胚层基板的鸡感觉神经元：
 (a)结状神经节
 (b)前庭神经节
 (c)岩神经节
 (d)膝状神经节
 (e)腹外侧三叉神经节
III：大鼠视网膜神经节细胞
B：不应答神经元
I：鸡和大鼠的交感神经元
II：鸡副交感睫状神经元
*：来自Barde et al.，1987，Prog.Brain Res.71：185-189
**：见Davies et al.，1986，Nature 319：497-499.
                 3.本发明的概述
本发明涉及编码了脑源神经营养因子(BDNF)的核酸顺序，由其大量生产的基本纯化的蛋白质，肽片段或衍生物和针对BDNF蛋白质、肽片段、或衍生物的抗体。本发明首次使制备足够量的BDNF成为可能，以致能够生产抗BDNF的抗体和保证BDNF的诊断和治疗应用。
在本发明的各种实施例中，BDNF核酸、蛋白质、肽、衍生物或本发明的抗体可以用于各种神经疾病的紊乱的诊断和治疗方法中，尤其是用于感觉神经疾病和视网膜退化的诊断和治疗中。而且，在本发明的一些具体实施例中，BDNF核酸或BDNF基因产物可以用于诊断和治疗成神经细胞瘤肿瘤，帕金森氏病和阿尔茨海默氏病(早老性痴呆)。在本发明的其他一些具体实施例中，BDNF基因产物也可以用来促进植入物结合到神经组织内，或者，用于促进由于创伤、梗死、感染或手术后引起损伤后的神经再生。
本发明还涉及到含有有效量的BDNF基因产物或者作为另一种选择含有针对BDNF基因产物的抗体的药物组合物，这种组合物可用于诊断或治疗各种神经疾病和紊乱。
另外通过给出BDNF完整的核苷酸序列，本发明可以对BDNF和NGF基因进行比较，籍以识别出同源区，并且定义一种BDNF/NGF基因族。因此，本发明涉及到一种BDNF/NGF基因族其他成员的识别方法。在某一个具体的实施例中，本发明的该方法用于识别BDNF/NGF基因族的一种新的，非NGF，非BDNF的成员。本发明进一步提供根据所公开的方法和他们的基因产物鉴定出的BDNF/NGF基因族中的其他成员。
               3.1.缩略语及定义
BDNF：是脑源神经营养因子
hBDNF：人的脑源神经营养因子
CAT：胆碱乙酰基转移酶
CNS：中枢神经***
DRG：背侧根神经节
EDTA：乙二胺四乙酸
NGF：神经生长因子
PBS：磷酸盐缓冲的盐水
PCR：聚合酶链反应
PNS：外周神经***
SDS：硫酸十二烷基钠
Tris：三羟甲基氨基甲烷
                 4.附图的说明图1：猪的前体BDNF cDNA的核苷酸序列和推断的氨基酸序列.在这个图中表示了两个重迭cDNA克隆的完整顺序。底部划线的是由微定序(表III)得到的肽顺序。底部划双线表示N-糖基化下仅有的一致顺序。成熟BDNF序列的起点以双克拉(Carat)标记。图2：NGF和BDNF之间的顺序比较。在相同位置上有两个以上氨基酸的区域已经标出。该顺序的成熟蛋白质的第一个氨基酸起始并且在终止密码子之前的最后一个氨基酸结束。五十一个氨基酸为BDNF和各种NGFs所共有的(Schwarz.et al.，1989，J.Neuro-chem.52：1203-1209)，包括6个半胱氨酸残基。图3：大肠杆菌(EcoRI)切割的人、猴、大鼠、小鼠、狗、牛、兔、鸡和酵母基因组DNA，与32P-标记的NGF和BDNF探针杂交后的Southem印迹的放射自显影照片。图4：Northern印迹分析。取每种组织20μg总量的RNA置于每条通道上，并与32P-标记的cRNA小鼠BDNF探针进行杂交。注意用脑组织在大约1.45KB处可以看到一个强的信号，而用其他七种被分析的组织则没有。图5：人的BDNF cDNA序列和推断的氨基的顺序，以及猪、鼠和鸡的DNA序列的比较。图6：BDNF的表达质粒pCMVI-pBDNF。图7：(a)运用一系列的抗血清稀释液，进行抗血清与B5肽结合的ELISA测定结果。
(b)各种抗血清1∶500的稀释液与50ng BDNF结合的定量测量。图8：对用BDNF处理的(阴影线条)和对照组(实线条)的前侧中脑培养物中的酪氨酸羟化酶进行免疫组织化学染色的结果。图9：由前侧中脑组织培养物摄取的多巴胺。添加BDNF的培养物以阴影线表示；而对照组培养物以实线条表示。图10：(a)在前脑胆碱能神经元培养物中，BDNF胆碱乙酰基转移酶(CAT)阳性细胞数目的影响。
(b)用150ng/ml和NGF，以每孔260,000个细胞(黑条)或每孔150,000个细胞(阴影线条)的密度对前脑胆碱能神经元培养物进行处理。对用NGF处理和未处理细胞中的胆碱乙酰基转移酶(CAT)免疫阳性细胞的数目进行比较。图11：CAT酶活性度量的变化与前脑胆碱能神经元培养物中BDNF浓度的函数关系，CAT酶活性大小以每分钟被催化底物的微微摩尔数计算。图12：用(a)表皮生长因子，或者(b)BDNF对星形神经胶质细胞培养物以大约60％的融合率进行处理42小时，然后与[3H]甲基胸腺嘧啶脱氨核苷一起进行保温培养，测定相对于EGF和BDNF浓度的3H结合量。图13：与BDNF/NGF探针RIB/2C杂交的EcoRI切割的鸡、小鼠、大鼠的Southern印迹图。NGF和BDNF基因组的EcoRI片段的位点分别以N和B表示。图14：NGF和BDNF与BDNF/NGF族中新成员的顺序比较，这种新成员是运用Box3/Box4引物通过聚合酶链反应从小鼠DNA中识别出的，所说的Box3/Box4引物是一种新的基因[这里被表示为M3/4]，也被称之为神经营养素-3(NT-3)，只表示编码链的顺序和推断出的相对于成熟小鼠NGF和成熟猪，大鼠，小鼠，或人BDNF排齐的氨基酸顺序。破折线(---)表示NGF中缺失一个密码子的位点，这种缺失被用来使相对于BDNF和M3/4的排列最佳化。斜体字母表示氨基酸顺序和/或保守的氨基酸取代物的配对物。图15：由各种人类肿瘤得到的细胞系中制备的RNA与BDNF人探针杂交后进行的Northern印迹反应。图16：海马神经元中BDNF-mRNA水平的去极化作用。
(a)在有50mMKCl存在的情况下，BDNF-mRNA在海马神经元起初培养物中表达的时间过程。从0.5×106个细胞中提取总的细胞RNA，使其乙醛酸化并在1.3％的琼脂凝胶上通过电泳进行分析(Biziere，K.and Coyle，T.，Neurosci.，1978，Lett.8：303；Mc Geer et al.，1978，Brain Res.139：381)。将转移到Hybond N滤纸上的RNA和通过体外完全(run-off)转录制备的对小鼠BDNF有特异性的32P-标记cRNA探针(特异活性，109cpm/μg)进行杂交。两条上谱带(4和1.5KB)与BDNF-mRNA相对应；BDNF的这两条谱带(4Kb和1.5Kb)是RNAse A-抗性的，并且代表了两种不同的转录，不过两种转录似乎以相似的方式被调节，下面部分(700bp)代表在RNA提取之前加到样本内的10pg的短时间的BDNF-mRNA恢复标准液。
(b)钙依赖性。将神经元分别在正常培养基(cM)无钙的修饰培养基(-Ca)或含有10μM硝苯吡啶的培养基(NIF)中培养3小时，标明(+K)的加50mMKCl。图17：钾和卡因酸对海马神经元中NGF-mRNA含量的增加。将神经元在对照培养基(C)中或在有50mMKCl(K+)或有25μM卡因酸(KA)存在的培养基中培养3小时。提取RNA并且通过定量聚合酶链反应(PCR)(11)测定NGF-mRNA的含量，其数值是平均数±SEM(n＝6)图18：卡因酸作用的剂量反应曲线。将海马神经元在有各种不同浓度卡因酸存在的情况下培养3小时，提取RNA并且用如图16所述的方法进行分析，数值代表三次实验的均数±SEM。图19：经卡因酸处理后BDNF-和NGF-mRNA含量增加的时间历程。在腹膜内注射卡因酸(12mg/Kg)后所标示的时间(以小时计)上从海马(a)或脑皮层(b)中提取总的细胞RNA，并按照图16所说的方法进行分析。在注射卡因酸后90分钟注射单独一次剂量的安定(10mg/Kg)[BDNF的这两条谱带(4Kb和1.5Kb)是RNAse A-抗性的，并且代表了两种似乎以相似方式调节的不同转录]。图中表示了对应于1.5Kb BDNF-mRNA(0)和1.3Kb NGF-mRNA(0)的测定值。对于4Kb BDNF-mRNA也观察到类似的增加现象。所给数值代表3至4次实验的平均值±SEM。图20：抗惊厥药对卡因酸诱导的BDNF-mRNA表达的影响。对大鼠腹膜内注射安全(10mg/Kg)(DZ)；在注射卡因酸(12mg/Kg)(+KA)或生理盐水(对照)之前15分钟注射MK-801(1mg/Kg)(MK)或氨基酮(20mg/Kg)(KET)。三小时后用海马组织按图16所述的方法制备总RNA。数值代表3次实验的平均值±SEM。图21：中隔细胞的培养
A-F。培养基中细胞生长时间历程的阶段对照显微照相，将细胞按照说明书中所述方法以1.3×(105)个细胞/cm2的密度置于平板上，保持在5HS/NS中。记录时间为节1(A，B)，2(C，D)和4(E，F)天。用细胞类型特异性标记物来识别细胞群，Ach E组织化学染色的神经元(G，H)和NGF-受体免疫阳性神经元(I)。标尺长度(Scale bar)＝25μm。图22：根据AChE细胞数目比较分离的中隔细胞对BDN或NGF处理的响应情况。
A：比较对BDNF(25ng/ml)NGF(50ng/ml)或者对二者以不同分布密度结合的响应。
(B)：比较胆碱能神经元对不同BDNF或NGF浓度范围(0-50ng/ml)的响应。获得这些结果所用的细胞要在含有血清的培养基中生长11-12天的时间。数据点代表6-9次测定值的均数±SEM。图23：直条图表示向分离的中隔细胞培养物中推迟加入BDNF或NGF所产生的效果。将BDNF(50ng/ml)或NGF(50ng/ml)在推迟5-6小时(+12)，5天(-5/+7)或7天(-7/+5)后加入到分离的细胞培养物中。将培养物保持12天。根据AChE阳性组织化学染色对细胞计数。所得结果以4到5次测定值的均数±S.E.M表示。图24：直条图表示BDNF或NGF对NGF-受体免疫阳性细胞数目的调节能力。
运用1∶1000的单克隆抗体192-IgG稀释液对NGF-受体进行免疫结合反应.(immunoslating)，将分离的中隔细胞以1.3×(105)个细胞/cm2的密度进行平板培养并连续处理12天。在饱和剂量的NGF和不同剂量范围的BDNF(0-100ng/ml)之间进行比较。所得结果是同等于4的均值±S.E.M.图25：中隔胆碱能神经元对BDNF(A)和NGF(B)的CAT诱导活性的剂量反应曲线。
将培养物涂覆于聚鸟氨酸和昆布氨酸覆盖的6mm孔上并在5HS/N3中保持12天。在涂覆后5-6小时将细胞与BDNF或NGF接触。每3天在更换培养基时更换一次这些因子。所得结果代表5-6次测定值的平均值±S.E.M.图26：BDNF和NGF对ACh E酶活性的剂量响应的影响。
将大鼠的中隔胆碱能神经元在含有血清的并且加入激素的培养基中生长12天。按照图25所述的方法用BDNF(空方框表示)和NGF(实框表示)对细胞进行处理。所得结果是同等于6-9的平均值±S.E.M.。未处理培养物中的AChE活性是16.4±2nmol/小时/孔。图27：由BDNF和NGF诱导的CAT酶活性增加的时间历程。
以密度为2.3×(105)个细胞/cm2涂覆的并在含有血清和加入激素和外源性因子的培养基中生长不同时间的细胞进行一定时间的CAT活性激活。在涂覆5-6小时后将这些细胞初次和BDNF(空方框表示)或NGF(实方框表示)接触。所得结果代表处理培养物和未处理培养物中所能测活性的百分比(n＝6)，BDNF12天n＝3)。图28：比较神经胶质细胞对BDNF诱导CAT酶活性能力的影响。
将中隔细胞以2.3×(105)个细胞/cm2的密度平板培养。在培养5-6小时后，将培养基换成一种不含血清或一种含血清但都含有如本发明书中详细说明的1％N3的培养基。为了进一步减少星形细胞数目在24小时期间加入胞嘧啶***糖苷(1μM)。然后将培养物保持12天。所得结果代表4次测定值的均值±S.E.M.图29：直条图表示BDNF或NGF处理对高亲合性胆碱摄入水平的影响。在以密度为1.3×(105)个细胞/cm2涂覆后对培养了11天的细胞进行胆碱摄入。在整个培养期间有BDNF(50ng/ml)和NGF(50ng/ml)存在。数据代表BDNF的5次测定以及NGF的10次测定值的平均值±S.E.M.图30：用胰蛋白酶和蛋白内切酶Arg-C对人脑源神经营养因子进行酶切割，得到的35S-标记的反应产物进行SDS page鉴别。图31：通过DRG生物测定法比较由蛋白内切酶切割的CHO-hBDNF和未处理的CHO-hBDNF的图解说明。在0到5之间计分评价轴突的生长情况，5分代表最大生物活性。图32：在培养基中9天后用酪氨酸羟化酶(TH)的单克隆抗体染色的E14大鼠前侧中脑细胞的分离培养物的相衬显微照相(A)和光亮背景(B.C)显微照相。
A和B，对同一区域的相衬和光亮背景摄影表明在这些培养物中TH+神经元很少。在含有很多由光亮图像代表的轴索神经元的区域中只发现一个TH+神经元(箭头所指)。通过形态学研究或GFAP染色(没有表示出)显然没有多少非神经元细胞。
C.在含有大约98个神经元形态学光亮相图像细胞的区域中，显示了两个TH+神经元(小箭头所指)光亮区域照片，标尺＝1001M。图33：E14大鼠前侧4脑细胞的6天培养物的高倍显微摄影它表示了TH+神经元的各种不同形态，有些有大量的轴突生长和非常精细的生长锥体(A.B)。培养物的制备和染色按照图32的说明所描述的进行。标尺＝25μM。图34：BDNF以与剂量有关的方式对培养周期长于3天以后在培养基中的TH+多巴胺能的中脑神经元的存活有明显的促进作用。
A：有BDNF(黑色直条)或没有BDNF(空白直条)维持的E14大鼠前侧中脑培养物中TH+神经元的数目的比较。在被处理的培养基中，在培养第2天一次加入BDNF(50ng/ml)。在第3天时对照培养物和实验处理培养物之间没有发现差异，但是，在第8天用BDNF处理的培养物中TH+神经元的数目比对照培养物高1.8倍。其数值是两份同样样本的平均值。
B：BDNF增加TH+神经元存活的作用是与剂量有关的。对没有BDNF的培养基或含有在第2天加入BDNF而增加浓度的培养基中培养8天后，测定一种培养基中TH+神经元的数目。
C：NGF对TH+神经元的生长没有影响。
为了确定BDNF的特异性，培养物还在有或没有NGF(50ng/ml)存在的条件下培养8天，并分析其TH+细胞，在第6天或第8天检查培养基，发现在第2天加入的NGF并不增加培养基中TH+神经元的生长。所得结果为两个培养皿的平均值。图35：与在第2天单独一次加入BDNF比较，重复剂量的BDNF还会进一步增加TH+神经元的生长。
按照本说明书的描述制备培养物，从CosM5细胞上清液中纯化重组体人BDNF，将培养物在第2天时一次加入(SA；点画直条表示)BDNF(50ng/ml)进行处理，或者在第1，2，4，6和8天时用重复剂量的BDNF(50ng/ml)进行处理(MA-多次加入；实体直条表示)，或在没有BDNF的情况下生长(对照；空白直条表示)。在所标示的时间上把培养基固定并染色以测定TH免疫反应活性。通过多次加入加强BDNF使得在第11天TH+神经元数目比对照组高2.7倍，而11天后在一次加入BDNF情况下看到的最大增加量不到对照组的两倍。所得结果，几次实验的代表性数据是两个样本的平均值。图36：BDNF的推迟加入不能像在第2天加入BDNF时同样程度地增加TH+神经元的数目。
除外源性BDNF的加入时间不同外，按照本说明书所述制备培养物。将所有培养物在第2天转换到不含血清的培养上并且以一次加入的方式，在第2天，第5天或第七天(CD2，CD5，CD7)时加入BDNF(50ng/ml，猪脑BDNF)。在培养第6，8，10天时，在一式两份的培养物中测定TH+神经元的数目。在这个实验中，在第2天时一次加入BDNF导致在第10天时TH+神经元的数目比对照组高3倍，如果推迟BDNF的加入，在第5天加入时，在第10天观察到TH+神经元数目超过对照组，但是不到两倍，而且随着更长的培养时间，用药组和对照组之间TH+细胞数的差别也不会进一步增大。对照组用空白直条表示；在第2天加入BDNF组用点画直条表示；在第5天加入BDNF组用实心直条表示；在第7天加入BDNF组用阴影斜线直条表示。图37：BDNF对海马培养物中高亲和性GABA摄入量的剂量依赖响应。
将部分纯化的nBDNF(从CosM5上清液中离心纯化)以不同稀释浓度加入到培养物中。发现1×10-2稀释度的BDNF对E8鸡背侧根神经节有最大的轴突促进活性。在体外BDNF处理8天后测定高亲和性3H-GABA的摄入量。图38：BDNF可防止MPP+对培养的黑质多巴胺能神经元的神经毒害作用。按照在图1说明中描述的方法从E14大鼠胚胎中制备培养物。在离体24小时后将培养基换成无血清的配方。培养3天后，将培养基分装到四组6个35mm的培养皿中。一组做为对照组，其他组分别加入(i)碱性成纤维细胞生长因子；10ng/ml(牛脑bFGF；Boerhinger-Mannheim)；(ii)小鼠NGF，50ng/ml；或(iii)BDNF，50ng/ml将培养物再保持24小时后，把每组中的三个培养皿与1μM MPP+(生物化学研究有限公司，Natick，MA)接触48小时。在总共6天的实验结束时，将所有的平皿进行TH的免疫反应活性测定，并测定每组的TH+细胞数目。给出的数据代表MPP+处理后的在未经MPP+处理的相似培养物中TH+神经元数目的百分比计算的TH+神经元数目。所有数值都是三份相同培养物平均值+s.e.m.
          5.本发明的详细说明
本发明涉及编码了脑源神经营养因子(BDNF)的核酸序列，以及用这些核酸序列大量生产的BDNF蛋白质，肽片段和衍生物。另外，本发明涉及BDNF的药物组合物和治疗用途，首次为临床运用提供了产生足够量的基本上是纯化的BDNF的生产方法。本发明还涉及到针对BDNF或其片段的抗体，并提供了制备足够免疫原的方法。而且，通过比较BDNF和NGF的核酸顺序，本发明还提供识别BDNF和NGF核酸顺序中的同源区的方法，从而定义一种BDNF/NGF基因族；本发明提供一种用于识别和分离这种基因族的其他成员的方法。
为了清楚地描述本发明而不是为了限制，本发明可以按照下列几个部分叙述：
(i)BDNF的纯化
(ii)BDNF的生物测定
(iii)BDNF蛋白质的微定序
(iv)BDNF编码DNA的克隆
(v)BDNF的表达
(vi)BDNF基因和蛋白质
(vii)抗-BDNF抗体的产生
(viii)BDNF/NGF基因族其他成员的识别
(ix)本发明的用途
(x)药物组合物
      5.1.脑源神经营养因子的纯化
为了识别BDNF编码核酸，可以从组织中获得微克量的BDNF蛋白质，使能测定可以用来设计寡聚核苷酸探针的氨基酸顺序。这种极少量的BDNF蛋白质实际限制了可被测定的氨基酸序列的量。可以按照Barde等人(1982，EMBO J.1：549-553)或Hofer和Barde(1988，Nature 331：261-262)所描述的方法从猪脑中制备BDNF。
BDNF的制备最好按照下面所提供的实施例中所给出的详细方案进行，但并不受其限制；该技术中的普通技术人员在使用时会设想出各种修改。用于BDNF的含量稀少，在纯化过程中最好使用大约6公斤的脑组织。将脑组织在磷酸钠缓冲液中匀浆，该缓冲液磷酸钠的浓度大约为0.2M；并且pH大约为6，含有1mM EDTA和1mM新鲜加入的甲苯磺酰氟，使得脑组织与溶液的比例大约为1公斤脑组织比2升缓冲液。然后可以用盐酸调节混合物的pH到大约4，之后，将混合物在4℃下搅拌2小时，再将混合物在20,000g下离心25分钟。离心之后，收集上清液，用氢氧化钠调节pH至大约6.0，然后再和1升(每6公斤脑组织)已经用0.1M磷酸钠平衡到pH6.0的预先膨胀的羟基甲基纤维素一起搅拌。用总量为大约20升的0.1M磷酸钠pH6缓冲液洗几次后，将浆液倒入一个柱子中，并且含有0.13M NaCl的相同缓冲液冲洗，最好过夜。然后将通过BDNF敏感生物测定(见下面5.2部分)识别的活性部分用含有0.5M NaCl的磷酸盐缓冲液洗脱，并且接着用大约5升pH6.8的5mM磷酸钾透析几次。将透析过的组分加于一个羟磷灰石柱子上，该柱的床体积大约是每公斤被处理的脑组织用20ml；在加入样本之前应当用5mM pH6.8的磷酸钾将羟磷灰石柱子预平衡，然后用pH都大约为6.8的线性梯度500ml 5mM磷酸钾至500ml的700mM磷酸钾对该柱子洗脱。BDNF活性应当在大约500mM磷酸钾附近被最佳地洗脱。将收集的活性组分调整到一个大约700mM磷酸钾的最终摩尔浓度，并且将其加到一个用pH6.8的700mM磷酸钾溶液平衡过的(pheny-sepharose)柱子(床容积为每6Kg被处理的脑组织大约5ml)上。用大约40ml相同的缓冲液冲洗后，可用0.1M pH6.8的磷酸钾洗脱BDNF活性物，接着用蒸馏水对BDNF活性物透析，并冻干。用一种含有0.1％SDS但最好不含有巯基乙醇的SDS-凝胶电泳样本缓冲液溶解该冻干的物质，并将其加于一种由线性梯度的10-25％丙烯酰胺组成的SDS凝胶上。电泳分离完成之后，用Coomassie兰对凝胶染色大约10分钟，然后脱色大约20分钟。取出迁移到细胞色素C标记物水平的带段并通过电泳方法从凝胶中洗脱出来。可以按照Weber和Kuter(1971，J.Biol.Chem.246：4504-4509)所述的方法基本上去掉SDS。应当注意的是：SDS的去除通常是不完全的。Hofer和Bardc.(1988，Nature 331：261-262)的方法改进了用于对BDNF进行微定序的纯化步骤，并且不利用凝胶电泳做为纯化过程的最后一步。
     5.2.脑源神经营养因子的生物测定
根据本发明可以使用任何定性或定量表示BDNF活性的方法。这样一些生物测定法在识别和/或测定天然的或重组的BDNF活性时是有用的。
可以使用该技术中已知的任何一种BDNF生物测定技术。例如：如Barde等人所述(1980，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77：1199-1203)在BDNF测定中可以使用鸡胚胎背侧根神经节(DRG)神经元。
例如：运用该技术中已知的分离技术采集6到14天，最好10到12天的鸡胚胎背侧根神经节，并立即置于一个小体积的F14培养基中(用GIBCOF-12粉末按照Vogel-等人，1972，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.69：3180-3184那样进行添加而制备)，这种培养基在分离结束时换成含有大约0.1％胰蛋白酶的无Ca2+和Mg2+磷酸盐缓冲液(PBS)。在37℃培育20分钟后，将该神经节离心分离，并用含有大约10％(体积/体积)热失活马血清的F14介质冲洗两次，然后利用一个小直径(大约1mm)的硅化巴斯德氏(Pasteur)吸管通过轻轻研磨成粉(大约吸10-15次)来分离这些神经节。然后，最好将细胞悬浮液通过40μM孔径的尼龙筛以去掉剩余的组织块。然后将细胞悬浮液置于一塑料组织培养皿上预培养大约210分钟，在这期间，大部分非神经元细胞会粘附在该塑料面上，而富集了神经元的细胞群留在悬浮液中。再将细胞稀释成每毫升培养基(最好是添加了10％vol/vol的热失活马血清和抗菌素的F14培养基)中含有大约5×103个细胞的浓度，然后置于聚鸟氨酸或者，最好是聚鸟氨酸/昆布氨酸覆盖的组织培养皿中(见下面)。
作为另一个可选择的方法，但并不局限于此，在某些场合下，最好采用NGF相对不敏感的BDNF生物测定方法，而不用那些在一定条件下对BDNF和NGF有响应的测定***，如前所述的DRG***。这种相对BDNF-特异的***包括视网膜神经节培养物以及来源于神经基板的神经元培养物。
可以根据Johnson等人(1986，J.Neorsci 6：3031-3038)所述的方法培养产期的视网膜细胞。例如，可以从产期的动物中取出视网膜(对于大鼠来说，这里的术语“产期的”是指胎令17天一直到出生后48小时内的产后幼鼠，用无钙和镁的磷酸盐缓冲盐柱(PBS)冲洗，然后在大约0.05％到0.1％胰蛋白酶的PBS中于37℃下保温大约15分钟，在蛋白水解酶水解后，将视网膜在会有大约10％(体积/体积)热失活马血清的F14培养基(F14-HS)中冲洗，然后在少量(大约1-10ml)的新鲜F14-HS中通过轻轻地用管吸取来分离视网膜。可使未分离的组织沉淀，然后将剩余的细胞和培养基吸出进行培养。
或者，根据本发明也可以使用包括神经基板产生细胞的BDNF生物测定方法如Davies et al.，(1986，J.Neurosci 6：1897-1904)所描述，可以例如：将三叉神经节的前侧部分胚胎脑神经移出物或前庭神经节，膝状神经节，岩神经节或结状神经节用培养介质覆盖的胶原凝胶中进行培养，或者按照Barde等人(1980，Proc.Natl.Acad.Sci 77：1199-1203)的方法使其分离。
由于已经发现通过将生长底物由聚鸟氨酸换成昆布氨酸——聚鸟氨酸后，对于BDNF的应答特性会增加10倍(Barde et al.，1987，Prog.Brain Res.71：185-189)；BDNF的测定最好在含有昆布氨酸的底物上进行。培养基表层的制备可以通过下列方式进行，如(i)用一种聚鸟氨酸的灭菌溶液在培养基表层上覆盖大约β-10小时(ii)用灭菌水冲洗几次；和(iii)用一种在PBS中浓度大约为25μg/ml的昆布氨酸覆盖培养基表面大约2个小时(John-son et al.，1986，J.Neurosci.6：3031-3038)。
在本发明所使用的任何生物测定***中，可以运用该技术中已知的方法来建立BDNF的剂量响应曲线。使用分离的鸡感觉神经节测定法，用浓度大约为5ng/ml的纯化BDNF可得到半数最大生存率，而用浓度为10-20ng/ml的纯化BDNF可以得到最大生存率(Barde et al.，1987，Prog.Brain Res.71：185-189)。
    5.3.脑源神经营养因子蛋白质的微定序
可以对由脑制备的BDNF蛋白质进行定序，但是，应当强调的是：由于这种蛋白质极稀少的量，以致不大可能可靠地得到大部分的BDNF蛋白质顺序，可以直接对这种蛋白质定序，或者先通过任何一种蛋白酶或该技术中已知的其他物质包括但不限于，金黄葡萄球菌V8(Staphylococcus aureus V8)，胰蛋白酶，和溴化氰进行切割。可以根据Hewick等人(1981，J.Biol.Chem.256：7990-7997)和Hun-kapillar等人(1983，Methods Enzymol.91：227-236)的方法在一种气相显微定序仪上通过自动Edman降解来对肽定序。然后根据Lottspeich的方法(1985，Chromatography 326：321-327)进行苯基硫乙内酰脲氨基酸检测。可以测定出氨基酸序列的重叠片段，并且用来推断更长的邻接的氨基的延伸。
    5.4.脑源神经营养因子-编码DNA的克隆
由于BDNF的稀少，实际上不能够使用标准的方法来克隆BDNF基因。例如，如果使用现有的蛋白质序列来制备一个互补的标记寡聚核苷酸探针，并且用这种探针对由被推测的组织得到的cDNA库进行筛选来合成BDNF，那么阳性克隆的数目可能会极少极少。本发明提供了一种克隆BDNF基团的组合步骤，包括纯化适量的BDNF蛋白质，对BDNF蛋白质微定序产生寡聚核苷酸探针，构建一个cDNA库，根据得到的BDNF氨基酸序列进行放大，最后选择BDNF基因。在本发明的这种方法中，放大步骤最好采用通过聚合链反应(PCR)进行组织核酸序列的放大(Saiki et al.，1985，Science，230：1350-1354)以便增加可用于克隆的BDNF序列的数目。对这种优选方法的详细描述如下：
首先，可以使用从纯化BDNF蛋白质中得到的氨基酸顺序来推断用于聚合酶链反应中的寡聚核苷酸引物，由于遗传密码的简并性，其中几个核酸三联体可能对同一氨基酸有特异性，所以对一个给定氨基酸顺序应当合成几个寡聚核苷酸，以便提供几种可能的核苷酸序列的组合，所得到的这些寡聚核苷酸被称之为简并引物。
聚合酶链反应(PCR)需要有义链及反有义链引物。因此，可以使用一种与BDNF氨基酸序列相对应的简并寡聚核苷酸引物做为一条DNA链的引物，而可以使用与常见DNA序列同源的第二种引物，如mRNA的多腺苷尾部反转录产生的胸腺嘧啶脱氨核苷残基段作为第二条DNA链的引物，这些引物就可以用于用假定含有BDNF编码序列的核酸模板的聚合酶链反应，该模板比如是基因组DNA，或者最好是由假定合成BDNF的组织中得到mRNA制备的cDNA。可以通过电泳分析DNA反应产物，以确定DNA反应产物是否具有与所需的BDNF基因尺寸相近的分子大小，最好是通过核苷酸顺序分析测定。
不过，由于在PCR过程中使用了两个简并引物，很可能增加了放大不是编码BDNF的核酸序列，优选的方法是只使用一种简并引物，即对应于准确BDNF序列的其他引物。为了识别准确BDNF序列，可以用由纯化BDNF蛋白质确定的氨基酸序列来设计简并型的有义和反有义两种寡聚核苷酸引物。利用BDNF编码核酸做为模板在PCR反应中使用这些引物而产生的DNA反应产物，应当是一种编码了用于设计这两个引物的氨基酸延伸的核酸片段，而且其大小是可以预测的(例如以最大计，是氨基酸残基数目乘以碱基对的长度3)。将DNA反应产物的顺序分析与已知的氨基酸顺序进行比较以确定所放大的核酸序列真正编码了BDNF肽片段。尽管可以使用该技术中已知任何一个核酸定序方法，但是最好使用双脱氧核苷酸链终止方法(Sanger etal.，1979.Prac.Natl.Acad.Sci.U.S.A.72：3918-3921)。可以利用纯化凝胶或者最好是克隆的DNA反应产物来完成定序，然后可以将DNA反应产物的顺序用于设计一种与准确BDNF编码序列对应的寡聚核苷酸引物。这种引物可以和一个第二种引物，它可以是简并引物，一起使用以增加BDNF序列的数量，使之超过由开始测定的准确顺序的片段所代表的量。例如，但不是限制有义链引物可以对应于准确“BDNF核苷酸”序列，而反有义引物可以是一种与可能存在于该编码片段的下游如在cDNA中进行反转录时mRNA的多腺苷尾部的序列区域同源的简并引物。然后必须使用一种相似的方法来重新得到该被定序片段的上游顺序，例如反有义链引物可以是与该定序片段上游的BDNF序列区，如利用末端脱氧核苷酸转移酶加在cDNA 5′端的5′多腺苷尾部区域同源的简并引物。因此，整个BDNF基因或mRNA的顺序可能是相似的。
可以使用该技术中已知的任何方法克隆DNA反应产物。该技术中已知的大量载体一宿主***都可以使用。可以使用的载体包括，但不局限于，粘性质粒(Cosmids)，质粒或修饰病毒，但是载体***必须与所用宿主相容。这样一些载体包括，但不局限于，噬菌体如入一衍生物，或质粒如pBR322，pUC或Bluescript(注册商标)(Stratagene)质粒衍生物。可以通过转化。转染感染、电击穿等方法将重组体分子***到宿主细胞中。
将BDNF基因***到一个可以用来转化、转染、或感染合适的宿主细胞的克隆载体当中，以产生许多这种基因序列的复制品。这可以通过将DNA片段连接到一个带有互补粘性末端的克隆载体中完成。但是，如果在克隆载体中不存在用于构造DNA片段的互补限制位点，就要通过酶学方法对DNA分子的末端进行修饰，最好是将限制核酸内切酶切割位点***到聚合酶链反应中所用的寡聚核苷酸引物中，以促进向载体内的***。或者也可以通过将核苷酸序列(接头)连接到DNA末端上以产生任何所需位点；这些被连接的接头可以包括专门化学合成的编码了限制核酸内切酶识别序列的寡聚核苷酸。另一种方法是同聚体的形式修饰被切割的载体和BDNF基因。
在一些特定的实施例中，对其有已经掺入一种分离BDNF基因，cDNA或合成DNA序列的重组DNA分子的宿主细胞进行转化能够产生该基因的许多复制品。因此，可以通过培养转化体，从转化体中分离重组DNA分子以及必需时从被分离的重组DNA中收回所***基因的方法来大量地获得这种基因。
根据本发明的一个优选实施例，只要产生出一种由cDNA得到的编码BDNF的克隆，就可以利用该技术中已知的标准方法分离出要编码BDNF的基因组克隆。例如：可以从BDNF克隆中制备出一种标记的核酸探针，并且用例如Benton和Davis(1977.Science196：180)用于筛选噬菌体库和Grunstein和Hogness(1975，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.72：3961-3965)用于筛选质粒库的方法通过核酸杂交法，用它来筛选基因组DNA库。根据该技术中熟知的方法通过限制片段图法和顺序测定方法对重新得到的克隆进行分析。
再者，运用根据本发明获得的序列，可以从一个cDNA库中识别出其他的cDNA克隆。
     5.5脑源神经营养因子基因的表达
可以将用于编码一种BDNF蛋白质或其中一部分的核苷酸顺序***到一个适当的表达载体中，也就是说***到一个含有转录和转译***蛋白编码序列所必需元件的载体中。必需的转录和转译信号也可以由天然的BDNF基因和/或它的侧区提供。也可以使用各种不同的宿主-载体***来表达这样蛋白编码序列。这些***包括但不局限于感染有病毒(如，牛痘病毒、腺病毒等)的哺乳动物细胞***、病毒(如杆状病毒等)感染的昆虫细胞***；微生物如含有酵母载体的酵母菌，或用噬菌体DNA，质粒DNA或粘性质粒(Cosmid)DNA转化的细菌，这些载体表达元件的强度和特异性各不相同，根据所采用的宿主-载体***，可以使用一些合适的转录和转译元件中的任何一种。
可以运用上述将DNA片段***到载体中的任何一种方法来构造含有一种由适当转录/转译控制信号和蛋白编码序列组成的嵌合基因的表达载体。这些方法可以包括体外重组DNA和合成技术以及体内重组技术(遗传重组)。可以通过一个第二核酸顺序的表达进行调节，使得BDNF蛋白质或肽在一种用该重组DNA分子转化了的宿主中进行表达。例如：可以通过任何该技术中已知的启动子/强化因子元件来控制BDNF的表达。用来控制BDNF表达的启动子包括，但不限于，SV40早期启动区(Bernoist and Chambon；1981，Nature290：304-310)，存在于Rous肉瘤病毒的3’长末端重复处的启动子(Yamamoto.et.al.，1980，Cell，22：787-797)，疱疹胸苷激酶启动子(Wagner et al.，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：144-1445)，金属硫堇(metallothionine)基因的调节序列(Brinsteret al.，1982，Nature 296：39-42)；原核表达载体如β-乳胺酶(lactamase)启动子(Villa-Kamaroff，et al.，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75：3727-3731)，或tac启动子(DeBoer et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：21-25)，并见“Usefulproteins from recombinant bacteria”-(来自重组细菌中的有用蛋白质一文，Scientific American，1980，242：74-94，含有蓝曙红合成酶启动子区的植物表达载体(Herrera-Estrella et al.，Nature303：209-213)或在椰菜花斑病病毒35sRNA启动子(Gardner etal.，1981.Nucl.Acids Res.9：2871)和用于光合酶核酮体二磷酸盐羧化酶的启动子(Herrera-Estrella et al.，1984，Nature 310：115-120)；由酵母菌或其他真菌中得到的启动子元件如Gal4启动子，ADC(乙醇脱氢酶)启动子，PGK(磷酸甘油激酶)启动子，碱性磷酸酶启动子，以及下列呈现组织特异性并已被用于突变(trans-genie)动物中的动物转录控制区，在胰腺泡细胞中具有活性的弹性蛋白酶I基因控制区(swift et al.，1984，Cell.38：639-646；Ornitzet al.，1986，Cold Spring Harbor Symp.Quant Biol.，50：399-409；MacDonald，1987，Hepatology 7：425-515)，在胰腺β细胞中具有活性的胰岛素基因控制区(Hanahan，1985，Nature 315：115-122)，在淋巴细胞中具有活性的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl.et al.，1984，Cell 38：647-658：Adames et al.，1985，Nature 318：533-538；Alexander et al.，1987，Mol.Cell.Biol.7：1436-1444)，在睾丸细胞乳腺细胞，淋巴细胞和肥大细胞中具有活性的小鼠乳胂瘤病毒控制区(Leder et al.，1986，Cell.45：485-495)，在肝脏中具有活性的白蛋白基因控制区(Pinker et al.，1987.Genes，and Devel.1：268-276)，在肝脏中具有活性的α-胎蛋白基因控制区(Krumlaufet al.，1985，Mol.Cell.Biol.5：1639-1648；Hammer et al.，1987.，Science 235：53-58)；在肝脏内具有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey et al.，1987，Genes and Devel.1：161-171)，在骨髓细胞中具有活性的β-珠蛋白基因控制区(Mogram et al.，1985，Nature 315：338-340；Kollias et al.，1986，Cell，46：89-94)；在脑的少突神经胶质细胞中具有活性的髓磷脂碱性蛋白质基因控制区(Readhead.et al.，1987.Cell.48：703-712)；在骨骼肌中具有活性的肌浆球蛋白轻链-2基因控制区(Sani，1985，Nature314：283-286)，在下丘脑中具有活性的促性腺释放激素基因控制区(Mason et al.，1986，Science 234：1372-1378)。
可以通过三种通用的方法来识别含有BDNF基因插段的表达载体：(a)DNA-DNA杂交法，(b)有或没有“标记物”基因功能和(c)***序列的表达。在第一种方法中，运用由一个***BDNF基因同源的序列组成的探针，通过DNA-DNA杂交可以检测到某个表达载体中有***外部基因的存在。在第二种方法中，根据某些由于在载体中***外部基因而引起的“标记物”基因的功能(例如，胸苷激酶活性，对抗菌素的抗性，转化表现型，杆状病毒中咬合体的形成等)的存在与否可以用来识别和选择该重组体载体/宿主***。例如，如果将BDNF基因***到载体的标记物基因序列中，就可以通过该标记物基因功能的消失来识别含有BDNF***段的重组体，在第三种方法中，通过测定由重组体表达的外源基因产物可以识别重组体表达载体。例如，这种测定可以根据如前面5.2部分所说的生物测定***中BDNF基因产物的物理或功能特性而进行。
一旦识别和分离出一种特定的重组DNA分子，就可以运用该技术中已知的几种方法使其繁殖。只要建立一个合适的宿主***和生长条件，就可以大量地制备和繁殖重组表达载体。如前所述，表达载体包括，但不局限于下列载体或其衍生物：人和动物病毒如牛痘病毒或腺病毒；昆虫病毒如杆状病毒，酵母载体；噬菌体载体(例如，入)，以及质粒和粘性质粒(Cosmid)，DNA载体，现只列出了少数名称。
另外，可以选择一种可以调节***序列表达的或者以所需的特定方式修饰和处理该基因产物的宿主细胞株。由某种启动子开始的表达在某种诱导物存在下可以得到提高；因此，对于一种遗传工程制备的BDNF蛋白质的表达是可以进行控制的。而且，各种宿主细胞对于蛋白质的转译和转译后的加工和修改(例如，糖基化、切割)具有特征性和特异性的机制。可以选择合适的细胞系或宿主***以保证对被表达的外部蛋白质进行所需要的修改和加工。例如：可以运用在细菌***中的表达来产生一种非糖基化的核心蛋白质产物。在酵母中的表达将产生一种糖基化的产物。运用哺乳动物细胞中的表达可以保证异种BDNF蛋白质的“天然”糖基化。再者不同的载体/宿主表达***可以在不同程度上进行处理加工反应如水解切割。
在本发明的一个特定实施例中，可以将编码早期前BDNF的DNA克隆到pCMV质粒中去，进行放大，然后用来通过磷酸钙方法(Chen and Okayama，1987.Mol.Cell.Biol.7：2745-2752)转染Cos细胞；再从细胞培养基中收集BDNF活性物(见下面的实施例部分10)
     5.5.1.被表达的基因产物的识别和纯化
一旦识别出一种表达BDNF基因的重组体，就应对其基因产物进行分析。这可以通过根据该产物的物理或功能特性的测定来完成。
一旦识别出该BDNF蛋白质，就可以通过标准方法包括色谱法[例如：离子交换色谱、亲和色谱和大小筛选柱色谱法)，离心法、差异溶解度或通过任何其他用于纯化蛋白质的标准方法使其纯化和分离。可以运用任何已知的BDNF测定方法，包括但不局限于，鸡胚胎背侧根神经节法，产期大鼠视网膜细胞法或神经基板产生的神经元法来评价其功能性特性。
重要的是：由于用来从脑组织中制备BDNF的方法中包括有制备凝胶电泳过程，做为最后的步骤，因而所产生的BDNF由于存在残余的SDS其活性是不完全的(Barde and Thoenen；1985)见“激素和细胞调节(Hormones and Cell Regulation)”Vol.9.Dumont et al.，eds.，Elsevier Science Publishers，pp.385-390)。对照之下，本发明可以分离从重组核酸分子产生的并且不含有SDS的BDNF，因此具有完全的活性。举例说明，但不限于此，可以运用本发明的抗-BDNF抗体(如下面11部分中所说的作用于猪BDNF的B5-33氨基酸片段的抗体)通过免疫沉淀法或亲和色谱来收集重组BDNF，从而制备不含去污剂的全活性的BDNF。
在本发明的另一个实施例中，可运用如，蛋白内切酶Arg-C将前期前BDNF通过酶学方法转化成有活性的成熟BDNF(见下面的实施例部分17)。
        5.6脑源神经营养因子基因和蛋白质
利用前面所述以及下面实施例6和9中所述的方法，可以测定出下列这些核酸序列，并且可推断出它们的相应氨基酸顺序。已经测定出猪BDNF，cDNA序列，并在图1中进行了描述已测定出人基因组cDNA BDNF序列，在图5中进行了说明，图5还表示了从猪、大鼠和鸡中制备的DNA序列。这些序列或它们的功能等同物中的每一种都可以用于本发明。另外，本发明涉及从猪、牛、猫、鸟、马或犬、以及灵长类动物和任何有BDNF活性存在的其他种类动物中分离的BDNF基因和蛋白质。本发明还涉及到含有至少10个核苷酸的BDNF核酸的亚序列单位，这种亚序列单位包含有BDNF序列的可杂交部分，这部分可用于如核酸杂交测定法，Southern和Northern印迹分析等。本发明根据图1和5所给出的氨基酸序列，还提供了BDNF蛋白质及其片段和衍生物，或者它们功能上的等同物，本发明还提供BDNF蛋白质的含有抗原决定簇或具有功能活性的片段或衍生物。这里所说的功能活性是指在对已知的BDNF功能的测定，如鸡胚胎DRG测定中，具有肯定的活性。
例如，可以通过提供功能上等同分子的取代，增加或去掉某些成份来改变图1和5中所述的核酸顺序。由于核苷酸编码序列的简并性，在实施本发明时，可以采用其他的编码了基本上相同于如图1和5所描述氨基酸序列的DNA顺序。这些序列包括但不局限于含有如图1和5所描述的被各种不同密码子取代而改变了的全部或部分BDNF基因的核苷酸序列，这些由部分BDNF基因组成的核苷酸序列编码了该序列内的一种功能上等同的氨基酸残基，从而产生一个小小的改变。同样，本发明的BDNF蛋白质或其片段或衍生物包括，但不限于那些含有基本上如图1和5所描述的全部或部分氨基酸序列包括那些含有序列内的残基被功能上等同的氨基酸残基取代后产生轻微改动的变化序列做为基本氨基酸序列的蛋白质或其片段，衍生物，例如：该序列中的一种或几种氨基酸残基可以被功能上等同的具有相似极性的另外一种氨基酸所取代，而引起一个轻微的变化。取代该序列中某个氨基酸的取代物可以从该氨基酸所属类中的其他一些成员中选择。例如：非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。本发明的范围还包括那些在转译过程中或之后通过如糖基化、蛋白水解切割、连接到一个抗体分子或其他细胞配体上等而进行不同修饰的BDNF蛋白质或其片段或衍生物。
另外，可以在体外或体内使一种给定BDNF发生突变，以产生和/或破坏转译，起始，和/或终止序列，或引起编码区的变化和/或形成新的限制核酸内切酶位点或破坏已存在的位点，以促进行体外进一步的修饰，可以使用该技术中已知的任何一种诱变技术，包括但不限于体外位点型诱变(Hutchinson，et al.，1978，J.Biol.Chem.253：6551)，运用TAB(注册商标)接头(Pharmacia公司)等
        5.7.产生抗脑源神经营养因子的抗体
根据本发明，可以使用BDNF蛋白质或其片段或衍生物做为免疫原来产生抗-BDNF抗体。以前试图产生一种抗-BDNF的免疫应答一直未能成功，可能是因为可得到的纯化BDNF量很少，通过给出利用蛋白合成重组技术(根据本发明的BDNF核酸序列)来相对大量生产BDNF蛋白质的方法，便解决了BDNF量不足的问题。
为了进一步改进产生一种抗-BDNF免疫应的可能性，可以对BDNF的氨基酸序列进行分析以识别与增强致免疫性有关的分子部分。例如：可以根据Hopp和Woods的方法(1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：3824-3828)对氨基酸序列进行计算机分析，以识别表面抗原决定簇，这种方法已被成功地用于识别肝炎B表面抗原的抗原肽。或者，可对来自不同种动物的推断的BDNF氨基酸序列进行比较，识别其相对非一同源区；这些非同源区极有可能在各种不同种类的动物中是致免疫的。
为了制备作用于BDNF的单克隆抗体，可以使用任何通过培养中的连续细胞系来生产抗体分子的方法。例如：最初由Kohler和Milstein建立的杂交瘤方法(1975，Nature 256：495-497)，以及三组瘤(Trioma)方法，人B-细胞杂瘤方法(Kozbor et al.，1983，Immunology，Today.4：72)，和制备人单克隆抗体的EBV-杂交瘤方法(Cole.et al.，1985，见“单克隆抗体和肿瘤治疗(Monoclonal.Autibodies and Cancer Therapy”，Alan R.Liss.Inc.pp.77-96)和类似方法都属于本发明的范围。
有治疗用途的单克隆抗体可以是人单克隆抗体。或人-小鼠(或其他种类)嵌合体单克隆抗体。可以通过该技术中已知的许多方法的任何一种来制备人单克隆抗体(例如：Teng et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：7308-7312；Kozhor et al.，1983Immnnology.Today 4：72-79；Olsson et al.，1982，Meth.Enzymol92：3-16)。可以制备一种含有一个具有人恒定区的小鼠抗原结合区的嵌合体抗体分子(Morrison et al.，l984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81：6851.Takeda et al.，1985，Nature 314：452)。
可以使用该技术中已知的各种方法来生产BDNF抗原决定簇的多克隆抗体。为了生产抗体，可以通过注射BDNF蛋白，或其片段或衍生物来免疫各种宿主动物，包括但不限于兔子、大鼠、小鼠等。可以根据宿主的种类使用各种佐剂来增加免疫学应答，包括但不限于弗氏佐剂(Freund′s)(完全和不完全)，无机凝胶如氢氧化铝，表面活性物质如溶血卵磷脂，复合多元醇(pluronic Polyols)，聚阴离子剂(Polyanions)肽，油乳剂钥孔形血花青苷(Keyhole lim-pet homocyanins)，二硝基苯酚，和可能有用的人佐剂如BCG(卡介菌)和细小棒状杆菌(Corynebacterium parvam)。
可以通过已知方法来制备BDNF抗原决定簇的抗体分子克隆。可以采用重组DNA方法(见，如，Maniatis et al.，1982，mole-cular cloning，A laboratory Manual，Cold Spring Harbor Labo-ratory，cold Spring Harbor New York)来构造用于编码单克隆抗体分子或其抗原结合区的核酸序列。
可以通过已知方法来纯化抗体分子，例如，免疫吸收法或免疫亲和色谱法，象HPLC(高效液相色谱)这样的色谱方法，或者它们的结合使用等。
可以通过已知方法产生含有该分子的特异基因型的抗体片段。例如，这种片段包括但不限于：可能通过对抗体分子进行胃蛋白酶消化而产生的F(ab′)2片段；可以通过去掉F(ab′)2片段上的二硫化物桥而产生的F(ab′)片段，和通过用木瓜蛋白酶和一种还原剂处理该抗体分子而产生的2Fab或Fab片段。
实施部分11对作用于BDNF蛋白质B5-33肽段的多克隆抗血清的制备方法进行了描述。
    5.8.BDNF/NGF基因族其它成员的识别
对编码BDNF的基因的序列分析以及对其氨基酸序列的推断揭示了这种蛋白质与NGF在结构上有很多相似之处(图2)。成熟BDNF的基本序列以及一般结构和对前体蛋白的可能加工方式有力地说明NGF和BDNF基因是从一个共同的原始基因演变而来，在成熟多肽的区域内，如果为了更好地配对在NGF序列中只掺入三个间隙，就会有总共51个氨基酸与以往知道的来自许多种动物的NGFS以及猪与人的BDNF相同。这些相同氨基酸包括6个半胱氨酸残基，这说明NGFs和BDNF在二级结构上是非常相似的。再者，可以发现4个具有6个或更多氨基的组成的片段，在这些片段中，来源于上面列举的所有种类动物中的NGFs和猪BDNF或者相同，或者其差别不超过一个保守氨基酸置换。因此，有理由认为NGF和BDNF似乎是同一基因族中密切相关的成员。
通过利用一种以前未预料到的在NGF和BDNF之间存在强同源性的保留片段存在的方法，可以合理地寻BDNF/NGF基因族中的其他成员，例如，可以通过从各种不同的核酸序列中选择那些与BDNF和NGF同源的顺序，并且，从这些选择的序列中进一步识别那些还含有与NGF和BDNF非同源核酸序列的顺序，来识别BDNF基因族中的其他成员。该术语“非同源”可以解释为指在会有至少大约6个邻接的核苷酸的区域中，至少大约2个核苷酸与NGF和BDNF序列不同。
本发明的一个优选实施例提供下列方法，针对上面描述的并在下面表m中列出的4个保留片段(“基因盒”)中每一个，合成一系列含有至少18个核甘酸的简并寡聚核苷酸探针代表了在6个邻接密码子上存在于NGF或BDNF中的氨基酸的所有可能的编码序列。根据对成熟多肽的氨基末端进行编号(使得前体BDNF的His134被当作成熟蛋白质中His1处理)，4个基因盒的特征如下(按照人成熟蛋白质编号；DNA顺序如图1所示。
                        表III
                                    DNA顺序基因盒1：NGF Gly10-Ser19                587-616
    BDNF Gly8-Ser17基因盒2：NGF Lys50-Cys58                713-739
    BDNF Lys50-Cys58基因盒3：NGF Gly67-Asp72                764-781
    BDNF Gly67-Asp72基因盒4：NGF Trp99-Cys110               863-898
    BDNF Trp100-Cys111
可以使用由表m所列基因盒的序列对得到的合成寡聚核苷酸做为引物，通过从可能感兴趣的来源(RNA或DNA)得到的PCR序列进行放大。这可以包括从任何能够表达一种与BDNF或NGF密切相关多肽的真核生物类中得到mRNA或cDNA或基因组DNA。通过进行少至6个PCR反应(即一种由基因盒1得到的引物与一个来自基因盒2的引物之间的反应；基因盒1与基因盒3的反应；基因盒1与基因盒4的反应；基因盒2与基因盒3的反应；基因盒2与基因盒4的反应，基因盒3与基因盒4的反应)，能够测定出一种在NGF和BDNF之间共有上述4个保留序列片段中任何两个片段的基因或基因产物。如果你选择对每一个基因盒合成几个不同的简并引物，则还能够运用一个合理小数目的PCR反应来进行全面筛选。还能够通过改变在启动PCR反应中使用的杂交条件的严格性，来增加或减少未知基因与NGF或BDNF间核苷酸序列的相似程度。如果对以前未知的BDNF/NGF基因族成员的一个片段进行成功地放大，则可以对这个片段进行分子克隆和定序，并可以用来做为一种探针以分离完全的cDNA或基因组克隆，这又能测定该未知基因完全的核苷酸序列，分析它的表达，并且生产其蛋白产物以用于功能性分析。
上述方法已被用来识别一种与BDNF和NGF都相关的新基因，并且在下面的实施例13中进行了描述。
另外，本发明还提供了利用BDNF/NGF序列的同源性来鉴别虽是BDNF/NGF基因族成员但在自然界中可能不存在的新的重组分子。举例说明：但不限于此，可以根据本发明构造一种既含有NGF基因部分又含有BDNF基因部分的重组分子。这种分子能够表现出与BDNF和NGF二者相关连的特性并且带来一种新的生物活性，包括***与拮抗剂，还可以利用BDNF和NGF的基本序列运用计算机模拟来预测出该分子的分级结构(Hopp and Woods，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：3824-3828)；按照三级结构与生物功能间的相关性可以设计出BDNF/NGF嵌合体重组基因。同样，可以构造出含有任何一种或几种BDNF/NGF基因族成员一部分的嵌合体基因，包括第13部分所述的新成员。
         5.9.本发明的用途
本发明涉及到BDNF的核酸序列和由它产生的基本纯化的蛋白质，肽片段或衍生物，可以首次大量地生产足够用于诊断和治疗的BDNF。同样，做为本发明的一个结果，还首次获得了抗-BDNF的抗体，和BDNF核酸探针，它们可以用于实际诊断和治疗学中，虽然在本发明的一些特定实施例中可以用交叉种类的BDNF，在大多数场合下，用于诊断和治疗目的时，最好使用来源于同种生物的BDNF基因或基因产物。
            5.9.1诊断应用
本发明涉及到编码BDNF的核酸，和由其产生的蛋白质，肽段或衍生物，以及作用于BDNF蛋白质，肽或衍生物的抗体，因而可以用来诊断可能与BDNF表达型或改变有关的神经***疾病和失调。
在本发明的各种具体实施方案中，可以将BDNF基因及相关的核酸序列和亚序列，包括互补序列，用于诊断杂交检测法中。可以将BDNF核酸序列或它的含有大约15个核苷酸的亚序列用来作为杂交探针。运用杂交测定法可以检查预测、诊断或监控与BDNF表达的改变有关的病因、失调、或疾病状态，尤其是引起感觉神经元损伤和视网膜神经元变性的病因。这种疾病和病因包括但不限于中枢神经***(CNS)损伤、梗死、感染、退化性神经疾病，恶性肿瘤、或手术后改变包括但不限于早老性痴呆(Alzheimer′s Disease)，帕金森氏病(Parkinson′s Disease)亨廷顿舞蹈病(Huntingtons Chorea)和视网膜退化性疾病。例如，可以对病人组织样本的总RNA进行检查以确定BDNF mRNA的存在，其中BDNF mRNA数量的减少则表示有神经元的变性。在成神经细胞瘤的肿瘤细胞中已经识别出相对高含量的BDNF mRNA(详见下面的第14部分)；因此，在本发明的一个特定实施例中，利用BDNF核酸探针检测到mRNA的增加可以用来诊断成神经细胞瘤肿瘤。大多数组织合成的BDNF含量水平非常低。使得BDNF mRNA成为一种特别有用的肿瘤标记。
在本发明的另一些实施例中，可以运用针对BDNF蛋白质、肽段，或衍生物的抗体来诊断神经***的疾病和失调，尤其是包括感觉失调和视网膜退化的疾病。以及前面所列举的那些疾病和功能失调。例如：可以将本发明的抗体用于利用需要进行这种检查的病人的组织样本的原位杂交方法中，在另一个实施例中，可以将本发明抗体运用于western印迹反应分析中以检测和/或测定组织或体液样本中BDNF的存在。对在ELISA和Western印迹反应中与BDNF结合的本发明抗体的描述见下面的第11部分。
在本发明的另一些实验例中，可以运用BDNF蛋白质、肽片段或衍生物来诊断神经***疾病和失调，在本发明的一个具体实施例中，但不限于此，可以利用标记的BDNF蛋白质或肽片段来识别表达BDNF受体的组织或细胞，以便识别BDNF受体表达的异常，因而识别出可能存在的对BDNF的组织或细胞应答的异常。5.9.2.治疗应用
本发明涉及编码了BDNF的核酸，以及由其产生的蛋白、肽片段或衍生物，并涉及针对BDNF蛋白、肽或衍生物的抗体，它可以用于治疗神经***的疾病和机能失调，这些疾病与机能失调是与BDNF表达方式的改变有关或者可以因与BDNF或抗BDNF抗体接触而受益。
在本发明的各种不同具体实例中，BDNF蛋白、肽片段或衍生物可以对神经***因外伤、外科手术、局部缺血、感染、新陈代谢疾病、营养性缺乏、恶性生长或有毒制剂而受损的患者给药，本发明特别可通过施用有效治疗量的BDNF蛋白或肽片段或衍生物来治疗那些感觉神经元或视网膜神经节细胞发生损伤的情况。在本发明各个具体实施方案中，BDNF可以对已经切开的感觉神经元局部给药、包括但不限于在背侧根神经节的或在以下任何组织中的神经元：膝、岩部和有节神经节；第八颅神经的前庭听觉集合体；三叉神经中心的与下颌有关的上颌叶的腹外侧极点；以及中脑三叉神经核，可以通过吸附到一个能植入到要给药神经附近的膜上，例如：硅橡胶膜上，而将BDNF相关肽或BDNF蛋白给患者施用，本发明也可用于例如促进糖尿病引起神经病患者的恢复，如复合性单神经病。在本发明的另一些实施例中，BDNF蛋白或其肽片段或衍生物，能用于治疗先天性的或神经变性的机能失调，包括但不限于早老性痴呆帕金森疾病，Parkinson-Plus综合症(其中帕金森症状是由多巴胺能神经元变性引起的)，例如进行性核上麻庳(Steele-Richardson-Olszewski综合症)，橄榄体脑桥小脑萎缩(OPCA)，shy-Drager综合症(多***萎缩)以及Guamanian parkinsonism痴呆综合症以及亨廷顿舞蹈病特别是，本发明可用于治疗先天性或与感觉神经机能障碍及视网膜变性疾病有交的神经变性产生的机能失调症，例如，本发明的BDNF蛋白或肽片段或衍生物可用于治疗有视网膜退化的遗传性痉挛下身麻庳(Kjellin和Barnard-Scholz综合症)，视网膜炎色素病，Star-gardt病症，Usher综合症(并有先天性耳聋的视网膜炎色素病)，Refsum综合症(视网膜炎色素病、遗传性耳聋以及多神经病)，提及的仅仅是少数。以视网膜变性或其它感觉功能障碍相结合为特征的各种综合症的主要病因很可能是在于BDNF合成或反应能力的缺陷。
在本发明的一个具体方案中，在治疗早老性痴呆症和/或帕金森症中，施用BDNF蛋白或肽片段或由其衍生的衍生物可以与外科的组织植入相结合使用。正如下面12和18节所讨论的BDNF可以用于以剂量有关的方式(图34)促进多巴胺能黑质神经元的存活，支持了用BDNF来治疗CNS多巴胺能神经元的机能失调，包括，但不限于帕金森病(特别是按照下面21节给出的数据，该数据表明，BDNF可用于阻止由MPP引起的神经性中毒，MPP是与诱发帕金森状综合症有相关的)。此外，已观察到BDNF可维持CNS胆碱能神经元的存活(下面，12和16节)，特别是维持底前脑胆碱能神经元的存活，这表明了BDNF可用于治疗涉及胆碱能神经元的机能失调症，包括，但不限于，早老性痴呆症。已经表明，约35％的患有帕金森症的病人遭受早老性痴呆症型的痴呆；可以证明按本发明所产生的BDNF是治疗这种综合症有用的单一制剂。同样，按本发明所产生的BDNF从治疗角度来看可以用于治疗结合有唐氏(Down)综合症的早老性痴呆症。按本发明产生的BDNF可用于治疗各种痴呆症以及先天性学习机能失调，还发现，BDNF似乎具有抑制星形神经胶质细胞的增生，支持了利用BDNF在CNS中缩小疤痕形成(例如，在外科，外伤或梗死之后)以及在治疗星形神经胶质导致的CNS肿瘤中使用BDNF，在本发明的另一实施方案中，BDNF可用于向上调节NGF受体的表达，从而可以对需要这种治疗的患者在NGF之前或NGF同时施用BDNF是有利的。
如下面15节中的例举说明的那样，施用红藻氨酸会诱导神经元、包括海马神经元以及皮层神经元中BDNF表达的增加(以及较少程度的NGF的表达)。已观察到(下面15节)抑制非-NMDA受体阻断了这种的红藻氨酸为中介的BDNF表达的增加。因此，可以在体内或体外通过施用红藻氨酸或相关化合物或氨基甲酰胆碱、组胺或缓激肽、或它们的发现在体内或体外具有同样效果的有关化合物或者通过非-NMDA谷氨酸受体的***或者能增加或模拟已酰胆碱、组胺或缓激肽作用的其它药物来诱导本发明BDNF和BDNF相关肽的表达。NGF表达的诱导也可以通过施用红藻氨酸或相关分子或非NMDA受体的***来实现。
本发明的另一方案中，BDNF蛋白、肽片段或衍生物可与其它胞质结合使用以达到所需的神经营养性效果。例如，但不限于此，按照本发明，BDNF可以与NGF或与骨骼肌肉提取物一起使用以在感觉神经元的生长中起到协同促进作用，其中协调性解释为BDNF蛋白、肽片段或衍生物与一个第二种药剂相结合的效果要大于单独使用任何一种同样量的物质的效果。预见得到，BDNF会与其它有待详细描述的CNS衍生的肽因子一起在中枢神经***的大量神经元亚群的生长、发展和存活中起协同作用。
还预见到，基于BDNF分子的所有特征，可能发展出新的肽片段，衍生物或BDNF突变体，它们能起BDNF的某些或全部生物功能的拮抗物的作用，这种BDNF拮抗物在选择性消除感觉神经元，例如，在治疗慢性疼痛综合症中是有用的。
在本发明的另一些方案中，针对BDNF蛋白或其肽片段或衍生物的抗体可以对患有各种神经机能失调和疾病并需要这种治疗的患者服用。例如：患有BDNF产生过多的患者会需要这种治疗。抗-BDNF抗体可用于阻止感觉神经元的异常再生，(例如，手术后)，或者如上面所讨论的用于慢性疼痛综合症的治疗中。依靠在成神经细胞瘤组织中发现的BDNF mRNA的高含量，BDNF有可能起成神经细胞瘤的一种autocrine钟瘤生长因子的作用；因此，在本发明的一个具体实施方案中，施用抗-BDNF抗体进行治疗以达到肿瘤的消退。5.10.药物组合物：
本发明的活性组合物，可以包含BDNF基因产物的全部或部分BDNF基因产品、包括蛋白、由其产生的肽片段或衍生物，或包含针对BDNF蛋白、肽片段或衍生物的抗体(或抗体片段)，或者包含BDNF和一种第二药剂，如NGF或骨骼肌肉提取物的结合物，它可以在任何无菌的生物相容的药物载体、包括但不限于盐水，缓冲盐水、葡萄糖和水中进行给药。
BDNF蛋白、肽片段或衍生物可以包括基本上如图1或图5中所描述的氨基酸序列或其亚序列；最好用特别是包括如图1所示的全部或由从大约氨基酸134到约氨基酸252部分组成的氨基酸序列或功能上相当的序列的B·D N·F蛋白，因为，这种亚序列被认为包含了BDNF分子的功能部分。BDNF可以由任何合适的动物种类的相应于BDNF基因的序列得到，包括，但不限于，人、猪、鼠、鸡、牛、狗、绵羊、山羊、猫、兔等等。
在治疗一种具体的功能失调或疾病中，有效的BDNF蛋白、肽片段、衍生物或抗体用量决定于该功能失调或病症的性质，并能够通过标准的临床技术来测定。如有可能，首先在体外，例如在前面描述过的BDNF生物测试***中，然后在人体试验以前在有用的动物模型***中确定本发明药物组合物的剂量-响应曲线是可取的。本发明一个具体实施方案中，基于体外的数据，在促进感觉神经元存活中有效的一个药物组合物应提供一个5-25ng/ml之间、最好在10-20ng/ml BDNF之间的局部BDNF蛋白浓度。在本发明的另一个具体实施方案中，在促进多巴胺能或胆碱能神经元的生长和存活中有效的一个药物组合物可以提供一个约在10ng/ml和100ng/ml之间的局部BDNF蛋白浓度。
引入的方法包括但不限于皮内的、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下的、口服以及鼻内的方式。此外，将本发明的药物组合物通过适当途径、包括脑室内和鞘内注射而引入中枢神经***是可取的；脑室内注射可以通过一种脑室内导管例如接到储液器、如一种Ommaya储液器的导管而易于实施。
另外，将本发明的药物组合物局部给药到需要治疗的区域也是可取的；也可以通过例如，但不限于，在外科手术期间通过注射、藉助于导管或藉助于植入物而局部注入，所述植入物是多孔的、非多孔的或胶质的材料，包括膜，如硅橡胶膜，或纤维。
本发明也提供通过脂质体，微粒或微胶囊，而给药的含有BDNF蛋白、肽片段或衍生物的药物组合物。在本发明的各种实施方案中，使用这种组合物以达到BDNF和BDNF相关产品的持续释放是有用的。
预计也有可能把主动产生BDNF、BDNF相关物质、BDN对抗物、或抗BDNF抗体的细胞导入到需要增加或减少BDNF浓度的区域中。
6.从猪脑源神经营养因子cDNA的分子克隆以及特征。
在组织中极稀少量的BDNF蛋白排除了使用标准方法克隆BDNF基因。取而代之的是利用DNA放大工艺将有限量的蛋白序列数据扩大，其法如下：
(i)由公斤量的猪脑中纯化微克量的BDNF
(ii)通过蛋白质微量定序技术分析纯化的BDNF并确定了一条36氨基酸残基组成的氨基酸序列。
(iii)基于在(ii)中确定的氨基酸序列，合成一些寡核苷酸并在利用猪上丘cDNA作为模板的聚合酶的链反应作为引物使用来放大编码了规定氨基酸片段的DNA。
(iv)对(iii)的DNA反应产物进行定序，并且
(v)合成相应的寡核苷酸引物，并用于用猪上丘CDN的聚合酶链反应，以产生代表编码了原始的36氨基的片段序列的BDNFmRNA上游以及下游DNA的重叠片段，这样，猪BDNF完全的编码区已分子克隆在两个重叠片段中。
这些步骤每一个的详细细节，以及BDNF基因的进一步表征列于下面：6.1.材料和方法6.1.1猪脑BDNF的纯化
通过基本上与Hofer和Barde(1988，Nature.331.261-262)所提出的一样的方法来完成猪脑BDNF的提纯。
使用Ultra-Turrax均化器，在pH6.0，含有1mM EDTA的0.2M磷酸缓冲液中，新鲜加入甲苯磺酰氟(1mM)，按1Kg猪脑2升缓冲液的比例，均化6Kg猪脑，用1NHCl将上清液pH调到pH4.0，并在4℃搅拌2小时，在20,000×g下离心25分钟后，合并相当于3Kg脑的上清液(用1NNaOH调到pH6.0)，与1升已用pH6.0的0.1M磷酸钠平衡过的预膨胀的羧基-甲基-纤维素搅拌2小时。用总体积为20升的pH6.0的0.1M磷酸钠冲洗二次后，将浆料倒进柱内，并且含有0.13MNaCl的同样缓冲液洗涤过夜。用含有0.5M NaCl的磷酸盐缓冲液洗脱活性组分，然后对2×5升的pH6.8的5mM磷酸钾溶液进行透析。将由处理2×3Kg原料所得到的透析组分加到一个130ml床体积的羟基磷灰石柱上，该柱预先已用pH6.8、5mM磷酸钾的溶液平衡过。然后用由500ml、5mM和500ml、700mM磷酸钾(两者pH都是6.8)所组成的线性梯度液提洗柱子，在约500mM磷酸钾附近洗脱BDNF活性物(参阅Barde等人，1982，EMBO J.1：549-553)。通过加入1.0M磷酸钾，将收集的活性组分调节到700mM的最终磷酸钾浓度，并加到用pH6.8的700mM磷酸钾平衡过的5ml苯基-琼脂糖柱上。用40ml同样的缓冲液洗涤后，用0.1M磷酸钾、pH6.8的溶液洗脱BDNF活性物，并对蒸馏水透析和冻干。在加到含有线性(不是指数性)梯度10-25％丙烯酰胺的SDS-凝胶上以前，将冻干物料溶解于含有0.1％SDS而没有硫基乙醇的SDS-凝胶电泳试样的缓冲液中，按Barde等人(1982，EMBO J.1：548-553)所述那样进行。在电泳分离完成后，将凝胶用考马斯兰短暂地染色(10分钟)，脱色20分钟，切下迁移到细胞色素C水平上的带段，并从凝胶中电泳洗脱。按Barde等人(1982，EMBO，J.1：549-553)所述，去除SDS。通向BDNF微定序分析的最后纯化步骤有所改变(按照Hofer和Barde 1988，Nature 331：261-262)，不使用凝胶电泳作为纯化的最后步骤。6.1.2蛋白定序分析
对BDNF或者直接进行序列分析(用氨基酸分析测定为55微微摩尔，最初得到的40微微摩用于氨基末端的组氨酸)或如下被切开：按下面方法切开5-10μg BDNF(由5个不同制剂得到)V8：将1μg S.aureusV8(Miles)加到pH8.0，含有10％乙腈的0.2M碳酸铵中的5μg BDNF(总体积：50μl)中并在室温下保温过夜。胰蛋白酶：将1μg TPCK处理过的胰蛋白酶(牛胰，Sigma型XIII)加到在含有10mM CaCl2的Tris-HCl(0.1M.pH8.0)的8μg BDNF中(总体积：40μl)并在37℃保温过夜。溴化氰(CNBr)：用10％(W/V)CNBr的70％(V：V)甲酸(最终浓度)，将10μg BDNF在室温下保温3小时(总体积：60μl)。在反应结束时，加入500μl水后，将样品在高速真空器中浓缩到50μl。和5μlβ-巯基乙醇一起加入50μl Tris-HCl(1.0M，pH8.0)，并在37℃将样品保温过夜。在加入5μl碘代甲烷后，在高速真空器上蒸发样品至干。在CNBr***后发现必需对BDNF还原和烷基化：通过HPLC和Swank-Munkres SDS-凝胶电泳(Swank和Munkres，1971，Anal.Bio-chcm.39：462-477)发现，不还原就得不到片段。这表明在BDNF中有二硫化桥键存在，并且被安排得使切开不会引起游离的肽。全部***后，干样品再悬浮在0.1％三氟乙酸(TFA)中并加到一个反相C8微孔(microbore)HPLC柱上，(Applied.Biosystems公司提供)，用60分钟的0-60％在0.1％TFA中的乙腈梯度，按0.1ml/分速度洗脱肽。用一Waters 441紫外检测器在214nm上检测。按照Hewick(1981，J.Biol.Chem.256：7990-7997)和Hunkapillar(1983，Methods Enzymol.91：227-236)，通过在气相微定序仪(470型，Applied Biosystems)上通过自动Edman降解这些肽来定序。PTH氨基酸的检测是按照Lottspeich(1985.J.Chroma-togr.326：321-327)的描述进行的。6.1.3.DNA模板的制备
按照Herrmann和Frischauf(1987，Methods Enzymol.152：180-183)的方法分离猪的基因组DNA。
由6g猪脑上丘样品制得总RNA以制备cDNA，在当地屠宰场获得组织样品，进行分离并在液氮中冷冻。使用标准方法(Okayama等人，1987，Methods Enzymol 154：3-28)以提取RNA。使用了以A，C或G作为端3′核苷酸(Oligo 3，用于匹配一个3′聚一A延伸段并含有BamHI、EcoRiI和PstI识别位点)的CGGATCCGAATTCTGCAGTTTTTTTTTTTT引物混合物，用Moloney鼠白血病病毒的反转录酶转录80μg总的RNA(BRL，按照制造商的说明，除了加入1μlRNasin并删除放线菌素D.有所不同)。6.1.4.聚合酶链反应
按照Saiki等人(1985，Science 230：1350-1354)所描述的方法进行聚合酶链反应(PCR)。6.2.结果和讨论6.2.1.蛋白微定序分析结果
蛋白微定序分析结果列于表IV
                表IV
实验所测定的BDNF肽序列N-端        HSDPARRGELSVV8          XVTAADKKTAVDV8          KVPVSKGQLKQYFYECNBr        XGGTVTVLEKVP(V)(S)CNBr        GYTKEGXRGIXRGI胰蛋白酶    (T)AVDMSGGTVTVLEK胰蛋白酶    ALTMDSK.
合并序列VT AADKKTAVDMSGGTVTVLEKVPVSKGQL KQYFYE，下面划线的氨基酸代表了由在PCR中使用的寡核苷酸引物编码的序列；参阅6.1.2节。
这些氨基酸序列的四个邻接段是用Edman降解法测定的，而这4个邻接段又可用于推断代表约三分之一完整氨基酸序列的36个氨基酸序列。6.2.2.寡核苷酸的合成以及用PCR来获得编码一个氨基酸片段的DNA。
基于分别邻近上面6.2.1节所描述的具有36个氨基酸残基片段的氨基端和羧基端末端的6个氨基酸段的编码序列，化学合成二个完全简并的聚17寡核苷酸引物。特别是，化学合成二个独立的基于序列AADKKT(有义)和KQYFYE(反有义)(在表III中，下面划线的)的聚17寡核苷酸[相应于全部可能的密码子并被称为oligol(寡1)和oligo2(寡2)]混合物，并将150微微摩的每种引物加到1μg猪基因组DNA模板中。按照制造商(GeneAmp(商标)Perkin-Elmer Cetus)的说明，利用聚合酶链反应(PCR)进行35次放大循环。在94℃变性1分钟，引物在45℃退火2分钟，并在72℃将引物延伸2分钟。从3％琼脂糖凝胶(用溴化乙锭染色)中切割出该预定大小(101bp)的DNA带，并按Innis等人(1988，Proc.Natl.Acad.Sic.U.S.A 85：9436-9440)，所描述的那样进行不对称放大，使不论是Oligol或Oligo2都超过100倍。6.2.3.cDNA片段的核苷酸序列
通过双脱氧核苷酸链终止方法(Sanger等人，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.72：3918-3921)使用32P末端-标记的寡核苷酸1和2作为引物对所得的有义和反有义DNA片段进行定序分析。所观察到的核苷酸序列仅含有一个末被链终止密码子中断的开放式阅读框架，对这开放式阅读框架所推断的氨基酸序列与对猪BDNF的这一区域所测定的实际氨基酸序列是完全一致的。6.2.4.完整猪BDNF cDNA的克隆
猪BDNF的完整编码区被分子克隆在二个重叠片段中。为了制取BDNF cDNA的3′部分(相对于有义链)合成一种含有准确的有义链BDNF序列的自上述区域内的21个碱基的聚30寡核苷酸引物，用作为“有义引物”这引物的核苷酸序列是Oligo4(寡4)即(5′)AAACTAGTC GACGGCAGTGGACATGTCGGG(3′)(下面划线的表示对应于BDNF从图1中643位置到663位置的有义链，编码了氨基酸序列Thr-Ala-Val-Asp-Met-Ser-Gly(Gly密码子的最初二个碱基)。还包括了在这一引物5′端的另外9个核苷酸以提供方便的SpeI和SalI限制性核酸内切酶切割位点供分子克隆用，一个三褶的变性聚31寡核苷酸引物被设计成与前面是cCNA有义链的任何一个核苷酸(T，G或C)的聚A延伸段是互补的，并含有限制性核酸内切酶BamHI、EcoRI和PstI的识别位点。这种“反有义”引物(寡3)的序列是(5′)CGGATCCGAATTCTGCAGTTTTTTTTTTTTX(3′)，其中X＝A，C或G。该合成的寡核苷酸引物是用于通过PCR而放大由上述猪上丘cDNA制剂的序列。具体地说，3′放大的DNA是通过在PCR反应中使用10μl反转录反应，150微微摩的有义引物(Oligo4)和150微微摩Oligo3(寡3)作为反有义引物而制得的。对放大的DNA产品进行Southern印迹分析，切割给出具有32P-末端标记的寡核苷酸AAGGATCCTGCAGTTGGCCTTTCGAGACGG(寡5，在下面描述的5′反应中作为反有义引物，并含有BamHI和PstI的识别序列)，杂交倍号的带段，用玻璃乳(glass milk)方法[基因Clean(商标，用EcoRI和SalI消化，克隆入Bluescript SK+质粒(strata-gene)]提取，并进行序列分析。
为了获得BDNF编码序列的其余部分(上游或5′部分)，按上所述制备cDNA，并利用末端脱氧核苷酸转移酶将多-A尾端加到5′端上。每个含有12个接续的T残基延伸段的三个31-聚寡核苷酸的同样混合物被用于给出与这些添加的多-A尾端互补的引物。合成一种独特的、含有与BDNF编码序列的互补链相对应的17个碱基的并具有限制性核酸内切酶BamHI和PstI识别位点的30-聚寡核苷酸引物。这种引物的序列是(5′)AAGGATCCTG CAGTTGGCCTTTCGAG ACGG(3′)(上面的寡5，下面划线的表示与BDNF编码序列从图1位置709到693的有义链互补的区域)；这相当于编码了氨基酸序列Pro(密码子的最后一个碱基)-Val-Ser-Lys-Gly-Glu的一段。将该引物加到多-A为尾端的cDNA上，并如上一样，通过PCR进行放大。用PstI切割反应产物并克隆进Bluesoript载体中，用双脱氧核苷酸链终止方法测定核苷酸序列。6.2.5.猪BDNF cDNA的核苷酸序列
由重叠的猪BDNF cDNA克隆所测定的组合核苷酸序列与所推断的氨基酸序列一起示于图1。该序列包括一个252氨基酸多肽的开放式阅读框架。根据在同一阅读框架中开始36碱基对的上游，有二个相邻的链终止密码子(TAG-TGA)，识别出起始因子Met密码子(ATG)。通过对纯化蛋白直接序列分析而测得的猪BDNF的氨基终端相当于这种多肽的残基His134。因此，该定序分析的数据表明，成熟的BDNF是由前体多肽通过加工而产生的。残基His134是紧跟序列Arg-Val-Arg-Arg。这样一些由一个碱性氨基酸残基接着-中性残基然后二个更加碱性的残基组成的序列被表明是前体多肽蛋白水解加工的靶位点。成熟的BDNF被推断的氨基酸序列预示出了一种带碱性电荷(pI＝9.99)的具有119个氨基酸的蛋白质(分子量为13511道尔顿)，其性质与上面通过二维凝胶电泳分离后进行生物活性因子测定所表征的BDNF相一致。通过蛋白微定列分析所测定的部分BDNF的氨基酸序列(总数为64个氨基酸残基)与由cDNA克隆的核苷酸序列所推断的氨基酸序列(在图1中下面划线的)完全相同。前体多肽的序列与至少按二步处理是相一致的：首先，一个大概18个残基的信号肽可以从氨基末端切割，接着在Arg 133和His 134之间***以放出成熟的多肽。如果这模式是正确的，则前体可以规定为prepro BDNF。7.实施例：BDNF基因是不同于在各种脊椎动物种类中的NGF基因7.1材料和方法7.1.1.NGF和BDNF DNA探针的制备
一种含有编码了成人NGF的合成基因的质粒，含有正常人NGF，其编码序列具有少量保守的密码子取代物以引入合宜的限制性核酸内切酶***位点，这种质粒是由英国Biotechnologies股份有限公司购得合成一对18-聚寡核苷酸引物使得可以通过PCR而放大这种基因的一个270碱基对片段，相当于氨基的残基9-111的编码区。为了制得一种标记的DNA探针，使用32P-dCTP进行10次循环的PCR反应。通过同样方法制得BDNF探针，不同的是使用猪的基因组DNA作为原始模板来进行放大，并且被放大的片段相当于成熟BDNF的氨基酸28到111的编码区。合成一种相当于氨基酸106-111区域的互补链(反有义)引物，并具有序列(5′)ACATACACAGGAAGTGTC(3′)。对氨基酸残基28-33[(5′)GCAGTGGACATGTCGGGT(3′)]区制备一种有义链寡核苷酸引物。用这两个探针在严格条件下在68℃2×SSC中进行southern印迹杂交(Southern，1975，J.Mol.Biol.98：503-517)。7.1.2.由不同种类动物得到的BDNF基因的序列分析
上面所描述的，***成熟的猪BDNF的氨基酸28-111编码区的同样的两个18-聚寡核苷酸，被用作引物以在标准PCR条件下，放大猪、兔、鸡和人的基因组DNA的252碱基对片段，而对所得DNA反应产物通过双脱氧核苷酸链终止方法(Sanger等人，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.72：3918-3921)进行定序分析。在某些情况下，切割出放大DNA的带段并在琼脂糖凝胶电泳后进行提取，在定序分析以前再放大。在另一些情况下再放大并不是必需的。7.2.结果和讨论
在本发明之前，仅从猪中纯化了BDNF蛋白。最重要的是要明确证明BDNF并不就是猪神经生长因子的β亚基(β-NGF，或这里简称为NGF)，其纯化和分子克隆至今尚未报导过。尤其关键的是因为过去所报导的猪BDNF的物理性质实际上与各种动物种类得到的β-NGF单体的性质是相同的。对猪BDNF缺乏中和抗体和以前缺乏对猪BDNF的氨基酸或核苷酸序列的情报，使得不可能测定在BDNF和NGF之间的确切关系。可以想象，在BDNF和NGF之间所观察到的生物活性的区别可能，例如，只是反映出在猪和某些其它动物品种(如小鼠)之间NGF的差别，或者可能由于不同组织中(如猪脑与小鼠唾腺比较)NGF蛋白分子有差别的修饰引起的，或者由于猪脑纯化期间在某些步骤中无意引入该蛋白的修饰引起的。
如果发现BDNF明显地不同于NGF，则测定BDNF是否存在于其它物种之中，特别是人中，是极有意义的。在本发明之前，对这一点得不到任何的情报，因为BDNF仅从一个物种中被纯化出来。在各种粗提取物和条件介质中存在的明显不同于NGF的神经营养性活性，并不暗示存在一种相同于或基本等同于猪BDNF的物质。
预测的猪BDNF氨基酸序列与许多动物种类(人、牛、quinea猪、鼠、鸡和蛇)已知的NGF序列的比较表明与NGF彼此之间比较，BDNF是较少地与任何脊椎动物NGF紧密关联(图2)。成熟BDNF最初结构的一个显著特点是它与NGF的相似性；在NGF序列中仅引入3个间隙优化匹配的情况下，51个同一性对不同NGF(从蛇到人)和BDNF是共同的(图2)。重要的是，这些同一性包括了全部6个半胱氨酸残基。虽然BDNF的二硫化物桥接的确切排列至今还不知道，但明显的是，这种桥接是存在的(表III，说明)。在BDNF中发现的3个色氨酸和2个苯基丙氨基酸也在NGF中的同样位置上被发现。我们也注意到，在哺乳动物NGF和BDNF中的同样位置上有6个天门冬氨酸残基(在BDNF的7个中)和7个缬氨酸(9个中)。这5个氨基酸引起这种蛋白质之间大约一半的氨基酸同一样。相反，在BDNF和所有的NGF之间具有一些显著的区别：除了已提及的三个间隙以外，在所有NGF中还有21个位置，在这些位置上氨基酸都是一样的，但在BDNF中是不同的。
大多数BDNF的前体序列与NGF无关，有两个例外，BDNF的推断的分泌信号序列表明有5个氨基酸同一性(18个氨基酸中)以及与小鼠NGF信号序列的总的明显的相关性，在该序列中已证明，切开发生在转译起始蛋氨酸后的18位置上发现的丙氨酸残基后(Edwards等人，1988.Mol.Cell.Biol.9：2456-2464)。似乎很可能是，在BDNF 18位置上也被发现的丙氨酸代表了一个用于取下BDNF信号序列的潜在的切割位点。与NGF的其它相似性开始于唯一的N-糖基化同样序列(图1中下面有双线的)，相当于天门冬氨酸126。这个天门冬氨酸是位于产生成熟BDNF的切割位点前的8氨基酸。在几种NGF中也发现同样的排列，以及序列Arg-X-Basic-Arg作为该前体的最后4个氨基酸(Schwarz等人，1989 J.Neurochem，52：1203-1209)。
各种脊椎类动物的互有区别的基因编码了NGF和BDNF的证据是通过由分子克隆的人NGF和猪BDNF制备DNA探针、并用由限制性核酸内切酶EcoRI消化的基因组DNA进行Southern印迹杂交而获得的。对以下来源的基因组DNA进行分析：人、猴、大鼠、小鼠、狗、牛、兔、鸡以及酵母。用EcoRI消化DNA，并在两个一样的滤器上，用一个32P-标记的人NGF探针和一个猪BDNF探针，通过Southern印迹进行分析。在被试验的所有有机体中，除了酵母外，用每个探针都观察到单独一个带段。在多数情况下，这些在任何一种有机体中与NGF和BDNF探针杂交的带段具有不同的电泳迁移率，虽然在某些情况下(如小鼠DNA)，杂交到NGF和BDNF探针的EcoRI片段具有接近同样的大小，并在所采用的电泳条件下不能被分辩(图3)。
由猪、鼠、鸡、和人得到的基因组DNA通过PCR放大成熟BDNF的部分编码序列并测定该核苷酸序列。由猪基因组DNA放大的区域的DNA序列分析正好肯定了同猪脑cDNA得到的分子克隆所得到的序列结果。对这252碱基对片段的鼠、人和鸡BDNF基因组序列(图5)也进行了测定。值得注意的是，在鼠和人中，对至少氨基酸28到111区域所推断的氨基酸序列是与猪BDNF的序列相同，虽然在不同动物种类中观察到一些核苷酸的差别(例如，在密码子的第三位置的保守变化)。在鸡中，在这一区域内观察到单独一个氨基酸的取代；与哺乳动物BDNF中的蛋氨酸比较，而在鸡中该成熟蛋白的第61残基是赖氨酸。序列数据，和上面所描述的Southern印迹杂交试验一起，给出了明确的证据，证明BDNF被一个高度保留的、不同于编码NGF的基因所编码。8.实例：BDNF RNA在神经元组织对照非神经元组织中的表达8.1.材料和方法：8.1.1.RNA的制备
按照Okayama等人(1987，Methods Enzymol.154：3-28)方法由成熟雌性小鼠中提取全RNA。简而言之，将冻组织在5.5M硫氰酸胍中均化，离心溶胞产物以除去碎片，上清液放到调节到密度为1.51g/ml的三氟乙酸铯的垫上。在SW27型的振荡桶回转器(swinging bucket roter)(Beckmann)中，以125,000×g的转速离心24小时后，将RNA重新悬浮，用乙醇和8M乙酸铵沉淀并在-70℃下贮存。按照Lehrach等人(1977，Biochemistry 16：4743-4751)的方法在1.3％琼脂糖-甲醛凝胶上进行电泳。将RNA转移到尼龙膜(Hybond-N，Amersham)并在1ml含有50％甲酰胺的2×SSC中，使用32P-cRNA小鼠BDNF探针(107cpm，参阅下面)。在62℃杂交过夜。在0.1×ssc中，在65℃下洗涤60分钟，洗涤后，斑点用0.1μg/ml RNAseA(pharmacia)在室温下保温60分钟，该薄膜在-70℃暴露(用增强屏)48小时。8.1.2.cRNA探针的制备
用2个单独的BDNF寡核苷酸筛选小鼠脑cDNA库，分离出双阳性克隆(double.positive clones)并亚克隆到Bluescript SK+质粒(strata gene)的EcoRI位点中。测定了相当于猪序列的核苷酸350到829(见图1)的核苷酸序列。在这序列中，在鼠和猪BDNF之间发现总共只有4个氨基酸差别，这表明在猪和鼠BDNF之间这一区域明显程度的保守性。使用这种模板和T3聚合酶(promega)制备单股RNA探针，这种探针的特异活性度为108cpm/μg。8.2结果和讨论
用Northern印迹分析来评估BDNF mRNA在神经元组织与非神经元组织中表达的对照。使用鼠组织进行Northern印迹分析，可以比猪组织更快地处理RNA的提取。在脑(图4)和脊柱索(数据未列出)中，在约1.45kb处，32P-cRNA探针检测到一个单独的信号。重要的是，在任何其他组织，包括肾、肠、肺、肝、脾、心和肌肉都没有检测到信号(图4)。如果猪mRNA的大小类似乎鼠的，则示于图2的cDNA序列代表了80％以上的完整mRNA序列。
说明BDNF生理学特性的一个重要的观察结果是，编码这种蛋白质的mRNA仅仅在中枢神经***中发现、而在7种非CNS组织中未被发现。BDNF mRNA不但在全脑(图4)中发现，而且也在脊柱索和上丘中发现(示于图1的序列完全由上丘cDNA模板得出)。这些资料支持了这样的想法，即BDNF是靶衍生的神经营养性因子以及BDNF-应答神经元或者是CNS固有的或者与CNS结构直接相连系。事实上，迄今已知对BDNF应答的所有神经元或者伸进CNS，如背侧根神经节或颅感觉神经节(Lindsay等人，1985，Dev.Biol.112：319-328；Davies等人，1986，J.Neurosci.6：1897-1904)，或者是CNS神经元，像视网膜神经节细胞(Johnson等人，1986，J.Neurosci.6：3031-3038)。很清楚，还需要进行详细的研究来调查CNS中合成BDNF位点的确切分布，但已清楚，在许多非CNS组织中发现的BDNF mRNA的分布是非常不同于NGF mRNA的分布(Heumann等人，1984，EMBO J.3：3183-3189；Shelton等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81：7951-7955)。9.实例：人和大鼠BDNF基因的分子克隆和表征9.1.材料和方法9.1.1基因组DNA和cDNA库
在λ-ZAP II的***网膜cDNA库是由Stratagene公司得到，在EMBL3/SP6/T7的人胎盘基因组DNA库由Clon-tech公司得到。在λgt11的人胎脑cDNA库由Clontech公司得到。在EMBL3/sp6/T7的大鼠基因组DNA库由Clontech公司得到。通过Sau 3A限制性核酸内切酶部分消化基因组DNA而制备两个基因组库并连结到载体的BamHI位点。在λ-ZAP II的大鼠脑cDNA库是由Stratagene公司得到。9.1.2.BDNF DNA探针的制备
在使用人基因组DNA的PCR反应中，使用上面节7.1.1中所描述的同样的寡核苷酸引物制备32P-标记的BDNF DNA探针，以放大人BDNF的残基28-111的编码区；同样地，使用大鼠基因组DNA作为PCR模板，制得大鼠BDNF-特异的32P-标记的探针。9.1.3.库筛选
按照标准方法(Benton和Davis，1977，Science 196：180-182；Maniatis等人，1978，Cell，15：687-701)在有硫酸葡聚糖的50％，甲醛和Denhardt溶液中，在42℃进行杂交，筛选入噬菌库。滤器在42℃下在50％甲酰胺、5×ssCPE、10％Denhardt溶液、0.5mg/ml鲑(Salmon)***DNA，0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖中被预杂交。杂交是在同样缓冲液中进行，不同的是Denhardt溶液是2％，鲑***DNA为0.1mg/ml，并省去SDS和硫酸葡聚糖。杂交以后，在68℃洗涤滤器，人BDNF探针被用于筛选人基因组DNA和视网膜cDNA库；大鼠BDNF探针被用于筛选大鼠基因组DNA和脑cDNA库。使用上面在7.1.1节所描述的方法而制备的人和大鼠NGF探针也用来筛选库。9.2.结果和讨论
从每个库至少对670,000个噬菌体进行了筛选，考虑到阳性人克隆被认为是那些与人BDNF探钟杂交而不与上述人NGF探针杂交的克隆。由人和大鼠两库中以一个与用每单倍体基因组一个拷贝表达BDNF基因相一致的频率获得BDNF基因克隆。对大鼠和人的这两个基因库，筛选了几乎一百万噬菌体。由大鼠基因组库中得到3个阳性的，而从人基因组库得一个。从人视网膜和大鼠脑cDNA库中得到的阳性克隆是以一个与基因表达水平很低相一致的频率被得到的；在大鼠脑cDNA中，在670,000中，识别出2个阳性的；在人视网膜cDNA库中，在670,000克隆中识别出一个阳性的。从人胎脑中所制备的商业性cDNA库中的670,000个中没有检测到阳性克隆。使用代表如上面7.1.2节所测定的来自人和大鼠BDNF编码区域内的准确序列的合成寡核苷酸引物对人BDNF cDNA和基因组克隆进行核苷酸定序分析。所得到的最长人cDNA克隆具有一个约1.6-1.8kbp的***物，正如所预料的，含有如上面下2节所描述的，在由人基因组DNA直接放大后被确定的该部分人BDNF的准确序列。这种cDNA(图5)克隆的详细的序列分析揭示了一个编码了一种247氨基酸多肽的开放式阅读框架，类似于、但不相同于猪BDNF的全长度的前体。在相当于成熟BDNF多肽的区域内(即从His134密码子到链终止密码子)，在所推断的氨基酸序列中没有发现差别；在猪和人之间的所有核苷酸取代对编码持异性而言都是保守的取代。推断的BDNF前体多肽的其余部分表明了有些氨基酸序列在人与猪之间是有差别的，最明显的是，在人BDNF基因中没有在猪中看到的6个接续的Ser密码子中的5个，导致一个稍短一些的多肽(247对照252个氨基酸)。
在载体EMBL3中所制备的库，在10-23Kbp之间，具有一些外源DNA的***物。在被详细分析的人基因BDNF克隆中确切的***物大小未被确定，但是该克隆含有单独一个与用于筛选库的标记的BDNF探针杂交了的约4Kbp的EcoRI限制性核酸内切酶片段，根据使用上面所述的猪BDNF探针进行人基因组DNA的Southern印迹杂交法的结果，这片段具有预期的大小。利用合成的寡核苷酸在人克隆上进行定序分析，该寡核苷酸代表了从噬菌体DNA模板引发DNA合成的cDNA序列。推断的人BDNF前体的编码序列的顺序被发现与人cDNA克隆中的一样，不同的是在prepro区的一个单独的核苷酸取代相当于在图5中核苷酸785上一个用蛋氨酸(ATG)取代缬氨酸(GTG)的氨基酸的取代。这种变化在人基因组中可以反映一个多态性。如同在人NGF基因情况下，在推断的人prepro BDNF的编码序列内，没有检测到***序列。大鼠cDNA序列数据也示于图5。10.实例重组体BDNF的表达10.1材料和方法10.1.1.BDNF表达载体的制备
相当于猪prepro BDNF的序列，是通过在用1μg猪基因组模板的PCR反应中使用寡核苷酸引物(每个150微微摩)ATAATCTAGATGACCATCCTTTTCCTT(有义)，ATAATCTAGACTATCTTCCCCTCTTAAT(反有义)，(每个引物有一添加的xbaI位点)而制备的。放大反应是按照所述进行，不同的是退火温度是50℃。用xbaI消化以后，放大的DNA被连接到质粒pCMV1的xbaI位点中以产生PCWV1-PBDNF-1(-表示图6中的有义取向并相当于表V中的cos+)，该质粒通过电击穿(electroporation)而引入XL-1细菌。10.1.2BDNF在COS细胞中的表达
用xbaI和Pst1从阳性克隆(用寡5杂交法检查，图2)中切下PCMV1-PBDNF质粒DNA。所得产物的大小使我们可以测定***物的取向，这两个质粒都用于通过磷酸钙方法(Chen等人，1987，Mol.Cell.Biol.7：2745-2752)来转染COS细胞，24小时后收集生长培养基。用上面详细讨论过的鸡胚背侧根神经节生物测定法测试BDNF活性。10.2结果和讨论
E8小鸡脊椎感觉神经元放在试验板上(每孔6,000个)，保温24小时，在24小时计数(Lindsay等人，1985，Develop.Biol.112：319-328)。数值是三次测定的平均值±标准偏差。以1ng/ml的浓度使用BDNF和NGF，在这浓度用任一因子都观察到最大的存活率。COS+是指用含有以有义取向的BDNF***物的质粒转染的细胞；COS-是指用含有反有义取向BDNF***物的质粒转染的细胞。COS是指没有转染的细胞，在稀释度高于1∶20，无论用COS-或COS的条件培养基都看不到高于对照的存活。在所有不用NGF实验中，使用一种单克隆的抗NGF抗体(Korsching等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：3513-3516)，其浓度为1μg/ml。
如表V所示，只有从以有义取向载有PCMV1-pBDNF质粒的COS细胞的培养物中所得到的培养基才伴随有高于对照值的鸡感觉神经元存活率。因此，该重组体BDNF是生物活性的。再者，加入由猪脑分离出来的BDNF并不使感觉神经元的存活明显高于由单独重组体BDNF得到的存活水平，这表明重组体BDNF能够使BDNF受体饱和。还观察到如果与NGF一起使用，重组体BDNF对促进鸡感觉神经元的存活具有叠加或协同作用。
                    表V
培养的小鸡感觉神经元的存活COS培养基(最终稀释度)     1∶20     1∶50     1∶200COS+                            2,510±263  2,833±171COS-                   211±16COS                     250±87BDNF+COS+                       2,516±209NGF+COS+                        5,770±72单独  BDNF                       2,718±42411.实例：BDNF抗体的产生11.1材料和方法
一种命名为血清4的BDNF特异多克隆抗血清，是在一种NZ白兔中通过用合成肽免疫接种而产生的。11.1.1肽合成和连接到载体上
一个命名为B5的包含有34个氨基酸残基的肽，是用通常方法合成的。它具有以下的氨基酸序列，相当于成熟BDNF的33个残基(示于图1中完整的猪prepro BDNF序列的残基153-185)，需要时在氨基末端具有另外一个半胱氨酸残基(以斜体表示)，使得可以使用间-顺丁烯二酰亚胺苯甲酸-N-羟基琥珀酸亚胺(MBS)而连接到载体蛋白上：Gys-Val-Thr-Ala-Ala-Asp-Lys-Lys-Thr-Ala-Val-Asp-Met-Ser-Gly-Gly-Thr-Val-Thr-Val-Leu-Glu-Lys-Val-Pro-Val-Ser-Lys-Gly-Gln-Leu-Lys-Gln-Tyr。
使用双-重氮基联苯胺(BDB)，将B5肽连接到牛血清的清蛋白上。通过将46mg联苯胺-HCl(对-二氨基二苯-HCl，由Sigma公司购得)溶解于9.0ml0.2N HCl中制得新鲜的BDB。将35mgNaNO2溶解于1.0ml水中并加到该联苯胺溶液，在4℃搅拌1小时。将21mgBSA溶解于3.0ml的0.16M硼酸盐、0.13M NaCl，pH9.0的溶液中。将大约15mgB5肽溶解在pH0.0的1.5ml硼酸盐-NaCl缓冲液中。将肽溶液加到BSA溶液中并放在冰中。将1.0mlBDB加入BSA-肽溶液中，在搅拌下，于4℃保温反应混合物2小时；检测其pH值，需要时加入少量0.5M NaOH以保持在9.0的范围。在加入0.2ml 1％苯酚-缓冲液反应终止。过量试剂通过对磷酸盐缓冲的盐水(PBS)渗析而除去。11.1.2.免疫接种
按照下面所描述的方法进行对总共6只兔子免疫接种；
兔1和4-使用BDB，将肽B5，在其C-末端连接到BSA；
兔2和3-使用MBS，将肽B5，在其N-末端连接到BSA；
兔5和6-将肽B5与粉末状硝基纤维素混合。
在所有的情况下，第一次免疫接种使用在0.5mlPBS加上0.5ml完全弗氏(Freund)助剂和1mg免疫原(对兔5和6是100μg B5/500μg硝基纤维素)。这种混合物是在背上多个部位被皮下注射的。第二次免疫接种是在三星期后进行，与第一次一样，不同的是使用不完全弗氏助剂代替完全弗氏助剂。其后以4-6星期的间隔进行加强注射。将免疫接种后一星期的兔子放血，通过酶连接的免疫吸附剂测定法(ELISA)定期检查杭血清与纯B5肽的结合。11.1.3.结合到BDNF的抗体的检测
将在水中的100μg抗原(B5肽)加到在微滴板上的孔中并让它干燥过夜，然后短暂地用水洗涤，用100μg 1％明胶在室温下阻断30分钟。用蒸馏水洗涤孔三次，然后加入100μg抗血清，并在4℃培养过夜，然后将孔在PBS/0.05％Triton X-100中洗涤三次，之后，将100μg的过氧化物酶标记的抗-兔免疫测定样品(1/1000稀释度)加到孔中并在室温保温3小时。洗涤孔两次，加入100μg ABTS溶液[将10mg ABTS(Sigma)溶解在10ml 0.1M柠檬酸钠(pH＝4.0)加10μg H2O2的溶液中。]并保温约5分钟，直到显色。加入10μg 1％ NaN3，使反应停止。样品用水稀释到1∶5并在415nm测量其光密度。11.2结果和讨论，
由兔4得到的抗血清(血清4)表明有最高的滴定度(图7a)，并被用于以后的实验中。由血清4得到的抗体通过用硫酸铵沉淀被部分纯化，在搅拌下对部分抗血清中慢慢加入等体积的饱和硫酸铵，将溶液再搅拌15分钟，然后在2,000×g的转速下离心。沉淀在50％饱和的硫酸铵中洗涤二次，然后再溶解于体积相当于原来血清体积的PBS中。对几次更换的PBS进行透析而除去硫酸铵。透析后的溶液按1.0ml体积分成等分，并使用高速真空器speed-vac进行冻干。将血清4抗体的样品再悬浮在0.5ml水中并通过ELISA用肽B5测试其反应性，发现稀释度达1∶4,000还可以反应。
通过按上面所描述的免疫兔子的方法产生相当于猪BDNF的一个33氨基酸片段的合成肽(B5)的多克隆抗体。对合成肽显示最高滴定度的血清4，表明通过ELISA与由猪脑纯化的BDNF有反应性(图7b)。通过免疫印迹法也检测出弱的反应性(数据没有显示出)。但是，在对鸡胚背侧根神经节感觉神经元的生物测试中抗血清不能阻断BDNF的活性。12.实例：BDNF的新的生物作用
下面的观察表明，BDNF能够(i)保持CNS多巴胺能神经元的存活并诱发它完全区别的状态，(ii)保持CNS胆碱神经元的存活；以及(iii)抑制星形神经胶质细胞的增生。BDNF的这些生物作用以前未曾描述过。因为多巴胺能的神经元、胆碱能神经元以及星形神经胶质细胞、每一个都可能与神经的疾病和机能失调有关系。所以可以证明BDNF在治疗涉及这些细胞群体的神经病理学中是有用的。12.1材料的方法12.1.1培养多巴胺能黑质神经元的方法
由胚胞约13天-胚胞约15天的不同时期的大鼠胚脑中剖割出前侧的中脑。一般，在每个实验中使用2升。该剖割物溶液有以下的组成：NaCl，136.8mM，KCl，2.7mM，Na2HPO4.7H2O，8.0mM，KH2PO4，1.5mM，葡萄糖，6mg/ml，以及BSA0.1mg/ml，pH7.4。制备这些溶液并通过0.2μM多孔滤器过滤消毒。剖割是在非灭菌条件下进行的。一旦从所有的脑中切割下组织，该方法的其余步骤都是在无菌条件下进行。组织碎片放在一个35mm的培养皿中并用好的剪刀将其切碎。2ml含有0.125％胰蛋白酶的F-12营养培养基加到组织上，并在37℃保温。在结束这保温期时，将DNAseI加到该浆料中，使其最终浓度为80ng/ml。进行另一个同样的培养，然后将组织浆料加到8.0ml含有补充有2mM谷氨酰胺、6mg/ml葡萄溏，5单位/ml青霉素，5mg/ml链霉素和7.5％胎牛血清(FCS)的最小基本培养基(MEM)的生长培养基中。在桌面离心机(table top centrifuge)中，在室温下，以500转/分速度离心样品5分钟。吸出培养基，在细胞沉淀中加入2ml生长培养基。一支有1mm开孔的火抛光吸管用于捣碎细胞8次。使其余的组织碎片通过重力沉淀下来，取出小部分上层清液；通过在血细胞计数器中计数确定细胞数。测定细胞密度后，细胞按50,000/cm2的密度平放在组织培养平板上。
培养平板是在剖割的前一天制备的。组织平板(24孔，2cm2/孔)用多鸟氨酸(分子量为30,000-70,000g/mol)，0.5mg/ml，在室温，预涂覆3小时。平板用水充分洗涤，接着，用5μg/ml的小鼠昆布氨酸在室温下处理3小时。然后如前一样用水洗涤平板，并在含有5％CO2；95％空气的潮湿气氛下；在有生长培养基存在的条件下，在37℃保温过夜。在第二天除去平板上的培养基并再放入新鲜的生长培养基。
一旦细胞平铺在培养平板上，细胞就放入设定在37℃和5％CO2/95％空气下的恒湿箱中保持24小时。培养基换成具有以下组成的无血清配方(SFM)：Basal.Eagle培养基和含有葡萄糖(33mM)、谷氨酰胺(2mM)，NaHCO3(15mM)，HEPES(10mM)，的营养混合物F-12，按1∶1(体积∶体积)比例的一处混合物，加有胰岛素(25μg/ml)、转铁蛋白(100μg/ml)，腐胺(60μM)，***(20nM)、***盐(30nM)、青霉素(5μ/ml)、链霉素(5mg/ml和T3(30nM)。在某些实验中，在培养第2天，培养基换成SFM后，在培养基中加入纯化的BDNF。
用于培养多巴胺能神经元的溶液是用取自Milli-Q试剂水***的水制备的。组织培养基配方是通过Gibco实验室(Santa Clara，Cali-fornia)得到的，胎牛血清(批号43N1086)和小鼠昆布氨酸也由那里得来。全部其它培养基组成都是从Sigma Chemical(st.Louis Mo)购得，而且是细胞培养测试级。多鸟氨酸和DNAseI也是从Sigma得到。胰蛋白酶是由Worthington(Freehold.NJ)得到，批号为3667。商购化学试剂是分析纯的，购自Baker Chemical(Phillipsburg.NJ.)在这些试验中所用的BDNF是按照Barde等人(1982，上述)的方法，由Y.A.Barde博士从猪脑中纯化的。12.1.2.前中脑培养的免疫细胞化学染色的方法
对每个实验都是新鲜制备固定溶液，对酪氨酸羟化酶(TH)的染色，固定剂是4.00％多聚甲醛的Sorenson磷酸盐缓冲液。Soren-son缓冲液是通过在0.2M Na2HPO4原储液中加入0.2MKH2PO4溶液直到pH达到7.3。然后将多聚甲醛加到溶液中并短暂地加热，使之溶解，在使用前冷却至室温。
在开始步骤时，通过轻轻吸取从培养皿中移去培养基，并轻轻地将适当的固定溶液加到皿中。室温保温20分钟，接着在轻轻转动下，在Sorenson磷酸盐缓冲液中洗涤三次，每次5分钟，然后，在室温，在轻轻转动下，将细胞在急***液中培养30分钟。要对TH染色的培养物的急***液是由含2％标准马血清的Sorenson磷酸盐缓冲液组成。接着，培养物是在渗透化缓冲液中，在室温和轻微转动下，保温30分钟，对于要TH染色的培养物，该溶液由含0.2％皂苷和1.5％标准马血清的Sorenson缓冲液组成。接着渗透化步骤，培养物在有初生抗体存在下在4℃保温过夜，抗大鼠TH的抗体是小鼠的单克隆同型抗体IgG2a。它是在10mM NaPO4、50.mM NaCl、0.2％皂苷、pH7.5的溶液中，以40μg/ml被使用的。在初生抗体保温后，培养物在适宜的渗透化缓冲液中洗涤五次，每次15分钟，下一步，培养物与结合到生物素上的次生抗体，即生物素化的马抗-小鼠IgG一起培养。这次培养是在室温下，在轻转动下进行2小时。接着与上面描述过相同地进行洗涤，然后将培养物在有预先形成的抗生物素蛋白-生物素化的马萝卜过氧化酶(horse radish peroxidase)络合物(ABC试剂，Vectorlaboratories，Burlingame，CA)存在下培养，该络合物按照制造商的方法制备的。在室温和轻轻转动下保温30分钟后，培养物如上面所述那样进行洗涤。接着，将培养物与pH7.3，含有0.5mg/ml二氨基联苯胺和0.01％过氧化氢的55mM Tris-Cl一起培养。使反应产物的展开进行2-5分钟。之后，移去溶液，用冰冷的PBS洗涤培养物几次，然后确定阳性细胞/cm2的数目。
多聚甲醛和戊二醛是Fluka Chemical中得到。含有标准血清(用作阻断剂)、生物素化，亲和一纯化的抗-免疫球蛋白、抗生物素蛋白DH、和生物素化HRP-H的Vectastain药盒是由Vectorlaboratories中购得。二氨基联苯胺是由BRL(Gaithersberg，MD得到)。12.1.3.用于测量在前侧中脑培养物中3H-多巴胺摄取量的方法。
按照Dal Toso等人(1988，J.Neurosci.8：733-745)所描述过的，并稍加修改进行3H-多巴胺(3H-DA)的摄取。摄取缓冲液具有以下组成；NaCl 136.8mM，KCl，2.7mM，Na2HPO47H2O，8.0mM，KH2PO4，1.5mM，葡萄糖，5.0mM，CaCl2 1.0mM、MgSO4，1.0mM，抗坏血酸，0.1mM，优降宁，0.1mM、pH7.4。需要时在摄取缓冲液中可加入5.0μM苯托品甲磺酰酯(BZT)。
细胞用预热(37℃)的摄取缓冲液洗涤一次，并在每2cm2孔中放置0.4ml摄取缓冲液。然后在37℃，将培养物预保温5分钟，在这预保温结束时，加入0.1ml在摄取缓冲液中的3H-DA(250nm，40Ci/mMol)，使3H-DA在缓冲液中的最终浓度为50nM。培养物在37℃保温15分钟，接着在4℃用摄取缓冲溶液洗涤4次，每次0.5ml。同样用冰冷的PBS(10mM NaPO4；150mM，NaCl pH7.6)再洗涤二次。在最后一次洗涤完成后，在细胞中按0.2ml/2cm2孔加入0.5N NaOH，并在室温下放置2小时，然后收集NaOH提取物，用10ml的“ultimagold”闪烁液体在闪烁计数器(Packard.Ls.500TD)中计数。摄取率定义为在有5μM BZT存在时摄取被废除。一般来说，这代表了所观察到的总摄取的70-90％。
3H-DA由NEN(Boston，MA)得到。抗坏血酸盐，优降宁、BZT和葡萄糖都是由Sigma(St.Louis；MO)得到。ultimagold闪烁液体是由Packard(Sterling.VA)购得。12.1.4产生底前脑胆碱能神经元培养物的方法
底前脑胆碱能细胞的最初培养物是由胚胎期17天的大鼠中产生。具体地说，用于本研究的胆碱能的神经元是从中间隔核和布罗卡氏(Broca)对角带的核中产生的。这种神经元群体最初伸向海马。分离的混合培养物(神经元和神经胶质)是由以下方法产生的，剖割隔区不带四周的组织，并从胎脑中移出。集中这种组织块，用剪刀剪碎，用12.5％胰蛋白酶在37℃处理20分钟。胰蛋白酶通过在平板培养基[Dulbecco改性的Eagle培养基(DMEM)，含有1％青毒素和链霉素，5％马血清和1％N3，一种激素添加剂]中稀释而失活。通过用火抛光的巴斯德(pasteur)吸管研磨被消化的组织碎片制备一种单细胞悬浮液。分离的细胞在血细胞计数器上计数，并以适当的密度平铺在平板培养基中。平铺5-6小时后，在培养物中加入试验配位体，细胞在体外生长10天，每隔3天换一次培养基。12.1.5.胆碱乙酰转移酶测定法
在处理期以后，细胞或者用于胆碱乙酰转移酶(CAT)的酶测定，或者按以下方法进行对CAT的免疫组织化学染色。CAT的单克隆抗体是从Boehringer Mannheim Biochemical Co.购得，并在别处已表征过。在试验期结束时，用DMEM将细胞冲洗两次。培养物用一个两步法固定；在10分钟的保温期间，在50μl DMEM中加入50μl 4％多聚甲醛。移去这种溶液，再放置100μl、4％多聚甲醛并在室温继续保温30分钟。固定后，细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗三次，通过与皂苷(0.5mg/ml)一起保温30分钟而进行渗透化。用PBS洗涤三次而除去去污剂，加入5％标准兔血清的阻断溶液30分钟。将最初的抗体按1∶3的稀释度加入到1％标准的兔血清，然后除去阻断溶液，培养物在4℃保温过夜，用PBS洗涤除去含有最初抗体的溶液，通过Vectastain“ABC”方法检测结合的免疫球蛋白。二氨基联苯胺四氢氯化物(DAB)用作过氧化物酶反应的基质，该反应一般要进行1-5分钟。用0.1M tris-HCl(PH7.2)冲洗培养物两次而使反应停止。培养物贮存在pH7.6、含有0.15M NaCl、42％甘油和0.15％Zephiran(Pierce Chemical Co.，Rockville，IL)的50mM tris中，温度在4℃。12.1.6.产生纯化的星形神经胶质细胞培养物的方法
主要按照McCarthy和Devellis(Mc Carthy K.D.和Devellis，J.1980，J.Cell.Biol.85：890-902)的方法由出生后1-2天的大鼠海马中制备纯化的神经胶质培养物。从5个幼畜中取出海马并用剪刀剪碎。将组织块于37℃下在2ml 0.125％的胰蛋白酶中消化20分钟。用平板培养基[10％胎牛血清Gibco.DMEM.0.5％青霉素(5000mcg/ml)和0.5％谷氨酰胺)稀释而使蛋白酶失活。通过将消化的组织碎片流经一狭窄的巴斯德吸管而制备一个单细胞悬浮液。细胞在900rpm转速下离心5分钟而沉淀，再悬浮在平板培养基中，然后在血细胞计数器上计数。单细胞悬浮液分到3个75cm2的组织培养瓶中，细胞生长到约有80％连生。然后将细胞通过胰蛋白酶化方法进行分培养，该方法类似于上面刚刚描述的方法。对神经胶质细胞计数并按10000细胞/0.9cm2的密度平铺。12.2.结果12.2.1.BDNF对前侧中脑培养物中的酪氨酸羟化酶的影响
按上面12.1.2节所述的免疫细胞化学染色被用于测量BDNF对一些酪氨酸羧化酶.(TH)阳性细胞(图8)的影响。在BDNF刺激的前侧中脑细胞培养物中，到第8天观察到高于对照200％的最大增加。在BDNF-刺激的培养物中在培养3天时观察到极少量的增加。12.2.2.BDNF对由前侧中脑培养物摄取的多巴胺摄取物的影响
如上面12.1.3节中所描述的那样，按照Dal Taso等人(1988，J.Neurosci.8：733-745)稍加改变的方法测量3H-多巴胺(3H-DA)的摄取量。在BDNF刺激前侧中脑培养物中到培养第8天观察到多巴胺摄取量稍有增加(图9)12.2.3.BDNF对由前脑胆碱能神经元表达胆碱乙酰转移酶的影响
图10(a)描述了体外生长期12天后BDNF对一些CAT阳性细胞的影响。当EC50计算为10ng/ml时，加100ng/ml BDNF，观察到CAT细胞数增加5.9倍。作为一个阳性对照，每孔为260,000(黑线条)或150,000(阴影线条)的培养物用NGF按同样方法处理(图10(b))。每孔260,000细胞的密度相当于用于BDNF研究的密度。这种CAT免疫阳性细胞数目的增加与以前所报导的相类似。通过测量CAT酶活性(F.Fonnum；J.Neurochemistry 1975，24：407-409)测定了对BDNF在胆碱能神经元上作用的能力。图11描述了用BDNF处理所产生的CAT变化。在这种情况下，用100ng/ml BDNF达到增加1.8倍而EC50计算为61ng/ml。12.2.4BDNF或EGF对星形神经胶质细胞培养物的影响
已经证明，II型星形胶质细胞对各种神经递质和神经肽具有高亲和力的受体。这样，星形胶质细胞能够应答由神经产生的信号。由于这个理由以及因为II型星形胶质细胞在其初生培养物中代表了细胞组成，因而试验了BDNF对胶质细胞可能有的直接作用。在加入生长因子以前，将细胞体外保持4天以使它们达到约60％连生，然后用EGF或BDNF处理42小时。在培养的最后18小时，在培养基中有[3H]甲基胸苷存在。EGF的作用示于图12(a)。正如以前所报导过的，发现EGF对于星形胶质细胞是促有丝***的。观察到在10ng/ml EGF下有最大的应答，EGF引起[3H]甲基胸苷的掺入量增加5.2倍。图12(b)描述了BDNF对[3H]甲基胸苷掺入量的影响。对BDNF的应答似乎是两相的：极低的剂量(0.1ng/ml)引起胸苷掺入量轻微的增加；而大于1ng/ml的BDNF剂量却抑制[2H]甲基胸苷的掺入。BDNF的剂量在5ng/ml时，引起24％的抑制，表明在处理期间胶质细胞增育速度的降低。12.3.讨论
这些体外实验清楚地表明，BDNF支持发育中大鼠黑质的多巴胺能神经元的存活或诱导它的完全区别状态，这些已通过染色酪氨酸羟化酶以及在由胚大鼠中脑得到的这些神经元培养物中的多巴胺摄取量所表明。因为这些是在帕金森病中的变性神经元，所以BDNF极有可能通过降低神经元的损失或通过增加酪氨酸羟化酶的量(在多巴胺合成中的限速酶)或可能通过两者而在帕金森病中具有治疗能力。
再者，如神经生长因子(NGF)一样，BDNF看来对大鼠底前脑的胆碱能神经元的存活具有影响，这已通过大鼠胚中间隔核和布罗卡氏对角带核培养物中增加的胆碱乙酰转移酶(CAT)染色，增加的CAT活性和增加的乙酰胆碱脂酶染色所表明。因此，单独BDNF或与NGF一起使用，BDNF在治疗影响底前脑的胆碱能神经元的疾病或机能失调症、如早老性痴呆症中可能是有用的。13.实例：BDNF/NGF基因族中一种新基因的鉴别
根据NGF和BDNF之间氨基酸序列的保守性(基因盒1-4见5.8节)，通过利用用简并寡核苷酸的PCR来鉴别NGF/BDNF基因系中的新成员的方法，通过测定这种引物对是否能够用于放大由几种动物种类的基因组DNA所得的NGF和BDNF两种基因序列而首次进行试验。然后这种方法被用于鉴别这样一种新基因，该基因与NGF和BDNF共享在被指出的具有同源性的所有四个基因盒中的同源性。13.1材料和方法：13.1.1.聚合酶链反应
PCR主要是按上面节6中所描述的进行13.2.结果13.2.1由基因组DNA得到的NGF和BDNF两个序列的
  放大
合成简并型合成寡核苷酸引物，相当于在NGF和BDNF之间氨基酸序列保守性的部分因盒1和基因盒2(参阅上面5.8节)，并用于用大鼠基因组DNA作模板的PCR反应中。确切引物的序列如下简并性位置，在寡核苷酸合成步骤中包括有2个或多个碱基的混合物，在括弧中表示；下面有划线的斜体字表明具有多个限制性核酸内切酶***位点的尾端，这些位点在随后的克隆步骤中便于与载体的连接；A＝腺嘌呤，G＝鸟嘌呤，C＝胞嘧啶，T＝胸腺嘧啶，N＝A，G，G，T的混合物)：
基因盒1(有义)，引物1B：
5′- GACTCGAGTCGACTCGGTGTG(C，T)GACAG(C，T)(A，G)T(C，T，A)AG-3′
基因盒2(反有义)，引物2C：
5′- CCAAGCTTCTAGAATTCCA(C，T)TT(N)GT(C，T)TC(A，G)(A，T)A(A，G)AA(A，G)，TA(C，T)TG-3′
将300ng的每种简并引物混合物加到在100μl用于PCR的标准反应混合物中的500ng大鼠基因组DNA中。进行35次循环，每一次包括在94℃保温1分钟，在43℃保温2分钟，在72℃保温2分钟，无论是BDNF或NGF基因，使用这些引物的PCR放大产物的预期大小是175个碱基对，包括两个17-聚的“尾端”(下有划线的)，包括它们在内是便于下面的克隆步骤。在8％聚丙烯酰胺/5％甘油凝胶上反应混合物的电泳产生了该预料尺寸，175bp的放大DNA的主带。13.2.2.在各种物种的基因组DNA中与BDNF/NGF探
   计互补序列的检测
通过电泳淋洗将175bp带由丙烯酰胺凝胶上洗脱，在与第一次相同的反应条件下，进行7次循环的第二次PCR反应中进一步放大，不同的是dGTP、dATP和TTP的浓度每个都降低到50μM，并用α-32P-dCTP示踪物代替没有标记的dCTP。在分选尺寸柱上进行色谱分析从反应组成中分离出该辐射标记的DNA产物。在用EcoRI限制性核酸内切酶消化后，并在EcoRI-消化的基因组DNA上通过Southern杂交方法而对硝基纤维进行印迹后，这种被称为“R1B/2C”(用于由引物1B和2C放大的大鼠DNA)的探针，然后被用于检测在各种脊椎动物类基因组DNA中的互补序列(在图13显示了大鼠、小鼠和鸡的结果)，结果示于图13。
含有NGF和BDNF序列的基因组DNA的EcoRI片段的大小是利用辐射标记的人NGF和BDNF探针、在并行的一些印迹上对照测定的，这些探针是从克隆基因通过PCR而制备的。NGF和BDNF基因组的EcoRI片段的位置分别示于图13的N和B。一个相类似分析的结果示于图3，像使用猪BDNF探针一样使用人BDNF探针所得的相等同的结果示于图3。如上所指出的，NGF和BDNF探针，每个被杂交到不同脊椎动物基因组DNA的单独一个EcoRI片段上。例如：在大鼠DNA中，BDNF探针检测出一个约8.8kb的带段，而NGF探针检测出一个约10.4kb的带段。
如在图13所看出的那样，在被试验的每个物种(所示数据是对鸡、小鼠和大鼠)中，R1B/2C探针都杂交到一个与由NGF探针所鉴定的带段不能区别的DNA带上，以及杂交到一个与由BDNF探针所鉴定的带段不能区分的DNA带上(在小鼠中，NGF和BDNF基因组EcoRI片段具有同样的电泳迁移率，相当于约11.5-12.0Kp)。这证明简并寡核苷酸引物1B和2C能够用于放大由NGF和BDNF这两个基因得来的序列。值得注目的是，在某些情况下，在用R1B/2C探针杂交的基因组Southern印迹中观察到一些另外的带。例如，在EcoRI-消化的小鼠基因组DNA中至少观察到两个另外的既不相当于NGF，也不相当于BDNF的带。(分别为约19.0Kb和1.5kb的X1X2)，同样，在杂交到大鼠DNA中，观察到至少两个另外的带(分别为约7.3和1.2.kb的X1，X2)，在鸡DNA中至少有一个(X，约为2.6kb)。在有些情况下也能观察到在本图中没有被明显标记的中外一些带。这些不属于NGF或BDNF的带的出现表明有可能存在该基因族的其它成员。同样，利用其它系列的引物对和基因组DNA模板发现了明显不同于已知含有BDNF和NGF基因序列的带，(数据未列出)。13.2.3.与BDNF和NGF相关的新基因的鉴别
与NGF和BDNF相关的新基因可以通过利用简并寡核苷酸引物的PCR来鉴别，这种假说的一个特定实验是利用基因盒3和4(参阅上面5.8节)的引物以及用小鼠基因组DNA作模板而进行的。合成具有以下序列的简并引物：
基因盒3(有义)
5′-GGGATCCGCGGITG(T，C)(C，A)GIGGIAT(T，C，A)GA-3′
基因盒4(有义)
5′-TCGAATTCTAGATIC(T，G)IAT(A，G)AAIC(T，G)LCCA-3′(G＝鸟嘌呤，A＝腺嘌呤，C＝胞嘧啶，T＝胸腺嘧啶，I＝次黄苷；在寡核苷酸中在单一位置上的多于一个碱基的混合物示于括弧中)。注意到，在某些与一个密码子的第三个(变位)碱基对应的位置用3次黄苷，让遗传密码简并。也有可以使用四个通常的DNA碱基混合物，而不用次黄苷，用这样一些引物已得到基本相同的结果。
用简并的基因盒3/基因盒4引物对，由在小鼠DNA中的基因组NGF和BDNF序列的PCR预料会放大一个约90bp的片段。使用上面所示的引物，进行4个退火温度为45℃的PCR循环，接着进行49℃退火温度的31个循环。通过凝胶电泳分析产物，观察到一个该预料大小的主带。在小鼠中，NGF基因在盒3和盒4之间的区域中含有一个HindII限制性核酸内切酶的切割位点，而BDNF基因在这一区域中含有一个teh酶Apal切割位点。因此，HindII和Apal对PCR放大产物的消化预料会从主要产物带中消除NGF和BDNF序列。但是，当PCR产物用这两个限制性酶消化到接近完全时，则发现在放大的DNA中持续有一个抗消化带。这就表明，除了NGF和BDNF基因以外，已放大了至少有一个新的基因。13.2.4.BDNF/NGF基因族中新成员的表征
抗一消化的PCR产物从凝胶上洗脱，并在不对称的PCR反应中用作模板，在该反应中存在的任一个原始的简并引物的量高于另一个引物100倍摩尔。这种不对称放大，可生产出适合于通常链终止方法进行定序分析的单股DNA模板。该新基因(这里命名为“M3/4”，但也被称为神经营养素-3)的序列分析是通过位于盒3和盒4之间的一个确切引物和在基因转录文本3′-端的多-A(多聚腺苷酸)序列之间的序列，使用快速放大cDNA末端“(RACE)的方法(由M.A.Frohman.M.K.Dush，和G.R.Martin，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：8998-9002；(1988))，进行PCR放大而进一步发展的。DNA定序分析结果揭示了一种新基因已放大，这种基因包括了一种开放式阅读框架，它能够编码一种不同于NGF和BDNF二者，但在氨基酸序列中又与两者有密切关系的多肽(图14)。
这种新基因编码了神经营养因子的初步证明是通过用Nathern印迹杂交测定它在大鼠组织中表达的方式而得到的。这种分析表明，新基因在脑组织中的表达要比在任何其它被测试的组织要强得多。13.3讨论
如上所示(图13)，通过使用盒1和2的引物、用大鼠基因组DNA作模板(R1B/2C)的PCR放大而获得的DNA探针，除了杂交到那些已知在所测试的每个物种的EcoRI-消化的DNA中含有NGF和BDNF基因序列的带上以外，还杂交到新带上。对小鼠基因组DNA，使用一种对于用盒3和盒4引物放大的新基因有用的放射性标记的探针(M3/4)进行一个相似的分析。在每一种情况下，M3/4探针杂交到EcoRI-消化的基因组DNA的一个单独的主带上，它是不同于已知含有BDNF和NGF序列的带。应注意到，通过与M3/4探针杂交而观察到的小鼠、大鼠和鸡的基因组DNA的EcoRI片段，在每种情况下，都与通过与R1B/2C探针杂交而得到的新带中的一个相吻合。这些带在鼠DNA中是19.0kb的EcoRI片段(图14中的XI)，在大鼠DNA中是7.3kb的片段(图14中的XI)，以及在鸡DNA中是2.6kb的带(在图14中的X)。这表明：由大鼠的DNA、使用1B/2C引物对以及从小鼠的DNA、使用3/4引物对放大了同样的基因部分。因此至少有一个新基因显然与NGF和BDNF同亨在前面被指出的具有同源性的所有四个基因盒中的同源性。
在NGF、BDNF和该基因族的其它成员(如“M3/4”也被称为NT-3)之间同源基因盒的概念在这里主要按基本氨基酸序列以及鉴别该族中新基因的方法来表示的。但是，很重要的是，在这些神经营养因子的二级和三级结构上、在它们与特异受体的相互作用上，以及对具有潜在治疗价值的新分子的合理设想上多半具有另外的联系。
例如，在NGF中有6个Cys残基而且所有这6个残基已被表明包括在二硫化物键中。从最N-末端到最C-末端来数Cys1-cys6，已经知道二硫化物桥接包括Cys1-Cys4、Cys2-Cys5、Cys3-Cys6。全部6个Cys残基被保留在NGF和BDNF之间，而且3个Cys残基在至今被定序的“M3/4”中的位置正好与NGF和BDNF的Cys4、Cys5、Cys6一样排列。这就使人想到，该基因族全部成员的二级结构可能是紧密相关的，并主要由保留的Cys残基决定。应当注意到，对BDNF和NGF所指出的同源基因盒包括了这6个Cys残基中的5个(Cys1在盒1，Cys2在盒2，Cys3在盒3，Cys5和Cys6在盒4)。这支持了这样的想法，即这些Cys残基和它们紧接的邻居”在决定这些神经营养因子的一般结构中起着重要作用。对每个神经营养因子与高亲和性受体特异相互作用的结构决定子，大概存在于每个分子的独特部分。
因此，可以在已描述的四个同源盒的任何一处，或在分子的其它处，通过基因族成员之间的重要组合(例如，通过体外重组、或者通过直接基因合成)产生新的嵌合基因。这样的嵌合蛋白由于保留了Cys残基和其它氨基酸残基很可能具有相似的二级结构，但会具有新的生物性质。例如一种BDNF/NGF嵌合蛋白由于能与BDNF和NGF二种受体相互作用可以是双功能的。嵌合蛋白由于二聚作用和其它物理-化学性质，也可以不同于母体分子。嵌合蛋白还能起任何一个母分子的对抗物作用。
基于用于适应折叠的关键性“核心”区的知识加上对该区域与受体的特异性相互作用所需要的信息，可以用BDNF/NGF的活性片段来设计该族的其它新的成员。
新的族成员(如“M3/4”)与已知的族成员通过比较可以用于揭示有助于引导寻找BDNF/NGF基因族其它成员的同源性基因盒。例如“M3/4”与BDNF的比较揭示了某些有用的同源基因盒。特别有意义的一个同源基因盒是含有第四个被保留的Cys残基，唯一没有在过去所指出的盒1-4中的Cys残基。实际上存在相当长的完全相同的片段或者存在由BDNF和“M3/4”共有的保守氨基酸取代，其中包括了这种Cys残基，即：His-Trp-Asn-Ser-Gln-Cys-(Arg或Lys)-Thr(Thr或Ser)-Gln-(Ser或Thr)-Tyr-Val-Arg-Ala-Leu-Thr。在这种区域内，可以选择至少两个同源基因盒用于合成有用的简并寡核苷酸引物(即：His-Trp-Asn-Ser-Gln-Cys对一个18-聚引物只需要96次简并，或对一个17-聚引物是48次简并；Tyr-Val-Arg-Ala-Leu-Thr，也会是一个有用的基因盒)。14.实例BDNF在成神经细胞瘤细胞中表达的增加14.1.材料和方法14.1.1.细胞系
CHP100，CHP126，CHP134，CHP234，LAN1，LAN5 NB9、SY5Y、Y79、F01、BU2、H01、HL60和COL320是保存在Fred Alt博士实验室中的细胞系，Fred Alt博士提供了在图15中Northern印迹中所使用的RNA。全部细胞系都是人肿瘤的细胞系。CHP100是一种神经上皮瘤细胞系；CHP126；CHP134，CHP234，LAN1、LAN5，NB9和SY5Y是成神经细胞瘤的细胞系；Y79是一种成视网膜细胞瘤的细胞系；F01，BU2，H01是黑素瘤细胞系，HL60是一种前髓细胞白血病细胞系；COL320是一种神经内分泌结构癌细胞系。14.1.2.RNA的制备
基本按上面8.1.1节所描述的那样制备RNA并使用一种全长的人cDNA探针进行Northern印迹分析。10μg全RNA放在用于产生图15的Northern印迹凝胶的每一通道中，除了在LAN1中的RNA被较轻地载带以及对SYS-Y使用了1微克多(A)+RNA。14.2结果
图15描述了杂交到由各种人细胞系得到的RNA试样盘上的BDNF探针的Northern印迹分析的结果。在CHP234和LAN5细胞系中检测了大量杂交到BDNF探针上的RNA，发现在CHP126和CHP134的量较低。所有的阳性系都是由人的成神经细胞瘤中产生的。15实例：BDNF-和NGF-mRNA在大鼠海马中的活性-依赖
调节关系是由非-NMDA谷氨酸为中介的15.1材料和方法15.1.1.用红藻氨酸处理大鼠
大鼠在腹膜内注射红藻氨酸12mg/Kg量在90分钟，常常施用苯甲二氮(安定)以抑制广泛的活性发作。如图19所示，在红藻氨酸之后给予的安定，并不会干扰BDNF-和NGF-mRNA含量的进一步增加。与在红藻氨酸之后给予安定的动物相比较，没有接受安定的大鼠显示出在红藻氨酸之后3小时，在海马中BDNF-和NGF-mRNA含量的相似增加。15.1.2.海马培养物的制备
海马是从E17天的鼠胚中制备的，剖割出来置于37℃下在没有钙或镁离子、但含有10mM葡萄糖、1mg/ml清蛋白、6μg/ml DNAase和1mg/ml木瓜蛋白酶的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中保温20分钟。用没有木瓜蛋白酶的该溶液洗涤后，用一支火抛光的巴斯德吸管将海马细胞小心地离解。低速离心以收集细胞，再悬浮在加有10％胎牛血清的DMEM中，并平铺在预先用多-DL-鸟氨酸(0.5mg/ml)和昆布氨酸(5μg/ml)涂覆的塑料培养皿(0.5×106细胞/35mm)中。平铺3小时后，培养基换成没有血清的、但含有按Brewer和Cotman(Brain Res.497：65，1989)所描述的添加剂、但删去谷氨酸的培养基。神经元在培养基中直至3个星期仍保持存活，并通常在平铺后第7天用于实验。15.1.3.RNA的放大
按照Chomcynski和Sacci(Anal.Biochem.1987，162：156-159)所描述的，由0.5×106细胞，在加入一种缩短的NGF cRNA回收标准物(30fg)后，提取全细胞RNA。NGF mRNA和cRNA是在一合并的单一试管反转录/聚合酶链反应(RT/PCR)中进行共放大，该试管含有1/5提取的RNA，1×RT/PCR缓冲液(10mM Tris-HCl pH8.3，50mM KCl，1.5mMMgCl2 0.1mg/ml明胶，0.1％ Tritbn X-100)，0.25mM dNTP，0.1μM每种5′和3′引物，5U RNasin(Promega)，3.2U AMV-反转录酶(Life Science)和2U Taq聚合酶(Genofit)，其总体积为25μl。混合物用无机油覆盖，并在41℃保温30分钟。60秒钟加热到92℃，引物在55℃退火60秒钟以及引物在72℃延展60秒钟。该放大产物(对NGF mRNA是203bp，而对回收标准物是153bp)在一个3％ Nusieve/琼脂糖为3∶1的凝胶(FMC.Bioproducts)上分离，在HybondN加上膜(Amersham)进行碱-印迹分析并所述(Heumann R.和Thoenen，H.，1986，J.Biol.Chem.261；9246；Lindhold等人，1988，J.Biol.Chem.263：16348)进行杂交，为了绝对鉴定，已知量的体外转录NGF mRNA和回收标准物在平行的反应中被共放大。近来，由Wang等人(PNAS86；9717-9721，1989)描述了一个类似的方法。15.2 结果和讨论
BDNF和NGF都是一个基因族的成员，具有约50％氨基酸的同一性(Leibrock等人，1989，Nature，341：149)。这些分子具有严格保留区域。在这些区域中含有6个半胱氨酸残基，很可能与这些分子的对其生物活性是必需的三维结构的稳定性有关。但是，在BDNF和NGF中也有一些决定了它们不同的神经元特异性的不同区域(Lindsay等人，1985，Dev.Biol 112：319；Johnson等人，1986，J.Neurosci.6：3031；Hofer.M.和Barde，Y.1988，Nature 331：261；Rodriguez-Tebar等人，1989，Dev.Biol.136：296)。而且，这两个神经营养性分子之间的区别也由它们的合成位置表明。NGF在外周(Korsching，S.和Thoenen，H.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：3513；Ebendal等人，1983，Exp.Cell Res.148：311；Heumann等人，1984，EMBO J.3：3183；Dhelton，D.L.和Reichardt，L.F.，1984，.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81：7951)和中枢神经***(CNS)(Korsching等人，1985，EMBO.J.4：1389；Shel-ton，D.L.和Reichardt，L.F.1986，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83：2714；Whittemore等人，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83：817；Large等人，1986，Science 234：352)两者中被表达。由NGF-应答神经元神经支配的密度反映了相应靶组织中的NGF的含量(Korsching，S.和Thoenen，H.1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：3513；Ebendal等人，1983，Exp.Cell Res.148：311；Heumann等人，1984，EMBOJ.3：3183；Dhelton，D.L.和Reicharct，L.F.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.s.A.81：7951；korsching等人，1985，EMBO J.4：1389；Shelton，D.L.和.Reichardt，L.F.，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83：2714；Whittemore等人，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S A.83：817；Large等人，1986，Science 234：352)。与NGF对照，BDNF主要在神经元的CNS中表达，并且BDNF-mRNA的含量显著高于NGF-mRNA的含量，例如，在海马中约50倍。在外周神经***中，NGF是由各种非-神经元细胞的类型所合成(Bandtlow等人，1987，EMBOJ.6：891)，而在脑中，正如由就地杂交所证明的，它主要是位于神经元(Rennert，P.D.和Heinrich，G.，1986，Biochem.Biophys.Res.Commun.138：813；Ayer-LeLievre等人，1988，Science 240：1339；Whittemore等人，1988，J.Neurosci.Res.20：403)，然而，所培养的1型呈胶质细胞也已表明产生显著量的NGF(Lindsay，R.M.1979，Nature 282：80；Furukawa等人，1987，Biochem.Biophys.Res.Commun.142：395)。神经元和星形胶质细胞对在脑中合成NGF的相对作用至今尚不知道。
由于BDNF-和NGF-mRNA两者在中枢神经***神经元中占优势的表达。我们研究了这两个mRNA的含量是否受神经元活性所影响，如果是这样，则其传递介质很可能与调节有关。在第一个实验系列中，我们从胚胎大鼠(E17)海马中制备神经元培养物。如图16a中所示，用高钾(50mM)液对海马神经元去极化，导致BDNF-mRNA的增加。在增加高钾浓度后3和6小时之间达到了最大含量，这种由钾为中介的BDNF-mRNA的增加可以通过从培养基中除去钙离子而受到抑制并且它也因钙通道阻断剂利心平(nifedipin)而抑制钙注入而降低(图16b)。
因为所用的海马培养物由呈现不同的传递介质和受体表达方式的神经元的混合群体组成，我们研究了各种生理的和合成的受体***对BDNF-和NGF-mRNA表达的影响。列于表VI的结果表明了在全部被试验的物质中，红藻氨酸、一种谷氨酸盐的受体***(Monagham等人，1989，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.29：365)，在马神经元中产生的BDNF-mRNA增加量最大。对照之下，其它的分子，如碳酰胆碱(一种蕈毒硷受体***)以及在更少程度上的组胺和舒缓激肽，对BDNF-mRNA提高较少，但也有明显量(表VI)。因为在海马神经元中NGF-mRNA的含量是非常低的，所以我们建立了一个适宜于测定NGF-mRNA变化的定量聚合酶链反应(PCR)方法。用这个方法，我们发现，在海马神经元中通过钾和红藻氨酸也可以增加如BDNF-mRNA、NGF-mRNA的含量(图17)。
如图18所示，用约25μM红藻氨酸在海马神经元中得到BDNF-mRNA的最大增加量。红藻氨酸浓度的再增加导致BDNF-mRNA含量的减少，这极可能反映了高浓度红藻氨酸对海马神经元的毒性作用(图18)。对各种中枢神经元，在使用兴奋性氨基酸谷氨酸盐的类似物后，以前已报导过(Choi等人，1987，J.Neurosci7：357，Rothman S.M.和Olney，J.W.1987；Trends Neurosci.10：299；Choi.D.W.1988.Neuron 1：623)有一种谷氨酸盐受体-中介的神经中毒。但是为增强BDNF-和NGF-mRNA在海马神经元中的表达所必需的红藻氨酸浓度可以清楚地与导致神经中毒的浓度分开。
为了更详细地研究红藻氨酸的作用，我们研究了BDNF-mRNA的增加是否会被任何已知的谷氨酸盐受体对抗物阻断(Monaghan等人，1989，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol  29：365)，犬尿喹啉酸，一种广谱的谷氨酸盐受体的对抗物，以及CNQX，一种非NMDA受体的竞争性的抑制剂(Monaghan等人，1989，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.29：365)完全阻断了在海马神经元中红藻氨酸引导的BDNF-mRNA的增加(表VII)。另一方面，专门阻断NMDA受体的MK801，在阻断这些神经元中的BDNF-mRNA的升高中无效。而且，NMDA本身并不改变BDNF-mRNA的含量(表VI)。这表明红藻氨酸通过它的受体直接起作用而且其作用并不是归于释放内生的谷氨酸(它也作用于NMDA受体)。因此可以断定，红藻酸在体外通过非-NMDA谷氨酸受体而提高BDNF-mRNA。
                   表VI
各种受体***对BDNF-mRNA在培养神经元中的表达的影响加入物                                    对照的％没有                                       100±5碳酰胆碱(50μM)                            220±25碳酰胆碱(50μM+阿托品(10μM)               85±15烟碱(100μM)                               110±7组胺(50μM)                                150±12血清素(100μM)                             95±6多巴胺(100μM)                             115±7降肾上腺素(25μM)                          75±10物质p(1μM)                                85±9生长激素抑制素(1μM)                       110±8缓激肽(1μM)                               155±15红藻氨酸(25μM)                            1365±70NMDA(25μM)                                105±10
                     表VII
不同谷氨酸受体的对抗物对红藻氨酸诱导的BDNF-mRNA表达的影响加入物                                     对照的％没有                                       100±60红藻酸(25μM)                              1250±60犬尿喹啉酸(1mM)                            70±6犬尿喹啉酸(1mM)+红藻氨酸(25μM)            84±7CNQX(10μM)                                109±6CNQX(10μM)+红藻氨酸(25μM)                105±7MK-801(5μM)                               96±5MK-801(5μM)+红藻氨酸(25μM)               1130±80
为评估我们体外观察结果的生理学意义，我们研究了在体内是否也进行着类似的机理。我们按12mg/Kg量的红藻氨酸处理重180-200g的成年两种性别的Wistar大鼠。在不同时间周期后，我们通过Northern印迹分析测定了在海马和皮质中BDNF-和NGF-mRNA的变化。图19表明，红藻氨酸诱发了在两个脑区域中BDNF-和NGF-mRNA含量的增加。BDNF-mRNA的增加明显大于NGF-mRNA中的增加。而且，在红藻氨酸给药后长达24小时的时间里，mRNA的量仍然增加。BDNF-和NGF-mRNA变化的时间进程表明，在海马中达到最大增加是在红藻氨酸给药后约3小时(图19)。很有兴趣地注意到，C-for-mRNA的增加先于海马中BDNF-和NGF-mRNA的增加；这两种现象可能是有因果关系的，正如最近表明的损伤后的坐骨神经情况一样(Hengerer等人，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87.3899)。而且，与海马中的增加相比较，在大脑皮层中BDNF-和NGF-mRNA两者的增加有一个延迟，这表明导致BDNF和NGF加强表达的信号是由海马传播到其它的脑区域。这种观察结果与以前的报导(Morgan等人，1987，Science 237：192)是一致的，该报导表明由惊厥剂(Convulsant)戊四唑诱发的C-fos的增加首先在海马中发生然后再在皮层发生。
在前面的研究给出了NMDA受体与海马mRNA例如NGFI-A(Cole等人，1989，Nature 340：474)的调节有关的证明后，我们再研究NMDA受体对抗物MK801和***(Ketamine)是否能阻断体内BDNF-和NGF-mRNA的增加。然而，肯定了我们体外的结果，MK801，并不抑制红藻氨酸引导的海马BDNF-mRNA的增加，虽然它有效地抑制了由NMDA受体活化引起的发作(图20)。最有可能这种NMDA受体活化是由红藻氨酸释放内生的谷氨酸引起的(Biziere，K.和Coyle，T.，Neurosci，1978，Lett.，8：303；McGeer等人，1978，Brain.Res.139：381)。同样，海藻氨酸处理后在海马中NGF-mRNA的增加既不被MK801阻断也不被***阻断。在一个过去的研究(Gall.C.M.和IsacksonP.J.1989，Science 245：758)中，它表明，引起边缘发作的电解损伤提高了大鼠海马中的NGF-mRNA。然而，本发明用MK801和红藻氨酸所得的结果表明了在诱导发作和增加BDNF和NGF的表达之间的明显无关。在红藻氨酸注射以前用苯甲二氨(安定)处理大鼠，完全阻断了大鼠海马中BDNF-和NGF-mRNA的增加(图20)。苯甲二氨对BDNF-和NGF-mRNA增加的阻断效应最有可能是由于通过抑制GABAergic***而抑制神经元活性引起的。但是在红藻氨酸给药90分钟后(即抽搐开始后约30分钟)；BDNF-和NGF-mRNA的增加不再被苯甲二氮所阻断，这表明一个相当短的增加活性期会足以开始导致两个神经营养性因子的mRNA表达增加的级联过程。
本发明表明，非-NMDA受体可以与海马中BDNF-和NGF-mRNA的调节有关，因此这种调节机制与过去Cole等人(Cole等人，1989，Nature，340：474)描述的调节机制区别开来，Cole描述的机制断定，编码早期基因的海马mRNA似乎是通过谷氨酸受体的NMDA-亚型(subtype)被调节。已有报导，红藻氨酸对神经元的某些作用也能够由谷氨酸受体的使君子氨酸(quisqualate)型所引导(MOnaghan等人，1989，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.29：365)。
总之，本研究表明，神经元活性调节了在大鼠海马和皮层中编码了神经营养性因子BDNF和NGF的mRNA的含量。在所有被试验的物质中，通过对非-NMDA谷氨酸受体起作用的红藻氨酸在体内和在海马神经元培养物中提高了BDNF-和NGF-mRNA两者。相形之下，在外周，没有证据说明在非神经元细胞中的NGF合成是由通常的传导物质或由神经支配(NGF应答)的神经元所释放的神经肽来调节的(Barth等人，1984，J.Cell.Biol.99：839；Hellweg等人，1988，Exp.Cell Res.179：18)。BDNF主要在CNS中表达，在使用谷氨酸作为神经传导物质的中心通道和表明具有比较丰富BDNF-和NGF-mRNA的区域之间至少有部分的重叠(Hofer等人，EMBOJ.在印刷中；Managham等人，1989，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.29：365)。特别是如就地杂交所表明的，NGF-mRNA的分配(Hofer等人，EMBO.J.在印刷中)和由海马、大脑皮层和小脑中的放射自显影照片中所见到的红藻氨酸受体(Monaghan等人，1989，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.29：365)之间有明显的相似性。观察结果和谷氨酸是CNS中调节BDNF-和NGF-mRNA的生理传导物质的解释是一致的。例16：脑源神经营养因子提高培养基中大鼠膈胆碱能神经元的存活及分化功能16.1.原料及方法16.1.1.分离细胞的制备及细胞培养条件
将妊娠7天的大鼠(Sprague-Dawley)解剖，使其体内的中隔区与周围的组织分开，将组织片段合并在一起，用Ham氏F-10溶液洗涤三次，然后，将它转移到35mm组织培养皿上并将它弄碎，通过用0.25％胰蛋白酶将该组织在37℃下培养20分钟，从而形成一个单细胞悬浮液，通过在含有50μg/ml 1型(Sigma公司)脱氧核糖核酸酶生长介质中，在室温下培养5分钟，使胰蛋白酶失活以后，接着通过将这些片段反复通过巴斯德吸管的狭窄顶部将这些细胞分离，然后将该分离细胞以500×g速率离心45秒，除去上清液，并两次离心，将松散的细胞沉淀，再次悬浮于生长介质中，并与之结合，用血细胞计数器测定细胞产量，最后，将该细胞放入事先已涂覆聚鸟氨酸(10μg/ml)和昆布氨酸(10μg/ml)的6毫米小孔中，在培养24小时后，通过测定细胞排除台盼蓝的能力，检测该细胞的存活力。
用于神经元和神经胶质组成培养物的标准生长介质，5HS/N3是在Dulbeuo的改性Eagle化介质(DMEM)中含有：5％(体积/体积)马血清(Gib Co)，1％N3添加物(体积/体积)(Romijn等人，1982，Dev.Brain Res.2：583-589)，0.5％(体积/体积)谷氨酰胺(200mM，Gib Co)和0.25％(体积/体积)青霉素-链霉素(分别为10,000单位/ml，10,000mcg/ml，Gib Co)。在放置5到6小时以后，用一种含有：1％N3添加物，0.5％谷氨酰胺和0.25％青霉素和链霉素的DMEM取代该生长介质，从而制得富集神经元的培养物，在这两种条件下，用胞嘧啶***糖苷进行处理(1μM，24小时)来限制神经胶质细胞的增殖。16.1.2.胆碱能转乙酰酶活性的测定
用100μlPBS将该细胞冲洗两次从培养物中除去生长介质，通过一次冻-熔循环并在pH为6.7，含有200mM NaCl和0.25％(体积/体积)Triton X-100 50mM KH2PO4缓冲液中在37℃下培养15分钟，将该细胞溶解。取出两微升细胞溶解产物，并根据微量-Fonnum方法(Fonnum，F，1975.J.Neurochem.24：407-409)测定其CAT活性。最终的底物组合物由在50mM NaH2PO4(pH7.4)缓冲溶液中的0.2mM[14C]乙酰辅酶A(NEN；54.4mCi/mmol)300mM NaCl，8mM溴化胆碱，2DmM乙二胺四乙酸和0.1mM新斯的明组成。在这些酶和底物浓度下，该酶促反应延持90-120分钟，通过在测试期间加入CAT活性特异抑制物，N-羟乙基-4-(1-萘乙烯基)吡啶姆(HNP)，对胆碱转乙酰酶诱导的特异性进行测试(White，H.L和Cavallito，C.J.1970，J.Neurochem.17：1579-1589)。16.1.3.乙酰胆碱酯酶(AChE)活性的测试
用有一些改进的Potter法(Potter，L.T.，1967，J.Pharmacologyand Experimental Therapeutics，156：500-506)和Johnson与Russell法(Johnson，C.D.和Russell R.L.1975，Anal.Biochem.64：229-238)测定存在于在该细胞溶解产物中的AChE的含量。将在含有200mM NaCl和0.25％(体积/体积)Triton X-100的50mM KH2PO4缓冲液(pH6.7)中制备的溶胞产物与在50mM KH2PO4(PH7.0)中的[3H]碘化乙酰胆碱(NEN NET-113，73.3mCi/毫摩尔)，爱普把嗪(0.1mM)相结合在37℃下培养15分钟以后，通过加入100μl终止缓冲溶液使反应终止，该终止缓冲溶液含有1M氯乙酸，0.5M NaOH和2.0M NaCl。在有1.0(10-6)M新斯的明存在的条件下，测定出具体的AChE活性。16.1.4.高亲和性胆碱摄取量的测定
基本上用Vaca和Pilar 1979年的方法(Vaca，K.和Pilar，G.，1979，J.Gen.Physiol.73：605-628)通过高亲和性”依赖Na+的机制测量胆碱摄取量，用100μl Ham氏F-10溶液将该细胞洗涤一次，然后再用100μl Tyrodes溶液冲洗，再用含有25mM钾的Tyrodes溶液引起的去极化作用10分钟以后，将该细胞与在常用的含Na+或Li+的Tyrades中的[3H]胆碱(NEN，NET-109，0.11μM，86.7Ci/mmol)一起在室温下培养20分钟。用PBS冲洗该细胞两次，使摄取反应终止，通过用100微升，含有1N甲酸的冷丙酮将该培养物培养至少20分钟将所累积的胆碱提取出来，然后收取其所溶部分并计数，总含量与和Na+无关的胆碱吸收量之差就是具体的胆碱吸收量。16.1.5乙酰胆碱酯酶的组织化学染色
用改进的Geneser-Jensen和Blackstadt染色法(1971，Z，Zell-forsch.114：460-481)对乙酰胆碱酯酶进行组织化学染色来鉴别胆碱能细胞，该培养基在4％多聚甲醛中固定化后，在有以下组成的AChE底物溶液存在下，将该细胞在4℃下培养5-6天，该底物溶液由在50mM乙酸盐缓冲溶液中(PH5.0)的4mM碘化乙酰硫代胆碱，2mM硫酸铜，10mM甘氨酸和10μg/ml明胶组成。如前所述(Hartikka，J.和Hefti，F.，1988，J.Neurosci.8：2967-2985)实现了多反应产物的目视观察。16.1.6NGF-受体的免疫组织化学染色
用DMEM将培养物洗涤两次，然后用4％多聚甲醛固定，用一种含有5％牛血清蛋白，0.02％ Triton X-100和5％蔗糖pH为7.4的磷酸钠缓冲微处理该细胞3-4小时(Hartikka J.和Hefti，F.1988，J.Neurosci，8：2967-2985)，用单克隆抗体192-IgG检测(Taniuchi，M.和Johnson.E.1985.J.Cell.Biol.101：1100-1106；Chandler等人，1984.J.Biol.Chem.259：6882-6889)并在含有5％马血清的缓冲溶液中以1∶1000的稀释度检测NGF-R，用该稀释的抗体将该培养物在4℃培养15-18小时，用生物素化的马抗小鼠IgG(1∶200载体)对结合的小鼠免疫球蛋白进行检测，用3′，3′-二氨基联苯胺作为结合过氧化物酶的底物来识别该免疫反应性细胞。16.1.7.BDNF和NGF的纯化
根据以前公开的方法(Barde等人，1982，EMBO.J.1：549-553；Lindsay等人，1985。Dev.Biol.112：319-328)对由猪脑中提取的BDNF，以及由雄性小鼠下颌下腺提取的NGF进行提纯，用于这些研究的重组BDNF以前已被详细说明(Maisonpierre等人1990，Science.247：1446-141)16.2结果
在涂覆聚鸟氨酸-昆布氨酸的孔上，中膈细胞培养物产生了精细的轴突生长物，这些细胞中有许多细胞在24小时内显现出一种特征的神经元相——明亮体(图21A和B)，连续的神经轴突生长物导致细胞间接触范围在体外第二天到第4天以后，增加(比较图21c，D和E、F)正如由存在无光泽的相-暗的细胞所表明的那样，甚至在4天以后，在该培养物中仍然只有极少量的非神经元细胞，为了分析BDNF对培养基中的中膈胆碱能神经元存活的影响，对AChE进行组织化学染色以及多NGF-受体进行免疫组织化学染色，图21G、H显示了AChE阳性神经元的典型形态，图21I中显示了几种NGF-受体阳性神经元。
如图22A所示在胚胎大鼠膈细胞的低密度培养物(细胞浓度在66,700，-133,300细胞/cm2之间)中BDNF引起AChE阳性细胞的数量增加2.4倍。在相同的细胞密度下，NGF的影响要稍小些(1.9倍)由于发现BDNF和NGF均能导致在膈细胞培养基中AChE阳性神经元数量的增加，这就促使我们去检测这两种因子是否作用于相似或不同的神经元群。如图22A中第三条所示，同时加入饱和量的BDNF和NGF并不引起比单独用其中任何一种所看到的AChE阳性神经元数目更大的增加。就神经元的存活而言，这些结果告诉我们，大鼠膈细胞培养物中应答BDNF或NGF的胆碱能神经元必定是很大程度上重叠的神经群体。
BDNF对AChE阳性神经元存活的影响取决于被生长细胞的密度(图22A)，在高铺放密度时(200,000-266,000细胞/cm2)，不论单独的BDNF或BDNF与NGF相结合均能使表达AChE的神经元数量增加，这可能是由于提高了内源性神经营养活性含量，或者是由于更高细胞密度出现的细胞与细胞接触增加引起的存活促进作用。
在细胞密度低时，AChE阳性细胞量以BDNF浓度的函数形式而增加。在浓度为10ng/ml时，观察到最大响应，此时的AChE阳性细胞/孔数量从对照值169.2±12.9增加到处理过的培养物中的388.0±26.2(增加2.5倍)。比较起来，50ng/ml时，观察到对NGF的最大反应，此时ACh E阳性细胞/孔从121.0±7.6增加到231.7±12.9(增加1.9倍)。对于BDNF和NGF，其响应曲线中的平稳段似乎均是稳定的，因为当剂量高达100ng/ml时，AChE阳性冲经元的数目没有下降。
很显然，在低密度培养物中，BDNF和NGF均能增加用AChE组织化学法检测到的细胞数，这种增加有可能是由于解救了在无生长因子存在的培养基中胆碱能细胞的死亡，由于补充了前体细胞，或由于诱导了胆碱能标志物AChE。为了区分出这些可能性，在一系列总共维持12天的培养物中进行了一些延缓添加的试验(图23)，将一组在铺放后处理5-6小时的培养物在BDNF或NGF存在下保持12天，而第二组培养物在前5天没有生长因子，而在最后7天用BDNF或NGF处理(-5/+7)，比较这两种培养物时，5天后加入NGF或BDNF的反应与一直在生长因子存在下生长的细胞的完全相似(比较图23中的实心的条和侧阴影线的)。但是BDNF或NGF仅于最后5天(-7/+5)存在的第三组培养物的结果明显地有差别，在这些条件下，不论NGF还是BDNF均不能提高AChE阳性细胞量。在其它的实验中，已经发现，将膈神经元与NGF或BDNF只接触3-4天就足以使AChE酶活性有大量的增加，从而可以通过AChE染色法检测这些细胞。因此，在“-7/+5”培养物中没有得到AChE阳性神经元数量的可察觉的增加并非是由于与生长因子接触的时间太短，不足以诱发AChE阳性细胞。
在体内(Montero，C.和Hefti，F.1988，J.Neurosci.8：2986-2999；Higgins等人，1989，Neuron.3：247-256)以及在体外，人们均已发现，NGF能调节其自身受体的含量(以mRNA和蛋白质含量计)。由于发现在膈细胞培养物中BDNF在胆碱能表现型的诱导及细胞存活力方面产生与NGF类似的作用，因此，我们对BDNF调节NGF-受体含量(用TgG-192免疫阳性细胞数目表示)的可能性进行了测试。在浓度为10ng/ml时，如图24所示，BDNF使NGF-受体免疫阳性细胞数目增加了3倍。有趣的是，当浓度更高时(25-100ng/ml)，BDNF的作用逐渐地不显著起来，因此，该例子中的剂量响应与用来检测BDNF对这些培养物中其它参数(例如AChE阳性细胞量)影响所观察到的剂量响应明显不同。用浓度为50ng/ml的NGF处理该细胞作为一个阳性对照，结果，它使阳性细胞数目增加了3倍。因此根据IgG-192染色结果，BDNF在向上调节NGF-受体的表达方面与NGF的作用基本相等。
除了影响细胞存活力以外，我们还对BDNF提高胆碱能表型特征的可能性进行了研究。在有浓度不断增加直至50ng/ml的BDNF存在的条件下，我们发现膈细胞物中CAT活性呈线性增加，如图25所示，该响应特性在参照值的1.8倍处达到饱和。在用NGF平行进行的培养物中，CAT活性的诱导作用在浓度为25ng/ml处达到平稳状态，其数量比照值增加3.4倍，当浓度是足以产生饱和响应的浓度的3倍时，对BDNF和NGF的响应仍然没有出现明显下降，用BDNF或NGF诱导CAT活性均不会影响与[N-羟乙基-4(1-萘乙烯基)吡啶姆]HNP无关的转化酶活性。
由于BDNF和NGF均能引起膈细胞培养物中的CAT活性增加，。因此，我们研究了同时用这两种因子处理时的响应(表VIII)，在进行这些实验时，使用了两种BDNF浓度，5和25ng/ml，它们各使CAT活性增加1.4倍和2.6倍，当NGF(50ng/ml)(单独使用它就能使酶活性增加2.8倍)与BDNF结合起来使用时，CAT活性的水平至少产生一个叠加的效应(表VIII)。在所用的BDNF浓度下，因NGF而引起的叠加作用使酶活性比参照值分别净增加4.2倍和5.4倍，所测得的值实际上要比叠加还要稍高些。
             表VIII
同时加入BDNF和NGF对CAT活性的影响浓度(ng/ml)       CAT活性          ％对照值
             (pmol/Hr/孔/对照物            561.3±34.8NGF(50)           1546.3±89.7      280BDNF(5)           768.0±25.4       140BDNF(25)          1470.1±66.2      260NGF(50)+BDNF(5)   2767.6±177.2     490NGF(50)+BDNF(25)    3742.0±669.3          670在所指出浓度的营养因子存在下，将膈细胞在5HS/N3中生长12天后，如前所述地测定CAT活性，数值代表了4-5次测定值的平均值±标准误差(S.E.M)。
对于用BDNF处理后的生物响应是由于以依赖于BDNF的方式释放内源性NGF而引起的可能性进行了试验。为了研究这个问题，用了一种NGF的单克隆抗体(抗体27/21，korsching和Thoenen，1983)来阻塞任何一种与NGF有关的响应。如表IX所示，NGF对CAT活性的作用因抗-NGF而大大降低了，而由BDNF诱导的响应基本上未受影响，但值得注意的是，与未处理的对照相比，在单独用抗-NGF处理的培养物中的CAT活性的基础水平降低了20％。不管如何，在膈细胞培养物中观察到因BDNF而使CAT活性的增加，看来是一种直接的作用，而不是由于内源性NGF的增加等中介而间接起作用的。
                表IX
抗-NGF对NGF和BDNF诱导CAT酶活性能力的影响CAT活性浓度(ng/ml)(pmol/HR/孔)    ％对照值对照物             517.53±3.2       -BDNF(25)           1021.6±106.1     197NGF(50)            1139.0±99.1      220参照物+抗-NGF      418.7±27.0       81BDNF+抗-NGF        819.2±68.8       158NGF+抗-NGF         551.0±27.0       107在所指示浓度的营养因子存在下，在5HS/N3中生长12天后，收集这些膈细胞[铺放浓度为2.3(105)细胞/cm2]。按在实验方法部分中所述的方法测定CAT活性，数值代表了6次测定值的平均值±标准误差。
对AChE活性和CAT活性一起受BDNF或NGF协调地调节的可能性进行了试验(图26)。对照CAT活性浓度直至50ng/ml，AChE对BDNF或NGF的剂量响应特性似乎与线性增加的该酶活性的响应是完全相同的。与未处理的对照相比，NGF和BDNF在该浓度下分别使AChE活性增加274％和234％。
对于BDNF或NGF诱导CAT活性增加的时间进程也进行了研究(图27)，在用50ng/ml BDNF处理过的培养物中，CAT活性在3天内增加到参照值的170％，这种增加一直持续到第6天，在剩下的试验时间内，CAT活性在高于对照值2.5倍时达到平稳状态。相比之下，CAT对NGF(50ng/ml)的响应变得更快，在3天内，其诱导量即达到参照值的2.5倍，CAT活性的增加继续呈线性，在12天后，其值达到参照值的3.2倍以上。
在培养物中生长了一段时间的星形细胞已表明还合成了除NGF外的多种神经营养活性(Lindsay，R.M.1979，Nature 282：80-82；Lindsay等人，1982，Brain.Res.243：329-343；Alderson等人，1989，Dev.Brain.Res.48：229-241)。虽然我们已经排除了，我们现在对BDNF的观察结果是通过NGF含量的增加为媒介而间接起作用的，可能性，但可以设想，BDNF可以通过调节其它神经营养因子的表达(特别是在神经胶质细胞中)，而间接起作用，为了分析非神经无细胞可能影响BDNF对膈细胞培养物中CAT活性的作用的可能性，我们在混合神经胶质-神经元培养物中与神经元富集培养物中胆碱能神经元对BDNF的响应进行比较(图28)，在神经元富集培养物中，CAT活性对BDNF的响应呈现一种钟形曲线；在BDNF剂量为5ng/ml时，其增加量达到最大，而当BDNF浓度为25ng/ml时，酶的活性有显著下降(P＞0.001，将BDNF浓度为15ng/ml的与浓度为25ng/ml的相比)。与图25中显示的结果相类似，在汇合神经胶质层存在下，CAT对BDNF的响应呈线性的，这种状态一直持续到BDNF浓度为25ng/ml。25ng/ml是试验中所用的最高剂量。在有非神经元细胞存在时，需要用更高水平的BDNF才能使CAT活性获得与在经过类似处理的神经元富集培养过程中所获得的等同的增加。尽管如此，在有神经胶质细胞或没有神经胶质细胞存在的条件下BDNF在膈胆碱能神经元中最大刺激CAT活性的能力是基本相同的。
根据CAT和AChE活性，很显然，在提高胆碱能表现型标志方面，BDNF和AGF起着相似作用。为了对此作进一步研究，将BDNF对与Na+有关的，高亲和性胆碱摄取量的影响与NGF的进行比较(图29)，在50ng/ml BDNF存在下生长12天的细胞能累积的胆碱量是未处理参照物的3.8倍。在平行的培养过程中，NGT(25ng/ml)能引起胆碱累积量增加2.3倍。16.3讨论
与BDNF对外周神经元所产生的作用相比(Barde等人1982，EMBO.J.1：549-553；Lindsay等人，1985，Dev.Biol.112：319～328；Davies等人，1986，J.Neurosci.6：1897-1904；Hofer，M.和Barde，Y.，1988，Nature 331：262-262)，BDNF在中枢神经***中的神经元特异性尚未被很好地描述，至今唯一已知有响应的CNS神经元是在E17大鼠视网膜培养物中被首次识别的Thy-1阳性视网膜神经节细胞的一种小的亚群，(Johnson等人，1986，J.Neurosci.6：3031-3038)。进一步的研究还发现BDNF对外殖体培养物中对成熟的视网膜神经节细胞的影响(Thanos等人，1989，Eur.J.Neuro 1：19-26)。在这项研究中，我们表明，BDNF增中了由大鼠胚胎中膈培养出的胆碱能神经元的存活力(AChE组织化学染色法表明)，而且也增加了各种胆碱能表现型标志物表达力，即增加了AChE和CAT的酶活性的高亲和性胆碱的摄取量。此外，还发现BDNF增加了NGF受体在膈细胞培养物中的表达。
在起始的实验中，我们发现BDNF使E17膈细胞培养物中的AChE阳性神经元的数目增加大约2倍。与用NGF时(Hartikka，J.和Hefti，F.，1988，J.Neurosci.8：2967-2985)一样，这种作用在低细胞密度时最明显，有趣的是，同时加入NGF和BDNF，并不会使AChE阳性细胞数目比单独用任何一种生长因子所达到的水平有进一步增加这一结果相当有力地表明，BDNF和NFGF主要对相同的膈胆碱能神经元群体起作用。
如以前对NGF所报导的那样(Hefti等人，1985，Neuros-cience 1：55-68)，BDNF在细胞浓度较高的培养物中并不能提高胆碱能神经元的存活力，当一部分细胞被放置后，发现在高细胞浓度时的胆碱能神经元存活力要比低细胞浓度时更高，即使在没有任何神经营养因子存在的条件下也是如此。对这种现象有几种可能的解释，这些解释包括：细胞之间接触的增加，因非神经元细胞数量增加而产生的有利影响；或者内源性神经营养活性高于成比例的增加。根据后一种可能性，我们发现由于向未处理的高密度培养物中加入过量的抗-NGF仅减少了20％的基本CAT活性，故没有明显增加内源性NGF的迹象。在这些培养物中，内源性NGF能使CAT活性增加3.4倍之多。
如同在蛋白质和mRNA含量中看到的那样，目前有许多报导指出，NGF能够向上调节它自己的受体在培养的神经元上和体内的表达。在这项研究中，我们用单克隆抗体IgG-192去检测NGF-受体，这种单克隆抗体已经在大鼠感觉神经元和大鼠脑中被表征(Taniuchi，M，和Johnson，E.，1985，J.Cell Biol.101：1100-1106)，结果一方面证实了Hartikka和Hefti的发现，即通过测得IgG-192免疫阳性神经元的数目的增加而表明NGF能在膈细胞培养物中提高其受体的水平。除此以外，我们还发现，BDNF能使IgG-192免疫阳性细胞增加3倍以上，对BDNF的响应是两个阶段的，因为在浓度较高时，在浓度范围为25-100ng/ml时，BDNF不能引起像在浓度为10ng/ml时的阳性细胞数目的增加，有趣的是，这种形式的剂量响应特别与用BDNF引起AChE阳性神经元数目增加时所看到的剂量响应特性十分不同，在后一种情况下，浓度较高时BDNF的最大作用不会降低。值得注意的是，最近已发现低亲和性NGF受体也会以类似的亲和力与BDNF结合，这说明NGF和BDNF的低亲和性受体可能是相同的(Rodriguez-Tebar等人.1990，Binding of Brain-Derived Neurotrophic Fac-tor to the Nerve Growth Factor Receptor Neuron.4，487-492).
BDNF和NGF在诱导AChE活性方面是等价的发现表明：BDNF和NGF作用机理上可能的相似性，尽管我们还发现BDNF能将胆碱能神经元存活力提高到与NGF相类似的程度，但BDNF对CAT酶活性的影响仍不如NGF那么大。在几次实验中，用BDNF对CAT的最大诱导范围在1.8-2.6倍之间，而用NGF时通常观察到3倍以上的数值。因此，BDNF和NGF虽然在作用机理上会存在一些相似之处，但在它们各自受体的表达和调节上，以及将这些受体与诱导CAT活性所必需的第二种信使通道耦合方面，很有可能存在细小的差别。
由BDNF或NGF产生的CAT活性诱导水平之间的差别可能代表了调节途径有差别的假设，进一步为时间过程的研究结果所支持。培养的膈神经元对BDNF发生响应，CAT活性一直增加到第6天，在第6天，响应呈现平稳状态。对照之下，NGF响应特性中CAT活性诱导过程则显示出一个从第3天到第12天的持续的线性增加。在用BDNF处理的培养物中，CAT活性诱导的增加在第6天停止，可能表示或者BDNF受体或者该响应途径中的一种所需成分表达发生了变化。假定在12天后的高密度培养过程中测得的胆碱能神经元(AChE阳性神经元)的数量与内源性BDNF或NGF无关，则不同神经元细胞的死亡不太可能导致这两种生长因子诱导CAT活性的时间过程的不同。
在最初的，用BDNF处理前脑低部胆碱能细胞的实验中，我们对基本的细胞类型即神经元或神经胶质并没有假定对这种神经营养因子有响应。尽管在高度富集外周神经元的培养物中进行的研究有力地使人想到BDNF直接对神经元产生作用(Lindsay等人，1985，Dev.Biol.112：319-328；Lindsay，1988.J.Neurosei.T：2394-2405)，但仍可以认为在本项研究中发现的BDNF对神经元的作用有可能是通过BDNF对星形神经胶质或其他非神经元细胞的基本作用而间接引起的，但是发现在有以星形神经胶质细胞为主的连生单层存在下，或者在通过用***抑制子胞嘧啶***糖苷处理而使神经胶质细胞大量被消耗的培养基中，BDNF同样有效地诱导CAT活性。这些实验中的一个有趣发现是对BDNF的剂量响应曲线的形状在这两种情况下明显不同，在有神经胶质单层存在下，对BDNF的响应随BDNF浓度的递增呈线性变化。在神经元富集培养物中，对BDNF的剂量响应特性左移。这些结果的一种可能的解释是：该神经胶质本身可以表达BDNF受体，从而降低了位于神经元上的受体可获得的配体的有效浓度。作为另一种解释是：星形细胞的抑制作用可能是间接的、即与配体浓度或受体表达的作用无关，并例如是通过大量增加BDNF的降解量而间接起作，Hartikka和Hefti(Hartikka，J.和Hefti，F.，1988，J.Neurosci.8：2967-2985)以及Honegger和Lenoir，(Honegger.P.和Lenoir D.1982，Dev.Brain Res.3：229-238)也报导了类似的观察结果。现已证实，不同脑区域的神经胶质细胞强烈影响着与这些区域有关的神经元的形态(Prochiantz等人，1979，Proc.Natl.AcadSci.U.S.A.76：5387-5391；Prochiantz et al.1981，Nature 293：570-572)。因此，膈神经胶质可能具有膈的或分泌的固有特性，该特性起抑制胆碱能表现型表达的作用。现在，人们正在对由海马分离的星形细胞在类似的试验条件下的调节特性进行研究。
根据所给出的数据，很显然，BDNF和NGF二者均能提高膈胆碱能神经元的功能，推测一下这两种显然作用在单独一个神经元群体上的高度同源的神经营养因子之间可能的生理学上的关系是十分有趣的，已有的一些建议告诉我们，在外周神经元的早期发育期间，尤其是在背侧根神经节神经元的亚群体上或其母前体上BDNF-和NGF的作用一开始可能是彼此重叠的，然后，后者分离出来，独立地对不同的细胞群体起作用(Lindsay et al.，1985，Dev.Biol.112：319-328；Ersberger，U.and Rohrer，H.，1988 Dev.Biol.126：420-432)，Barde，Y.，A.1989，Neuron 2：1525-1534)，但是，至今尚未用合适确定感觉神经元亚群的标志物以确切地确认这一点。由于这项研究集中于在发育的单独一个时间点E17上培养物中产生的胚胎膈神经元上，因此，在该膈细胞以后的各个发育阶段中，有可能发生类似的分离现象。因此，在膈胆碱能神经元对BDNF或NGF的响应中可以证明存在时间上和空间上的差别。
现在，我们感兴趣的是对于BDNF在体内对前脑底部胆碱能神经元的作用进行研究，有证据表明，由海马获得的NGF可能与体内前脑底部胆碱能神经元的正常发展及维持有关，弄清BDNF在体内是否具有类似的作用是十分有意义的，最近的关于BDNF mRNA在海马中特别丰富的发现支持了这样一种作用。17：例：将前期前BDNF酶催转化成有活性的成熟BDNF17.1.原料及方法
将从市场上买来的内蛋白酶Arg-C(由小鼠下颌下腺提取)用于将hBDNF较大的前体形式(前期前BDNF)酶催转化成生物活性的成熟蛋白质，该酶催***过程在体外完成，酶催反应中的基质是在CHO-DG44细胞中合成的前期前hBDNF，该前期前hBDNF被分泌到细胞培养介质中并被收集起来，该培养介质由Ham氏F12介质(无核苷)组成，该Ham氏F12介质中具有1％胎牛血清(FBS)和各1％的青霉素和链霉素。在37℃下，用5个单位的酶和50μl含有前期前hBDNF的CHO-DG44细胞上清液将反应进行5分钟，在这些条件下，前期前hBDNF***成成熟的hBDNF。17.2结果及讨论
用内蛋白酶Arg-C在体外将前期前体形式的重组hBDNF(大约31,000道尔顿)完全加工成成熟的生物活性hBDNF(大约12,000道尔顿)。重组体人脑获得的神经营养因子已经能成功地在哺乳动物细胞(CHO-DG44细胞)中产生。该hBDNF基因能被稳定地整合到CHO细胞基因组中，而用氨甲嘌呤扩增法可以将该hBDNF基因扩增，该重组hBDNF被分泌到介质中，并被发现它是有生物活性的。在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(15％凝胶)之前进行的代谢标记证明，合成的用[35S]标记的大多数hBDNF产物(被分泌到培养介质中)均能象具有表现分子量为31,000的前期前体形式那样迁移(图30，通道2)。由野生型CHO-DG44细胞分泌的，用[35S]-标记的蛋白质被示于图30中的通道。为了主要产生成熟的hBDNF(表现分子量为12,000)我们设计了一种酶促化***hBDNF的体外方法。
图30中通道3-6表示胰蛋白酶消化产物，将牛胰腺蛋白酶(由Worthington购买，无胰凝乳蛋白酶)溶解在磷酸盐缓冲液中，并将它加入到50μl，用[35S]标记的CHO细胞hBDNF的等分试验中，所用的胰蛋白酶浓度分别是25、50、75和100μg/ml，用[35S]标记的反应产物分别示于泳道3-6，该酶催化***反应在37℃下进行5分钟，可以看到分子量为31,000的前期前体hBDNF的标记强度在逐渐减小。而分子量为18,500的产物则相应地增加，在这些条件下，不能产生成熟形式的hBDNF(分子量为12,000)。图30中通道7表示在用内蛋白酶Arg-C对CHO细胞hBDNF进行酶催化消化后的[35S]标记的反应产物，所述的内蛋白酶Arg-C是由来自Boehringer MannheimBiochemicals Inc.得到的小鼠颌下腺中分离出的。用100μlMilli-Q水，由冻干制剂重构100单位的这种酶，并将它贮存在-20℃下，为了对CHO细胞hBDNF进行酶催化消化，我们采用了5单位(5μl)的酶和50μl从含有原始hBDNF(图30通道2)的CHO细胞上清液得到的[35S]标记蛋白质。如图30中通道7所示，5个单位的内蛋白酶Arg-C(能在37℃下，5分钟内将前期前体形式的hBDNF(31,000分子量)，转化成成熟的hBDNF(12,000分子量)。
相对未加工的上清液而言，用内蛋白酶Arg-C酶催处理表达hBDNF的CHO细胞上清液，可以增加BDNF的生物活性水平，在37℃下，用内蛋白酶Arg-C将从表达hBDNF的CHO-DG44细胞得到的上清液处理5分钟，用20单位的酶处理200μl的上清液，用E8小鸡背侧根神经节的外殖体对经过处理的和未经处理的hBDNF进行生物活性测定，在加入hBDNF后24小时，对神经轴突的生长情况定量计分，我们始终发现经内蛋白酶处理过的BDNF试样，其生物活性明显高于对照的(未处理的)hBDNF试样的生物活性。图31表示由这些数据组成的浓度曲线。
总之，提纯的内蛋白酶Arg-C可用于体外酶催化反应中来从未完全处理的前体分子(即前期BDNF)产生成熟的，具有生物活性的重组体人脑源神经营养因子。这种新方法可以使我们由哺乳动物细胞培养***大规模地有效制备有生物活性的人BDNF，举例来说，我们可以将内蛋白酶Arg-C固定到一种固体基质中，并建立一种有效的柱色谱分析方法。18.例：脑源神经营养因子促进大鼠前侧的多巴胺能神经元的存活成熟18.1原料和方法18.1.1.细胞培养物
通过将由E14-E15大鼠胚胎剖割获得的前侧中脑组织用酶催化法和机械法分离建立解离的培养物。典型地，收集由2升或3升大鼠胚胎(取自定时交配的Sprague-Dawley大鼠)得到的组织，并在F12介质(Gibco)中于37℃下用胰蛋白酶(0.125％，Wor-thington)处理20分钟，将它在生长介质(含有下列补充物的MEM，谷氨酰胺，2mM，葡萄糖，6mg/ml，青霉素G，0.5U/ml，链霉素5μg/ml，胎牛血清7.5％)中冲洗，然后将该组织低速下短时间离心5分钟，并将沉淀通过研磨解离，等1-2分钟，使其中未分散开的细胞团沉淀，而后，将该单细胞悬浮液接种到35mm含有生长介质的皿板上(该皿板上事先涂以聚鸟氨酸和昆布氨酸；Lindsay，et al.，1985，Dev.Biol.112：319)，使其密度达到每平方厘米5×104细胞，在生长介质中培养一整夜，使其细胞附着，而后，将细胞在有或没BDNF存在的条件下在无血清的如Bottenstein和Sato所述的(Bottenstein和Sato，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76：514)规定介质中培养，不同的是所述规定介质中以20ng/ml包括胰岛素。为了用肉眼观察多巴胺能细胞，将培养基用4％多聚甲醛固定，仔细冲洗用含有1.5％马血清的Sorensen氏缓冲溶液中的0.02％Saponin进行渗透化，并用抗大鼠TH(Boehringer-Mannheim)的小鼠单克隆抗体将它染色，用Vectastain ABC药盒(Vector Labs)使初始的抗体结合情况能用肉恨观察到。18.1.2.测定多巴胺摄取量
按上18.1.1所述制备培养物，并在有或没有50ng/ml猪BDNF条件下将它生长所指出的天数，在所指明的时间点上在同样的三个培养物中测定多巴胺的摄入量，将细胞在其有下列成份的摄取一缓冲溶液中预洗；136.8mM NaCl，2.7mMKCl，8mM Na2HPO4 7H2O，1.5mMKH2PO4，5mM葡萄糖，1mM CaCl2，1mMMgSO4，0.1mM抗坏血酸盐和0.1mM巴吉林，pH7.4。这些等测定非神经元3H-多巴胺摄取量的试样，含有苯托品(BZT)，它包括在该吸收缓冲溶液中，其浓度为5μM，洗涤后，将这些细胞在新鲜的摄取缓冲液中预热到37℃5分钟，在第5分钟时，加入3H-多巴胺(NEN，40ci/mmol)，使其最终浓度达到50nM，将该培养物在37℃下保温15分钟，除去该摄取溶液，并将该细胞放在冰上，并用冰冷的摄取缓冲液洗涤四次，向培养皿中加入0.5N NaOH，收集细胞在贝克曼闪烁计数器中，用15ml Ultima Gold闪烁液(Packard.Instruments)测量该NaOH提取物。特定的神经元的多巴胺吸收量被定义为：在没有BZT存在时观察到的摄取量(cpm)，低于有BZT存在时的摄取量。一般，全部摄取量中的70-90％可被BZT抑制，在每一个同样的培养物中，在每个时刻利用免疫细胞化学染色技术测定TH+神经元的数目，所显示的结果代表了对每一种TH+的基值标准化的摄取量。18.1.3.BDNF的短暂表述
用含有编码人BDNF的顺序的载体cDMS将Cos M5细胞转染，在转染后第72小时，收集50ml培养物上清液，并对6M尿素渗析，将渗析后的上清液与两性电解质(pH3.5-10，BioRad)结合4个半小时。收集其组分，并用渗析管将它对pH为7.6的25mM NaPO4缓冲液进行渗析，所述的渗析管事先用BSA(0.5mg/ml)预洗涤，以防止非特异性吸收生。在E8小鸡背侧根神经节外殖体培养物，检测组分的神经轴突生长促进活性。将活性组分合并在一起，在8-18％凝胶上，用SDS PAGE对该活性集中物进行分析，随后在8-18％凝胶上进行银染色(Wrayet al.，1981，Anal，Biochem.118；197)揭示了在对应于BSA的68KD处有一条微弱的带，而在12KD附近有一条单吸收带，该吸收带与以前看到的猪BDNF的相对应(Barde.et al.，1982，EMBO.J.1：549)(数据未给出)。将在鸡背侧根神经节的，结状的和交感神经节的外殖体上进行的生物测试结果作比较，结果发现提纯的重组体BDNF的特异活性及神经元特异性与提纯的猪BDNF的相似。18.1.4.由转染的CHO细胞产生hBDNF
CHO-DG44细胞是L.Chasin博士(Columbia University，NY)的一项成果，这些细胞缺乏二氢叶酸还原酶(dhfr-)(Urlaub和Chasin，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220)将CHO-DG44细胞保持在含有10％胎牛血清1％青霉素和链霉素及2mM“谷氨酰胺的Ham氏F12介质中，将这些细胞一周通过两次，并对其枝原体掺杂情况进行例行检查，在转染之前，通过双层氯化铯色带法纯化所有的质粒DNA，如前所述，将由人脑获得的神经营养因子基因亚克隆到该哺乳动物表达载体pCDM8中，以生成pC8hB(Maisonpierre et al.，1990，science.247：1446-1451)。由L.chasin博士提供弱化的二氢叶酸还原酶基因，p410。用电穿孔技术将这两种基因结构一同转染到CHO-DG44细胞中(参见Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques 6：742-751)。用20μgp′C8hB和0.2μgp410可以转染大约1×106细胞。转染后48小时，将CHO-DG44细胞分到一些由下列物质组成的选择介质中；无核苷酸的Ham氏F12(无胸苷和次黄嘌呤；-HT)加上10％经过渗析的牛胎血清以及1％青霉素和链霉素。在将这些细胞放在无核苷选择介质中后大约10天，分出各单个克隆体。用0.02，0.05，或0.1μM氨甲喋呤(MTX)处理经单个选择出来的，对在无核苷Ham氏F12(-HT)介质中生长有抗性的克隆体，从而诱发基因扩增，(Alt et al.，1978，J.Biol.Chem.253：1357-1370)。将这些抗MTX克隆体培养成资源库，并用1.5、2.0或2.5μM MTK使之进一步扩增，从中分离并选出单独一个抗2.5μM MTX的克隆体，以用于扩大培养以及制备hBDNF。对该克隆(DGZ1000-B-3-2.5)进行Southern印迹分析，结果发现，与野生型CHO-DG44细胞相比，BDNF基因扩增了大约50倍，用胚胎(E8)鸡背侧根神经节(DRG)外殖体进行生物测试，用该测试结果推测出这种克隆体产生约9.5μg hBDNF/ml(未示出)。通过在480cm2回转瓶中培养DGZ1000-B-β-2.5细胞来大规模地制备重组hBDNF，在这些细胞达到连生状态后大约4天时，收集介质，象前面对COS上清液所述的那样，从培养上清液中提纯hBDNF。18.2.结果及讨论
表征控制神经元存活及靶细胞支配特异性的分子信号具有重要的意义，这不仅仅是因为它有助于解释神经***是如何形成的，而且有可能使我们更好地理解有关维持和以适当的突触构形修复成熟神经元的机理。显然人们普遍认为神经元的存活及维持取决于特定的、由靶细胞获得的神经营养因子(Levi-Montalcini和Angeletti，1968，Physiol.Rev.，48：534；Thoenen和Barde，1980，Physiol.Rev.60：1284；Purves，D.，1988，in Body and Brain，Harvard UniversityPress，Cambridge，MA；Barde，Y.A.1989.Neuron.2：1525；Lind-say，R.M.1988，The Making of the Nervous system，Oxford Uni-versity Press，Oxford，p148)但只有极少数这样一些分子的特征被完整地描述过，至今只有两种神经营养因子，即神经生长因子(NGF)和由脑源神经营养因子(BDNF)已被表明能选择性地维持体内不同神经元群体的存活(Levi-Montalcini and Angeletti，1968，Physiol，Rev.48：534；Barde，Y.A.，1989，Neuron，2：1525，Leibrocket al.1989，Nature 341：149)。
神经元细胞培养物已被广泛地用来进行识别细胞和组织提取物中的神经营养活性的生物测定(Levi-Montalcini and Angeletti，1968，Physiol，Rev.48：534；Thoenen and Barde，1980，Physiol，Rev.60：1284；Lindsay，R.M.1988，The Making of the Nervous System，Oxford University Press，Oxford.P.148；Varon and Adler，1981，Adv.Cell.Neurobiol.2：118)，它们还被用来测定被纯化神经营养因子的神经元特异性(Ebendal，T.，1989，in Nerve Grouwth Factors，John Wiley London.p81，Barbin et al.，1984.J Neurochem.43.1468；Barde et al，1982，EMBO J.1：549；Davies et al.，1986，J.Neurosci.6：1897；Lindsay et al.，1985，Dev.Biol.112：319).至今，已有许多人对不同种类的外周神经***(PNS)神经元的神经营养需求问题进行了研究，NGF的可获得性使之已经成为被详细表征过其特性的神经营养因子：NGF被表明在体外及体内对PNS和CNS的神经元亚群体的存活和维持是必不可少的(Levi-Montal-cini和Angeletti，1968，Physiol.Rev.48：534；Thoenen和Barde，1980，Physiol，Rev.，60：1284；Whittemore和Seiger，1987，BrainRes.Rev.，12：439；Snider和Johnson，1989，Ann.Neurol.26：489；Hefti et al.1989.Neurobiology of Aging 10：515；Martinez etal.，1987，Brain Res.412：295；Takei et al.，1988，J.Neuro-chem.51：1118；Hartikka和Hefti，1988，J.Neurosci，8：2967)。阻碍识别CNS神经元的神经营养因子一直是不同于NGF的神经营养因子的提取制剂有限的可获得性，以及制备特定神经元群体的同源制剂的困难性。最近的两项观察成果促使我们去研究BDNF对CNS(黑质)多巴胺能神经元的作用，首先，现在已经清楚，BDNF基因是在CNS可表达的，且其表达水平相当于或比NGF基因更高(Leibrock et al.，1989，Nature 341：149)。其次，已经有报导说，一种由牛的纹状体(一种黑质多巴胺能神经元的靶)部分纯化的，其特征似乎与BDNF相似的蛋白质能提高由中脑制得的多巴胺能神经元的体外存活力(Dal Toso et al.，1988，J.Neurosci 8：733)
图32A表示在培养9天以后，被分离的前侧中脑细胞的典型外部形状。事实上，所有的细胞均具有明亮相的核周体，且过程较长，很明显，只有极少量具有成纤维细胞形态的细胞出现，而且当对培养物用星形标记物，即神经胶质纤维酸蛋白(GFAP；Bignami etal.，1972，Brain Res.43：429)的抗体进行染色时，检测不到有星形神经胶质细胞存在。为了肉眼观察这些培养物中的多巴胺能神经元，用TH的单克隆抗体进行免疫细胞化学染色，正如所期望的那样，TH+神经元的数量较小(箭头，图32B，32C)并且随培养时间而变化，变化范围为被放置细胞的0.1-0.5％。如图33所示，在TH细胞中可以看到各种神经元形态。
在所有的培养过程中，当在体外最初的3-4天后，TH+细胞的数量总要逐渐下降(图34A、35)例如，在培养到第8天时，对照培养物中的TH+细胞数只是第二天在相似培养物中所测得数量的25％(图35)但是，与对照物相比，在用BDNF处理过的培养物中，TH+细胞的损失量大大地减小，在体外培养8天后，在任一时间(在用BDNF处理过的培养物中)测得的TH+细胞量总是高于未处理的对照物中的量，例如，当单独一次加入BDNF时数量增加1.8倍(图34A)，而当多次加入时则增加5倍(图35)。即使是向维持了8天的培养物中只加一次BDNF，也能发现BDNF的作用随剂量变化的(图34B)，与以前的报导(Dal.Toso et al.，1988，J.Neurosci.8：733；Knusel et al.，1990，J.Neurosci.10：558)相一致的是，NGF(50ng/ml)对TH+细胞的数量没有影响(图34C)。
作为研究BDNF在这些培养过程中对多巴胺能神经元影响的另一个方法，我们对TH+细胞摄取3H-多巴胺的能力进行了研究。如表X所示，多巴胺的摄取能力(每一个TH+神经元标准化的值)在培养过程前8天中显著增加，而此后便下降，但我们发现，BDNF不改变TH+细胞摄取多巴胺的能力。因为在有BDNF存在或没有存在时，其时间过程相同，摄取量相似(表X)。由此结果，我们假定，与在存活不一定非需要BDNF不可的神经元中诱导多巴胺能表现型的表达相反，在中脑培养物中，BDNF可能在起作用来促进多巴胺能神经元的存活。为了进一步研究这点，我们进行了一些实验，在这些实验中，我们一开始推迟几天向培养物中加入BDNF，然后测定这些培养过程中的TH+神经元的数量。我们发现当推迟到第5天方加入BDNF，并随后在第6、8或10天时测定TH+细胞的数量，结果发现，与在第二天加入BDNF的平行培养过程相比，在这些延缓培养过程中只有极少量的多巴胺能细胞(图36)。虽然延缓加入BDNF与参照物相比能明显提高TH+神经元的数量，但即使是在同等的时刻进行测定，延缓加入的作用永远不能发现救活象在第二天加入BDNF是救活那样多的TH+神经元。
综合起来看，这些结果与BDNF只可能在一定数量的细胞中起增加TH基因表达作用的说法是矛盾的，并且说明BDNF通过提高多巴胺能神经元的存活力而施加其影响。而多巴胺能神经元不在早期就向培养物中加入这种BDNF神经营养因子时，就会被损失。
有好几份报告均提供资料证明，用从靶获得的提取物或各种生长因子均能促进中脑多巴胺能神经元的成熟，并提高其体外存活力(DalToso et al.，1988，J Neurosci.8：733；Knusel et al.，1990，J Neurosci.10：558；Prochiantz et al.，1979，Proc Natl.Acad.Sci.USA 76：5387；DiPorzio et al.，1980，Nature 288：370，Pro-chiantz et al.，1981，Nature 293：570；Denis Donini et al.，1983.J.Neurosci 3：2292)但至今，还没有一份报告说一种完全纯化的分子能在完全没有神经胶质细胞存在下直接地和有选择性地维持TH+神经元的存活或促使细胞***(例如：用IGF-1或FGF进行观察，Dal Toso et al.，1988，J.Neurosci.8：733)。与以前的采用早期小鼠胚胎组织的报导(Dal Toso et al.，1988，J.Neu-rosci.8：733)相一致的是：在无血清规定介中培养的E14大鼠前侧中脑细胞中基本上没有星形细胞或成纤维细胞。该研究过程采用比较低的细胞放置密度50,000细胞/cm2，因此，使得任何一种可能的内源性神经营养活性的作用减至最少，并且可以更准确地进行计数，从这里给出的结果来看，由Dal Toso等人从牛纹状体中被部分纯化的该神经营养因子(Dal Toso et al.，1988，J Neurosci.8：733)看来很可能与BDNF相似，这表明BDNF是在该纹状体中产生的并被从该黑质伸出的多巴胺能神经元的末端所吸收。但至今为止，用Northern印迹分析法一直不曾发现，在纹状体组织中有大量的BDNF的mRNA(或该神经营养因子族中其它成员的mRNA)。
很显然，在培养期间加入BDNF，即使是采用多次加入方式也不会使黑质多巴胺的神经元完全存活。在与我们的实验条件极其相似的条件下，Dal Toso等人也观察到了这种现象(Dal Toso et al.，1988，J.Neurosci 8：733)，Dal Toso等人认为这种损失可能与所用的细胞密度有关：在较高的细胞密度时(是我们所用密度的4倍)，可以看到大量儿茶酚胺-萤光细胞，而且这些细胞的自发消失现象降低了。有可能是细胞间的接触是这些细胞长时间存活所需要的。
为了确定这里所述的BDNF作用的生理关系，有必要进行进一步的研究，特别应对BDNF对体内前侧中脑多巴胺能神经元的发育及维持的影响进行研究。考虑到在帕金森症中黑质多巴胺能神经元的特定消失，因此，特别需要找到一种选择性地影响这些细胞的神经营养因子。因此，我们发现BDNF能维持这些用NGF难控制的神经元细胞的存活。就为一些确定BDNF是否能保护多巴胺能神经元使之免受6-羟基多巴胺或MPTP(1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶)的神经元毒性影响的动物实验提供了理论基础。这些研究将找到一种新的治疗帕金森综合症的方法。
                      表X
在前侧中脑细胞培养过程中，BDNF不直接使多巴胺摄取量增加，培养天数                              3H-多巴胺摄取量
                             (cpm/TH/(+)神经元/15分钟)
               对照物              用BDNF处理的3                  0.51±0.1           0.95±0.26                  4.5±0.3            3.1±0.68                  18.5±5.3           27.3±1.210                 3.37±0.24          2.21±0.1819.例：BDNF对γ-氨基丁酸摄取量产生一个与剂量有关的抑
   制作用。19.1原料及方法19.1.1.海马细胞培养物
从Sprague-Dawley大鼠的E18-19大鼠胚胎中解剖分离出海马，并将它收集在F10介质中，将该组织弄碎，用F10介质(Gibco)冲洗两次，并在37℃下，用0.25％胰蛋白酶Gibco将它胰蛋白酶化20分钟，通过向其中加入由补充有牛胎血清(FCS10％)、谷氨酰胺(2mM)、青霉素(25U/ml)和链霉素(25μg/ml)的最低基本介质(MEM)组成的含血清介质使胰蛋白酶失活。轻轻研磨使细胞离解，然后将离解的细胞收集起来，并以低速(500转/分)将它离心30秒钟，该离心过程是重复两次进行的，然后将细胞沉淀再次悬浮于含血清介质中，将这些细胞铺放到6mm小孔或35mm皿板上，这些小孔或皿板事先涂覆了聚鸟氨酸(10μg/ml)和昆布氨酸(10μg/ml)，在大多数实验中，细胞以大约71,000细胞/cm2的低密度铺放，在细胞铺放后5-6小时，将介质换成一种含有1％N3和青霉素-链霉素(分别为25单位/ml，25μg/ml)的无血清介质，并在此时加入BDNF介质每3天至4天换1次，同时重新加入该因子。19.1.2.测定γ-氨基丁酸GABA的高亲和性摄取量
利用改进的Tomozawa和Appel的方法(1986，Brain Res.399：111-124)来测定高亲和性GABA的摄取量。在含有140mM NaCl，2.6mM Kcl，1mM KH2PO4，1mM Na2HPO4，6mg/ml葡萄糖，1mMMgCl2，1mM CaCl2，0.1％BSA的GABA摄取缓冲溶液洗涤细胞，该GABA吸收缓冲液冲洗后在37℃下，将细胞与该GABA摄取缓冲液一起培养5分钟，然后加入3H-GABA(NEN，NET-191X，111.4Ci/mmol)，使其最终浓度达到12nM，在37℃下进行10分钟保温，然后将细胞放在冰上，并用该摄取缓冲液洗涤三次，在室温下与0.14N NaOH一起将细胞保温2小时，并对提取物中的3H-GABA进行计数。结果发现，3H-GABA摄取量一直高达至少30分钟是线性增加的，加入2mMβ-氨基丙酸后，摄入到非神经元细胞的GABA的摄取量受到抑制，而通过1mM3-哌啶甲酸的抑制作用，改变对神经元特异的摄取量。19.2.结果及讨论
最近我们已在神经元富集的海马培养物中，检测到大量的BDNF信使，而在海马星形细胞中则未发现，这些数据有力地表明BDNF.位于海马神经元中。为了观察BDNF对培养过程中的海马神经元的影响，我们用各种浓度的BDNF(由COS上清液rotorphor纯化的)处理这些细胞。在8天处理周期结束时，测定进入神经元中的高亲和性GABA摄取量。如图37中所示，BDNF产生了一种与剂量相关的GABA摄取抑制作用，因此，BDNF可能影响GABA能神经元的存活和/或表现型的表达，BDNF对含有谷氨酸的神经元没有任何作用(由谷氨酸摄取量测定结果得出)，对神经纤维蛋白质也没有作用，因此，BDNF对海马培养物的作用似乎是对GABA能神经元特异的。20.例：BDNF对MPP+的毒性作用产生一种保护作用20.1原料及方法20.1.1测定神经营养因子对MPP+处理过的SH-sy5y
  细胞的作用
将SH-SY5Y细胞以1×105细胞/孔的密度种入24孔板中，种入后24小时，用神经营养因子处理该细胞，用神经营养因子处理后24小时用MPP+(10μM)处理该细胞，在加入MPP+48小时后，用台盼蓝排斥测定法定量确定存活的细胞量。所用的神经营养因子是：mNGF-COS(1∶5稀释度)，hBDNF-COS(1∶5稀释度)，由大肠杆菌提纯的rCNTF(25ng/ml)，提纯的牛脑bFGF(25ng/ml)，rNT3-COS(1∶5稀释度)和纯化的hEGF(25ng/ml)。20.1.2.测定神经营养因子对经MPP+处理的前侧中脑细胞
   培养物的作用
根据前面所述的方法(参见前面18部分)，用E14大鼠胚胎建立被离解的前侧中脑神经元培养物，在这些培养物建立后48小时，用适当的所指出的神经营养剂对这些培养物进行处理，神经营养因子包括：hBDNF(由CHO细胞rotophor提纯的，≤50ng/ml)，提纯的mNGF(50ng/ml)，rNT-3(COS上清液，1∶50稀释度)，提纯的牛脑bFGF(10ng/ml)和由大肠杆菌提纯的rCNTF(25ng/ml)。加入神经营养因子后24小时，用MPP+(1μM)处理这些培养物，在用MPP+处理后48小时，用免疫组织化学染色法识别其中的TH阳性神经元并进行计数，数据代表了每个实验用三份同样试样做的三次独立实验的平均值，用有斜阴影的条块表示经MPP+处理后的TH阳性神经元的数目。空白条块代表末用MPP+处理的TH-阳性神经元的数量。20.2结果及讨论
台盼蓝排斥测定法分别测试BDNF、NGF，CNTF，NT-3，bFGF和EGF保护SH-SY5Y细胞免受1-甲基-4苯基吡啶姆(MPP+)毒性影响的能力时，结果发现，似乎只有BDNF和NGF对MPP+毒性表现出明显的保护性活性(表XI和表XII)
              表XI
BDNF和NGF使SH-sy5Y细胞免受MPP+毒性的保护作用
结果：
处理：                  存活的细胞数(％存活)COS-Mock转染的(1∶5)       0.4×104(5％)BDNF-COS(1∶5)             1.2×105(67％)NGF-COS(1∶5)              1.7×105(84％)CNTF                       0.6×104(14％)NT-3                       0.7×104(20％)bFGF                       0.4×104(11％)EGF                        0.1×104(3％)
            表XII
BDNF和NGF在MPP+毒性实验中的浓度曲线
处理                    ％存活细胞COS-MOCK(1∶2)                    13
    (1∶5)                    5
    (1∶10)                       3
    (1∶20)                       6
    (1∶50)                       7
    (1∶100)                      2COS-BDNF(1∶2)                        73
    (1∶5)                        67
    (1∶10)                       65
    (1∶20)                       42
    (1∶50)                       30
    (1∶100)                      25COS-NGF (1∶2)                        88
    (1∶5)                        84
    (1∶10)                       63
    (1∶20)                       50
    (1∶50)                       47
    (1∶100)                      34
在前侧中脑细胞培养过程中，这些数据表明BDNF对MPP+毒性具有明显的保护性作用，而bNGF起比较小的作用(图38)，用MPP+处理能使酪氨酸羟基酶阳性神经元的数量比对照培养物降低85％，但在与MPP+接触前预先用BDNF处理的培养物中只减少40％。MPP+是毒素MPTP的可能的活性代谢物，它已被认为能在体内诱发象帕金森病那样的综合症(它是一个人们接受的、帕金森氏综合病的典型方式)，因此，BDNF和NT-3的保护作用表明，这两种物质可能在治疗帕金森氏病或在中毒后防止神经组织受到伤害被证明是有用的。21.微生物寄存
下列重组噬菌体得重组质粒DNA已在1989年8月30日寄存在美国典型培养物收藏中心，(The American Type CultureCollectien.12301 Parklawn Drive Rockville Maryland 20852).
登记号                                    ATCC
phBDNF-C-1                                40648
λhBDNF-G-1                               40649
本发明并不限于本文中描述的具体实施例的范围，事实上，除了这些描述内容以外，根据前面所作的描述及附图本领域专业人员显然可对本发明作出各种的改变。这些改变也落在本申请所附的权利要求书的范围中。
本文中引用了许多篇出版物，它们作为参考文献被全部结合到本申请中。

Claims (29)

1.一种生产脑神经营养因子(BDNF)蛋白质的方法，它包括繁殖一种包含DNA分子的宿主细胞，该DNA分子包含一种编码成熟人BDNF蛋白质的序列，所述BDNF蛋白质具有下列的氨基酸序列：
     (a)His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser
Val Cys Asp Ser Ile Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp
Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser Gly Gly Thr Val Thr
Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gln Leu Lys
Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr
Thr Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp
Asn Ser Gln Cys Arg Thr Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala
Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg Ile Gly Trp Arg Phe
Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr Leu Thr Ile
Lys Arg Gly Arg；或
     (b)His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser
Val Cys Asp Ser Ile Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp
Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser Gly Gly Thr Val Thr
Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gln Leu Lys
Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr
Thr Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp
Asn Ser Gln Cys Arg Thr Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala
Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg Ile Gly Trp Arg Phe
Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr Leu Thr Ile
Lys Arg Gly；或
 (c)Met His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser
Val Cys Asp Ser Ile Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp
Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser Gly Gly Thr Val Thr
Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gln Leu Lys
Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr
Thr Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp
Asn Ser Gln Cys Arg Thr Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala
Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg Ile Gly Trp Arg Phe
Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr Leu Thr Ile
Lys Arg Gly Arg；
其中该DNA分子在宿主细胞中被表达；和分离所表达的BDNF蛋白质。
2.权利要求1的生产具有序列(a)的蛋白质的方法，其中所述的DNA分子如图(5)所示或者是其编码具有BDNF活性多肽的亚序列。
3.一种生产BDNF蛋白质的方法，它包括繁殖一种包含与权利要求1或2中定义的DNA分子同源或互补的核酸分子或其编码具有BDNF活性多肽的亚序列的宿主细胞；其中该DNA分子在宿主细胞中被表达；和分离所表达的BDNF蛋白质。
4.权利要求3的方法，其中所述核酸分子是具有图(5)核苷酸974至核苷酸1330所示的人BDNF序列的DNA分子。
5.前述的任一权利要求的方法，其中所述核酸或DNA分子受一个调控DNA序列控制。
6.前述的任一权利要求的方法，其中该核酸或DNA被包含在一种载体中。
7.前述的任一权利要求的方法，其中所述的宿主细胞是一种真核细胞或原核细胞。
8.前述的任一权利要求的方法，其中所述的宿主细胞是一种重组的微生物。
9.权利要求8的方法，其中所述的重组的微生物是一种细菌或酵母菌。
10.权利要求9的在细菌中生产具有权利要求1中的给出的序列(c)的蛋白质的方法。
11.权利要求7的方法，其中所述的宿主细胞是一种中国仓鼠卵巢细胞。
12.权利要求11的生产具有权利要求1给出的序列(b)的蛋白质的方法。
13.一种生产药物组合物的方法，该药物组合物含有基本上纯的、分离的和非变性的、且具有神经营养活性和下列氨基酸序列的蛋白质：
     (a)His Ser Asp pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser
Val Cys Asp Ser Ile Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp
Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser Gly Gly Thr Val Thr
Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gln Leu Lys
Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr
Thr Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp
Asn Ser Gln Cys Arg Thr Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala
Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg Ile Gly Trp Arg Phe
Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr Leu Thr Ile
Lys Arg Gly Arg；或
     (b)His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser
Val Cys Asp Ser Ile Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp
Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser Gly Gly Thr Val Thr
Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gln Leu Lys
Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr
Thr Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp
Asn Ser Gln Cys Arg Thr Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala
Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg Ile Gly Trp Arg Phe
Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr Leu Thr Ile
Lys Arg Gly；或
 (c)Met His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser
Val Cys Asp Ser Ile Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp
Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser Gly Gly Thr Val Thr
Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gln Leu Lys
Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr
Thr Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp
Asn Ser Gln Cys Arg Thr Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala
Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg Ile Gly Trp Arg Phe
Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr Leu Thr Ile
Lys Arg Gly Arg；
该方法包括使所述的蛋白质与可药用载体结合。
14.权利要求13的方法，其中所述载体是缓慢释放载体。
15.权利要求13或14的方法，该方法进一步包括使所述蛋白质和载体与第二种试剂结合。
16.权利要求15的方法，其中所述第二种试剂是神经生长因子(NGF)或BDNF/NGF家族中的另一成员。
17.一种生产抗体、抗体片段或其衍生物的方法，所述抗体、抗体片段或其衍生物能特异地识别如权利要求13定义的或由权利要求1-12中任一权利要求的方法获得的BDNF蛋白质，该方法包括用一种BDNF蛋白质、肽片段或多肽作为免疫原使宿主动物免疫，并且回收所产生的抗体。
18.一种生产单克隆抗体的方法，所述单克隆抗体能特异地识别如权利要求13定义的或由权利要求1-12中任一权利要求的方法获得的BDNF蛋白质，该方法包括构建一种编码所述单克隆抗体的核酸，在培养物中在含有所述核酸的连续细胞系中产生所述单克隆抗体，并回收所产生的抗体。
19.具有下列氨基酸序列的蛋白质或按权利要求1-12中任一权利要求的方法获得的BDNF蛋白质在制造治疗神经***疾病或失调的药物中的用途：
     (a)His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser
Val Cys Asp Ser Ile Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp
Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser Gly Gly Thr Val Thr
Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gln Leu Lys
Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr
Thr Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp
Asn Ser Gln Cys Arg Thr Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala
Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg Ile Gly Trp Arg Phe
Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr Leu Thr Ile
Lys Arg Gly Arg；或
     (b)His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser
Val Cys Asp Ser Ile Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp
Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser Gly Gly Thr Val Thr
Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gln Leu Lys
Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr
Thr Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp
Asn Ser Gln Cys Arg Thr Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala
Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg Ile Gly Trp Arg Phe
Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr Leu Thr Ile
Lys Arg Gly；或
 (c)Met His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser
Val Cys Asp Ser Ile Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp
Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser Gly Gly Thr Val Thr
Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gln Leu Lys
Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr
Thr Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp
Asn Ser Gln Cys Arg Thr Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala
Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg Ile Gly Trp Arg Phe
Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr Leu Thr Ile
Lys Arg Gly Arg。
20.权利要求19的用途，其中所述疾病或失调是感觉神经元的疾病或失调。
21.权利要求20的用途，其中所述感觉神经元的疾病或失调是糖尿病性神经病。
22.权利要求19的用途，其中所述神经***的疾病或失调是胆碱能神经元的疾病或失调。
23.权利要求22的用途，其中所述的胆碱能神经元是基底的前脑胆碱能神经元或中隔的胆碱能神经元。
24.权利要求19的用途，其中所述神经***的疾病或失调是阿耳茨海默氏病、杭廷顿氏舞蹈病、视网膜病、帕金森氏病、帕金森氏-附加综合症或糖尿病性神经病。
25.权利要求19的用途，其中所述神经***的疾病或失调是多巴胺能神经元的疾病或失调。
26.权利要求25的用途，其中所述的疾病或失调是帕金森氏病。
27.权利要求19的用途，其中所述神经***的疾病或失调包括神经***的损伤。
28.权利要求27的用途，其中所述的损伤是由创伤、外科手术、梗塞、感染、恶性肿瘤、接触毒剂、营养缺乏或糖尿病性神经病所致。
29.由权利要求17或18的方法获得的抗体在制造诊断神经***疾病或失调的药物中的用途。
CN90108380A 1989-08-30 1990-08-30 由脑组织获得的神经营养因子 Expired - Lifetime CN1124343C (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/400,591 US5180820A (en) 1989-08-30 1989-08-30 Brain-derived neurotrophic factor
US400,591 1990-03-07
US570,657 1990-08-20
US07/570,657 US5229500A (en) 1989-08-30 1990-08-20 Brain derived neurotrophic factor

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1052142A CN1052142A (zh) 1991-06-12
CN1124343C true CN1124343C (zh) 2003-10-15

Family

ID=27017110

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN90108380A Expired - Lifetime CN1124343C (zh) 1989-08-30 1990-08-30 由脑组织获得的神经营养因子

Country Status (20)

Country Link
US (2) US5229500A (zh)
EP (1) EP0440777B1 (zh)
KR (1) KR100188189B1 (zh)
CN (1) CN1124343C (zh)
AT (1) ATE148921T1 (zh)
AU (1) AU647412B2 (zh)
CA (1) CA2040412C (zh)
DE (1) DE69029934T2 (zh)
DK (1) DK0440777T3 (zh)
ES (1) ES2098271T3 (zh)
FI (1) FI105342B (zh)
HK (1) HK1006578A1 (zh)
IE (1) IE903128A1 (zh)
IL (1) IL95512A0 (zh)
LV (1) LV10725B (zh)
NO (1) NO303584B1 (zh)
PT (1) PT95152B (zh)
SG (1) SG46954A1 (zh)
SK (1) SK279668B6 (zh)
WO (1) WO1991003568A1 (zh)

Families Citing this family (88)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5844072A (en) 1992-05-26 1998-12-01 University Of California Antibiotic cryptdin peptides and methods of their use
US6780837B1 (en) 1989-08-30 2004-08-24 The Regents Of The University Of California Prevention of retinal injury and degeneration by specific factors
US5229500A (en) * 1989-08-30 1993-07-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Brain derived neurotrophic factor
GR1000980B (el) * 1989-08-30 1993-03-31 Max Planck Gesellschaft Νευροτροφινη-3,ενας νεος neυροτροφικος παραγοντας που σχετιζεται με τον παραγοντα αναπτυξης νευρων και τον νευροτροφικο παραγοντα που προερχεται απο τον εγκεφαλο.
US5180820A (en) * 1989-08-30 1993-01-19 Barde Yves Alain Brain-derived neurotrophic factor
US5986070A (en) * 1990-04-06 1999-11-16 Amgen Inc. Production of biologically active NGF proteins
US5235043A (en) * 1990-04-06 1993-08-10 Synergen, Inc. Production of biologically active, recombinant members of the ngf/bdnf family of neurotrophic proteins
WO1992020797A1 (en) * 1991-05-20 1992-11-26 Case Western Reserve University Neurotrophic factor, preparation and uses thereof
US5389529A (en) * 1991-06-12 1995-02-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Modified lamβ signal sequence and processes for producing recombinant neurotrophins
NZ242467A (en) * 1991-07-03 1995-06-27 Regeneron Pharma Methods and compositions using oligonucleotides to treat mammalian tumour cells expressing neurotrophic factors
CA2113083A1 (en) * 1991-07-10 1993-01-21 Vivien Wong Methods of treatment of motor neuron diseases using members of the bdnf/nt-3/ngf family of molecules
DE4237047A1 (en) * 1991-11-04 1993-05-06 I N R O Handels-Gmbh, 8750 Aschaffenburg, De Drug contg. polypeptide homologous to nerve growth factor and slow virus sequence - for treating amyotrophic lateral sclerosis, spinal muscle atrophy or Parkinson's disease
ATE193207T1 (de) * 1992-02-14 2000-06-15 Regeneron Pharma Vorbeugung von verletzungen und degenerationen von photorezeptoren durch neurotrophische faktoren
US6451763B1 (en) 1992-06-04 2002-09-17 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Retinal pigmented epithelium derived neurotrophic factor and methods of use
CA2137377C (en) * 1992-06-04 2011-03-08 Lincoln V. Johnson Retinal pigmented epithelium derived neurotrophic factor
ATE206056T1 (de) * 1992-06-08 2001-10-15 Takeda Chemical Industries Ltd Therapeutisches agens für neutropenie
AU4995193A (en) * 1992-08-04 1994-03-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method of enhancing differentiation and survival of neuronal precursor cells
AU676847B2 (en) * 1992-09-03 1997-03-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Dorsal tissue affecting factor and compositions
ZA936478B (en) * 1992-09-03 1994-09-30 Regeneron Pharma Dorsal tissue affecting factor and compositions
US20040224409A1 (en) * 1992-09-25 2004-11-11 Laurent Pradier Recombinant adenoviruses coding for brain-derived neurotrophic factor (BDNF)
IL109280A0 (en) * 1993-04-15 1994-07-31 Regeneron Pharma Neurotrophins for treatment of depression
DK0632008T3 (da) * 1993-06-01 1998-09-23 Ono Pharmaceutical Co Pentansyrederivater
WO1995006656A1 (en) * 1993-09-03 1995-03-09 The Regents Of The University Of California Neural tissue affecting factor and compositions
US6652850B1 (en) 1993-09-13 2003-11-25 Aventis Pharmaceuticals Inc. Adeno-associated viral liposomes and their use in transfecting dendritic cells to stimulate specific immunity
WO1995012686A1 (en) * 1993-11-03 1995-05-11 Cephalon, Inc. Method for screening for compounds which change the tyrosine hydroxylase content of intact cells in culture
US5556837A (en) * 1994-08-01 1996-09-17 Regeneron Pharmaceuticals Inc. Methods for treating addictive disorders
ES2191719T3 (es) * 1994-11-10 2003-09-16 Univ Kentucky Res Found Dispositivo implantable y recargable de descarga controlada para suministrar farmacos directamente a una parte interna del cuerpo.
US5770577A (en) * 1994-11-14 1998-06-23 Amgen Inc. BDNF and NT-3 polypeptides selectively linked to polyethylene glycol
US5679783A (en) * 1994-11-22 1997-10-21 The Regents Of The University Of California DNA encoding a tissue differentiation affecting factor
US6030613A (en) 1995-01-17 2000-02-29 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
JP3093974B2 (ja) * 1995-06-27 2000-10-03 住友ベークライト株式会社 神経細胞用培養液、その製造方法及びこれを用いる神経細胞の培養方法
US5830857A (en) * 1995-07-14 1998-11-03 Amgen Inc. Method of treating epilepsy
US6743628B1 (en) * 1995-08-28 2004-06-01 Washington University Method of cell culture using neurturin
US6184200B1 (en) 1995-09-28 2001-02-06 Amgen Inc. Truncated glial cell line-derived neurotrophic factor
US5731284A (en) * 1995-09-28 1998-03-24 Amgen Inc. Method for treating Alzheimer's disease using glial line-derived neurotrophic factor (GDNF) protein product
US5859311A (en) * 1995-11-27 1999-01-12 University Of Kentucky Research Foundation Transgenic mice which overexpress neurotrophin-3 (NT-3) and methods of use
US6225282B1 (en) * 1996-01-05 2001-05-01 Genentech, Inc. Treatment of hearing impairments
US5958875A (en) * 1996-03-29 1999-09-28 The Regents Of The University Of California Synthetic peptides derivatives with nerve growth factor-like neurotrophic activity
GB9608335D0 (en) * 1996-04-23 1996-06-26 Univ Kingston Method of enhancing ngf-mediated neurite growth with low molecular weight analoues of p.75 ngfr 367-379
AU720232B2 (en) * 1996-07-19 2000-05-25 Amgen, Inc. Analogs of cationic proteins
NZ335207A (en) * 1996-11-15 2000-09-29 Genentech Inc Process to isolate recombinant human neurotrophin using hydrophobic chromatography resin
KR20000070357A (ko) 1997-01-23 2000-11-25 다께우찌 마사야쓰 당뇨병 치료제
EP1029051A1 (en) * 1997-11-11 2000-08-23 Universiteit Utrecht Genes with restricted expression in mesencephalic dopaminergic neurons
US6331523B1 (en) 1998-03-12 2001-12-18 Genentech, Inc. Method of enhancing the survival of retinal neurons and treating ocular diseases using FGF-5
ES2316194T3 (es) * 1998-10-28 2009-04-01 Cornell Research Foundation, Inc. Metodos para la regulacion de la angiogenesis y la integridad vascular utilizando los ligandos bdnf, nt-3 y nt-4.
US20040120891A1 (en) * 1998-12-21 2004-06-24 Craig Hill Compounds for intracellular delivery of therapeutic moieties to nerve cells
AUPQ084899A0 (en) * 1999-06-08 1999-07-01 University Of Melbourne, The Neurotrophin agonists
AU780408B2 (en) * 1999-06-08 2005-03-17 Calibre Biotechnology Pty Limited Small cyclic mimics of brain-derived neurotrophic factor (BDNF)
EP1220681A2 (en) * 1999-09-16 2002-07-10 Prescient Neuropharma Inc. Opaminergic neuronal survival-promoting factors and uses thereof
EP1262189A1 (en) * 2000-03-06 2002-12-04 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Leptin-resistance ameliorating agents
US6784335B2 (en) 2000-06-29 2004-08-31 Deltagen, Inc. Transgenic mice containing BMP gene disruptions
WO2002007757A2 (en) 2000-07-21 2002-01-31 Lue Tom F Prevention and treatment of sexual arousal disorders
US7223406B2 (en) * 2000-07-21 2007-05-29 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for preventing and treating male erectile dysfunction and female sexual arousal disorder
US6902881B2 (en) 2000-10-13 2005-06-07 President And Fellows Of Harvard College Compounds and methods for regulating cell differentiation
US20030050273A1 (en) * 2001-08-29 2003-03-13 Keiya Ozawa Compositions and methods for treating neurodegenerative diseases
US7615676B2 (en) 2001-11-30 2009-11-10 U.S. Department Of Veterans Affairs Transgenic screen and method for screening modulators of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) production
US7491810B2 (en) 2001-11-30 2009-02-17 U.S. Department Of Veterans Affairs Transgenic screen and method for screening modulators of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) production
US20030124095A1 (en) * 2001-12-31 2003-07-03 Regents Of The University Of California Methods for therapeutic use of brain derived neurotrophic factor in the entorhinal cortex
US20030219696A1 (en) * 2002-05-23 2003-11-27 Moreland Gerald W. Method and apparatus for preventing backflow in dental saliva evacuators
US20050272040A1 (en) * 2002-11-01 2005-12-08 Black Ira B Method for increasing synaptic growth or plasticity
US20050265983A1 (en) * 2002-11-17 2005-12-01 Eldad Melamed Methods, nucleic acid constructs and cells for treating neurodegenerative disorders
US7388079B2 (en) * 2002-11-27 2008-06-17 The Regents Of The University Of California Delivery of pharmaceutical agents via the human insulin receptor
US20050048041A1 (en) * 2003-01-13 2005-03-03 Rao Mahendra S. Persistent expression of candidate molecule in proliferating stem and progenitor cells for delivery of therapeutic products
EP2460529B1 (en) * 2003-09-09 2014-08-20 Two Cells Co., Ltd Therapeutic agent and therapeutic method for pulpal diseases
NZ549990A (en) 2004-04-07 2009-08-28 Rinat Neuroscience Copr Methods for treating bone cancer pain by administering a nerve growth factor antagonist
US8110361B2 (en) * 2005-05-02 2012-02-07 University of Southern California USC Stevens Center for Innovation DNA methylation markers associated with the CpG island methylator phenotype (CIMP) in human colorectal cancer
ES2524996T3 (es) 2005-06-16 2014-12-16 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Células aisladas y poblaciones que comprenden a las mismas para el tratamiento de enfermedades del SNC
US8142781B2 (en) * 2005-10-07 2012-03-27 Armagen Technologies, Inc. Fusion proteins for blood-brain barrier delivery
US8741260B2 (en) * 2005-10-07 2014-06-03 Armagen Technologies, Inc. Fusion proteins for delivery of GDNF to the CNS
US8124095B2 (en) * 2005-10-07 2012-02-28 Armagen Technologies, Inc. Fusion proteins for delivery of erythropoietin to the CNS
WO2007066338A1 (en) * 2005-12-08 2007-06-14 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Isolated oligodendrocyte-like cells and populations comprising same for the treatment of cns diseases
WO2008027648A2 (en) * 2006-06-26 2008-03-06 Case Western Reserve University Methods and compositions for treating pathologies associated with bdnf signaling
JP5959795B2 (ja) * 2006-08-18 2016-08-02 アーメイゲン・テクノロジーズ・インコーポレイテッドＡｒｍａｇｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ． 血液脳関門送達のための物質
US20090011040A1 (en) * 2007-05-02 2009-01-08 Naash Muna I Use of compacted nucleic acid nanoparticles in non-viral treatments of ocular diseases
EP2997976A1 (en) 2007-07-27 2016-03-23 Armagen Technologies, Inc. Methods and compositions for increasing alpha-l-iduronidase activity in the cns
US20090196854A1 (en) * 2008-02-04 2009-08-06 Kytos Biosystems S.A. Methods and compositions for use of crl 5803 cells for expression of biotherapeutics and encapsulated cell-based delivery
US8663987B2 (en) 2008-05-28 2014-03-04 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Mesenchymal stem cells for the treatment of CNS diseases
JP5873003B2 (ja) 2009-03-18 2016-03-01 アーメイゲン・テクノロジーズ・インコーポレイテッドＡｒｍａｇｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ． ＩｇＧデコイ受容体融合タンパク質の血液脳関門送達のための組成物および方法
DK2485761T3 (da) 2009-10-09 2019-05-06 Armagen Inc Fremgangsmåder og sammensætninger til øgning af iduronat-2-sulfatase-aktivitet i CNS
EP2594295A1 (en) 2011-11-16 2013-05-22 Servicio Andaluz De Salud Nerve implants based on a compacted biomaterial containing cells
CA2857647C (en) 2011-12-02 2022-04-19 Armagen Technologies, Inc. Methods and compositions for increasing arylsulfatase a activity in the cns
CN105017406B (zh) * 2014-04-21 2020-10-09 上海市第一人民医院 一类新的具有神经保护功能的多肽
US10538589B2 (en) 2015-01-14 2020-01-21 Armagen Inc. Methods and compositions for increasing N-acetylglucosaminidase (NAGLU) activity in the CNS using a fusion antibody comprising an anti-human insulin receptor antibody and NAGLU
GB2547179A (en) 2015-10-26 2017-08-16 Quethera Ltd Genetic construct
KR102573622B1 (ko) 2016-12-26 2023-08-31 제이씨알 파마 가부시키가이샤 Bdnf를 포함하는 융합 단백질
WO2019042282A1 (zh) * 2017-08-28 2019-03-07 上海易乐生物技术有限公司 多肽及结合多肽的抗体
JP2021530507A (ja) 2018-07-18 2021-11-11 マンザニータ ファーマシューティカルズ，インク． 神経細胞に抗がん剤を送達するためのコンジュゲート、その使用方法及び製造方法
CN116543838B (zh) * 2023-07-05 2023-09-05 苏州凌点生物技术有限公司 一种生物基因选择表达概率的数据分析方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3123963C2 (de) * 1981-06-19 1985-05-15 Berchem & Schaberg Gmbh, 4650 Gelsenkirchen Gesteinsschneidkopf für einen Schneidkopf-Saugbagger
DE3213963A1 (de) * 1982-04-15 1983-10-27 Max Planck Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V., 3400 Göttingen Neurotropher faktor
US4935370A (en) * 1983-12-23 1990-06-19 Pfizer Inc. Expression plasmids for improved production of heterologous protein in bacteria
CA1310602C (en) * 1986-06-03 1992-11-24 Hajime Horii Yeast promoter and process for preparing heterologous protein
GR1000980B (el) * 1989-08-30 1993-03-31 Max Planck Gesellschaft Νευροτροφινη-3,ενας νεος neυροτροφικος παραγοντας που σχετιζεται με τον παραγοντα αναπτυξης νευρων και τον νευροτροφικο παραγοντα που προερχεται απο τον εγκεφαλο.
US5229500A (en) * 1989-08-30 1993-07-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Brain derived neurotrophic factor
US5235043A (en) * 1990-04-06 1993-08-10 Synergen, Inc. Production of biologically active, recombinant members of the ngf/bdnf family of neurotrophic proteins

Also Published As

Publication number Publication date
AU647412B2 (en) 1994-03-24
FI912104A0 (fi) 1991-04-30
AU6337390A (en) 1991-04-08
NO303584B1 (no) 1998-08-03
IE903128A1 (en) 1991-03-13
KR100188189B1 (en) 1999-06-01
LV10725B (en) 1995-12-20
WO1991003568A1 (en) 1991-03-21
US5438121A (en) 1995-08-01
SK422990A3 (en) 1999-02-11
PT95152A (pt) 1991-05-22
SK279668B6 (sk) 1999-02-11
IL95512A0 (en) 1991-06-30
EP0440777A4 (en) 1992-05-13
NO911689L (no) 1991-06-25
NO911689D0 (no) 1991-04-29
ES2098271T3 (es) 1997-05-01
US5229500A (en) 1993-07-20
ATE148921T1 (de) 1997-02-15
EP0440777B1 (en) 1997-02-12
HK1006578A1 (en) 1999-03-05
DE69029934T2 (de) 1997-07-24
EP0440777A1 (en) 1991-08-14
CA2040412C (en) 2003-03-18
LV10725A (lv) 1995-06-20
PT95152B (pt) 1998-06-30
KR920701432A (ko) 1992-08-11
DE69029934D1 (de) 1997-03-27
CN1052142A (zh) 1991-06-12
DK0440777T3 (da) 1997-04-21
CA2040412A1 (en) 1991-03-01
FI105342B (fi) 2000-07-31
SG46954A1 (en) 1998-03-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1124343C (zh) 由脑组织获得的神经营养因子
CN1124342C (zh) 产生神经营养因子－3－ 蛋白质和对其有免疫反应的抗体的方法及其用途
CN1146440C (zh) 血管内皮生长因子-b
CN1243770C (zh) 神经营养生长因子
CN1268744C (zh) 新的神经营养因子
CN1327452A (zh) 具有肝细胞增殖活性的成纤维细胞生长因子
CN1404488A (zh) Nogo受体介导的对轴突生长的阻断
CN1141059A (zh) P53-结合多肽和编码该多肽的多核苷酸
CN1232500A (zh) 轴突素,一种神经基因(neurogene)
CN1061623A (zh) 睫状神经营养性因子受体
CN1318099A (zh) Ly6h基因
CN1620466A (zh) 胱氨酸结折迭蛋白质
CN1390256A (zh) 新型蛋白质及其dna
CN1195853C (zh) 神经营养因子nnt－1
CN1192751A (zh) 单核细胞趋化蛋白－4
CN1359421A (zh) 新型多肽及其dna
CN1073264A (zh) 基于组织的特定的nt-3表达与受体结合的治疗和诊断方法
CN1387568A (zh) 修饰的睫状神经营养因子及其制备方法和使用方法
CN1311818A (zh) 神经营养因子
CN1704426A (zh) 一种癌症基因及其医药用途
CN1074220A (zh) 无细胞睫状神经营养性因子/受体复合物
CN1054099A (zh) 睫状神经营养性因子
CN1798840A (zh) Nogo受体结合蛋白
CN1803837A (zh) 神经营养生长因子
CN1470523A (zh) 一种多肽——锌指蛋白64和编码这种多肽的多核苷酸

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C12 Rejection of a patent application after its publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: NONE

Free format text: FORMER OWNER: JANA DRUGS CO., LTD

Effective date: 20030410

Owner name: JANA DRUGS CO., LTD

Free format text: FORMER OWNER: MAX PLANCK INSTITUTE FOR THE ADVANCEMENT OF SCIENCE ASSOCIATION

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
CI01 Publication of corrected invention patent application

Correction item: Service bar

Correct: delete

False: The rejection of the patent application

Number: 16

Page: 136

Volume: 14

ERR Gazette correction

Free format text: CORRECT: AFFAIR COLUMN; FROM: REJECTION OF AN APPLICATION FOR A PATENT TO: DELETION

TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20030410

Address after: No 777 River Road, old sawmill, New York, USA

Applicant after: Regeneron Pharmaceuticals, Inc.

Address before: The Federal Republic of Germany Madingsilide

Applicant before: Max-Planck-Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften E.V

Co-applicant before: Regeneron Pharmaceuticals, Inc.

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant