CN1074220A - 无细胞睫状神经营养性因子/受体复合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种稳定的生物活性CNTF/受体 复合物及其杂交体或突变体。本发明还部分基于这 样一个发现，即CNTF/受体复合物通过不表达该 CNTF/受体的靶细胞上的信号转导途径来促进分 化。本发明还提供一种促使信号转导而不结合 CNTF的特异性CNTFR突变体。本发明也提供一 种CNTF/受体阻断突变体，该突变体对CNTF的 结合亲和力高，但其不具有信号转导功能。本发明还 证实了该IL-6，CNTF，LIF和OSM信号转导途径 所共用的受体成分，而启动信号转导则基于这类组分 的存在。本发明另外还提供了治疗及诊断应用方法， 这种应用与该CNTF/受体复合物，杂交体或突变 体在适宜靶细胞上引发生理应答的能力有关。

Description

本申请系于1991年12月2日申请、序号为07/801，562的美国专利申请的部分继续申请。

1.前言

本发明提供一种基本纯化的无细胞CNTF/受体复合物，及相关的杂交型或突变型蛋白或肽，这些蛋白或肽在本发明的其它实施方案中，可用来促进或拮抗细胞增殖及/或分化，而且可以用于诊断及/或治疗细胞增殖及/或分化所致疾病的方法中。本发明还保证能使这些复合物与由IL-6、LIF及CNTF信号转导途径共有的受体成分之间能相互作用。

2.发明背景

2.1.睫状神经营养性因子

睫状神经营养性因子（CNTF），如其名所喻，是一种胚鸡睫状神经节神经元在体外存活特需的蛋白[Manthorpe等，J.Neurochem.34：69-75（1980）]。正如Sendtner等于1990年9月14日申请的国际申请PCT/U.S.90/05241中所述.CNTF已在真核细胞表达系及细菌表达系中加以克隆和合成，上述国际申请，全文在此一并资作参考。

近十余年来，除了CNTF支持睫状神经节神经元存活的能力之外，人们还一直将许多生物效应也归因于它。人们认为，CNTF诱发了产期大鼠视神经和脑中双性潜势神经胶质远祖细胞的分化[Hughes等，Nature  335：70-73（1988）]。另外，人们还观察到， 它能促进胚鸡脊神经节感觉神经元的存活[Skaper及Varon，Brain  Res.389：39-46（1986）]。

人们还发现CNTF的一些新效能，其中包括其维持运动神经元和海马神经元的生存和分化，并提高海马星形细胞增殖的能力（国际申请PCT/US  90/05241，同上）。

2.2.睫状神经营养性因子受体

如在此全文一并资作参考的美国专利申请（申请号为07/700，677;名称为“睫状神经营养性因子受体”，由Davis等于1991年5月15日申请）和国际申请（PCT/US  91/03896，1991年6月3日递交）中所述，CNTF受体（CNTFR或CNTFRα）已于真核细胞中克隆、表达过。

CNTFR的序列揭示，与大多数包含胞外结构域、疏水性横跨膜结构域及胞质结构域的受体不一样，CNTFR似乎并不具有胞质结构域。此外，横跨膜疏水结构域还经蛋白水解处理，使成熟态CNFR通过非常规键固着在细胞表面上，该非常规键称为糖磷脂酰肌醇（GPI）键（Id.）。连有GPI的蛋白，例如CNTFR可由于GPI固着被酶，即对磷脂酰肌醇特异的磷脂酶C切断而从细胞表面释出。在已知的受体序列中，CNTFR涉及许多受体，在此谓之CNTF/IL-6/LIF受体族，其中包括IL-6、LIF、G-CSF及制瘤素M（OSM）[Bazan，Neuron  7：197-208（1991）;Rose及Bruse，Proc.Natl.Acad.Sci.88：8641-8645，（1991）]，但似乎与IL-6受体序列最为密切相关。然而，IL-6从来未显示出是连有GPI的蛋白[例如，Taga等，Cell  58：573-581（1989）;Hibi等，Cell  63：1149-1157（1989）]。

LIF、G-CSF及OSM都是一些有广泛效能的因子，尽管它们有着独特的一些生长调节活性，但它们在造血过程及其它过程中，必竟都同IL-6一起起着一些共同的作用。例如，它们都能抑制增殖并诱发鼠骨髓白血病细胞系M1的分化[Rose及Bruce，Proc.Natl.Acad.Sci.88：8641-8645，（1991）]。使用相关的受体体系，可为这些造血细胞素的相似生物学作用提供基础-G-CSF、IL-6、OSM及LIF都具有结构上与gp130同系的受体成分[Fukunaga等，EMBO  J.10：2855-2865（1991）;Gearing等，EMBO  J.10：2839-2848（1991）;Gearing等，Science255：1434（1992）]。此外，近来的研究工作表明，LIF能诱发类似IL-6的酪氨酸磷酸化作用及基因激活作用[Lord等，Mol.Cell.Biol.11：4371-4379（1991）]。

在中枢神经***、坐骨神经、肾上腺组织中，以及在肌肉中，人们都已观察到CNTFR  mRNA表达。这表明，CNTFR不仅具有神经营养性活性，而且还具有包括肌营养性活性在内的其它活性，这就可以解释某些临床综合征中既牵涉中枢神经***又牵涉肌肉的复杂情况。

可以有理由推断，CNTF的活性谱主要限于表达CNTFR的细胞。由于已证明CNTF能产生促进存活的效果和细胞分化的效果，如果这样的活性可扩大到不表达CNTF受体的靶细胞，则是有益的。

鉴别出与CNTF共有受体成分的造血因子，就有可能利用CNTF及其激活通常应答这类造血因子的靶细胞特异受体成分。

3.发明简述

本发明涉及一种无细胞CNTF/受体复合物。它部分地以下述发现为基础：即无细胞CNTF/受体复合物对较表达CNTF受体的细胞类型更广的细胞类型谱具有生物活性。在本发明的一个具体实 施方案中，所述CNTF/受体在表达属于CNTF/IL-6/LIF受体族的受体的细胞类型中，起着分化因子的作用。

本发明还以CNTF和无细胞CNTFR在正常生理缓冲条件下形成稳定的生物活性CNTF/受体复合物的能力为基础。在本发明的一个具体的非限定性实施方案中，将等摩尔量（即80mM）的CNTF和CNTFR重组体在正常生理缓冲条件下（100mM  Tris-Hcl，50mM  NaCl，pH8.0）混合，形成稳定的生物活性CNTF/受体复合物。这种CNTF/受体复合物可用凝胶过滤法提纯，并用于下文所述的测定中。

本发明还提供杂交或突变型的、与CNTF/受体复合物相关的、起细胞分化因子激动剂或拮抗剂作用的蛋白。例如，在一个具体实施方案中，杂交型或突变型CNTFR也许不能结合CNTF，但能转导信号。这种杂交体或突变体，可用来促进或增强能应答CNTF/受体复合物的细胞分化、增殖、生长或存活，所述细胞包括那些不受CNTF含量制约地表达CNTF/IL-6/LIF受体族中成员受体的细胞在内。在另一个非限定性的实施方案中，一种突变型受体可显示出对CNTF结合的亲合力有所提高，但不能有效地诱发信号转导。这样的突变体在结合到CNTF上并中和CNTF，而不引起对细胞分化的副作用方面，是有用的。

本发明还提供体外或活体内的诊断方法，以及用于检测靶细胞对使用CNTF/受体的特殊疗法的敏感性测定方法。

本发明还提供了一种治疗方法，该方法不仅治疗与CNTF相关的疾病，而且还治疗与任何应答无细胞CNTF受体复合物或相关化合物的靶细胞相关的分化和/或增殖所致的疾病。

本发明还提供一种产生基本纯化的生物活性CNTFR或细菌中相 关分子的方法。

本发明还以这样一个发现为基础，即CNTF和LIF通过IL-6转导受体成分gp130及象gp130那样的第二受体成分（称为LIFβ），在这二种受体一起结合到CNTF和CNTFR上时，用与IL-6相比的信号途径一起启动信号转导而作用于神经细胞。基于此发现，本发明为利用CNTF和CNTFR在通常应答LIF或IL-6的细胞中诱发应答（估计因为LIF或IL-6表达gp130和LIFRβ之故）提供了保证。

本发明还提供以CNTFR（CNTFRα）结合靶细胞使CNTF可在此类细胞中用来有选择地启动信号转导的方法。

本发明还提供以CNTF取代LIF来防止被培养胚干细胞分化的用途。

4.附图说明

图1.人CNTF的核酸序列（SEQ  ID  NO：1）及推导的氨基酸序列（SEQ  ID  NO：2）。

图2.编码CNTFR的CDNA核酸序列（SEQ  ID  NO：3）及推导的氨基酸序列（SEQ  ID  NO：4）。

图3.pRPN  151结构中所用PCR引物的DNA序列。小写字母表示一些位置，在这些位置上为使表达最优化，改变了DNA的序列，而使蛋白序列不改变。意义：（SDQ  ID  NO：5），反义：（SEQ  ID  NO：6）。

图4.pRPN  151的物理限制图谱。其中示出以碱基对（bp）为单位计的质粒长度。一些独特限制位点的位置，以及huCNTRF1的物理位置（散点带所示）和β-lactamase（实黑带所示）基因。

图5.通过凝胶过滤分离活性受体。（A）S100-HR柱的洗脱图，用280nm处的吸光度测得。核酸对主峰吸光度的影响约为50%，而对较小的峰只有低于10%的影响。（B）在馏份9-14（每段20μl）和16-21（每段200μl）中的蛋白洗脱物用SDS-PAGE分析。总的施于柱（E段）上的蛋白提取物与尺寸标记14、21、31、45、66及90KD（M段）也一起示出。R-表示在40KD处的受体带的位置。

图6.用天然PAGA形成受体配位复合物。恒定量的（1μg）受体与给定量（以μg计）鼠CMTF混合，然后用天然PAGE分析。与CNTFR、CNTF及CNTF/受体复合物相应的带的位置均被标出。

图7.用CNTF、LIF及FGF治疗后的MAH细胞生长。A.将MAH细胞以250K/35mm皿的密度置于皿中，用CNTF（10ng/ml）或LIF（1ng/ml）在培养物中处理4天。在培养期结束时，点算明相细胞的数目。B.将MAH细胞以6K/6mm凹孔的密度置于平板上，用CNTF（10ng/ml），或LIF（1ng/ml）处理1-4天，然后用MTT染料测定活细胞数目。C.将不同浓度的CNTF、LIF及FGF加于MAH细胞。在³H一胸苷渗入测定前，对于CNTF和LIF，培养期持续4天，对于FGF则是3天。对于CNTF和LIF，涂抹密度为6K/6mm凹孔，对于FGF则为40K/16mm凹孔。

图8.CNTF对神经元分化的影响。A.用CNTF（10ng/ml）、LIF（1ng/ml）或FGF（10ng/ml）处理MAH细胞48小时，接着测量CAT活性。B.用CNTF（10ng/ml）将MAH细胞处理24小时。制备总RNA，并用CNTFR探针及GAPDH探针对其进行Northern分析。CNTFR和GAPDH的转录尺寸为2kb。

图9.应答CNTF、LIF及FGF时蛋白的剂量依赖性酪氨酸磷酸 化。在用各种浓度（0.1-100ng/ml）的CNTF、LIF或FGF处理5分钟后，用MAH细胞（A）或EW-1细胞（B）制备细胞溶解总产物。按实验步骤中所述，用抗磷酸酪氨酸抗体使溶解产物免疫沉淀，电泳，并用抗磷酸酪氨酸抗体将之免疫印迹（C），在按上述程序进行抗磷酸酪氨酸免疫沉淀和印迹之前，用50ng/ml  CNTF处理SK-N-LO细胞5或15分钟。

图10.用FGF或NGF处理过的细胞与用CNTF或LIF处理过细胞相比较的独特蛋白酪氨酸磷酸化图型。A.用50ng/ml  CNTF、LIF或FGF将EW-1细胞处理5分钟。用抗磷酸酪氨酸抗体免疫印迹总溶胞产物。B.在用50ng/mlCNTF、LIF或FGF处理后，用EW-1细胞制备总溶胞产物，用抗磷酸酪氨酸抗体将之免疫沉淀。作为对照，用ERK特异性抗体将ERK1和ERK2，从PC12溶胞产物中沉淀出来。用ERK抗体进行免疫印迹。C.由经CNTF（50ng/ml）或LIF（50ng/ml）处理过的EW-1细胞及用NGF（50ng/ml）处理过的PC12细胞制取总溶胞产物。使溶胞产物电泳，并用抗磷酸酪氨酸抗体进行免疫印迹。

图11.蛋白酪氨酸磷酸化变化对MAH细胞中应答CNTF和LIF时tis11诱发的时间过程比较。A.用50ng/ml  CNTF或LIF将MAH细胞处理5-60分钟。如图3所示，用抗磷酸酪氨酸抗体使总溶胞产物免疫沉淀并免疫印迹。B.用CNTF或LIF对MAH细胞以类似方法处理15-120分钟。按实验步骤中所述制取总RNA，用甲醛琼脂糖凝胶电泳分级，再杂交成tis11及c-fos  DNA探针。C.用CNTF（50ng/ml）或LIF（50ng/ml）或FGF，将MAH或EW-1细胞处理30分钟。制取总RNA并按上述方法分析tis11和c-fos表达。 tis11和c-fos的转录尺寸分别为2.3及2kb。

图12.应答EW-1及M1细胞中CNTF、LIF或IL-6时酪氨酸磷酸化变化的比较。用CNTF（50ng/ml）、LIF（50ng/ml）或mIL-6（100ng/ml）处理EW-1或M1细胞5分钟。如上文所述，用抗磷酸酪氨酸抗体使总溶胞产物免疫沉淀和免疫印迹。

图13.蛋白激酶抑制剂对CNTF及LIF诱发的蛋白酪氨酸磷酸化及tis11基因表达的影响。在添加CNTF（50ng/ml）、LIF（50ng/ml）或mIL-6（100ng/ml）之前，用蛋白激酶抑制剂H-7（40μg/ml），或星状孢子素（Staurosporine）（100ng/ml），将MAH（A）或EW-1（B）细胞处理15分钟。如上文所述，用抗磷酸酪氨酸抗体使总溶胞产物免疫沉淀和免疫印迹。为检验蛋白激酶抑制剂对tis11诱发的影响，在添加CNTF（50ng/ml）、LIF（50ng/ml）或mIL-6（100ng/ml）之前，用蛋白激酶抑制剂H-7（40μg/ml）处理MAH（C）或M1（D）细胞30分钟。制备总RNA并用tis11探针对之进行Northevn分析。

图14.CLIP_S由CNTF和LIF（A）共同调节，并在细胞表面（B）上，而CLIP_S之一（CLIP₂）为gp 130。A.用CNTF和LIF共调节CLIP1和CLIP2。如已指出的那样，用CNTF（50ng/ml）或LIF（50ng/ml）处理EW-1细胞5或60分钟，于此60分钟时间点之后，再以5分钟向细胞中另外添加CNTF（3和7段）或LIF（4和6段）。然后，用抗磷酸酪氨酸抗体使总溶胞产物免疫沉淀和免疫印迹。B.生物素化（Biotinylation）分析表明，CLIP1和CLIP2在细胞表面上。EW-1细胞如本文所述，已经表面生物素化（biotinylated）。该图示出，对照细胞（C）或CNTF刺激过的、在 抗生蛋白链菌素琼脂糖上被分成未结合的（UB）或结合的（B）馏分之前，接着被生物素化或未生物素化的细胞（CNTF）的抗磷酸酪氨酸免疫印迹。C.CLIP2是gp130。该图示出，由对照细胞（C）或CNTF/LIF刺激过，经用抗磷酸酪氨酸抗体（α  pTyr）或用gp130特异性抗体（αgp130）免疫沉淀过的EW-1细胞所得溶胞产物的抗磷酸酪氨酸免疫印迹。如上所述，各免疫沉淀抗体，或单个地或以顺次的方式使用。

图15.gp  130mRNA的随机分布与CNTFRα  mRNA限制神经元分布的比较。从所指出的细胞系中制取总RNA，再用人gp130  cDNA探针（上图）或鼠CNTFR  cDNA探针（下图）对之进行Northern分析;对啮齿动物细胞系用gp130探针查得的较弱杂交，是由于交叉种之间杂交不良之故。SH-SY5Y为成神经细胞瘤;EW-1为Ewing氏肉瘤;SK-N-LO为神经上皮瘤;MAH为交感肾上腺原始粒子;M1为骨髓原始粒子;B9为不应答CNTF的IL-6依赖性β细胞杂交瘤。

图16.gp130mRNA在组织中的随机分布。总RNA及Northern分析按图15所示进行。

图17.阻断gp130的抗体防止了CNTF/LIF诱发的酪氨酸磷酸化及基因诱导。检验了抗体阻断CNTF和LIF在EW-1细胞中诱导酪氨酸磷酪化的能力。CLIP1和CLIP2（图A）的酪氨酸磷酸化以及CNTF或LIF（图B）所诱导的tis11基因表达均完全被反gp130所阻断。

图18.LIF和CNTF对ES细胞的作用。ES细胞在设有饲养细胞，但有未分化的致密小细胞集落状态保留下来的LIF（10-20ng/ml）存在下，加以保持。较低浓度的LIF（小于10ng/ml），导 致ES细胞在2-7天的时间内分化，这可由内胚层状细胞及扁平大细胞的存在并有一些细胞死亡发生，而被证实（图18A）。ES细胞在有5pg/ml-10ng/mlCNTF的明胶平皿上生长，导致分化和一些细胞死亡。浓度大于10ng/ml直至50ng/ml的CNTF，使ES细胞保持为小的致密细胞集落（图18B）。在既无LIF又无CNTF的条件下保存的ES细胞，在2-7天的时间内呈内胚层状或大而扁平状（图18C）。

图19.CNTFR在ES细胞中的表达。对来源于ES细胞和鼠脑的RNA进行Northern分析，表明了CNTFR的表达。

图20.ES细胞中CNTF和LIF对tis11的诱导。将ES细胞涂在平皿中，并在有CNTF（20ng/ml）或LIF（20ng/ml）存在下，以不分化的状态加以保存。制取总细胞RNA，使之在甲醛琼脂糖凝胶上电泳，移到尼龙膜上，然后杂交成以³²P标记的tis11探针。在ES细胞中，CNTF和LIF的在tis11基因表达中产生类似的诱导。

图21.G-CSF、IL-6、CNTF及LIF受体复合物的示意模型。A.描绘指定细胞素受体复合物已知成分的模型。B.假设CLIP1是LIFRβ时，CNTF和LIF受体复合物的修正“统一”模型。在B部分所示的模型中，CNTFRα全都是将起作用的LIF受体复合物转变成起作用的CNTF受体复合物所需的。因子以方块表示;已知α亚单位因IL-6及CNTF受体复合物而存在，并因而用实线绘出（邻近CNTFRα/膜结点的星号表示GPI键），潜在的LIFRα成分则用虚线标出。尽管被描述成与膜结合，但α亚单位还可起着可溶性辅助因子的作用。

5.本发明的详细说明

本发明涉及无细胞CNTF/受体复合物及相关化合物，以及其在促进可表达或不表达CNTFR的细胞的存活、分化、增殖和/或生长中的用途。为了公开得清楚而又不作为限定，本发明将分成下列小节加以详述：

（ⅰ）CNTF/受体复合物;

（ⅱ）CNTF/受体复合物的特征;及

（ⅲ）CNTF/受体复合物的用途。

本发明基于一些进一步的发现：即CNTF和LIF经共有的、包括IL-6信号转导受体成分gp130的信号途径而作用于神经元细胞，以及CNTF和LIF要求一种第二CLIPI/LIFRβ成分来启动信号转导。因此，本发明的详述再分成以下小节进行：

（ⅳ）CNTF，IL-6和LIF的共有信号转导成分;

（ⅴ）共有的独特信号转导成分的用途。

5.1.CNTF/受体复合物

本发明涉及稳定生物活性无细胞CNTF/受体复合物的形成。它部分基于有效量CNTF和CNTFR的产生和提纯，以及在正常的生理条件下，它们形成稳定生物活性复合物的能力。

比如，可先通过克隆再接着通过对每种相关的蛋白进行基因编码测序，来制备有效量的CNTF和CNTFR。然后可使每个经克隆的基因在原核或真核表达体系中表达。本技术领域中普通技术人员可获得的多种方法中的任何一种方法，都可被用来将CNTF和CNTFR克隆并测序。比如（但不限于）可将CNTF在某一细菌表达体系中表达之前加以克隆和测序，这正如美国专利申请No.07/570，651（题为“睫状神经 营养性因子”，Sendtner等于1990年8月20日申请）及国际申请No.PCT/US90/05241中所述，此两文献全文在一并资料作参考。另外，举例而不限定地说，CNTFR可如美国专利申请No.07/700，677（题为“睫状神经营养性因子”，Davis等于1991年5月15日申请）及国际申请No.PCT/US91/03896（Davis等于1991年6月3日申请）中所述，以克隆和定序。在较佳实施方案中，可用具有基本如图1中所示序列的CNTF和具有基本如图2中所示序列的CNTFR。

可用多种方法中的任何一种方法表达和提纯重组CNTFR基因。在本发明的一个较佳但非限制性的实施方案中，CNTFR可按如下所述，用表达重组CNTFR的细菌细胞来制取。编码基因的人CNTFR可亚克隆成细菌表达载体，比如（但不限于）pCP110。所得到的质粒pRPN151编码一种重组的成熟态人CNTFR（huCNTFR），该成熟态人CNTFR（huCNTFR）由具有成熟huCNTFR编码区和在NH₂端另有三个氨基酸，met ser Thr的327个氨基酸构成。如第6节实施例中所述，在编码区开始处的附加操作进一步优化了huCNTFR表达，而不改变蛋白序列。这种重组质粒然后可转化成适宜的细菌菌株，如E.coli菌株RFJ26，并在本技术领域中已知的培养条件下生长，以诱发重组蛋白的合成，从而获得有效量的重组huCNTFR。

任何可随后形成稳定生物活性CNTF/受体复合物的工艺，都可用来提纯该重组huCNTFR。例如（但不限于），可从RFJ26/pRPN151细胞中作为包含体回收huCNTFR，接着按下文第7节，在8M氯化鈲中定量萃取并渗析。为了进一步提纯CNTFR，采用诸如常规的离子交换色谱法，疏水相互作用色谱法，或反相色谱法等方法，也许不符合 需要，因为活性CNTFR可能难于按这些方法加以分离。反之，本发明提供了一种进一步提纯CNTFR的方法，其中包括凝胶过滤法。根据本发明，除CNTFR之外，以低含量（即＜2%）表达的蛋白也可用此法提纯。

CNTF/受体复合物可在CNTF和CNTFR提纯之后形成。能产生稳定CNTF/受体复合物的任何比例的CNTF和CNTFR都可采用，这包括（但不限于）1∶1，2∶1，3∶1等。比如（但不限于），等摩尔量（即80nM）的重组CNTF和重组CNTFR可在生理缓冲溶液（即100mM  Tris  HCl，50mM  NaCl，PH8.0）中，于室温下加以混合。然后可将此混合物涂于凝胶过滤柱上，接着可回收与CNTF/受体复合物相应的峰，以便用与下文所述的多种测定。

本发明提供一种其中CNTF和CNTFR被共价或优选的非共价键合的复合物。

本发明还涉及任何可用来促进，或任选地拮抗细胞分化的复合物或分子。在本发明各具体实施方案中，提供这样一种作用的CNTF/受体复合物，它可为杂交或嵌合的核酸序列所编码，这种杂交或嵌合的核酸序列，可用本技术领域中已知的任何多种重组DNA方法构成，从而使CNTF和CNTFR的序列编码机能部分都被转译连接;亚克隆成原核或真核的表达质粒，以使该杂交或嵌合的核酸序列为多种启动子成分中的任何一种与原核或真核宿主***及表达质粒中杂交基因的取向相容的启动子成分所控制。在本发明的一个较佳实施方案中，CNTF和CNTFR中起编码核酸序列作用的部分，以相同的取向并在控制相同调节序列的条件下被亚克隆，形成“dicistronic”结构。横跨CNTF及CNTFR基因结合点的核酸区，或者会具有促进转译前起 始转录拼接的序列，或者作为选择，该区将编码本技术领域中已知的肽序列，以促进宿主细胞中具活性的蛋白酶所进行的后转译蛋白水解处理。这种杂交或嵌合分子的结构，促进了等摩尔量CNTF/受体复合物的两种起作用成分的表达，并使CNTF/受体复合物可以直接在原核抑或真核宿主细胞中提纯。本发明还涉及编码突变型CNTFR的核酸序列。给定的CNTFR基因可在体外或体内突变，在编码区内形成位点特异性变化，添加或删除。任何为本技术领域所知的诱变技术都可使用，这包括（但不限于）体外位点定向诱变[Hutchinson等，J.Biol.Chem.253：6651（1978）]、使用TAB衔接物（Pharmacia）等。在本发明的各非限定性实施方案中，如上述制备的杂交或突变型分子或复合物，可具有一些不同于天然CNTF/受体复合物的特征。比如，这样的杂交或突变体可以有能力促进在没有CNTF存在下的信号转导（即不形成CNTF/受体复合物）。

作为另一实施例，杂交体或突变体可以有能力结合CNTF而不导致信号转导。那么，可以下文中所述的任何一种测定方法来测定这些CNTFR阻断突变体或杂交体在CNTF存在下起信号转导拮抗剂作用的能力。在一些较佳实施方案中，这类CNTFR阻断突变体或杂交体可以与高于天然CNTFR对CNTF亲合力的亲合力结合CNTF。在本发明的另一实施方案中，可产生一种结合在CNTFR上的CNTF突变体，以使所得到的复合物无能力进行信号转导。

5.2.CNTF/受体复合物的特征

本发明涉及一种稳定的CNTF/受体复合物，在第5.1节和第6节实施例中所述的本发明具体实施方案中，在室温下向生理缓冲液中添加等摩尔量的CNTF和CNTFR，以此形成生物活性的CNTF/受体 复合物。该具体实施方案中的CNTF/受体复合物在天然聚丙烯酰胺凝胶中，具有不同于CNTF或CNTFR纯化馏份中任一馏份的移动性。

该CNTF/受体复合物还可根据其生物活性来表征，在CNTF应答细胞中，CNTF/受体复合物的活性与CNTF的活性相当。

CNTF促进细胞分化以及初级神经元的存活。表达CNTFR的CNTF的靶细胞包括（但不限于）睫状神经节细胞，脊神经节细胞，海马细胞及运动神经元细胞。

CNTF在这些靶细胞中的生物应答，通过CNTF/受体复合物共有信号转导途经而产生（例如，参见下文第9节）。比如，CNTF在MAH细胞系的生长停滞和分化之间进行调节。MAH细胞系暴露于CNTF，就快速诱发三种性质不同CLIP蛋白的酪氨酸磷酸化型式。此外，这些CLIP基因的磷酸化，立即领先于诱发有特征的前早基因，tis11。这些早期应答CNTF的磷酸化现象，是这种信号转导途径存在的标志。

然而，在本发明的另一实施方案中，CNTF/受体复合物对不表达CNTF受体的靶细胞传递如上文中所述的类似的作用（如见下文第8节），条件是，这种细胞表达一种第二成分，本文中称之为“信号转导成分”，也即与受体分子相互作用而诱发信号转导的一种第二成分，如与IL6受体体系联合的gp130或白血病抑制因子（LIF）受体的β链。表达这些信号转导成分的细胞，在此被认为是应答CNTF/受体复合物的。CNTF/受体复合物的靶细胞可以是在应答CNTF/受体复合物处理时，任何有助于通过体外信号转导测定进行鉴定的细胞（例如，如上文所讨论的，诸如表明表型分化，前早基因表达或CLIP蛋白磷酸化的靶细胞），或者这些细胞能模拟或改变CNTF/受体复 合物正常生理作用的杂交体或突变体。

CNTF/受体复合物，或相关的杂交或突变型化合物对靶细胞的影响，可用多种表征特定细胞类型的表型和/或生物化学应答的任何一种来测定。如果靶细胞应答CNTF，则该复合物的活性可作为CNTF相关生物作用，如睫状神经节神经元，脊神经节神经元或运动神经的存活等的函数来测量。

如果靶细胞不应答CNTF，但应答CNTF/受体复合物，则可测量它们，以知道分化的其它标志。比如（但不限于），可将M1细胞系用于检测CNTF/受体复合物或其杂交或突变型蛋白以类似于IL-6或LIF受体途径的方式促进分化的能力。未分化的M1细胞是园的，而且是明相的，又不附着于基质。由于分化，当被CNTF/IL-6/LIF受体族促进时，M1细胞分化得更多，而且附于基质。因此，容易对M1培养物计数这种分化表型。

如上文中对MAH细胞所述的那样，细胞的特异性标志，如CLIP蛋白图型的变化或者磷酸化及前早基因激活等其它图型变化（如，tis11;见下文第9节）也都可利用。

CNTF/受体复合物促进M1细胞（如属于IL-6/LIF受体族的）中的表型分化的能力表明，任何应答这种复合物的其它靶细胞，都是此CNTF/受体的靶细胞。除象M1细胞系这样的髓样白血病细胞外，CNTF/受体或其杂交体或突变体的潜在靶细胞，包括白血病细胞、造血干细胞、巨核细胞及其先祖细胞、DA1细胞、破骨细胞、成骨细胞、肝细胞、脂肪细胞、肾上表皮细胞、胚干细胞、肾小球系膜细胞、T细胞、B细胞等。

CNTF/受体复合物的靶细胞，可以是任何有助于通过体外信号转 导测定加以鉴定的细胞（例如，如上文中所讨论，诸如表明表型分化、前早基因表达或CLIP蛋白磷酸化的靶细胞），这种靶细胞对CNTF/受体复合物或其杂交体或突变体的处理有反应，而所述的杂交体或突变体，或者模拟或者改变该CNTF/受体复合物的正常生理作用。

5.2.1.直接¹²⁵I-hCNTF结合测定

如上文所讨论，本发明的另一实施方案，涉及对CNTF的结合能力有所改变的CNTFR突变体的分离。在本发明的一个较佳实施方案中，pCMX-hCNTFR（12）（所给的登记号为NRRL B-18789）诱变后，接着进行如美国专利申请NO.07/700，677（标题：“睫状神经营养性因子”，Davis等于1991年5月15日申请）中所述的直接¹²⁵I-hCNTF结合测定。简而言之，用乳过氧化物酶6ng/μl（Sigma），在20℃下可使10μghCNTF（以560μg/ml的浓度溶于10mM Na₃PO₄，PH7.4）1mCi¹²⁵INa碘化15分钟。15分钟后，可用含0.1M NaI、0.1%BSA和0.1%细胞色素C、0.3%HOAc、0.05%苯酚磺酞及0.02%NaN₃的等体积缓冲液，使该反应骤停。可取等分试样以确定TCA的可沉淀的读数。可将残留物加到用0.05MNa₃PO₄、0.1M NaCl、0.5mg/ml鱼精蛋白硫酸盐及1mg/ml BSA平衡的Bio Rad PD-10 Biogel柱上。各馏份可予收集并测定TCA沉淀数。接着，可用已诱变的质粒DNA使COS细胞转染。48小时后，可除去该介质，再用0.25ml的只含¹²⁵I-hCNTF的结合缓冲液（RPM1 1640与10%FBS及0.1%NaN₃），或用未标记的hCNTF替代之。在室温下以¹²⁵I-hCNTF进行培育，可历时60分钟。培育完毕后，除去¹²⁵I-hCNTF溶液，用1.0ml结合缓冲液将细胞洗涤3次，然后用0.25ml的0.1N NaOH溶解。这 种溶解产物可移往12×75mm的聚苯乙烯管，再置于γ计数器中。通过添加至少100倍的过量的未标记hCNTF，可确定非特异性结合。最后一次洗涤后，可对这些平皿作自体放射照像测定。

可选择显示高CNTF结合的，或低CNTF结合的，或根本没有CNTF结合的CNTFR突变型，供进一步分析用。从被转染的所涉及细胞系得到的上清液，可被用于任意数次的分化测定中，以确定每种突变体促进信号转导的能力。

5.2.2.信号转导测定

如上文中所讨论，M1细胞测定方法对测量CNTF/IL-6/LIF受体族各成员的信号转导能力是有用的。

这种测定方法对于实施本发明中另一些实施方案也是有用的，即对鉴定转导信号但不结合CNTF的突变型CNTF受体，及结合CNTF但不诱发信号转导的突变型CNTF受体是有用的。比如，如果一种CNTFR突变体在¹²⁵I-hCNTF直接结合测定中只给出弱的，或不存在的信号，那么就在M1测定中对这种突变型受体进行促进表型分化能力的计数。相反，显出较高结合的CNTFR突变体也可在该M1方法中测定。突变型CNTF受体可与不同量的未标记CNTF混合，并在M1测定中作抑制表型分化（如，突变型CNTFR对信号转导途径起拮抗剂作用）能力的计数。

在本发明的另一实施方案中，CNTF/IL-6/LIF族的不同靶细胞，可用如对M1细胞所述的相同类型的测定方法来鉴定。

作为选择，可按下文第9节中所述，用证实有信号转导如CLIP蛋白磷酸化或前早基因诱导的测定方法来鉴定靶细胞。比如，可将公认的靶细胞培养物暴露于有效浓度的CNTF/受体复合物，然后评价 CLIP蛋白的磷酸化，tis11前早基因表达的传导等，其中这类信号转导证据表明，这种细胞确实是CNTF/受体复合物的靶。

5.3.CNTF/受体复合物的用途

按照本发明，CNTF/受体复合物，或其杂交体或突变体可被用于促进一些细胞的分化、增殖或体外或体内存活，所述细胞是对CNTF/受体复合物有反应的细胞，这包括表达CNTF/IL-6/LIF受体族中的受体的细胞，或任何为上文第5.2节所述的特征（如，CLIP蛋白磷酸化和/或前早基因诱发）所证明，表达适宜信号转导成分的细胞。突变体或杂交体可任选地用来拮抗细胞分化或存活。

5.3.1.体外应用

本发明可被用于鉴定CNTF/受体复合物的潜在医疗和诊断用途的新靶细胞。比如（但不限于），确定形态学变化（如，细胞从园细胞到扁平细胞的进展，细胞病变的漫延及从自由漂浮细胞到附着细胞的转变），或生物化学标志（如细胞特异性标志的表达，细胞基因、如前早基因tis11的激活，或者磷酸化型式，如CLIP蛋白磷酸化型式的变化），或细胞生长或增殖，都可用来鉴定这类新的靶细胞。

反之，应答CNTF/受体复合物的细胞，可用来鉴别与CNTF/受体复合物相关的杂交或突变化合物。比如，这类细胞可被暴露于不同浓度的CNTF/受体复合物相关杂交或突变化合物，然后可确定生理效应，如细胞增殖、细胞形态学、CLIP蛋白的磷酸化、前早基因诱变等的有无及大小。如果该杂交体或突变体起着CNTF/受体复合物活性的激动剂作用，那么生理变化应与CNTF/受体复合物所产生的变化相似。作为选择，如果杂交体或突变体起着CNTF/受体复合物活性的拮抗剂的作用，那么与CNTF/受体复合物有关的生理变化就 应减弱或消除。

任何通过形态的或生物生学型式变化而被鉴定为应答CNTF/受体复合物细胞的靶细胞，都是用于诊断性测定的候选细胞。这些诊断性测定，包括检查病人活体细胞，对特定治疗方案的敏感度，所述方案包括使用CNTF/受体复合物或其能促进或拮抗该受体族中的信号转导的杂交体或突变体。

本发明可用来诊断可能与CNTF或CNTFR表达型式变化相关，并因而与CNTF/受体复合物的形成相关的神经***的疾病和障碍。比如，取自病人的细胞对CNTF/受体复合物有异常应答，可支持对病人神经障碍的诊断。

这样的细胞活组织检查，可用来检测、预测、诊断或监测与CNTF表达改变有关的状况、障碍或病状，尤其包括导致已知对CNTF有反应的神经元损伤及退化的各种状况，所说的神经元例如为副交感神经元、胆碱能神经元、脊髓神经元、或神经细胞瘤细胞及肾上腺髓质细胞。这些疾病和状况包括（但不限于）中枢神经***创伤、梗塞、感染、退化性神经病、恶性肿瘤或手术后变化，其中包括（但不限于）早老性痴呆、帕金森病、享延顿舞蹈病及肌萎缩性侧索硬化。

在另一实施方案中，本发明使任何经上文所述生物测定方法鉴定的靶细胞得以实用。任何这样的靶细胞都是用于检测、预测、诊断或监测分化障碍或疾病状况的体外测定方法的候选细胞，所述状况包括（但不限于）恶性或赘生性状况，而特别是与下述细胞有关的疾病或障碍：白血病细胞、造血干细胞、巨核细胞及其直系先祖细胞、DA1细胞、破骨细胞、成骨细胞、肝细胞、脂肪细胞、肾上皮细胞、胚干细胞、肾小球系膜细胞、T细胞、B细胞等。

5.3.2.体内应用

本发明可被用来治疗任何应答CNTF/受体复合物的细胞的障碍，这些细胞包括应答CNTF的细胞以及对其不应答的细胞。在本发明的较佳实施方案中，按这些方法可治疗表达CNTF/IL-6/LIF族中成员的细胞的障碍。这些障碍的例子包括（但不限于）涉及下列细胞的障碍：白血病细胞、造血干细胞、巨核细胞及其直系先祖细胞、DA1细胞、破骨细胞、成骨细胞、肝细胞、脂肪细胞、肾上皮细胞、胚干细胞、肾小球系膜细胞、T细胞、B细胞等。

因而，本发明提供一些方法，其中患有与CNTF有关的神经病学或分化方面的障碍或疾病的病人被给用有效量的CNTF/受体复合物，或其杂交体或突变体进行治疗。该CNTF/受体复合物或其适宜的杂交体或突变体可被用于治疗如国际申请PCT/US90/05241（Sendtner等申请）中就CNTF所述的，以及美国专利申请NO.07/700，677（标题“睫状神经受体”，Davis等于1991年5月15日申请）就CNTFR所述的障碍或疾病。包括给用CNTF/受体复合物、诱导信号转导而不结合CNTF的CNTFR突变体或CNTF/受体复合物拮抗剂（如有高度CNTF结合亲合力的，不诱发信号转导的CNTFR突变体）的治疗方法，均在本发明的范围之中。

本发明还提供在适宜药用载体中含有CNTF/受体复合物、其杂交体或突变体的药用组合物。

可***地或局部给用CNTF/受体复合物、其杂交体或突变体。任何在本技术领域中已知的用药方式均可采用，这包括（但不限于）静脉内、椎管内、动脉内、鼻内、经口、皮下、腹膜内给药，或局部封闭注射或外科埋入给药。还提供缓释剂型。

5.3.2.1活性成分的制剂

可含有稳定CNTF/受体复合物或其杂种体或突变体的活性成分，应在用于体内给药的适宜的药用载体中配剂，给药可通过任何合适的方式进行，所述的方式包括（但不限于）注射（例如，静脉内，腹膜内、肌内、皮下、神经内、神经周、脊髓内、心室内、椎管内等）;可通过经上皮层或粘膜层（例如，口腔粘膜、直肠粘膜及肠粘膜）的吸收进行;或通过包括细胞植入剂或组织植入剂在内的缓释植入剂进行。

取决于给药方式，该活性成分可在液态载体，如盐水中制成剂型，可渗入脂质体、微囊体、聚合物或蜡基物中，其释放性能可被控制，或配制成片剂、丸剂或胶囊剂。

配制时用的活性成分浓度将取决于所需的有效剂量及所用的给药方式。所用的剂量应是足以达到活性成分有效的循环血浆浓度。比如，当CNTF/受体复合物是活性成分时，可用范围在约50微微摩尔-100毫微摩尔的循环血清浓度。有效剂量可从由体外或动物模型试验方法得到的剂量应答曲线外推求出。

在另一实施方案中，提供了CNTF/受体复合物的配制品，其中一种以上的CNTF/受体复合物直接连接在一起，或通过另一个成员，如一种小珠连接在一起。

5.4.CNTF、IL-6及LIF共有信号转导成分

将由MAH细胞系中及其它神经元细胞系中的CNTF和LIF所激活的信号转导途径，与造血细胞系中LIF和IL-6所激活的信号转导途径进行了比较。在此一并资作参考的美国专利申请NO.676，847（1991年3月28日申请）中，我们叙述了CNTF、CNTF受体和信 号转导物gp130之间可能发生的相互作用。本说明书中所述的研究，进一步证实这样一个结果，即CNTF信号途径有gp130参与，而且进一步表明，LIF也利用有IL-6信号转导物gp130参与的信号途径。本文还要述及的发现是CNTF和LIF共有一种类似gp130的第二受体组分。这暗示着CNTFR（CNTFRα）才是将LIF受体复合物变成起作用的CNTF应答受体复合物所需的。

在IL-6的情况下，复合物在IL-6及其受体成分之间结合了gp130，然后它再以某种程度激活信号转导过程[Taga等，Cell  58：573-581（1989）;Hibi等，Cell  63：1149-1157（1990）]。gp130转导机能信号的能力与其在酪氨酸上被磷酸化的能力相关[Murakami等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：11349-11353（1991）]。这里我们已鉴别出可用来比较对CNTF和LIF反应的细胞系，IL-6的远缘系。令人注目的是，被检测的CNTF应答神经元细胞系，显示出对LIF的难以分辨的表型和生物化学应答;相反，应答LIF的造血细胞不应答CNTF。神经细胞中CNTF和LIF的应答可以为由三种CLIP的酪氨酸磷酸化所启动，该CLIP中至少两种（CLIP1和CLIP2）是可相互作用而形成稳定可免疫沉淀复合物的细胞表面蛋白。

CLIP磷酸化居先进行，而且基于激酶抑制物的研究，CLIP磷酸化明显地被要求有后续的特征基因诱导。LIF和CNTF显示同样的剂量应答、时间过程及与这些磷酸化相关的抑制剂分布模式及基因诱导，而且在用任一种因子处理之前，对另一因子的应答调小。不仅CNTF和LIF在神经元细胞中被诱导出基本上难以区分的信号现象，而且它们似乎与造血细胞中为LIF所诱发的信号现象相同。除CLIP1磷酸化是CNTF和LIF响应的特有特性外，这些现象也与造血细胞中 由IL-6所诱发的信号现象非常相似。通过提出各CLIP中之一（CLLP2）是IL-6信号转导物gp130的证据，我们提供了CNTF、LIF和IL-6信号途径中相似性的基础。

我们的发现提出了许多关系到各种CNTF和LIF受体成分与gp130/CLIP2相互作用的问题。CNTF可同与IL6R相关的CNTFR直接结合[Davis等，Science  253：59-63（1991）]，基于我们的数据及由于与IL-6***（图21A）相似，然后估计CNTFR会与gp130相互作用。然而，CNTF受体复合物显然还包括在应答CNTF时被酪氨酸磷酸化，而且可直接与gp130（图21A）相互作用的另一种细胞表面蛋白，即CLIP1。已知LIF结合分子量约为190KD，新近克隆过的gp130相关受体组分（以下称为LIFR），而且LIF-受体β（以下称为LIFR）的存在已被提出[Gearing等，Cell66：9-10（1991）]。我们的数据表明，LIF受体复合物还包括CLIP1和gp130（图21A）。最后，与IL-6/CNTF/LIF相关的G-CSF所相宜的受体复合物，显然是与gp130相关的G-CSF受体的同型二聚体[Fukunaga等，EMBO  J.10：2855-2865（1991）]（图21A）。

虽然，图21A中所描绘的各受体复合物，介导对结构上相关的配位体的结合，但如图所示，它们的区别不能令人满意。然而，如果人们考虑到尺寸上相似于LIFRβ的CLIP1确实是LIFRβ（图21B）的可能性，那么就有可能提出更“统一的”受体模型。因此，CNTF和LIF受体复合物将各利用两种不同象gp130的成分，LIFRβ/CLIP1以及gp130本身。基于我们的共沉淀数据，这两种β成分将直接相互作用，而且它们都可诱导地在酪氨酸上被磷酸化。为支持这种受体结构，新近的交联数据[Godard等，J.Biol，Chem， 267（正在印刷）]表明，LIF可与两种尺寸同LIFRβ/CLIP1和gp130相应而性质不同的蛋白结合。LIF和CNTF受体复合物中包含两种β组分，会使人想起G-CSF受体的结构（图21B），并提高了IL-6受体复合物也可包含gp130同型二聚物的可能性。实际上，这可能是，β亚单位的二聚作用和/或活化作用导致了信号过程的活化，这就象对受体酪氨酸激酶和某些细胞素受体所提出的那样[Aaronson等，Science  254：1146-1153（1991）];De  Vos等，Science  255：306-312（1992）]。

在图21B中所示模型中，β受体成分能起调节各因子与该β组分结合的作用，并因此是使配位体具有共有转导机理的特异性的原因。交联数据[Godard等，J.Biol.Chem.267（印刷中）]许能提示，对于LIF来说，如同G-CSF那样，这些组分可能都不是必要的。因此，CNTFR组分可能才是将起作用的LIF受体转变为起作用的CNTF受体所需要的。这后一种可能性连同CNTFR对神经***、肾上腺、坐骨神经及骨骼肌的限制表达一起[Davis等，Science  253：59-63（1991）]，可以解释为什么所有CNTF应答神经细胞也同样应答LIF[见上文;也见Rao等，Dev.Biol.139：65-74（1990）]，而在该神经***之外应答LIF的细胞都不应答CNTF。

有趣的是，为了与其转导成分相互作用，IL-6或CNTF的成分不必经膜束缚[Taga等人，Cell58：573-581（1989）]。因此，含有这些因子连同其受体可溶形式的复合物，可作为细胞的杂二聚物因子，该细胞不能单独地应答因子（因其不表达相宜的受体），但其确实表达适宜的转导成分。受体成分与自然杀伤细胞刺激因子（正常出现的杂二聚物因子）的两个亚单位中一个亚单位之间的同源性，支持 了这类杂二聚物复合物在活体内实际起可溶因子成分作用的可能性[Gearing  and  Cosman，Cell  66：9-10（1991）]。此外，不常见且易于开裂的CNTFR糖基磷脂酰肌醇对细胞表面的连锁，表明了调节释放这一受体成分的功能[Davis等，Science  253：59-63（1991）]。

尽管上面提出的各受体模式需要进一步实验证实，但它们显然具有切合的先例。过多的G-蛋白偶联受体与少数信号转导杂二聚物G-蛋白相互进行类似的反应，使得广泛排列的不同信号（如，神经递质，多肽激素和气味物质）会聚在较为适当数量的信号通道上[Gilman，Ann.Rev.Biochem.56：615-647（1987）]。更直接与gp130偶联受体体系相关的是IL-3、IL-5和GM-CSF的那些受体系,由IL-3、IL-5和GM-CSF导致的重叠活性和类似的酪氨酸磷酸化作用使我们发现，这些因子使用不同的受体成分，但共有这些成分[又见Nicola  and  Metcalf，Cell67：1-4（1991）;Miyajima等，Annu.Rev.Immunol（1992），正在印刷]。受体成分又一次主要参与结合因子，但缺少扩展的胞质结构域，因此似乎不具有信号转导能力。对这些共有亚单位似乎要求高度的亲合性结合，其决定着启动包含酪氨酸磷酸化的信号转导作用。当用gp130（且估计可能是LIFR/CLIP1）时，这些亚单位自身酪氨酸磷酸化，但看来不具有固有的激酶活性。虽然几乎不了解将这些亚单位酪氨酸磷酸化的机制，但多组分IL2受体也利用一个决定着高亲合性结合和信号转导作用的亚单位（LI2R），且该链被与其物理联接的src型酪氧酸激酶（lck）所酪氨酸磷酸化（又见Miyajima等，正在印刷）。有趣的是，CLIP磷酸化和IL-2诱导的lck磷酸化对激酶抑制剂都表现出相似的敏感分布[Hatakeyama等，Science252：1523-1528（1991）]。这就 是说，两种磷酸化都对星状孢子敏感，而对H-7不敏感，这示意，可能含有类似的酪氨酸激酶;CLIP3可为这种象src的激酶的应选者。

在某些重要方面，CNTF与其远缘细胞素相比，似乎相当异乎寻常。最重要的是，CNTF有限制性很大的受体成分分布，且迄今为止，它表现出是对CNTF有反应的神经系的主要细胞[Davis等，Science253：59-63（1991）]。这一局限性同与CNTF相关的细胞素的广谱作用形成对比;该CNTF实例意示，可能存在作用范围显得非常有限的另外相关细胞素。对MAH细胞系的鉴定，提供了一种对CNTF和LIF，以及对使用不相关受体系（诸如，FGF和NGF）的因子，表现生理性相关反应的神经元先祖细胞系。使用MAH细胞系，会有助于理解，不同因子使用各自信号通道，如何能够相互作用，而影响神经元远祖细胞的生长和分化。将MAH细胞系和造血细胞系的应答同细胞素对比，还会使我们深入了解，性质不同的细胞组织改变极相似起始信号感应和译码的机制。

5.5.一般和特殊受体成分的用途

如本文所述，CNTF和LIF共有某种受体复合物/信号转导途径的各成分。因而可以证实，单独的或与CNTFR（CNTFα）相结合的CNTF，可在通常应答LIF的细胞中，用作启动应答的工具。视细胞所具有的各受体成分而定，它可能应答CNTF或应答CNTF与CNTFR的结合体。如果细胞含有gp130，则LIFRβ和CNTFα（如采用ES细胞系的情况中出现），单独的CNTF具有与LIF相同的作用。如果细胞仅有gp130和LIFRβ，则CNTF和CNTFR相结合将模拟LIF的作用。

5.5.1.用CNTF阻止胚干细胞的分化

近来已确证，可采用CNTF代替LIF来阻止ES细胞的分化。胚干（ES）细胞为从预植入阶段鼠胚分离的全能性细胞，可将其在试管中培养并处理，然后将其再引入寄主胚，它们在其中可正常发育，并有助于包括种系在内的所有细胞谱系。因此，ES细胞对向鼠体引入特异性突变提供了一种理想的载体体系。

在培养物中维持全能性ES细胞，要求或有成纤维细胞（如，STO细胞）饲养层存在，或有可溶因子白血病抑制因子（LIF）存在[Smith等，Nature336：688-690（1988）;Williams等，Nature3365，684-687（1988）]。使用饲养细胞很可靠，但制备饲养层却耗费时间。STO细胞必须用丝裂霉素C处理2-3小时，以停滞其生长，再用PBS洗涤数次之后，可将STO细胞涂于带明胶层的平皿上。该平皿第二天即可使用，但仅在涂复后一周内有效[Robertson，Nature323，445-448（1987）]。为防止饲养层发生问题，Williams等[Nature（1988），同上]及Pease与Williams[Exp.Cell  Res.190，209-211，（1990）]发现，无饲养细胞存在下所维持的ES细胞，保留着其形成种系嵌合体的潜能，但条件是，培养基内须含LIF。

在有CNTF存在，但无饲养细胞和LIF存在下培养的ES细胞，会保留小细胞密集集落的特征性干细胞形态。这是非LIF因子防止ES细胞分化的第一个实例。两种引发相似应答的因子的存在提供了研究ES细胞分化转移的调节机制的又一个机会。

5.5.2.用CNTF/CNTFR激活LIF应答细胞

如本文所述，CNTF与CNTFR或可溶性CNTFR（sCNTFR）的联合使用，应结合到任何应答LIF的细胞上，并激活该细胞。不过，LIF应答细胞相当随遇，因此，就增强特异性而言，使用CNTF及其可溶性受体去激活这类细胞，不可期望获得任何可观的优越之处。此外，与经GPI固着将CNTFR并连在细胞表面相比，可溶性受体/CNTF复合物的效率显得低得多。

为了同时提高CNTF/CNTFR复合物的特异性以及其效率，本发明考虑将CNTFR复合在靶细胞表面，并接着用CNTF激活这样一种细胞，以此来靶定细胞。在另一实施方案中，以某一方式修饰该CNTF/CNTFR复合物，使其对特定靶细胞具有特异性。

将蛋白质（如CNTFR）靶定在细胞表面的方法是本领域普通技术人员公知的。通常，用一连接分子将这类蛋白质并连在细胞表面，该连接分子是既能与CNTFR又能与靶细胞结合的分子。较佳的是，这类连接分子可与靶细胞上自然产生的受体柔性结合。例如，有端部半乳糖的连接分子与CNTFR并连，即可在肝中使这种复合物并连在肝去唾液酸糖蛋白受体上。另一实施侧包括用含Fc连接分子与CNTFR并连，这就能使CNTFR并连在含Fc受体的靶细胞上。

另外，抗体（最好是单克隆抗体）可有效地用作连接分子。例如，可将识别特定细胞表面受体的抗体与CNTFR连接。另一方面，抗原决定基也可与CNTFR并连，其中该抗原决定基被同时结合CNTFR-抗原决定基复合物和靶细胞上抗原决定基的连接抗体所识别。如果直接面对靶细胞的抗体结合一种未知抗原决定基，则该抗体可为全随机肽表达库所识别[见，如PNAS  89：1865（1992）]。

若CNTFR并连在靶细胞表面上，则可通过添加CNTF来激活该细胞。另外，并连在连接分子（能使之并连在靶细胞表面的分子）上 的CNTFR，可与CNTF联合使用。在此情况下，活化剂便为CNTF/CNTFR/连接分子的复合物。

5.5.3.CNTFR拮抗体的鉴定

在本文识别IL-6，ILF和CNTF共有信号转导途径的基础上，可以看出，识别会与CNTF结合，并会与LIFRβ和gp130相互作用形成复合物，但不能转导信号的可溶性CNTR类似物，也会对LIF或IL-6所致激活作用起有效抑制剂作用。CNTF突变体也可表现这些活性。

在一个具体实施方案中，用HepG₂细胞提供一种测定CNTF激动剂或拮抗剂的方法，所述HepG₂细胞，在涉及包括纤维蛋白原在内的多种基因的转录上调节的快时应答中，应答LIF和IL-6。实验表明，由ChAT和应答基因上游序列（即纤维蛋白原启动子）构成的受体构建，会通过上调节ChAT活性而准确反映IL-6的功能信号。与分泌酶或细胞表面酶（如碱性磷酸酶）连接的记录构建，可用来筛选CNTF-sCHTFR的突变体，以便具有阻断LIF或IL-6激活极导体的能力。可将该突变体转染到HepG-2细胞中，并在96凹孔的平板上筛选。

另外，用CNTFR转染的HepG-2细胞，可向CNTF激活剂及/或抑制剂的筛选提供有价值的测定体系。

6.实施例：在E.COLI中生成人CNTF受体

6.1.材料和方法

1.pCP110的构建

亲本质粒表达载体pCP110，见Masiakowski等在J.Neurochem.57∶1003-1012（1991）中所述。

2.huCNTFR1表达载体的构建

用图3所示的DNA引物，以从质粒pCMX-hCNTFR（12）复制的PCR片段代替pCP110中单一Sall与Eagl限制位点间的DNA，以此产生质粒pRPN151。人CNTFR1由成熟huCNTFR序列的327个氨基酸和Met-Ser-Thr序列的NH₂末端上的另外三个氨基酸组成。含有该另外三个氨基酸，是为了在所需的氨基酸位置上启动信号转译，也为了简化随后的基因工程操作。与此同时，为了在不改变蛋白质序列的前提下优化表达，则要进一步修饰DNA序列编码区的起始端。这通过将所需的变化参入有义PCR引物（图3）来实现。然后将质粒pRPN151转染到E.coli菌株，RFJ26中。在RFJ26/pRPN151细胞的适宜诱导条件下，huCNTFR1达到为总蛋白10-20%的含量。

3.huCNTFR1的提纯

如对重组体鼠体和人CNTF所述（国际申请NO.PCT/U.S.90/05241，Sendtner等人1990年9月14日申请），将于RFJ26/pRPN151细胞中合成的受体主要部分置于内含体中，在8M氯化鈲中将其从内含体中定量萃取出来，并以可溶形式透析回收。用凝胶过滤回收具有活性且正确折叠的受体，以便使正确折叠的CNTFR1分子以其真实尺寸自含空隙体积的集聚蛋白质中洗脱出来。

6.2.结果

对从这样一种柱上洗脱的还原SDS-PAGE蛋白质凝胶以280nm吸光度进行的分析和电泳表明，尽管大多数受体在空隙体积中显凝聚态洗脱（30-40%纯度），还有些受体在裁然的尖峰（纯度80-90%）范围内以适当分子量位置（40KD）洗脱。后峰中的受体为起始物质中受体的10-50%，具体含量取决于再折叠的条件（图5）。

对天然凝胶上洗脱分布的分析表明，正如对凝聚蛋白所予料的那 样，处于无峰段的受体蛋白质不进入凝胶，另一方面，正如对有统一构象的分子群体所预料的那样，40KD峰的受体移动形成一尖谱带。

7.实施例：CNTF/受体复合物的形成

将按第6.1.3.节所述回收的40KD峰受体用于与纯化大鼠CNTF的混合实验。

7.1.材料和方法

如Goldenberg[Analysis  of  Protein  Conformation  by  Gel  Electrophoresis，in：“Protein  Structure”，ed：Creighton  IRL  Press，Oxford（1989）]所述，将恒量的受体与增量的大鼠CNTF混合，并使各样品在PH7.4的天然凝胶体上流动。

接着，在室温下，将纯化受体与大鼠CNTF在生理缓冲液（100mM  Tris-HCl，50mM  NaCl，PH8.0）中混合，并装载于Superdex-75柱（Pharmacia）上。回收相应于该受体-CNTF复合物的吸收峰谱物，并将其在5℃下储存48小时，到此时间后，将部分样品进行如上文中所述的凝胶过滤。

7.2.结果

当使无峰段受体与大鼠CNTF混合，并在天然凝胶上分析时，受体连同一些CNTF保留在凹孔中。作为对比，当40KD峰的受体与大鼠CNTF混合时，两种蛋白在凝胶的新位置上以单谱带形式迁移（图6）。凝胶迁移率的偏移，看来在CNTF与CNTF受体的摩浓度大致相等时完成。这些结果表明，huCNTF1与CNTF联合紧密。

在那时，对部分试样在如上所述的相同凝胶过滤柱上进行的分析表明，全部蛋白质都以相应于受体-CNTF复合物的主吸收峰区内洗脱，而不存在对应各别蛋白成分峰的迹像。作为对比，将第二部分样 品在0.1%三氟乙酸-乙腈中用C8柱体（Applied  Biosystems）做反相色谱分析。如同所预计和先前在这种强酸-有机溶剂溶混合物中用其它受体[Cunningham等，Science，254，821-825（1991）]所观察的那样，受体-CNTF复合物解离成其所含的两个各别成分，从而证实了该复合物的组成。

这些结果表明，在这些实验条件下（即受体和CNTF浓度为80nM并接近生理的离子强度，PH和温度诸条件），重组CNTF受体与CNTF形成稳定的复合物。

8.实施例：CNTF/受体复合物促使髓样白血病细胞的分化

8.1.材料和方法

8.1.1.细胞培养条件

将M1细胞（一种髓样白血病衍化的细胞系）在Dulbecco改变的Eagle培养基和10%马血清中进行培养。以每凹孔50，000个细胞的密度将其接种于NUNC24凹孔平板中。将细胞素和/或CNTF受体加到各凹孔中，并于5天后对培养物评价分化的表型。可溶性CNTF受体在E.Coli中产生，并纯化成均质。

8.1.2.表型评价

未分化的M1细胞为圆形且有明相又不粘连底物。这些细胞被评为（-）。当细胞越加分化时，就粘连底物，相光泽减退，呈现不规则至纺锤形的形态，且延长各过程。根据其具有这些特征的程度，将培养物评为（+）到（++++）。在最佳条件下，IL-6处理得分（++）而LIF处理得分（+++）。极高浓度的CNTF和CNTFR使这些特征表现得最强，且被评为（++++）。

8.2.结果

在20ng/ml浓度下，观察到的细胞最大应答是在IL-6（++）和LIF（+++）时。表1列出大鼠CNTF和可溶性人受体在不同结合使用情况下所处理M1细胞的应答结果。表2列出该细胞对人CNTF和人受体在不同结合使用情况下的应答。显然，CNTF与其受体结合使用的情况要比二者中任用一种的情况所引发的应答要有效得多。单有受体，在所试的任何浓度下，都不引起分化，即使很高的各浓度下也是如此，单有CNTF，看来确实会引起应答。最后，对一些实验而言，天然受体在COS细胞中产生且经磷脂酶C处理后，自细胞表面切断下来。在这些实验中，可溶受体的浓度未予测定。这种受体与200ng/ml大鼠体CNTF的结合使用，也产生分化，而仅只CNTF抑或CNTFR却没有这种作用。

表1
						鼠体CNTF(ng/ml)
人体CNTFR(ng/ml)	0	20	100	500
					0	-	-	-	+/-
40	-	+	+	+
					200	-	+	++	+++
1000	-	++	+++	+++

表2
										人体CNTF(ng/ml)
人体CNTFR(ng/ml)	0	20	100	500	1000	5000	10000	25000
									0	-	-	-	-	+/-	+	+	++
40	-	-	-	+/-	ND	ND	ND	ND
									200	-	-	+/-	+	ND	ND	ND	ND
1000	-	-	+	++	+++	+++	+++	++++

9.实施例：CNTF在介导CLIP蛋白磷酸化和前早基因表达方面类似LIF

9.1.材料和方法

9.1.1.试剂

用于此项研究的重组大鼠CNTF的制备和纯化，先前已有记述[Masiakowski等，J.Neurochem.57：1003-1012（1991）]。鼠IL-6（mIL-6）购自UBI（Upstate  Biotech，Inc.NY），而重组人LIF购自Amgen  Biologicals（CA）。从牛脑中提纯的bFGF，购自R  &  D  System，而NGF从小鼠下颌腺中提纯。所用的蛋白激酶抑制剂，包括H-7[1-（5-异喹啉磺酰基）-2-甲基哌嗪二盐酸盐，Seikagaku  Kagyo  Co.]和星状孢子（Kamiya  Biomed.Co）。与琼脂 糖珠接合的抗磷酸酪氨酸单克隆抗体，来源于Upstate  Biotech.，Inc.（NY）。

9.1.2.细胞结构

如先前文献中所述[Birren等，Neuron 4：189-201（1990）]，将MAH细胞保持在培养物中。简短地说，将该细胞以6K/6mm凹孔或40K/16mm凹孔的密度铺复在预先涂以聚D-赖氨酸（100μg/ml）和昆布氨酸（10μg/ml）的培养皿中。所用的培养基为补充以10%FBS和***（5μM）的改型L15-CO₂培养基。将IARC-EW-1（Ewing肉瘤细胞）和SK-N-LO（神经上皮瘤细胞）在含10%胎牛血清、补充以2mM L-谷氨酰胺和100单位/ml的青霉素与链霉素的RPMI培养基中培养。PC12细胞在补充以6%马血清、6%幼牛牛清、2mM L-谷氨酰胺及100单位/ml青霉素与链霉素的Dulbecco改变的Eagle培养基中培养。

9.1.3.MTT测定，³H-胸苷参入测定及ChAT测定

在添加MTT染剂（最终浓度0.5mg/ml）之前，用因子处理MAH细胞不同时间周期。继续保温8小时，并添加DMSO，以溶解由活体细胞所吸收的染料产物。用FLow Titretek多重扫描仪测定570-650nm的光密度值。为进行³H-胸苷掺入测定，将细胞用各种因子处理不同时间周期，再以1uCi/ml的最终浓度添加³H-胸苷（NEN-NET-027E），并在37℃下保温4小时。然后，用PBS洗涤细胞三遍，在室温下用NaOH（0.5N）溶解2小时，并计数3H-DNA。采用标准技术生产ChAT。简短地说，用不同因子处理细胞，用冰冷的PBS洗涤该细胞，加入含20mM Tris-HCl（PH8.6）和0.1% Triton X-100的ChAT收集缓冲剂，并将其在冰上保温15 min。然后，在37℃下将细胞萃取物同反应混合物一起保温60分钟，所述反应混合物含11mM胆碱盐酸盐，0.2mM 14C-乙酰基CoA，0.14mM毒扁豆碱，300mM NaCl，50mM Na₃PO₄，20mM EDTA。将此混合物的一个等分试样与含乙腈/四苯硼（5mg/ml）的闪烁流体混合，并记数。

9.1.4.RNA分离与分析

将细胞以100mm平皿上含5×10⁶个细胞的密度铺复，再用因子处理不同时间周期。用早先文献中所述的硫氰酸鈲法制备总RNA[Chomczynski等，Anal，Biochem.162：156-159（1987）]。将10μg RNA在甲醛琼脂糖凝胶上电泳，转移到尼龙膜（MSI）上，并杂交到由无规微启动（stragene）标记的32p-探针上。所用的探针包括tis11（2.3 kb EcoR1片段）、c-fos（1kb Pst片段）、大鼠CNTF受体（rCNTFR，0.4kb Pst片段）和GAPDH（1.25kb Pst片段）。

9.1.5.蛋白质分离，免疫沉淀和免疫印迹

为了检测蛋白质的酪氨酸磷酸化，在无血清的规定培养基中，将约1-2×10⁶个细胞断养60分钟，用不同因子处理5分钟，并如早先文献中所述，用RIPA缓冲剂（补充以蛋白酶和磷酸酶抑制剂）制备蛋白质溶胞产物[Glass等，Cell66：405-413（1991）]。为制备总蛋白样品，将承截蛋白的染剂直接加入RIPA溶胞产物上清液中，并于90℃沸腾3分钟。另外，将RIPA溶胞产物的上清液在4℃下，用100μl与抗-磷酸酪氨酸抗体（4G10）接合的琼脂糖沉淀过夜，再用RIPA缓冲液洗涤3遍。用200μl（1x）承载蛋白的染剂将蛋白从琼脂糖珠洗脱出来，再沸腾3分钟。将50μl的总蛋白 试样品抑或免疫沉淀物，在10%SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳，如早先文献中用抗-磷酸酪氨酸抗体进行免疫印迹[Glass等，Cell66：405-413]，并用¹²⁵I标记的山羊抗小鼠多克隆抗体（1μl的4.91uCi/μg每ml缓冲液，DuPont）。为免疫沉淀PC12细胞中的ERK蛋白质起见，用ERK特异性抗体（Zymed，Inc）和随后用与琼脂糖接合的山羊抗小鼠IgG抗体免疫沉淀细胞的溶胞产物。将沉淀物进行如上所述的电泳并用同样的ERK抗体免疫印迹。

9.1.6.细胞表面生物素化测定

在同LIF或CNIF一起保温5分钟以诱导CLIP磷酸化后，将细胞在补充1mM原钒酸盐的5ml  PBS（PBSV）中洗涤，然后在含1mg/ml  NHS-SS-生物素（3-[2-（生物素氨基）乙基]二硫代]丙酸  3-硫代琥珀酰亚胺酯;一种不透膜试剂，Pierce）的PBSV中，于冰上保温10分钟。然后将细胞平皿用含原钒酸盐的tris-缓冲盐水洗涤，并如上所述用RIPA缓冲液溶解。如前所述，用固定化的抗-磷酸酪氨酸抗体沉淀溶胞产物，然后经在PH8.2且含1%SDS的50mM  tris中沸腾5分钟，以此将结合的磷蛋白自琼脂糖珠取出。同20L抗生蛋白链菌素-琼脂糖（Pierce）一起保温1小时，以此使生物素化蛋白自该溶液中沉淀出来。在添加样品缓冲液后，将含未生物素化蛋白的上清液置于SDS  PAGE。在结合缓冲液中，再一次洗涤含生物素化蛋白的小珠，然后在含10%β-疏基乙醇的2X  SDS  PAGE样品缓冲液中沸腾5分钟使结合的生物素化蛋白自小珠中洗脱出来。按上所述进行这样品上的抗-磷酸酪氨酸免疾印迹。

9.2.结果

9.2.1.CNTF与LIF的介导生长停滞和MAH细胞的分化

本实施例中所用的MAH细胞系，通过用v.myc致癌基因使交感肾上腺先植细胞不灭化（immortalizing）而得[Birren等，Neuron 4：189-201（1990）]。用CNTF处理MAH细胞，显著地阻断了培养这类细胞时通常出现的细胞数量的增长。对成熟交感神经元具有类似CNTF作用的LIF在CNTF或LIF-处理的培养物中也阻断MAH细胞中通常出现的细胞数量增长，使该培养物在4天时间内细胞数基本保持不变，而对比培养物则以指数速率不断累积（图7B）。CNTF和LIF的作用均表现出非常相似的剂量依赖性，其EC₅₀值约为50pg/ml（或2pM）（图7C）;这一剂量依赖性相似于观察CNTF对睫状神经元存活作用所知的剂量依赖性[Masiakowski等，J.Neurochem 57：1003-1012（1991）]。不像CNTF抑或LIF，碱性成纤维细胞生长因子（FGF）对这些细胞起着潜在促有丝***剂的作用（图7C插图），这正如早先文献[Birren等，Neuron 4：189-201（1990）]中所述的那样。

在MAH细胞中CNT和LIF，都不诱导轴突扩张或神经元分化的其它形态学变化特征。然而，细胞周期分析显示，用CNTF处理的MAH细胞在细胞周期的G1阶段停滞，该阶段记忆许多诱导增生状态和细胞分化间转变的因子。已表明CNTF诱导交感先祖细胞的胆碱能分化，且CNTF和LIF都诱导成熟交感神经元的胆碱能分化。为了寻求CNTF和LIF对MAH细胞具有分化效应的可能性，我们测定了胆碱乙酰转移酶（ChAT）应答这些配体时的活性诱导。如图8A所示，用CNTF或LIF处理MAH细胞，导致ChAT活性约提高2倍，而bFGF则没有效应。而且，将MAH细胞暴露于CNTF24小时，在用NGF刺激PC12细胞分化时，会导致低亲和性NGF受体mRNA的增 加。

总之，上面的数据表明，CNTF对交感肾上腺先祖细胞起着生长停滞/分化因子的作用。这些行为看来与FGF的行为截然不同。FGF除了起MAH细胞促有丝***剂作用外，还诱导轴突增生并引发这些细胞的神经元分化（而不是胆碱能分化）;FGF诱导的分化，可能产生NGF-依赖细胞。因此，多因子通常能够影响神经元先祖细胞的分化。MAH细胞看来是一种非常有效的模型体系，该体系中剖析不同因子在调解神经元分化不同方面的作用。

9.2.2.CNTF和LIF快速诱导细胞蛋白酪氨酸磷酸化的不易分辨图型

尽管细胞素并不利用含有内在酪氨酸激酶活性的受体，但酪氨酸磷酸化仍被多种不同细胞素快速诱导。为了确定CNTF是否在应答细胞中诱导酪氨酸磷酸化，也为了将这类磷酸化与由CNTF结构远缘所诱导的磷酸化相比较，我们首先检验了CNTF和LIF在MAH细胞及在神经上皮瘤及Ewing肉瘤细胞中的应答。如图9所示，CNTF和LIF都快速诱导MAH细胞，Ewing肉瘤（EW-1）和神经上皮瘤（SK-N-LO）细胞中的三种蛋白（标为CNTF-和LIF-可诱导磷蛋白的p200^CLiP1、p160^CLiP2和P75^CLiP3）酪氨酸磷酸化。任一因子在检验的不同细胞系中诱导的磷酸化图型是难于分辨的，因此，对CNTF有不同表型应答（即就细胞生长而言）的CNTF受体阳性细胞系，在应答CNTF时呈现难于分辨的磷酸化图型。所观察的酪氨酸磷酸化应答，具有剂量依赖性，CNTF和LIF都在10ng/ml时获得最大诱导。

为了确定是否CLIP磷酸化为CNTF和LLF应答的特异性特征，我们将CNTF和LIF的磷酸化图型与FGF和NGF的磷酸化图型做 了比较。虽然MAH细胞和EW-1细胞都应答FGF，但各种CLIP在任何一种细胞系中应答FGF时都不被磷酸化（图9）。同样，各CLIP在应答NGF的嗜铬细胞瘤细胞系PC12中应答NGF时，也不被磷酸化（Figure  10C）。

被称为胞外信号调节激酶或ERKs的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家系，近来已被确认，定性并被分子克隆[Boulton等，Cell65：663-675（1991）]。该ERKs（也称为MAP或MBP激酶）的激活，要求酪氨酸磷酸化[Boulton等，Cell65：663-675（1991）]，而且在受体酪氨酸激酶与其相关配体结合后很快发生（如对NGF来说，见图10C）。ERKs在应答不利用受体酪氨酸激酶的不同种促有丝***剂和分化剂时，也被激活。我们选择检验了ERK在EW-1细胞中应答CNTF，LIF和FGF时的磷酸化。与FGF相比，CNTF或LIF并不诱导可能被识别为ERK2（图10B）的40KD蛋白的快速酪氨酸磷酸化（图10A）。

我们的发现表明，诱导p200^CLiP1、p160^CLiP2和P75^CLiP3酪氨酸磷酸化以CNTF和LIF所激活的信号转导途径为特征，并对该转导途径具有特异性。使一种尺寸类似于p160^CLIP2的蛋白在同时应答IL-6和LIF时在酪氨酸上磷酸化[Nakajima and Wall，Mol.Cell.Biol，11：1409-1418（1991）;Lord等，Mol.Cell.Biol.11：4371-4379（1991）];将这些被诱导蛋白之间可能有的联系将在下面提及。与CNTF和LIF受体介导的应答不同，激活酪氨酸激酶受体的应答（诸如FGF和NGF所诱导者），不产生CLIP磷酸化。相反，酪氨酸激酶受体的刺激，则使ERKs被快速激活，而ERKs不被CNTF抑或LIF快速磷酸化。

9.2.3.CLIPS的快速瞬时磷酸化先于特征性前早应答基因Tis11的诱导

由配位体受体相互作用启动的某个信号转导串（cascade）的诱导，常常从激活酪氨酸磷酸化开始，随后激活前早应答基因。先前的文献中之记载，在p160的快速瞬时酪氨酸磷酸化居先于LIF及IL-6同时对前早基因表达的激活[Nakajima  and  Wall，Mol.Cell.Biol.11：1409-1418（1991）;Lord等，Mol.Cell.Bilo.11：4371-4379（1991）]。在图11中，我们将CNTF或LIF诱导的CLIPs酪氨酸磷酸化时程与前早基因表达的激活进行了比较。我们专门检验了一种表现得具有IL-6所介导应答特征的前早应答基因tis11的表达，以及另一种对IL-6应答不表现出其特异性的前早基因c-fos的表达。在MAH细胞中，CNTF和LIF对所有三种CLIPs的酪氨酸磷酸化诱导都很快，在5分钟内发生，且在30分钟后明显减弱（图11）。在EW-1细胞中，两种因子的磷酸化动力学很相似。

在MAH细胞中，CNTF和LIF都在CLIP磷酸化诱导之后产tis11基因表达诱导。最大程度的激活发生在45分钟时，并在120分钟以前回降到无激活水平（图11B）。

在EW-1细胞中，观察到tis11的相似基因激活动力学，在MAH细胞中无论用CNTF，还是用LIF，都未观察到c-fos表达的诱导（图11B）。然而，bFGF不像CNTF和LIF，它在没有tis11基因诱导的情况下，却在MAH细胞中诱导c-fos基因表达（图11C）。CNTF和LIF在EW-1细胞中，既诱导tis11，又诱导c-fos（图11C）。

我们的试验结果表明，继而诱导tis11基因表达的三种CLIPS 的快速磷酸化以CNTF和LIF都在神经元细胞系中应答为特征。对有一种160KD磷蛋白（CLIP2）及tis11参与的上述那些过程进行测时，可以看出CNTF和LIF在神经元细胞中利用的转导途径与IL-6和LIF在造血细胞中激活的途径之间有着相似性。直接比较酪氨酸磷酸化过程，会看出明显相似性与不同性。LIF在M1髓样先祖细胞系中诱导了与CLIP1，CLIP2和CLIP3尺寸等同的蛋白的酪氨酸磷酸化，而IL-6仅诱导了这些蛋白中相应于CLIP2（可能为p160）和CLIP3的两种蛋白的酪氨酸磷酸化;CNTF在M1细胞中并不诱导任何可检测的酪氨酸磷酸化（图12）。

特异性磷酸化过程，可用不同的蛋白激酶抑制剂加以区别。我们利用蛋白激酶抑制剂星状孢子与H-7，来进一步证实CNTF与LIF诱导的磷酸化是等同的，并确定激酶级联（cascades）导致的tis11激活对CNTF，LIF和IL-6来说是否相似;使用H-7是因其特异地阻断IL-6诱导tis11基因所需的下游激酶又不影响引发酪氨酸磷酸化过程[Nakajima及Wall，Mol.Cell.Biol.11：1409-1418（1991）;Lord等Mol.Cell.Biol  11：4371-4379（1991）]。如图13所示，在MAH细胞抑或EW-1细胞中，CNTF和LIF诱导的酪氨酸磷酸化过程都被星状孢子所阻断，但不被H-7所阻断。然而，H-7同样阻断MAH细胞中CNTF和LIF诱导tis11基因诱导（图13C）或M1细胞中IL-6和LIF诱导tis11基因诱导（图13D）;如根据磷酸化数据所予见，星状孢子也阻断tis11基因诱导。

因此，通过直接比较同时使用蛋白激酶抑制剂的各磷酸化过程可表明，神经元细胞系中被CNTF和LIF激活的信号途径相应于造血 细胞中LIF所用的信号途径。而且，这一途径难于区别于，但共有造血细胞中IL-6所激活途径的许多新特征。

因此，该tis11诱导表现得能应答数种这类远缘细胞系的特征，而这些不同的细胞素诱导的机制，表现了类似于蛋白激酶抑制剂的敏感性。

M1细胞并不表达CNTF受体，也不应答CNTF，而所检验的MAH细胞系、Ewing肉瘤细胞系和神经上皮瘤细胞系，则不应答IL-6。能够找到可将对CNTF，LIF或IL-6的应答加以分离的细胞系，这一发现表明，这些因子中的任意两种因子都不采用等同的受体。

9.2.4.以CNTF或LIF予处理所致CLIP1和CLIP2的下调节不能经添加CNTF或LIF而逆转

正如所料，若CNTF和LIF共有信号转导成分，则由于用CNTF或LIF予处理造成的CLIP1和CLIP2磷酸化下调节，不能通过随后添加其它因子而克服（图14A）。而且，这些因子的亚饱和浓度，呈现对MAH细胞生长抑制的累加效应，而饱和浓度则不再累加。

9.2.5.CLIPS在细胞表面的表达

为确定CLIPs是否在细胞表面表达，我们利用一种专门造成细胞表面蛋白生物素化的测定方法[Stah1等，Biochemistry29，5405-5412（1990）]。这种测定揭示，CLIP1和CLIP2确实表达能被生物素化的胞外结构域（图14B）;CLIP1的表面定位还与这样的发现相符合，即在进行肽-N-糖苷酶F处理时，CLIP1的表现尺寸减小。

10、实施例：CLIP2的特征记述

10.1.CLIP2等同于gp130

用一种对人gp130特异的单克隆抗体（AM64）考察IL-6、CNTF和LIF共有与对CNTF和LIF都应答的人体细胞系协同的gp130可能性[Hibi等，Cell  63：1149-1157（1990）]。这种抗体不结合任何与gp130相关的蛋白，也不结合啮齿种的gp130。gp130的免疫沉淀揭示，在EW-1细胞中它在应答CNTF抑或LIF时都被强烈酪氨酸磷酸化，而且这种磷酸化的gp130与CLIP2一起共迁移（将图14C中第3，7道与第2，6道比较）。而且，抗-gp130抗体可用来从CNTF/LIF-诱导的EW-1细胞的萃取物中完全排除CLIP2（将图14C中的第4，8道与第2，6道比较）。由这些数据我们可以推断，CNIP2确实为gp130，因而gp130在应答CNTF和LIF时是被磷酸化的酪氨酸。有趣的是，当使用AM64抗体时，CLIP1部分地与gp130共沉淀，这表明该两种分子可能存在于复合物中，不太强烈的溶胞条件（如用毛地黄皂苷）能够在应答CNTF处理时提高CLIP1与gp130的共沉淀量。

10.2.抗gp130抗体选择阻断CLIPs的酪氨酸磷酸化和tis11诱导

在有或无抗-gp130抗体鸡尾酒（2μg/ml）存在下在规定的培养介质中使EW-1细胞断养1小时。分别在酪氨酸磷酸化测定和RNA分析之前，将该细胞用不同因子处理5分钟或45分钟。

检验抗-gp130抗体在EW-1细胞中阻断CNTF和LIF诱导的酪氨酸磷酸化的能力，所述抗体之显示抑制肝细胞瘤细胞系中的IL-6应答。数据表明，由CNTF或LIF诱导的CLIP1和CLIP2的酪氨酸磷酸化（图17A）及tis11基因表达（图17B）都被抗-gp130抗体完全阻断。另一方面，由不相关配位体EGE诱导的酪氨 酸磷酸化则不受影响。

10.3.gp130被普遍表达而CNTFR的表达较为有限

基于gp130转录本比IL-6R转录本分布宽得多的发现[Hibi等，Cell63：1149-1157（1990）]，前已推测，gp130起着IL-6之外其它因子的转导物的作用。与这种见解和我们关于CNTF和LIF发信号体系共用gp130的发现相符，我们认为，gp130转录本在应答IL-6（而不是CNTF）的两种造血细胞系中（图15，注意M1和B9细胞系）及应答CNTF和LIF（而不是IL-6）的成熟脑组织（图16）和神经元细胞系中（图15，注意MAH，EW-1，SK-N-LO和SH-SY5Y细胞系）被表达。对比来看，inCNTFR  mRNA呈限制性分布，且在这一实验中，仅在应答CNTF的脑细胞系和神经元细胞系中表达（图15）。

实施例11.ES细胞应答CNTF

11.1.以LIF或CNTF培养ES细胞

此项研究所用的129/Sv/Ev  XY  ES细胞系（Elizabeth  Robertson赠）得自黑灰色（BBAA）小鼠[Robertson等，Nature323  445-448（1986）]。一般，使ES细胞生长在STO细胞喂养层上[以丝裂霉素C（Sigma  chemical  Co.产）停滞生长]，并在Du  lbecco改型的Eagle培养基（DMEM，Irvine  Scientific）内保持，该培养基中补充了10%  FBS（Lot  ＃  11111020，Hyclone，）、0.1  mM  β-巯基乙醇（Sigma  Chemical  Co.）、292mg/ml  L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素G和100mcg/ml硫酸链霉素（由L-谷氨酰胺、青霉素和硫酸链霉素组成的100倍储液Irvine  Scientific产）。作为予防措施，以10ng/ml的浓度添加LIF（重组人LIF，Amgen  Biologicals），以防止 分化。如先前文献中所述，使ES细胞每隔3-4天在新制备的饱养细胞板（plates）上传代[Robertson等，Nature323，445-448（1986）]。

为确定CNTF对ES细胞的效应，从ES细胞培养物中消除STO细胞和LIF。将ES细胞在LIF（20ng/ml）存在下，两次继代接种在涂胶的平皿上（0.1%猪皮明胶，Sigma  Chemical  Co.），第二次继代接种后，很少有STO细胞保留下来。在LIF（20ng/ml）存在下，使ES细胞生长一天，洗至无LIF，然后在有CNTF、LIF存在或无因子存在下培养7天。

11.2.RNA分析

如先前文献中所述[chomczynski等，Anal.Biochem.162，156-159（1987）]，用硫氰酸鈲法自ES细胞制备总RNA，使其在无STO饱养细胞存在下生长，并在LIF（20ng/ml）存在下保持。将10μg  RNA在甲醛琼脂凝胶上电泳，转移到尼龙膜（MSI）上，并杂交成32P标记的CNTF受体的cDNA探针（800bp，PstI片段），该探针用随机激启动（Stratagene）标记。

11.3.CNTF结合到ES细胞上

用Bolton-Hunter方法碘化重组大鼠CNTF[Bolton and Hunter，Biochem J.133：529-539，（1973）]。在结合之前，将ES细胞以2.5×10⁶细胞/35mm凹孔的密度铺复在明胶板上，并使其在20ng/ml LIF存在下生长4天。自凹孔中去除培养基，并用测定缓冲剂（PBS，PH7.4，含BSA（1mg/ml），0.1mM杆菌肽，1mM PMSF和抑酶醛肽（leupeptin），（1μg/ml）将细胞洗涤一遍。将细胞同125 I-rCNTF（700pM）一起于室温下保温2小时，随后用测定缓 冲剂快速洗涤两次。用含1%  SDS的PBS溶解该细胞，并监测其放射性。

11.4.结果

11.4.1.ES细胞培养

在无饲养细胞而有LIF（10-20ng/ml）存在下维持的ES细胞，保持为未分化小细胞的致密集落。不过，较低浓度的LIF（低于10ng/ml）则导致ES细胞内分化2-7天，这为内胚层类细胞和扁平大细胞的存在所证实。也发生某种程度的细胞死亡（图18，A部）。为确定在无饲养细胞存在下，CNTF是否还能维持ES细胞呈不分化态，使ES细胞在有不同浓度CNTF的明胶板上生长。低浓度的CNTF（5pg/ml-10ng/ml  CNTF）产生分化和某种程度的细胞死亡。然而，高于10ng/ml直至50ng/ml浓度的CNTF，则使ES细胞维持小而密集的细胞集落（图18，B部）。维持在既无LIF又无CNTF存在下的ES细胞，在2-7天内呈现内胚层状或大而扁平状（图18，C部）。

11.4.2.CNTFR在ES细胞的表达

对源于ES细胞的RNA进行的Northern分析表明，CNTF受体mRNA以比成熟大鼠脑低的含量存在（图19）。

11.4.3.CNTF对ES细胞的结合

ES细胞对¹²⁵I-rCNTF呈85%特异性结合，其总结合体CPMave（每分钟平均记数）＝10235+157而非特异性CPMave＝1517+163。

11.4.4.ES细胞中CNTF和LIF对tis11的诱导

将ES细胞铺复在涂有明胶的平皿上;并使具在有CNTF（20ng/ml）抑或LIF（20ng/ml）存在下，保持未分化态。将细胞在规定的培养基中洗涤两次，并在持续45分钟添加CNTF（50ng/ml）或LIF（50ng/ml）之前，于规定的培养基中使其断养2小时。制备总细胞RNA，在甲醛琼脂糖凝胶上电泳，将其转至尼龙膜（MSI），并杂交到32P-标记的tis11探针上（图20）。在ES细胞中，CNTF和LIF都在tis11基因表达中产生类似的诱导，这表明ES细胞对这些细胞素都应答。

参考资料

本文援引了多种公开文献，均在此一并资作参考。

序列表

（1）一般资料

（ⅰ）申请人：Ip等

（ⅱ）发明名称：无细胞睫状神经营养性因子/受体复合物

（ⅲ）序列数：6

（ⅳ）通信地址：

（A）收件人：Pennie  &  Edmonds

（B）街道：美国1155大道

（C）城市：纽约

（D）州：纽约

（E）国家：U.S.A.

（F）邮区：10036-2711

（ⅴ）计算机可读形式：

（A）中型：软盘

（B）计算机：IBM  PC兼容

（C）操作***：PC-DOS/MS-DOS

（D）软件：PatentIn  Release  ＃  1.0，Version  ＃1.25

（ⅵ）本申请资料：

（A）申请号：

（B）申请日：

（C）分类：

（ⅷ）委托人/代理人资料：

（A）姓名：Misrock，S.Leslie

（B）登记号：18，872

（C）参考/记录号：6526-105-228

（ⅸ）电讯资料

（A）电话：212  790-9090

（B）传真：212  8698864/9741

（C）电传：66141  PENNIE

（2）序列ID  NO：1的资料

（ⅰ）序列特征

（A）长度：782碱基对

（B）类型：核酸

（C）链型：单链

（D）拓扑结构：未知

（ⅱ）分子类型：DNA

（ⅸ）特征：

（A）名称/标示：CDS

（B）位置：126..725

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：1：

（2）SEQ  ID  NO：2的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：200氨基酸

（B）类型：氨基酸

（C）拓扑结构：未知

（ⅱ）分子类型：蛋白质

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：2：

（2）SEQ  ID  NO：3的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：1591碱基对

（B）类型：核酸

（C）链型：双链

（D）拓扑结构：未知

（ⅱ）分子类型：DNA（cDNA）

（ⅸ）特征：

（A）名称/标示：CDS

（B）位置：289..1404

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：3的序列描述

（2）SDQ  ID  NO：4的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：372氨基酸

（B）类型：氨基酸

（C）拓扑结构：未知

（ⅱ）分子类型：蛋白质

（ⅹⅰ）序列描述：SED  ID  NO：4：

（2）SED  ID  NO：5的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：43碱基对

（B）类型：核酸

（C）链型：单链

（D）拓扑结构：未知

（ⅱ）分子类型：DNA

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：5：

CGCAGTGTCG  ACAGCACAGC  GICACAGTCC  ACAAGAAGCA  CCC  43

（2）SEQ  ID  NO：6的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：35碱基对

（B）类型：核酸

（C）链型：单链

（D）拓扑结构：未知

（ⅱ）分子类型：DNA

（ⅳ）反意义：是

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：6：

GGACGCCGGC  CGATTAGGGT  GCGCAGGGTC  CCCCG  35

Claims (57)

1、一种基本纯化的无细胞蛋白复合体，其含有稳定结合于睫状神经营养性因子受体的睫状神经营养性因子。

2、权利要求1的蛋白复合物，其中该睫状神经营养性因子具有基本如图1所示的氨基酸序列。

3、权利要求1的蛋白复合物，其中该睫状神经营养性因子受体具有基本如图2所示的氨基酸序列。

4、权利要求1、2或3的蛋白复合物，其中该睫状神经营养性因子非共价健合于该睫状神经营养性因子受体。

5、权利要求1、2或3的蛋白复合物，其中该睫状神经营养性因子共价健合于该睫状神经营养性因子受体。

6、权利要求1、2或3的蛋白复合物，其进一步含有能够将所述复合物与一靶细胞连接的连接分子。

7、权利要求6的复合物，其中所述连接分子为一种抗体。

8、权利要求6的复合物，其中所述的连接分子为一种抗原决定基。

9、权利要求8的复合物，其中所述的抗原决定基结合一种与靶细胞结合的抗体。

10、一种基本纯化的无细胞蛋白复合物，其含有睫状神经营养性因子受体（CNTFR）和一种能够将所述受体结合于靶细胞的连接分子。

11、权利要求10的复合物，其中所述连接分子为一种抗体。

12、权利要求10的复合物，其中所述连接分子为抗原决定基。

13、权利要求12的复合物，其中所述抗原决定基结合一种与靶细胞结合的抗体。

14、一种含权利要求1所述蛋白复合物的药用组合物。

15、一种含权利要求2所述蛋白复合物的药用组合物。

16、一种含权利要求3所述蛋白复合物的药用组合物。

17、一种含权利要求4所述蛋白复合物的药用组合物。

18、一种含权利要求5所述蛋白复合物的药用组合物。

19、一种含权利要求6所述蛋白复合物的药用组合物。

20、一种含权利要求7所述蛋白复合物的药用组合物。

21、一种含权利要求8所述蛋白复合物的药用组合物。

22、一种含权利要求9所述蛋白复合物的药用组合物。

23、权利要求22的药用组合物，其还含有能够结合抗原决定基和靶细胞的抗体。

24、一种含权利要求10所述蛋白复合物的药用组合物。

25、一种含权利要求11所述蛋白复合物的药用组合物。

26、一种含权利要求12所述蛋白复合物的药用组合物。

27、权利要求26的药用组合物，其还含能结合抗原决定基和靶细胞的抗体。

28、权利要求24-27中任一项所述的药用组合物，其还含CNTF。

29、一种促细胞分化的方法，其包括将应答CNTF/受体复合物的细胞露置于有效量的权利要求1所述蛋白复合物。

30、一种促细胞分化的方法，其包括将应答CNTF/受体复合物的细胞露置于有效量的权利要求2所述蛋白复合物。

31、一种促细胞分化的方法，其包括将应答CNTF/受体复合物的细胞露置于有效量的权利要求3所述蛋白复合物。

32、一种促细胞分化的方法，其包括将应答CNTF/受体复合物的细胞露置于有效量的权利要求4所述蛋白复合物。

33、一种促细胞分化的方法，其包括将应答CNTF/受体复合物的细胞露置于有效量的权利要求5所述蛋白复合物。

34、一种促细胞分化的方法，其包括将表达一种受体的细胞露置于有效量的权利要求1所述蛋白复合物，该受体为CNTF/IL-6/LIF受体家系一成员。

35、一种促细胞分化的方法，其包括将表达一种受体的细胞露置于有效量的权利要求2所述蛋白复合物，该受体为CNTF/IL-6/LIF受体家系之一成员。

36、一种促细胞分化的方法，其包括将表达一种受体的细胞露置于有效量的权利要求3所述蛋白复合物，该受体为CNTF/IL-6/LIF受体家系之一成员。

37、一种促细胞分化的方法，其包括将表达一种受体的细胞露置于有效量的权利要求4所述蛋白复合物，该受体为CNTF/IL-6/LIF受体家系之一成员。

38、一种促细胞分化的方法，其包括将表达一种受体的细胞露置于有效量的权利要求5所述蛋白复合物，该受体为CNTF/IL-6/LIF受体家系之一成员。

39、权利要求34的方法，其中该细胞应答睫状神经营养性因子。

40、权利要求35的方法，其中该细胞应答睫状神经营养性因子。

41、权利要求36的方法，其中该细胞应答睫状神经营养性因子。

42、权利要求37的方法，其中该细胞应答睫状神经营养性因子。

43、权利要求38的方法，其中该细胞应答睫状神经营养性因子。

44、权利要求34的方法，其中该细胞不应答睫状神经营养性因子。

45、权利要求35的方法，其中该细胞不应答睫状神经营养性因子。

46、权利要求36的方法，其中该细胞不应答睫状神经营养性因子。

47、权利要求37的方法，其中该细胞不应答睫状神经营养性因子。

48、权利要求38的方法，其中该细胞不应答睫状神经营养性因子。

49、权利要求34-36之任一项所述的方法，其中所述受体为gp130或LIFRβ。

50、一种处治细胞分化障碍患者的方法，包括向患者投用有效量的权利要求1所述蛋白复合物。

51、权利要求50的方法，其中的病症为髓样白血病。

52、一种在细菌中产生睫状神经营养性因子受体的方法，其包括：

（ⅰ）在于细菌宿主中转化的质粒表达载体中表达编码核酸的睫状神经营性因子;

（ⅱ）从细菌宿主中分离包含体;

（ⅲ）用氯化鈲处理包含体;

（ⅳ）透析步骤（ⅲ）的产物;

（ⅴ）将步骤（ⅳ）的产物凝胶过滤。

53、制备权利要求1所述蛋白复合物的方法，其包括在正常的生理条件下，将基本等摩尔量的重组睫状神经营养性因子与睫状神经营养性受体相配合。

54、权利要求53的方法，其中正常的生理条件为PH＝8.0，100mM  Tris-HCl和50mM  NaCl。

55、识别睫状神经营养性因子/受体复合物所用靶细胞的方法，包括：

（ⅰ）将公认的靶细胞露置于有效量的睫状神经营养性因子/受体复合物中;

（ⅱ）评价CLIP蛋白在按步骤（ⅰ）制备的细胞中的磷酸化作用;和

（ⅲ）将步骤（ⅱ）测定的CLIP蛋白磷酸化与由IL-6，LIF或CNTF在其靶细胞中引发的磷酸化型式相比较，其与任一型式的类似性表明该公认的靶细胞即为该睫状神经营养性因子/受体复合物的靶细胞。

56、权利要求52的方法所产生的睫状神经营养性分子。

57、一种防止ES细胞分化的方法，包括在有效浓度的CNTF存在下培养该ES细胞。

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